Nous avons étudié l'agrégation de protéines adhésives (les cadhérines) lors de la formation de contacts intercellulaires. Les cadhérines sont liées au cytosquelette d'actine par un complexe protéique. Nous avons déterminé des rôles respectifs pour la membrane et pour l'actine dans la formation des jonctions adhérentes: les lois de nucléation et croissance d'agrégats de cadhérines fluorescentes entre cellules ont été acquises et confrontées à des modèles faisant intervenir les propriétés de membrane et la polymérisation d'actine. On a pu ainsi montré le rôle structurant de l'actine qui impose la forme des contacts. Nous avons aussi mis au point un montage dans lequel une cellule adhère sur une surface recouverte de cadhérines. L'apparition de motifs cadhérines allongés a été observée par microscopie à ondes évanescentes. Nous avons montré, comme l'avaient prédit les physiciens, que ces agrégats se forment à la suite d'une augmentation de la tension membranaire.

Cette thèse décrit la mesure du dipôle électrique permanent de molécules et de complexes moléculaires en phase gazeuse. Le dipôle électrique caractérise la distribution de charge dans l'état fondamental de la molécule, il dépend des transferts de charge internes et de la géométrie du système. Les mesures sont réalisées gr`ace une source vaporisation/désorption laser couplée à un montage de déflexion de jet moléculaire dans un champ électrique intense et inhomogne (similaire à l'expérience de Stern & Gerlach). Trois familles de systèmes ont ainsi été étudiées : des agrégats mixtes fullerènes-métal, des agrégats d'halogénures d'alcalins à un électron en excès et des polypeptides.

NIL

Dans le cadre du traitement chirurgical du cancer, des sondes agissant comme des compteurs de radioactivité ont été introduites en bloc opératoire pour assister en temps réel le chirurgien lors de l'ablation des tumeurs radio-marquées. Cette technique de radio-guidage permet d'accéder à la localisation précise et à l'ablation complète des tissus tumoraux. Pour renforcer cette pratique chirurgicale nous avons développé une mini gamma-caméra appelée POCI (Per-Operative Compact Imager). L'objectif de cette thèse était de déterminer l'apport de cette nouvelle génération de détecteur pour assister le chirurgien dans l'exérèse des lésions tumorales et d'aborder également la cancérologie à travers les études in vivo sur petits animaux. Du point de vue instrumental, le principe de détection reposant sur une photodiode à localisation intensifiée validé par un premier prototype a été étendu à l'imagerie à grande surface d'analyse avec la double contrainte de ne pas dégrader les performances spatiales et de réduire l'encombrement de l'imageur. La caméra ainsi réalisée offre un champ de vue de 40mm de diamètre et une masse de 1.2kg. A 140 keV, la résolution spatiale est de 2.1mm pour une efficacité de détection de 2.8 10^-4%. POCI a été évalué à travers le protocole du ganglion sentinelle dans le cadre du cancer du sein selon deux approches : l'une basée sur une étude comparative des performances de détection d'une sonde et de POCI et l'autre reposant sur une évaluation clinique menée en collaboration avec l'Institut Gustave Roussy. Cette étude a permis d'établir la complémentarité entre POCI et la sonde en fonction des différentes configurations cliniques. Les performances de détection de POCI ont également été évaluées chez la souris pour étudier la biodistribution de l'iode dans la thyroïde et les glandes mammaires. L'ensemble de ces résultats prometteurs permet d'envisager l'utilisation du détecteur dans un plus large cadre d'investigations tant cliniques que biologiques.

Charger faiblement la surface des membranes ne modifie en rien les paramètres structuraux et élastiques d'une phase lamellaire inverse, car les contre-ions s'auto-écrantent. En revanche, pour la phase lamellaire directe, les répulsions électrostatiques entre charges dans le même plan "repassent" les fluctuations de la membrane, entraînant une diminution de la périodicité. Le paramètre de Caillé eta diminue etla rigidité de la membrane augmente, en accord avec les prédictions de Fogden et al. Le module de compressibilité smectique Bbar augmente à cause des répulsions électrostatiques puis diminue, soit car la couche de contre-ions renormalise l'épaisseur de la membrane, soit sous l'effet des corrélations de fluctuations prédit par Lukatsky et al. Un peptide hydrophobe-hydrophile-hydrophobe globalement neutre a été inséré dans des phases lamellaire et éponge: il se couche sur les membranes et sa partie hydrophile s'organise en hélice alpha rigide. Dans la phase lamellaire, il entraîne une diminution du paramètre de Caillé eta, sans modifier ni la stabilisation par les répulsions stériques, ni la périodicité. La diminution de eta peut s'expliquer soit par une augmentation de l'épaisseur effective de la membrane, soit par le modèle de Sens et Turner. Le peptide induit aussi une importante augmentation de la rigidité. Les hypothèses restrictives des modèles ne leur permettent pas d'expliquer cette augmentation, cependant corrélée à l'augmentation de l'épaisseur effective de la membrane. Les mesures d'absorption et de fluorescence sur la protéine transmembranaire collectrice de la lumière LH2 insérée dans une phase cubique Q230 de monooléine ont montré qu'elle subit des modifications affectant certains de ses pigments, l'état oligomérique de la protéine étant préservé. Ces effets proviennent de la forte concentration en monooléine (et/ou de la faible teneur en eau), et pas de la forte courbure de la membrane. Ces observations nous ont conduits à ne pas tenter la cristallisation du LH2 dans la phase cubique et mettent un bémol à l'utilisation de cette phase comme matrice de cristallisation. Nous avons en outre montré que l'insertion du LH2 dans des phase éponges de tensioactifs le dénaturait.

INTRODUCTION. L'objectif de ce travail est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l'adhésion leucocytaire au cours de la filtration sanguine. Les filtres sont conçus pour associer des phénomènes de tamisage et d'interaction avec des fibres synthétiques pour retenir les leucocytes et laisser passer les érythrocytes. MATERIEL ET METHODES. Afin de mieux étudier les mécanismes, nous avons réalisé deux modèles expérimentaux : le minifiltre et la chambre de perfusion. Les propriétés des leucocytes normaux et de lignée de cellules leucémiques ont été comparées en déterminant pour ces types cellulaires leur adhérence et le niveau d'expression des molécules d'adhérence par cytométrie en flux. Dans la chambre de perfusion, différents types de fibres ont été testés et l'adhésion des cellules analysée par vidéomicroscopie et analyse d'images. RESULTATS. Dans le minifiltre, nous avons pu démontrer que les leucocytes et les cellules leucémiques HL60 étaient retenues dans le filtre secondairement à une interaction entre les intégrines (CD11/CD18) et les fibres contenues dans le filtre. Le système de chambre à perfusion a permis l'étude de l'adhésion de différents types cellulaires à des fibres synthétiques chimiquement différentes. Les lignées HL60 en particulier induites par la vitamine D3 et les THP1 qui expriment le CD11/CD18 adhèrent significativement plus à deux types de fibres (PET, PI). CONCLUSION. La leucoréduction dans le filtre est en partie dépendante de l'adhérence aux fibres. L'adhérence est la conséquence d'une interaction entre les molécules d'adhésion leucocytaires et des molécules chimiques présentes sur les fibres. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour améliorer la performance et la sélectivité des filtres pour les produits sanguins.

Dans les cellules des organismes eucaryotes, l'ADN est associé à diverses protéines pour former la chromatine qui est condensée dans le volume du noyau cellulaire. L'association ADN-histones forme alors une structure périodique dont l'unité répétitive est le nucléosome, mais dont les niveaux d'organisation supérieurs sont toujours en discussion. Afin de comprendre cette organisation, nous avons étudié in vitro le comportement des particules cœur de nucléosome. Dans des conditions de concentrations (en particules et en sel monovalent), recouvrant celles du milieu cellulaire, les particules forment différentes phases ordonnées dont la nature dépend de la concentration ionique de la solution. Nous avons montré, par diffraction des rayons X, qu'à faible concentration saline les particules s'organisent en une phase lamellaire de bicouches et qu'à fort sel, elles forment une phase hexagonale ou quasi-hexagonale organisée à deux ou trois dimensions. Afin de comprendre l'origine du polymorphisme observé en phase dense, nous avons réalisé des études de diffusion des rayons X et des expériences d'osmométrie en solution diluée. Nous avons mis en évidence de très faibles changements de la conformation des particules cœur de nucléosome, et plus précisément une extension des queues des histones lorsque la concentration saline de la solution augmente de 10 à 200 mM. Cette augmentation de la concentration ionique modifie également les interactions entre particules. Nous avons montré que ces deux phénomènes (extension des queues et changement des interactions) sont couplés. Ces changements conformationnels et les variations des interactions pourraient expliquer le polymorphisme structural observé en milieu dense. Cependant, cette comparaison nécessite de prendre en compte l'évolution des concentrations ioniques en fonction de la concentration en particules, et les phénomènes d'encombrement stérique.

Ce mémoire rapporte la mise en oeuvre de la technique d'Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) de l'hélium-3 hyperpolarisé à 0,1 T puis à 1,5 T, in vivo, chez l'Homme sain. L'utilisation des gaz hyperpolarisés en IRM entraîne deux conséquences majeures : l'absence de régénération de l'aimantation longitudinale et une diffusion très rapide. Prenant en considération ces deux contraintes, différentes stratégies d'acquisition sont comparées à bas champ (0,1 T) : séquences "single-shot" (RARE et EPI) et "multi-shot" (FLASH). On montre ainsi que la séquence RARE permet d'acquérir des images de bonne qualité en moins de 400 ms avec peu de gaz ; la séquence EPI a l'avantage de la rapidité mais entraîne davantage d'artefacts, en particulier en raison du terme de Maxwell ; ces deux séquences sont intrinsèquement limitées en résolution à 5 mm in vivo ; la séquence FLASH, moins efficace en termes de rapport signal sur bruit, permet cependant d'atteindre de meilleures résolutions. Les avantages de l'utilisation d'un bas champ magnétique en régime hyperpolarisé sont discutés : en particulier, le rapport signal sur bruit est, dans une très large gamme, indépendant du champ principal. Des mesures RMN puis IRM de diffusion utilisant la technique CPMG sont présentées et permettent de mettre en évidence la restriction due à la structure alvéolaire des poumons.

Mon travail de thèse fut de développer différents projets en vue de mieux comprendre la dynamique et l'organisation des réseaux d'actine, ainsi que les mécanismes moléculaires à l'origine de la production de force grâce à différents systèmes reconstitués biomimétiques. Dans un premier temps, je me suis intéressée à l'étude de l'organisation spatiotemporelle des réseaux dynamiques d'actine et de ses protéines associées durant la propulsion de particules recouvertes de promoteurs de nucléation des filaments d'actine (Achard et al, Current Biology, 2010 et Reymann et al, accepté à MBoC). J'ai notamment suivi en temps réel l'incorporation de deux régulateurs de l'actine (Capping protein, protéine de coiffe et ADF/cofilin, protéine de fragmentation) et montré que leurs actions conjuguées assurent un contrôle biochimique de l'assemblage d'un réseau complexe d'actine, mais gouvernent également les propriétés mécaniques de ce réseau. Par ailleurs, afin de mieux caractériser les propriétés mécaniques de ces réseaux d'actine en expansion, j'ai développé un système biomimétique novateur utilisant la procédure de micropatrons ou "micropatterning" qui permet un contrôle spatial reproductible des sites de nucléation d'actine. Cela m'a permis de montrer comment des barrières géométriques, semblables à celles trouvées dans les cellules, peuvent influencer la formation dynamique de réseaux organisés d'actine et ainsi contrôler la localisation de la production de forces. (Reymann et al, Nature Materials, 2010). De plus, l'incorporation de moteurs moléculaires dans ce système versatile, nous a permis d'étudier la contraction induite par des myosines. En particulier, j'ai pu montrer que les myosines VI HMM interagissent de manière sélective avec différentes architectures d'actine (organisation parallèle ou antiparallèle, réseau enchevêtré), aboutissant à un processus en trois phases: tension, puis déformation des réseaux d'actine fortement couplée à un désassemblage massif des filaments. Aussi, ce phénomène de désassemblage massif induit par la myosine est intimement dépendant de l'architecture du réseau d'actine et pourrait, de ce fait, jouer un rôle essentiel dans la régulation spatiale des zones d'expansion et de contraction du cytosquelette in vivo.

La question de savoir comment les protéines se replient dans leur propre structure tridimentionnelle offre un défi passionnant pour les biophysiciens de nos jours. L'utilisation d'un saut de température rapide est une technique très puissante pour l'étude du processus de dénaturation des protéines. Toutefois, sonder la structure secondaire est un défi difficile et on obtient rarement des valeurs quantitatives. Le but principal de ce projet de thèse est de développer une mise en œuvre technique de dichroïsme circulaire dans l'UV extrême dans une expérience de saut de température nanoseconde. Notre expérience permet de suivre quantitativement l'évolution de la fraction hélicoïdale d'un peptide poly(acide glutamique) au cours de sa dénaturation thermique avec une résolution de 12 ns de temps.