Nous avons exploré la capacité des émulsions à adhérer de manière spécifique à des surfaces modèles solides et notamment la relation entre la composition des gouttes à leur interface et la formation d'un angle de contact macroscopique. Nous avons développé une méthode de fonctionnalisation covalente in-situ de l'interface liquide de gouttes d'émulsion H/E par de la biotine puis par de la streptavidine. La distribution de taille et la densité de streptavidine à la surface des gouttes sont caractérisées à l'aide d'une technique originale utilisant un cytomètre à flux. Nous avons montré que l'angle de contact et l'énergie d'adhésion croissent linéairement en fonction de la densité de biotine sur la lamelle et nous avons observé une répartition spatiale différente (disque, couronne) de la streptavidine dans la zone de contact suivant la densité totale en PEG, suggérant une transition de phase à 2D.

Le but de cette thèse est de caractériser un continuum généré en régime femtoseconde dans une fibre microstructurée (puissance spectrale, durée des pulses, fluctuations tir à tir) et de valider son utilisation comme source optique dans des instrumentations dédiées aux domaines biologique et clinique.<br />La première application est l'élaboration d'un microscope confocal de fluorescence entièrement versatile en longueur d'onde : le continuum, filtré par un cristal acousto-optique, est ainsi utilisé comme une source accordable permettant l'excitation de n'importe quel fluorophore. Des images de cellules identifiées par différents marqueurs ont été réalisées.<br />Afin de disposer d'un outil alliant une grande versatilité spectrale à une très haute résolution spatiale, le dispositif précédent a été modifié en un microscope STED. Notre continuum est trop peu énergétique pour apporter une validation expérimentale, mais des simulations numériques prenant en compte les fluctuations du continuum permettent d'estimer que la résolution latérale peut atteindre 90 nm, voire 35 nm pour les pulses les plus puissants.<br />La troisième application est l'utilisation du continuum en tant que source large bande pulsée pour une expérience de spectroscopie de temps de vol dans les milieux diffusants tels le muscle, l'os, la moelle osseuse. Grâce à un modèle adapté de propagation de la lumière, les coefficients d'absorption, de diffusion et d'anisotropie des tissus ont été extraits des traces expérimentales, avec d'autant plus de précision que la plage spectrale utilisée est grande.<br />Même si des améliorations sont attendues, l'emploi de continua en microscopie de fluorescence et en spectroscopie est validé.

Nous avons étudié la croissance de contacts cellulaires asymétriques: les jonctions adhérentes et les contacts focaux. Nous avons montré par des expériences d'imageries, de micromanipulation, et d'altération des assemblages cellulaires, que la brisure de symétrie des jonctions adhérentes entre des cellules apparemment identiques s'explique par des rôles différents du cytosquelette d'actine des deux cellules formant le contact. Une cellule «donneuse» polymérise de l'actine, ce qui amène les membranes cellulaires en contact. La cellule «receveuse» assemble des faisceaux contractiles d'acto-myosine qui exercent localement des forces sur les jonctions et régulent leur longueur. Des courbes de croissance de ces jonctions adhérentes ont par ailleurs été mesurées pour des cellules soumises à des augmentations contrôlées de force contractile par incubation dans le nocodazole. L'ajustement des courbes de croissance expérimentales par des lois théoriques a permis de déterminer les forces contractiles mises en jeu par la cellule «receveuse». Le tracé du diagramme force-extension des jonctions adhérentes a pu donc être réalisé pour la première fois et par une méthode non-invasive. Les approches biologiques pour l'identification des assemblages en jeu et physiques pour l'ajustement des lois de croissance ont l'une et l'autre montré que les contacts entre cellules se renforcent localement à la manière des contacts focaux. Nous avons enfin observé la dynamique interne des contacts focaux en croissance par TIRFM pour différentes protéines participant au contact (fibronectine, intégrine, vinculine, actine) afin de proposer un mécanisme de mécanosension.

Ce travail a eu comme objectif de mettre en place des techniques de spectroscopie RMN du proton optimisées pour la détection du glutamate cérébral afin d'étudier des changements éventuels du métabolisme glutamatergique dans la maladie de Parkinson. En vue d'une application chez le patient, une approche de filtrage à double quanta et une méthode liée à la spectroscopie bi-dimensionnelle ont été évaluées à 3 Tesla sur un imageur corps entier. Une étude incluant dix patients atteints par la maladie de Parkinson idiopathique et dix volontaires sains a ensuite été réalisée, utilisant une méthode liée à la spectroscopie bi-dimensionelle et ciblant le noyau lenticulaire (putamen et globus pallidum). Aucun changement significatif du glutamate total (intra- et extracellulaire) n'a pu être mis en évidence comparant le patient sous traitement par levodopa (L-DOPA) ou ayant temporairement interrompu son traitement et le volontaire sain. Une tendance à la diminution de la creatine/phosphocreatine a été observée chez le patient. En vue d'une étude complémentaire sur le modèle animal, la méthode mise en œuvre chez le patient a été évaluée chez le rat à 7 Tesla. Une étude sur le rat traité par 6-hydroxydopamine (6-OHDA) a ensuite été réalisée, utilisant une séquence PRESS standard à un temps d'écho de 136 ms et ciblant le striatum. Sur le même animal, des spectres avant traitement à la 6-OHDA, après traitement et suivant une injection de levodopa ont été acquis. Aucun changement de glutamate n'a pu être mis en évidence, alors qu'une tendance à la réduction de la choline suivant le traitement à la 6-OHDA était observée. Nos résultats indiquent que les changements du métabolisme glutamatergique, ayant lieu dans le cadre de la maladie de Parkinson qui ont été mis en évidence dans le modèle 6-OHDA par d'autres méthodes, ne sont pas reflétés par des changements des concentrations du glutamate total mesuré par RMN in vivo.

Cette thèse est consacrée à l'étude analytique et numérique d'instabilités de forme de vésicules lipidiques à deux phases. Les vésicules sont un système modèle de choix pour étudier les propriétés mécaniques et physico-chimiques de la membrane cellulaire. Aussi, elles ont été largement étudiées depuis une trentaine d'années et, dans le cas d'une bicouche homogène, leurs propriétés sont désormais bien comprises. On sait maintenant réaliser des vésicules formées d'un mélange de lipides. Il peut alors se produire une séparation de phase conduisant à la formation de domaines de composition différente. Des structures similaires de très<br />petite taille, appelées 'rafts', existeraient dans les membranes cellulaires. Différentes expériences sur des vésicules multiphasiques montrent que cette inhomogénéïté latérale favorise des instabilités de forme. Nous avons modélisé trois instabilités différentes, observées expérimentalement, pour mieux comprendre comment les propriétés mécaniques des vésicules sont affectées par l'existence d'un domaine. Deux instabilités concernent des déformations hors du plan de la bicouche : la rupture d'un tube de membrane, provoquée par les contraintes mécaniques internes, et l'éjection d'un domaine d'une vésicule tendue, soit par l'absorption de molécules soit par un changement de pression osmotique. Enfin, nous avons modélisé une instabilité illustrant le comportement hydrodynamique de la bicouche, qui justifie le concept de viscosité associé à celle-ci tout en soulignant son caractère bidimensionnel.

De nombreuses protéines doivent localiser de courtes séquences-cibles sur de longues molécules d'ADN. Le temps nécessaire à cette localisation est souvent beaucoup plus court que celui qui résulterait d'une diffusion 3D des protéines. Plusieurs mécanismes ont été suggérés pour rendre compte de l'efficacité remarquable du processus de localisation (diffusion 1D le long de l'ADN, sauts...). Cependant, malgré les nombreuses études menées par des biochimistes depuis plus de vingt ans, en particulier sur les enzymes de restriction EcoRI et EcoRV, à ce jour aucune expérience n'a pu trancher définitivement entre les différents mécanismes proposés.<br /><br />Au cours de cette thèse, nous sommes parvenus à observer en microscopie de fluorescence l'interaction entre une enzyme de restriction EcoRV individuelle et une molécule d'ADN. Pour cela, nous avons développé une technique permettant d'étirer les molécules d'ADN au-dessus d'une surface, et nous avons couplé les enzymes EcoRV à des nanocristaux semi-conducteurs, sondes très fluorescentes non sujettes au photoblanchiment. Les enzymes ainsi marquées, toujours actives, sont détectables avec une résolution spatiale de l'ordre de 10 nm et une résolution temporelle de 20 ms.<br /><br />Nous avons observé de nombreux événements d'association/dissociation d'enzymes sur les molécules d'ADN étirées. L'analyse de ces événements nous a permis de mesurer la constante de dissociation des enzymes couplées, de mettre en évidence une diffusion facilitée d'EcoRV le long de l'ADN et d'estimer les caractéristiques de cette diffusion.

Les génomes de bactériophages sont connus pour être mosaïques. Avec l'augmentation des structures disponibles sur ces virus, leur morphologie aussi apparaît de plus en plus comme telle. Les structures de 4 différents intermédiaires dans l'assemblage de la capside icosaédrique du bactériophage Gifsy-2, infectant les bactéries Salmonella ont été résolues par cryo-microscopie électronique jusqu'à une résolution de 12Å. Au niveau génétique, un long gène code en partie Cterminale pour la protéine de capside majeure alors que sa partie Nterminale est fortement similaire du point de vue de sa séquence primaire aux protéases de la famille Clp. Ces résultats et ceux obtenus sur d'autres phages suggèrent que les 200 résidus en partie centrale regroupent les fonctions restantes, nécessaire à l'assemblage de la capside. Cette organisation en un gène unique est une nouvelle variante des stratégies développées par les phages pour modifier la voie d'assemblage de leur capside.<br />Nous avons aussi déterminé les structures de la capside et de la queue du phage T5 , infectant la bactérie E.Coli à des résolutions de 19 et 30 Å respectivement confirmant l'inhabituelle symétrie d'ordre 3 de sa queue. Sa capside icosaédrique est composée par des pentamères et hexamères de pb8 et par pb10 s'attachant au centre de ces derniers, le tout étant décrit par une géométrie T=13. La comparaison des séquences primaires de pb8 et gp5 d'HK97 et la modélisation du modèle atomique de gp5 dans la capside de T5 montrent que ces 2 protéines adoptent sûrement le même repliement 3D. Nous proposons aussi que le domaine Nterminal de la protéine pb8 soit impliqué dans l'assemblage initial de la capside d'une manière similaire à HK97.

La manipulation optique d'objets en surface d'un guide d'onde représente une approche potentiellement intéressante pour le développement de microsystèmes de tri de particules. Toutefois, la mise en oeuvre de ces dispositifs est actuellement freinée par des performances limitées en terme de propulsion mais aussi par une mauvaise maîtrise des interactions mises en jeu sur des objets métalliques. Ces difficultés ont jusqu'alors interdit la manipulation d'objets biologiques sur ces composants. A travers une étude théorique, nous proposons une méthode originale de calcul des forces optiques s'exerçant sur un objet en surface d'un guide d'onde. Elle permet de mettre en évidence l'existence de forces de gradient répulsives, sur des billes métalliques, dans certaines conditions. L'élaboration d'un dispositif expérimental dédié à la manipulation de particules nous a permis de valider ce modèle et de mettre en évidence une forte dépendance des vitesses des billes métalliques micrométriques avec la polarisation de la lumière. Ces observations illustrent l'impact des forces de gradient sur le mouvement des particules. D'un point de vue plus appliqué, le modèle théorique développé nous a permis de concevoir des structures guidantes destinées à optimiser la propulsion des particules. Expérimentalement, l'utilisation de guides en nitrure de silicium a effectivement conduit à améliorer de façon conséquente les performances des dispositifs existants. Celles-ci nous ont permis d'élargir le champ d'application de cette technique au domaine de la biologie et de mettre en oeuvre le déplacement et la concentration de cellules sur des guides d'onde, sans aucun marquage.

Suite aux travaux de Marie Glanc de l'Observatoire de Paris sur l'imagerie rétinienne in vivo à partir d'optique adaptative (OA) et à ceux d'Hubert Gardette sur le développement de la tomographie optique cohérente (OCT- système d'interférométrie) plein champ appliquée à l'ophtalmologie, le projet de coupler ces deux techniques a fait l'objet d'une troisième thèse, celle-ci. Elle consiste en l'étude de faisabilité du couplage dans l'optique d'un usage ophtalmologique in vivo et non invasif. L'étude passe en revue les nombreuses contraintes auxquelles se soumettre ainsi que les diverses améliorations du principe pour parvenir à un détail de la sensibilité théorique finale d'un tel système d'imagerie.

DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM EST UN ORGANISME UNICELLULAIRE SE NOURRISSANT PAR PHAGOCYTOSE DE MICROORGANISMES ET ENDOCYTOSE DE PHASE FLUIDE. ELLE EST CAPABLE DE MIGRATION SUR UN SUBSTRAT, PAR EMISSION DE PROTRUSIONS SUR LE FRONT CELLULAIRE AVANT, ET PAR RETRACTION DU FRONT ARRIERE. LA MOTILITE EST LIEE A L'ADHERENCE DES CELLULES SUR LE SUBSTRAT, SIEGE DE LA TRANSMISSION DES FORCES EXERCEES PAR LA CELLULE. SOUMISE A UNE FORCE DE CISAILLEMENT HYDRODYNAMIQUE, DICTYOSTELIUM SE DEPLACE DANS LE SENS DU FLUX. NOUS AVONS ETUDIE LES MECANISMES BIOCHIMIQUES MIS EN JEU EN REPONSE A LA FORCE OU A L'ETALEMENT. NOUS AVONS ANALYSER LE COMPORTEMENT DE CELLULES SAUVAGES ET DE MUTANTS D'INVALIDATION, A L'ECHELLE DE LA CELLULE ET DU BORD CELLULAIRE. NOUS MONTRONS PLUSIEURS RESULTATS. LE CALCIUM LIBRE EXTRACELLULAIRE AUGMENTE LA VITESSE DE MIGARTION DES CELLULES ET LEUR SENSIBILITE AUX FORCES. CECI EST DU A UNE AUGMENTATION DE LA DYNAMIQUE DES BORDS CELLULAIRES, LES PROTRUSIONS ETANT PLUS GRANDES ET LES RETRACTIONS PLUS EFFICACES. IL Y A DES OSCILLATIONS DES BORDS CELLULAIRES, AVEC DES PERIODES PROPRES DIFFERENTES A L'AVANT ET A L'ARRIERE DE LA CELLULE. CES PERIODES NE DEPENDENT NI DE LA CONCENTRATION NI DU TYPE CELLULAIRE. LE CALCIUM AUGMENTE LA CINETIQUE ET LA REGULARITE DE L'ETALEMENT, EN AGISSANT SUR LA POLYMERISATION D'ACTINE. L'ETALEMENT NE DEPEND QUE DE LA POLYMERISATION D'ACTINE ET DE L'EMISSION DE PROTRUSIONS, TANDIS QUE LES RETRACTIONS NE PEUVENT EXISTER SANS MYOSINE 2. ENFIN, LES PROTEINES G ET LES RECETEURS A L'IP3 SONT IMPLIQUES DANS LA SIGNALISATION CALCIQUE.