Les nanoparticules magnétiques peuvent être utilisées pour détruire des cellules cancéreuses. La connaissance des propriétés rhéologiques de ces cellules permet de modéliser le mouvement des particules sur la surface des membranes et de mieux comprendre les mécanismes en jeu. Une première approche fut d'utiliser des microsondes magnétiques pour déterminer les propriétés viscoélastiques du milieu cellulaire. Puis une technique plus directe à l'aide d'un AFM a été utilisée. Nous avons à cet effet développé une méthode générale d'analyse du mouvement de la pointe AFM pour les étapes d'indentation et de relaxation, ce qui permet une détermination plus précise des paramètres rhéologiques de cellules et en particulier de la lignée Hep-G2. La modélisation du comportement viscoélastique des cellules a ensuite permis de calculer l'indentation de ces cellules par des particules magnétiques soumise à un gradient de champ magnétique. Des nanoparticules de fer en forme de fuseau, recouvertes d'or, ainsi que des nanofibres de cobalt ont été synthétisées au laboratoire. Nous avons montré que l'application d'un champ magnétique de basse fréquence (quelques Hz) sur ces nanoparticules de fer pouvait "in vitro" détruire des cellules cancéreuses mais que, par contre, un champ constant n'avait pratiquement aucun effet. En s'appuyant sur la modélisation de l'indentation, on montre que seule la formation de clusters de particules peut expliquer ces résultats. A coté de la magnétolyse par voie mécanique, nous avons montré qu'il était aussi possible d'utiliser l'importante hystérésis magnétique des nanoparticules de cobalt pour le traitement par hyperthermie de cellules cancéreuses à des fréquences aussi basses que 10 kHz.

Polymeric nanoparticles are potential candidates as carriers for pharmaceutical agents. Development of such nanoparticles generally requires molecules immobilized on the particle surfaces to ensure biocompatibility and/or targeting abilities. Following particle preparation and surface modification, excess reagents must be removed. Ultracentrifugation, which is the most widely used purification technique as per today, is not feasible in industrial applications. In this diploma work, tangential flow filtration is studied as an alternative purification method which is better suited for implementation in a large-scale process. Comparison of ultracentrifugation and tangential flow filtration in diafiltration mode for purification of nanoparticles, indicate that they are comparable with respect to particle stability and the removal of the surfactant SDS from methacrylic anhydride nanoparticles. The purification efficiency of tangential flow filtration is superior to that of ultracentrifugation. Conductivity measurements of filtrates and supernatant liquids show that a stable conductivity value can be reached 6 times faster in filtration than in centrifugation with equipment and settings used. This conductivity arises from several types of molecules, and the contribution from surfactant molecules alone is not known. However, protein adsorption on the particles indicates successful removal of surfactant. Conductivity and tensiometry were evaluated as potential methods to quantify surfactant in solutions, but both proved unsatisfactory. Using bovine serum albumin as a model protein, the extent of immobilization to nanoparticles is evaluated at different pH. A maximum amount of 6,8 mg/m2 is immobilized, whereof an unknown part is covalently bound. This coverage is achieved at pH 4,0 and is probably partly due to low electrostatic repulsion between particle and protein. An estimation of 2,0 µmol covalently bound BSA per gram of nanoparticles corresponds to 5,3 mg/m2 and a surface coverage of 76%. Removal of excess reagents after surface modification is done with ultracentrifugation instead of filtration, as particle aggregates present after the immobilization reaction might foul the membrane.

<p>Polymeric nanoparticles are potential candidates as carriers for pharmaceutical agents. Development of such nanoparticles generally requires molecules immobilized on the particle surfaces to ensure biocompatibility and/or targeting abilities. Following particle preparation and surface modification, excess reagents must be removed. Ultracentrifugation, which is the most widely used purification technique as per today, is not feasible in industrial applications. In this diploma work, tangential flow filtration is studied as an alternative purification method which is better suited for implementation in a large-scale process.</p><p>Comparison of ultracentrifugation and tangential flow filtration in diafiltration mode for purification of nanoparticles, indicate that they are comparable with respect to particle stability and the removal of the surfactant SDS from methacrylic anhydride nanoparticles. The purification efficiency of tangential flow filtration is superior to that of ultracentrifugation. Conductivity measurements of filtrates and supernatant liquids show that a stable conductivity value can be reached 6 times faster in filtration than in centrifugation with equipment and settings used. This conductivity arises from several types of molecules, and the contribution from surfactant molecules alone is not known. However, protein adsorption on the particles indicates successful removal of surfactant. Conductivity and tensiometry were evaluated as potential methods to quantify surfactant in solutions, but both proved unsatisfactory.</p><p>Using bovine serum albumin as a model protein, the extent of immobilization to nanoparticles is evaluated at different pH. A maximum amount of 6,8 mg/m2 is immobilized, whereof an unknown part is covalently bound. This coverage is achieved at pH 4,0 and is probably partly due to low electrostatic repulsion between particle and protein. An estimation of 2,0 µmol covalently bound BSA per gram of nanoparticles corresponds to 5,3 mg/m2 and a surface coverage of 76%. Removal of excess reagents after surface modification is done with ultracentrifugation instead of filtration, as particle aggregates present after the immobilization reaction might foul the membrane.</p>

Cette thèse s'intéresse aux effets des rayonnements ionisants sur les cellules vivantes. Le travail peut être divisé en 3 parties principales :<br />La première partie résume les processus de dommage et de réparation cellulaire après les irradiations, et les résultats obtenus par Dionet et al. au Laboratoire de Physique Corpusculaire notamment la mise en évidence de l'effet d'hypersensibilité de la lignée du mélanome pour des irradiations à faibles doses et faibles débits de dose en neutrons de 14 MeV.<br />La deuxième partie décrit le développement de la version officielle du code GEANT4DNA qui est un code Monte-Carlo capable de suivre les protons jusqu'à 100 eV et les électrons jusqu'à 15 eV dans l'eau. Ce code a été utilisé pour décrire d'une manière détaillée les traces des particules qui traversent la cellule pendant les iradiations. <br />La troisième partie décrit les formalismes de la microdosimétrie et de la théorie « Dual Radiation Action » qui ont été utilisés pour calculer l'efficacité biologique relative des neutrons de 14 MeV par rapports aux photons de 1 MeV pour la lignée irradiée au LPC, le mélanome. L'EBR calculé est comparé aux données expérimentales disponibles.

Les propriétés mécaniques des cellules adhérentes ont une importance capitale pour l'ensemble de leurs fonctions : division, migration, différenciation, etc. De plus, on sait désormais qu'elles sont très sensibles aux caractéristiques mécaniques de leur substrat, auquel elles sont ancrées par l'intermédiaire des intégrines. Ces récepteurs transmembranaires lient indirectement le cytosquelette d'actine intracellulaire aux protéines de la matrice extracellulaire.<br />Nous avons conçu un dispositif de pinces optiques contrôlées par une boucle de rétroaction, qui permet d'appliquer aux cellules une force locale constante, via des microbilles liées aux intégrines.<br />Nous pouvons ainsi mesurer la fonction de fluage de chaque cellule et en tirer une estimation de sa rigidité. Des observations simultanées en épifluorescence permettent par ailleurs d'évaluer les effets de l'application de la force sur la répartition d'actine locale.<br />Nous avons constaté que les cellules se rigidifient sous l'application prolongée d'une force, tout en gardant le même comportement rhéologique : une fonction de fluage en loi de puissance du temps, J(t) = At^(alpha), où A décroît aux temps longs. Cette rigidification est couplée à un recrutement d'actine au niveau des contacts et au sein du réseau cytsoquelettique (jusqu'à plusieurs µm du point d'application de la force). De plus, les dynamiques de ces deux phénomènes semblent fortement corrélées. Ce travail présente une évaluation de la dynamique de renforcement cellulaire sous contrainte, et ouvre des perspectives prometteuses vers l'élucidation des phénomènes intervenant dans la mécanotransduction.

Ce travail a porté sur l'étude théorique de modèles d'ADN, afin de mieux caractériser le processus de dénaturation thermique. Nous avons proposé trois modèles d'ADN basés sur des énergies d'empilement finies et dépendantes de la séquence, qui reproduisent très bien les résultats expérimentaux. Nous avons ensuite étudié l'amplification des fluctuations de température de l'ADN à la dissociation et mis en évidence une dépendance en 1/f du spectre des fluctuations. Nous avons également effectué une étude complète du comportement critique des modèles d'ADN à la limite thermodynamique : nous avons calculé les exposants critiques, démontré quantitativement la discontinuité de la transition et montré que deux lois d'échelle sur quatre ne sont pas vérifiées. Enfin, nous avons analysé les effets de finitude de taille sur la dénaturation de l'ADN et testé les hypothèses de la théorie de finite size scaling. Les études en cours portent sur l'effet du désordre sur la transition de dénaturation.

Cette étude sur la locomotion de C. elegans vise à mieux comprendre le fonctionnement de son système nerveux et à apporter des éléments nouveaux de réflexion pour la conception de modèles ou d'objet biomimétiques. Ce travail débute par une description du ver, de sa physiologie ainsi que des principaux modes de locomotion connus : la nage (en milieu liquide) et la reptation (sur gel aqueux). Puis dans le cas de la nage, nous mettons en évidence une dissymétrie du mouvement, nécessaire pour la progression en milieu visqueux. L'analyse des vitesses des déplacements locaux permet de faire un bilan des forces exercées sur le ver, en admettant que celles-ci sont visqueuses. On montre ainsi que les coefficients de friction transverse et longitudinale peuvent être assimilés à ceux d'un ellipsoïde allongé. Dans le cas du mode reptation, on observe une diminution de l'amplitude de la tête vers la queue. L'interaction ver-substrat est abordée d'abord théoriquement (hypothèse de lubrification). Il en résulte des prédictions pour les coefficients de friction en désaccord avec les résultats expérimentaux. Ce désaccord est expliqué par la mise en évidence de seuils de friction statique. On mesure aussi la rigidité passive d'un ver. Un confinement vertical du ver en milieu liquide permet d'observer une transition continue de la nage vers la reptation. On montre que la période du mouvement ainsi que le déphasage entre les mouvements de la tête et la queue augmentent avec le placage. Un confinement horizontal du ver sur substrat permet de contraindre l'amplitude. On montre que la longueur d'onde diminue avec l'amplitude.

Chez la majorité des organismes vivants, depuis certaines bactéries, jusqu'aux mammifères, de nombreux processus biologiques sont rythmés, comme par exemple l'alternance veille sommeil, ou encore le cycle d'hibernation. Le contrôle de ces rythmes biologiques est effectué grâce à des horloges biologiques, qui sont dans certains cas des oscillateurs auto-entretenus programmés génétiquement. Les oscillateurs biologiques dont la période est de proche de 24h sont dits circadiens. La cyanobactérie Synechoccocus elongatus sp. PCC7942 est l'un des plus simples organismes possédant cette horloge circadienne. Malgré la division cellulaire (jusqu'à 3 divisions par cycle), l'oscillation circadienne persiste au sein d'une population. De plus, des mesures faites sur cellules individuelles montrent la persistance de l'oscillateur circadien avec un temps de corrélation de plusieurs mois. Nous nous intéressons ainsi à l'origine de la robustesse de l'oscillateur : comment conserver une oscillation aussi stable malgré les sources de bruits (fluctuations internes et environnementales) auxquelles est soumis le réseau génétique ? Une telle stabilité pourrait être intrinsèque à l'oscillateur, ou alors être due à une interaction entre oscillateurs. Notre étude s'intéresse à la 2ème hypothèse ; ainsi, nous avons cherché l'existence potentielle d'un couplage entre 2 populations d'oscillateurs circadiens. Pour accéder à l'oscillation de l'horloge circadienne, nous avons utilisé une souche sauvage dans laquelle a été introduit le gène rapporteur de la luciférase. La souche mutée ainsi obtenue va présenter une luminescence oscillante, traduisant l'expression de la luciférase sous le contrôle du promoteur correspondant. Les souches mutées et non mutées ont une activité génétique régulée par l'horloge circadienne. L'interaction est étudiée en réalisant des mélanges de deux populations -souche mutante +souche sauvage- de cyanobactéries ayant initialement des phases d'oscillation différentes, avec un rapport de concentration 1:20. L'évolution temporelle de la bioluminescence donne ainsi accès à l'oscillation circadienne de la population minoritaire. Les éventuels effets du couplage sont analysés en étudiant la phase d'oscillation de la population minoritaire. Notre étude a montré qu'après une quarantaine de jours d'interaction potentielle, la phase d'oscillation des minoritaires n'est pas affectée de façon significative par la présence d'oscillateurs ayant une autre phase initiale. Au vu de ces résultats, nous avons établi un modèle théorique de couplage afin de majorer l'éventuel couplage entre oscillateurs cyanobactériens. Notre modèle est principalement décrit par le modèle de Kuramoto, qui donne une description pertinente de nombreux oscillateurs biologiques. Des simulations numériques ont montré qu'il était possible de faire des hypothèses simplificatrices concernant la forme des distributions de phase au sein de chacune des populations en interaction. Ainsi, nous avons établi une relation simple entre le changement de phase, et la constante de couplage. En tenant compte des incertitudes sur la phase calculée expérimentalement, nous estimons une borne supérieure de la constante de couplage entre oscillateurs cyanobactériens.

L'étude des verres bioactifs constitue un domaine de recherche pluridisciplinaire aux enjeux considérables : la mise au point d'une nouvelle génération de biomatériaux, capables de se lier avec les tissus receveurs, de former un lien interfacial fort et d'aider l'organisme à se soigner lui-même grâce à une action directe sur les cellules. Les applications concernent particulièrement le comblement de défauts osseux en chirurgies orthopédique et dentaire. Dans cette optique, nous avons élaboré plusieurs verres bioactifs dans des systèmes de composition binaire SiO2–CaO, ternaires SiO2–CaO–P2O5 , et pour la première fois à notre connaissance des verres contenant du strontium SiO2–CaO–SrO et SiO2–CaO–P2O5–SrO. L'utilisation du procédé sol-gel comme voie de synthèse des verres bioactifs s'est révélée avantageuse, car permettant l'élaboration de matériaux nanoporeux, de grande pureté et homogénéité. La bioactivité in vitro des verres est avérée : au contact d'un milieu biologique, tous les matériaux élaborés induisent la formation d'une couche Ca-P-Mg sur une profondeur de quelques microns à leur surface. Nos travaux se distin-guent par l'utilisation des microsondes nucléaires PIXE-RBS pour la caractérisation de l'interface verre bioactif/milieu biologique; leur emploi a permis de réaliser des cartographies chimiques rendant possible l'étude des gradients de concentrations en éléments majeurs et traces à l'interface. De plus, des informations quantitatives sur la réactivité locale des verres ont été acquises. Ces données sont importantes pour évaluer les cinétiques et l'amplitude des réac-tions physico-chimiques impliquées dans le processus de bioactivité. Nous avons ainsi mis en évidence que le verre binaire est le plus prompt à réagir en ce qui concerne la dissolution de la matrice vitreuse et l'apparition de la couche riche en Ca et en P. Toutefois la plus lente décroissance du rapport Ca/P à l'interface verre/milieu biologique indique que la couche Ca-P-Mg éprouve des difficultés à évoluer vers une phase apatitique. Pour les verres contenant du phosphore, la désalcalinisation de la matrice et la formation de la cou-che phosphocalcique sont retardées ; cependant le calcul du rapport Ca/P à l'interface et le suivi de l'état de saturation du milieu biologique montrent que la couche Ca-P-Mg se développe plus rapidement en une couche de type apatiti-que. Concernant les verres dopés en Sr, nous avons démontré que leur capacité de dissolution est amoindrie et que la couche Ca-P-Mg se forme sur une profondeur plus réduite. Néanmoins, la couche évolue plus promptement en apa-tite d'après la rapide décroissance du rapport Ca/P. Nous avons également obtenu des preuves de la présence de Sr à l'interface verre/liquide et de la diffusion de cet élément dans le milieu biologique sous forme de traces. Grâce aux effets bénéfiques du strontium sur l'activité cellulaire et sur le cycle de remodelage osseux, ceci pourrait résulter en une bioactivité grandement améliorée pour les verres dopés en Sr en milieu vivant.

Nous avons développé un microlaboratoire pour étudier la diffusion et son couplage<br />avec la réaction chimique. Il est constitué d'une chambre d'analyse dans laquelle on peut<br />appliquer des champs électriques en deux dimensions pour obtenir des profils de concentration<br />stationnaires ou non-stationnaires. La simplicité spatiale du flux électrophorétique<br />utilisé permet d'appliquer systématiquement une analyse dans l'espace de Fourier. Ce traitement<br />fournit le coefficient de diffusion d'un analyte pur ainsi que la constante thermodynamique<br />et les constantes cinétiques d'un mélange réactif. Dans le but de développer des<br />techniques de séparation resposant sur la cinétique, nous avons étudié la réaction d'hybridation<br />entre deux brins d'ADN et constitué une banque d'oligonucléotides avec des<br />constantes cinétiques variées. Ces études nous ont mené à developper, en collaboration<br />avec le Museum National d'Histoire Naturelle, une sonde oligonucléotidique fluorescente à<br />motif quadruplex permettant une discrimination cinétique lorsqu'elle s'hybride avec une<br />séquence parfaitement complémentaire ou mésappariée.