La morphogenèse dans le vivant est contrôlée par un ensemble complexe de processus, parmi lesquels la physique joue un rôle essentiel. Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes intéressé aux processus mécaniques d'auto-organisation qui guident la morphogenèse gastrovasculaire de la méduse Aurelia aurita. Le système gastrovasculaire de cette méduse est constitué d'un réseau branché de canaux, dont le rôle est de distribuer les nutriments et l'oxygène dans son ombrelle, et dont l'organisation est relativement simple. Nous avons observé la croissance de ce réseau de canaux et étudié la structure et les propriétés mécaniques des tissus qui les entourent. Les canaux grandissent dans un mince feuillet cellulaire plat, l'endoderme, et sont entourés par de la matrice extracellulaire. Ces différents tissus sont comprimés périodiquement par des contractions musculaires. Des expériences de macro- et microrhéologie ont montré que la matrice apparaît comme un gel viscoélastique mou, dont la structure et les propriétés mécaniques évoluent au cours du développement de la méduse. Cette évolution peut être mise en rapport avec les contraintes physiques particulières subies par la matrice lors des contractions musculaires. Par ailleurs, nous avons montré par microscopie optique et électronique que les canaux croissent localement par accumulation, empilement et différenciation des cellules de l'endoderme en cellules de canal. Des simulations numériques et des résultats expérimentaux suggèrent que ce processus est induit par une accumulation locale des contraintes de compression dans l'endoderme, à l'extrémité des canaux en croissance, à chaque contraction musculaire de la méduse.

L'adhésion cellulaire est un processus biologique fondamental contrôlé par des liaisons moléculaires spécifiques entre ligands et récepteurs attachés à des surfaces. La formation et la rupture de ces liens dépendent de facteurs cinétiques, mécaniques et structurels. Le but de ce travail était d'observer comment l'interaction ICAM-1 (Inter- Cellular Adhesion Molecule 1) - anti ICAM-1 pouvait être modifiée en jouant i) sur la multivalence de molécules impliquées dans la liaison ii) sur la topographie de surface et iii) sur la mobilité des ligands. A cette fin, on a principalement utilisé une chambre à flux laminaire, complété par une détection de molécule unique par fluorescence. L'étude sur les effets de multivalence, utilisant des monomères et dimères d'ICAM-1, a été réalisée en absence ou en présence d'une force mécanique, montrant la plus grande stabilité des liaisons divalentes. En outre, un renforcement avec la force et le temps a été trouvé et décrit avec une fonction à deux paramètres, montrant, pour les liaisons divalentes, un comportement intermédiaire entre rupture parallèles et successives des liaisons monovalentes. La fréquence d'adhésion des liaisons monovalentes et divalentes présente différentes valeurs causées par la différence de longueur de ces molécules. Les expériences d'adhésion ont été effectuées en variant la topographie du substrat à l'échelle nanométrique pour les molécules étudiées. Une comparaison des cinétiques de liaisons sur ces surfaces ne montrent pas de différences soit dans la formation ou dans la rupture. Dans l'écoulement, le temps de contact entre les molécules est contrôlé par la convection de microsphères. Des résultats récents montrent qu'un temps minimum est requis pour former la liaison (Robert et al. 2011). Pour tester cette prédiction, les ligands sont ancrés à une bicouche lipidique (SLB) pour étudier comment la diffusion peut modifier l'adhésion. Expérimentalement, les fréquences d'adhésion des liaisons ont montré un comportement similaire pour les SLB fixes et fluides. Toutefois, une simulation numérique 2D prédit un effet sur la formation de la liaison, même lorsque la diffusion des ligands est faible. Il semblerait que la diffusion joue un rôle dans la dissociation de la liaison, limitant fortement la dissociation de la bicouche fluide. Cet effet peut être expliqué par la présence éventuelle de liaisons multiples dues à l'accumulation des ligands sur la surface de contact. La chambre à flux laminaire et le suivi de particule individuelle a permis de mieux comprendre les mécanismes d'adhésion et le comportement de l'interaction des molécules d'ICAM-1 au niveau de molécule individuelle, lorsque l'environnement moléculaire a été modifiée. Des travaux similaires peuvent être effectuées sur d'autres molécules d'adhésion afin d'atteindre une connaissance beaucoup plus large des mécanismes d'adhésion, ou sur les liaisons entre TCR et pMHC qui sont extrêmement importantes dans la réponse immunitaire.

Par micromanipulation et mesure de force sur molécule unique, avec un piège magnétique, ce travail a porté en partie sur l'étude du système de réparation « à longue distance » de l'ADN. Cette réparation fait intervenir pour son initiation les protéines MutS, MutL, et MutH et utilise un mécanisme non identifié précisément, qui lui permet<br />d'agir à distance, entre un site de mésappariement de l'ADN (dû par exemple à une erreur de réplication), et un site proximal distant (hémi-méthylation de séquence GATC), ce qui permet de diriger la réparation sur le brin néosynthétisé. Certains modèles de l'action de la protéine MutS font intervenir une boucle dans l'ADN. Nous<br />avons cherché à mettre en évidence une telle action sur un ADN double brin, contenant (ou ne contenant pas) un mésappariement. Nous n'avons pas mis en évidence de<br />formation de boucle par MutS, qui soit spécifiquement liée à la présence d'un mésappariement. Ce résultat négatif semble donc exclure ce modèle de boucle spécifique. Dans une deuxième partie, nous avons effectué des expériences de micromanipulation sur une jonction de Holliday (ADN en forme de croix, intermédiaire de recombinaison). Nous avons montré directement qu'il est possible d'extruder une jonction de Holliday, en sous-enroulant mécaniquement une molécule d'ADN comportant une séquence palindromique, et avons aussi déduit de ces expériences une mesure du pas de l'hélice de l'ADN. Dans une dernière partie, nous avons étudié l'influence du bromure d'éthidium sur l'ADN. Nous avons montré que la présence de cet agent intercalant peut induire une attraction non-spécifique, intra- ou inter- simple brins d'ADN.

Le mouvement cellulaire est organisé par des processus moléculaires qui couplent la dynamique de la membrane plasmique à celle du cytosquelette d'actine, pour engendrer des protrusions cellulaires. Pour analyser le lien fonctionnel entre ces processus et le comportement motile qui en résulte, j'ai utilisé une approche biomimétique. J'ai mis au point une méthode rapide d'électrogonflement de liposomes géants unilamellaires, que j'ai fonctionnalisés avec la protéine N-WASP. Cette protéine catalyse la formation d'un réseau de filaments branchés par le complexe Arp2/3 au bord avant des cellules motiles. Les liposomes, placés dans un milieu reconstitué contenant l'actine, Arp2/3 et les protéines de régulation du treadmilling, sont déformés par la polymérisation insertionnelle de l'actine et se propulsent in vitro. J'ai montré que les liposomes adoptent un régime de propulsion soit continu, soit saltatoire périodique, la transition entre les deux régimes étant contrôlée par la concentration de Arp2/3. Les résultats établissent que le complexe Arp2/3 est le partenaire de N-WASP responsable de l'interaction entre la membrane et les filaments au cours de la réaction de branchement. Cette interaction est transitoire et détermine l'équilibre ségrégation-diffusion de N-WASP dans la bicouche lipidique et la formation d'un réseau cohésif de filaments branchés. Le modèle physique que nous proposons selon lequel l'équilibre ségrégation-diffusion de NWASP est contrôlé par les paramètres cinétiques du cycle catalytique de branchement, reproduit quantitativement les profils de densité de surface de NWASP observés expérimentalement.

Le cytosquelette des cellules est une structure composite et versatile qui leur confère des propriétés mécaniques extrêmement complexes. En particulier, le cortex d'actine qui s'assemble de manière dynamique sous la membrane cellulaire fournit la force nécessaire aux déformations et au mouvement de la cellule : la polymérisation de l'actine permet aux filaments en formation de pousser la membrane et les moteurs moléculaires génèrent des forces contractiles. L'utilisation de systèmes biomimétiques permet d'isoler des modules particuliers du cytosquelette pour les étudier indépendamment de façon simplifiée. Une expérience de reconstitution du cortex d'actine in vitro a été mise au point dans ce but. Les protéines et métabolites nécessaires pour la polymérisation de l'actine sont ainsi introduits dans un liposome et la réaction est localisée à la membrane, en y greffant l'activateur de la polymérisation de l'actine, sur le modèle du cortex cellulaire. Une fois la polymérisation déclenchée, nous sommes arrivés à reproduire un gel d'actine à la membrane, formant une coque. Les propriétés mécaniques de ce système simplifié sont alors étudiées par des expériences qui caractérisent leur dynamique d'étalement sur des surfaces. Les résultats sont comparés à ceux obtenus sur des cellules, et reproduisent une bonne partie des comportements cellulaires. On utilise également ces liposomes dans une situation physiologique: l'internalisation de la toxine de Shiga dans les cellules et nous montrons que la toxine est internalisée dans un système aussi épuré que des liposomes comportant un cortex reconstitué, prouvant le rôle important de l'actine dans ce processus.

Depuis la découverte de la protéine fluorescente verte (GFP) en 1962, de nombreux développements ont permis d'améliorer l'utilisation de cette protéine naturellement luminescente en tant que puissant outil permettant de suivre des protéines ou des organelles d'intérêt dans les cellules ou organismes vivants. Au début du 21ème siècle, la découverte des protéines fluorescentes photoactivables (PAFPs), notamment chez les anthozoaires, a initié une révolution dans le domaine de la technologie des FP. Certaines PAFPs sont capables d'être irréversiblement photoconverties d'une forme fluorescente verte à une forme fluorescente rouge alors que d'autres peuvent être réversiblement commutées entre des formes allumées ou éteintes, selon des longueurs d'onde d'excitation spécifiques.Ces protéines sont intensivement employées pour les techniques de microscopie optique, particulièrement en “nanoscopie”, qui permet d'atteindre une résolution optique 10 fois meilleure que la limite théorique d'Abbe. Afin de développer plus en avant ces techniques, notamment en terme de résolution temporelle, la nécessité d'obtenir des sondes fluorescentes plus lumineuses pouvant se photoconvertir ou se photocommuter efficacement est cruciale. Dans un même temps, les marqueurs fluorescents doivent généralement être monomériques et photostables. Afin de mieux comprendre les mécanismes des phototransformations des PAFPs, trois membres de la famille ont été étudiés : EosFP, Dendra2 et IrisFP. Le phénomène de photoconversion du vert au rouge, de photocommutation réversible et de photoblanchiment irréversible ont été étudiés grâce à une combinaison de cristallographie des rayons X et de microspectrophotométrie, en utilisant le laboratoire Cryobench de l'ESRF/IBS. Pris ensemble, les résultats nous ont permis de proposer un mécanisme de photoconversion pour EosFP et Dendra2 et de découvrir et caractériser IrisFP, première PAFP combinant à la fois les propriétés de photoconversion et de photocommutation. Les modifications structurales du chromophore associées à la formation d'un état radicalaire induit par les rayons X, probablement impliqué dans la voie de photoblanchiment des PAFPs, ont aussi été caracterisées.

Les protéines membranaires interviennent dans de nombreux mécanismes cellulaires. Cependant, peu de techniques sont adaptées à l'étude des interactions entre ces protéines. Nous sommes parvenus à les caractériser dans un milieu de membranes modèles dont l'épaisseur et la séparation entre bicouches sont ajustables. L'étude de la diffusion d'objets membranaires a permis de remettre en question l'utilisation du modèle de Saffman-Delbrück. Ces résultats montrent la sensibilité de la mobilité par rapport à l'état de liaison d'une protéine. Grâce à des mesures de recouvrement de fluorescence, nous avons caractérisé des interactions entre protéines membranaires en étudiant deux exemples : l'interaction connue entre streptavidine et biotine et celle entre des protéines constituant une pompe à efflux chez la bactérie P. aeruginosa. Cette thèse s'articule autour des différentes questions soulevées par une interaction : la géométrie du complexe, sa stoechiométrie selon différentes conditions de pH mais aussi la mesure des constantes dynamiques de l'accrochage comme les taux d'association ou de dissociation ainsi que des constantes d'affinité. Ces mesures ont été effectuées entre des protéines diffusant sur une surface dans des conditions proches de leur environnement biologique.

La métabolomique est un outil récent, aujourd'hui en plein essor, qui se définit comme étant l'étude de l'ensemble des petites molécules ; les métabolites, produites par un organisme sous différentes conditions. Son application à la problématique du cancer consiste en l'étude des perturbations métaboliques liées au processus oncologique. La métabolomique mêle diverses techniques d'analyses telles que la spectroscopie de masse et la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN), couplées à des méthodes statistiques évoluées afin d'extraire les informations métaboliques pertinentes permettant de caractériser les systèmes biologiques. La spectrométrie RMN haute résolution en rotation à l'angle magique (HRMAS) est la technique que nous avons choisie pour l'étude du métabolome des tumeurs car elle regroupe un nombre important d'avantages (simplicité de préparation des échantillons, la reproductibilité intra et inter laboratoire et le cout relativement modeste de fonctionnement). L'étude principale réalisée dans le cadre de cette thèse a porté sur les tumeurs cérébrales. Une centaine de tumeurs ont ainsi été analysé et leur métabolome caractérisé. L'analyse effectuée s'est focalisé sur la problématique du « grading de malignité » des tumeurs cérébrales, principalement sur les gliomes. Ainsi une forte corrélation a été trouvé entre les profiles métabolique des gliomes (glioblastome, oligodendrogliome) et l'évolution clinique des patients. L'approche métabolomique pour l'étude des tumeurs, d'un point de vue diagnostic et pronostic, semble aujourd'hui prometteuse. De plus l'étude des profiles métaboliques, devrait, à terme, permettre une meilleure compréhension des perturbations métaboliques lié à la pathologie, et potentiellement, conduire à la mise en place de traitements individualisés parfaitement adaptés à chaque patient. Néanmoins, une étape de validation de ces premières observations est aujourd'hui indispensable. C'est pourquoi ces travaux ont accompagné l'installation du premier spectromètre RMN HRMAS dans le milieu clinique en novembre 2007 dans le cadre du projet CARMeN. L'objectif général de ce projet est, maintenant, d'étendre l'expérience acquise durant cette thèse à tous les domaines de la cancérologie où il existe, soit une dissociation entre le diagnostic histopathologique de la tumeur et le devenir du patient, soit une discordance à la réponse thérapeutique pour un sous‐type de tumeur.

Caenorhabditis elegans est un organisme modèle bien adapté à l'analyse du fonctionnement de son réseau de neurones, de l'intégration des informations sensorielles qu'il reçoit à l'élaboration d'une réponse comportementale. Au cours de cette thèse, je me suis intéressée à l'étude de quelques paramètres cellulaires, moléculaires et environnementaux de la stratégie locomotrice de ce nématode. J'ai développé une méthode originale d'analyse quantitative de l'alternance des phases d'activité de C. elegans en présence de bactéries. J'ai montré que la phase inactive est induite par la perception interne de bactéries nutritives alors que la phase active est favorisée par la perception chemosensorielle. Ce comportement bimodal est aussi contrôlé par la concentration en nourriture de l'environnement et est modulé par son état de satiété. On observe en effet une transition d'un état constamment actif à un comportement majoritairement inactif en une décade de concentrations en bactéries. J'ai également montré que ce comportement est régulé par les voies de signalisation de la sérotonine, de l'insuline et des TGF-beta. J'ai par ailleurs développé un nouveau système d'imagerie permettant l'enregistrement simultané de l'activité calcique de neurones uniques et du comportement de vers se déplaçant librement en conditions standard de laboratoire. J'ai pu montrer que les mouvements de recul spontanés de C. elegans reflètent précisément l'activité calcique des neurones de commande AVA. Par ailleurs, j'ai pu détecter des pics d'activité calcique spontanés des neurones mécanosensoriels PLM lors du déplacement libre du ver corrélés à de courtes phases d'accélération de l'animal.

Ce travail est consacré à l'étude de la diffusion de la lumière dans les tissus biologiques, en vue du développement d'une méthode de biopsie optique pour la détection précoce du cancer des organes creux. D'un point de vue théorique nous avons développé un modèle permettant de rendre compte de la diffusion de la lumière dans un système multistratifié, hétérogène, diffusant, dont la géométrie est proche de celle des tissus biologiques. Ce modèle est basé sur la résolution de l'Equation de Transfert Radiatif Vectorielle (ETRV) par la méthode des Ordonnées Discrètes. Il permet de calculer la répartition angulaire et les variations spectrales de la lumière diffusée suivant différents états de polarisation. Nos simulations du processus de cancérisation à l'intérieur d'un tissu épithélial ont montré que l'on peut espérer distinguer un tissu sain d'un tissu cancéreux à partir de l'analyse de l'intensité et de l'état de polarisation de la lumière diffusée en fonction de sa direction de diffusion. L'élément morphologique discriminant étant le doublement de la taille du noyau des cellules, principal diffuseur de la lumière, dans le tissu dysplasique. D'un point de vue expérimental nous avons réalisé des mesures de diffusion de lumière sur des échantillons école (lait et intralipides) à l'aide d'un gonio-spectro-photomètre construit au laboratoire. Elles ont permis la validation de notre modèle. Dans la continuité de ces expériences nous avons étudié des tissus reconstitués dont les cellules présentaient des tailles de noyaux différentes et des peaux de souris dont l'une présentait vraisemblablement un début de tumeur. Les résultats de ces mesures sont en accord quantitatif (pour les tissus de culture) et qualitatif (pour les essais préliminaires sur la peau de souris) avec les prédictions du modèle. Ils sont encourageants pour poursuivre notre étude de la diffusion élastique de la lumière comme outil de diagnostic.