Dans l'objectif de développer une nouvelle activité dans le domaine des biocapteurs, nous avons mené les travaux de cette thèse qui portent sur la conception et la réalisation de nanostructures photoniques à bas de silicium poreux fonctionnalisé pour la détection du glucagon. Affin d'exploiter une transduction optique liée aux propriétés intrinsèques du silicium poreux et une bioréception immunologiqe basée sur l'affinité entre le glucagon et les anticorps monoclonaux spécifiques (Ac. Anti‐glucagon de type IgG1), nous avons réalisé une étude sur les conditions expérimentales d'élaboration de silicium poreux pour la mise en oeuvre d'un prtocole chimique permettant sa biofonctionnalisation. Nous avons aussi mis en place les outils nécessaires pour le suivi des étapes de fonctionnalisation de silicium poreux et préaré des structures photoniques multicouches fonctionnalisées. En effet, après avoir effectué une étude bibliographique sur les biocapteurs en général et les dispositifs optiques en particulier, nous avons opté pour une approche fondée sur l'utilisation d'une microcavité à miroir de Bragg dont la longueur d'onde de résoance est déplacée par la modification de son indice de réfraction due à la présence de l'espèce biologique à détecter. Pour cela nous avons tout d'abord développé un programme de simulation de spectres de réflectances de structures optiques à bae de silicium poreux. Ce programme calcule la réflectance d'une structure poreuse monocouche ou multicouche en appliquant le formalisme des matricesde transfert et ce à partir des indices de réfraction calculés à partir de la composition des milieux effectifs constitués par e silicium poreux (dont la porosité est modulée) remplis par l'espèce biologique étudiée. Cet outil nous a permis dans un premier temps de prévoir l'influence des paramètres structuraux, tels que le diamètre moyen des pores et la porosité, sur la sensibilité de la réponse spectrale de structures monocouches et multicouches (miroir de Bragg et microcavité) dans le suivi de la biofonctionnalisation de ces structures. Dans un deuxième temps, nous avons simulé la réflectance des monocouches de silicium poreux que nous avons élaborées par anodisation électrochimique ain de déterminer leur porosité. La caractérisation structurale de ces monocouches a été complétée par des observations au microscope électronique à balayage (MEB). La fonctionnalisation de ces couches de silicium poreux selon un procédé chimique comportant une étape de silanisation suivie ar une réaction de couplage aldéhyde et le greffage d'éléments immunologiques (anticorps‐antiglucagon) a été contrôlée par réflectométrie et spectroscopie RAMAN. Nous avons ainsi pu d'une part, vérifier la fixation des anticorps anti‐glucagon en volume d'une couche de silicium poreux de forte porosité (~ 90%) et d'autre part estimer le taux de recouvrement de la surface poreuse par ces biorécépteurs (0.4x1012 molécules d'IgG par cm²). Nous avons par la suite appliqué ce procédé de biofonctionnalisation aux microcavités conçue auparavant ce qui nous ont perms de confirmer dans certaines conditions l'efficacité du protocole chimique utilisé pour recouvrir la surface interne du matériu par des molécules organiques.

Cette thèse décrit la réalisation d’un nanocalorimètre dynamique différentiel pour l’étude de la transition vitreuse. Le capteur microfabriqué, la chaine de mesure de bas niveau de bruit et de grande stabilité, ainsi que l’environnement thermique du capteur sont décrits en détails. La méthode de mesure utilisée est une méthode fréquentielle dans laquelle l’amplitude et la phase de la température oscillante sont mesurées avec une grande résolution. La résolution du nanocalorimètre sur le module de la capacité calorifique complexe est de ∆|C_p^* |/|C_p^* |  ± 0,001 %, et sur la phase de l’oscillation de température est de ∆φ/φ  ± 0,0005 %. La résolution est environ mille fois plus élevée que celle des calorimètres à modulation de température commerciaux. Les potentialités du nanocalorimètre pour l’étude d’effets thermodynamiques et cinétiques fins sont démontrées sur un modèle de polymère vitreux, le poly(acétate de vinyle). Des effets nouveaux et trop tenus pour être détectés avec des calorimètres classiques ont été mesurés. Le module de la capacité calorifique complexe et la phase de l’oscillation de température présentent des relaxations temporelles de faible variation dans l’état de liquide surfondu comme dans l’état vitreux. De plus, le dégel des degrés de libertés internes structuraux du polymère peut, suivant l’histoire thermique suivie par le matériau, se réaliser en deux étapes lors du réchauffement. Ce double dégel n’est visible que sur la dérivée en température du module de la capacité calorifique complexe. En conclusion, la résolution, la stabilité et la répétabilité du nanocalorimètre sont particulièrement adaptées à des mesures nanocalorimétriques fines pour l’étude thermodynamique et cinétique de systèmes complexes hors équilibres dont les verres font partie. / This thesis reports the working principle and the building up of a dynamic differential nanocalorimeter to the study of the glass transition. The micro-fabricated sensor, the low noise and highly stable measurement chain, as well as the thermal environment of the sensor are described in details. The measurement method is a spectroscopic method in which the amplitude and phase of the oscillating temperature are measured with a high resolution at different frequencies. The resolution of the nanocalorimeter on the measurement of the complex heat capacity module is ∆|C_p^* |/|C_p^* |  ± 0,001 %, and on the phase of the temperature oscillation is ∆φ/φ  ± 0, 0005 %. This resolution is about one thousand times higher than that of the commercial temperature modulated calorimeters. The potentialities of the nanocalorimeter for the study of fine thermodynamic and kinetic effects are demonstrated on a model of glassy polymer, the poly(vinyl acetate). New effects which are too fine to be detected by conventional calorimeters have been measured. The modulus of the complex heat capacity and the phase of the temperature oscillation exhibit small relaxational effects of low amplitude either in the super-cooled liquid state or in the glassy state. In addition, according to the thermal history followed by the material, the structural recovery of this polymer can take place in two steps during the heating. These two steps are visible only on the temperature derivative of the modulus of the complex heat capacity. In conclusion, resolution, stability and repeatability of the nanocalorimeter are particularly suitable for fine thermodynamic and kinetic study on out of equilibrium complex systems such as glasses.

L’utilisation de détergents est inévitable pour les études structurales des protéines membranaires. Dodecylphosphocholine (DPC) est un des détergents les plus utilisés pour ce type d’études employant la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) en solution. L’effet des détergents sur la structure et la dynamique des macromolécules est une problématique importante, mais peu étudiée à ce jour. Dans cette étude nous avons caractérisé la dynamique à l’échelle de la milliseconde, la liaison des substrats ainsi que des propriétés structurales de trois protéines membranaires différentes solubilisées dans des micelles de DPC. Ces protéines font partie de la famille des transporteurs mitochondriaux et nous avons choisi les séquences de la levure (ORC1, GGC1, AAC3). Nous avons détecté de la dynamique à l’échelle de la milliseconde qui est distribuée d’une manière asymétrique à travers la structure. En contradiction avec des propos de la littérature, nous montrons que cette dynamique n’est pas corrélée à la fonction, puisqu’elle n’est pas modifiée par des mutations qui inhibent le transport effectué par ces protéines quand elles sont reconstituées dans des liposomes. En plus, nous avons pu montrer que leur spécificité par rapport aux substrats, n’est pas conservée quand ces transporteurs sont reconstitués dans du DPC, mettant en question leur fonctionnalité dans ce détergent. La RMN a aussi permis de démontrer que les structures tertiaire et secondaire sont perturbées dans les micelles avec quelques hélices transmembranaires apparaissant exposées au solvant. Nous avons donc conclu que la présence du détergent a un effet fort sur les trois transporteurs mitochondriaux de notre étude et probablement d’autres protéines similaires, en les rendant très flexible. Nos résultats indiquent un probable effet général de ce détergent sur les protéines membranaires, comme nous le discutons dans une analyse détaillée de quelques études de protéines membranaires décrites dans la littérature. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons adressé une question fondamentale de la dynamique des protéines: comment se comportent les protéines dans des cristaux ? Nous avons étudié la dynamique de l’ubiquitine cristalline à l’échelle de la milliseconde afin de comprendre l’influence de la maille cristalline sur ce type de mouvement. Pour ce faire, nous avons employé la RMN à l’état solide et des simulations de dynamique moléculaire de la protéine dans différents réseaux cristallins distincts. Il est intéressant à noter que dans ces cristaux on détecte toujours des processus locaux d’échange dynamique sur une échelle de temps de la milliseconde. Cependant, en comparant les résultats obtenus avec différentes formes cristallines, nous constatons que les paramètres thermodynamiques des différents états en échange et les vitesses d’interconversion entre ces dernières sont significativement modifiés par les contacts cristallins. De plus, nous avons détecté des mouvements globaux de type «rocking» des ces molécules à l’état cristallin qui surviennent également à l’échelle de la milliseconde. Ceci suggère que les mouvements globaux et locaux sont corrélés. Cette observation ouvre la discussion de l’importance de ce type de mouvements pour la qualité et l’interprétation des données des expériences de diffraction des rayons-X. / The use of detergents is often unavoidable in the structural studies of membrane proteins. Dodecylphosphocholine (DPC) is one of the most commonly used detergents for such studies in solution state NMR spectroscopy. The effect of detergent on structure and dynamics remains an important and poorly understood question. In this study we have investigated millisecond dynamics, substrate binding and structural features of three different yeast proteins from mitochondrial carrier family (GGC1, ORC1 and AAC3) in DPC micelles. We have detected millisecond dynamics, which are asymmetrically distributed across the structure. Contrary to previous claims, we show that these dynamics are unrelated to function, as they are not affected by the substitutions which abolish mitochondrial carrier transport in proteoliposomes. Furthermore, we could show that the very well-defined substrate specificity of these proteins in membranes is abolished when they are reconstituted in DPC, questioning their functionality. Structural investigations have revealed that both tertiary and secondary structures of these carriers are perturbed in DPC micelles, with some TM helices showing substantial solvent exposure. We have concluded from these observations that DPC detergent strongly perturbs these, and likely other mitochondrial carriers by rendering them very flexible. Our findings point to a possibly general effect of this detergent on membrane proteins, as we discuss with examples of previously studied membrane proteins. In the second part we have addressed a fundamental question of protein dynamics: how do proteins move inside crystals? We have investigated ms dynamics in a crystalline ubiquitin to gain the insight on the impact of the crystalline lattice on such motions, using solid-state NMR and ms long MD simulations of explicit crystal arrangements. Interestingly a local dynamic exchange process on a ms time scale is still present in crystals. However, by comparing different crystal forms we establish that the thermodynamics of the exchanging states and their interconversion rate constants are significantly altered by the crystal contacts. Furthermore, we detect overall "rocking" motion of molecules in the crystal, occurring on a tens-of-ms time scale, and provide evidence that overall and local motion are coupled. We discuss the implications of ms dynamics on the data quality in X-ray diffraction experiments.

Le moteur flagellaire bactérien (BFM) est un complexe moléculaire qui permet aux bactéries de nager dans un milieu liquide. La rotation du moteur est générée à l’interface entre deux éléments clés: les protéines formant le stator (MotA and MoB) et l’anneau C “switching complex” à la base du rotor. Les stators sont des modules du moteur structurellement et fonctionnellement différentiables du reste du moteur, et leurs association et dissociation dynamique autour du rotor contrôle la génération du couple. Quand une protéine fluorescente (PF) est fusionnée à MotB, le moteur est en état de marche mais une réduction générale de la mobilité de la cellule a été observée. La raison précise d’une telle réduction de mobilité n’a pas été étudiée.Le but de cette étude est de comprendre comment la fusion PF de la protéine du stator modifie la génération du couple et le sens de rotation du moteur. C’est particulièrement important car le tag FP se trouve à l’interface entre le stator et le rotor, là où le couple et le changement du sens de rotation sont produits. Trois différentes PFs (eGFP, YPet, Dendra2) ont été fusionnées à la protéine MotB. Malgré la haute similarité de leurs structures, notre analyse a montré que les trois stators fusionnés génèrent des couples différents. Les stators marqués avec YPet produisent un couple moyen similaire au WT (stators sans tag PF), alors que les stators marqués avec eGFP et Dendra2 produisent respectivement 70% et 40% du couple moyen du WT. De plus, les moteurs utilisant les stators fusionnés ont montré des capacités de changement de sens de rotation réduites. Lors d’un changement de sens de rotation, la valeur absolue de la vitesse des moteurs WT ne change pas. Cette “symétrie” de vitesse lors du changement n’apparaît pas avec les moteurs à stators fusionnés et le changement peut être accompagné d’une importante diminution (~30%) de la vitesse absolue.En observant par microcopie TIRF avec détection de molécules uniques, des stators marqués dans un moteur en état de marche, les signaux de fluorescence sont détectés à la membrane comme prévu pour ces protéines, montrant une population de stators diffusant dans celle-ci. Les clusters fluorescents étaient visibles au centre des cellules en rotation, attachés au couvre-glace par une seule flagelle, confirmant que le tag de fluorescence peut être visualisé dans des moteurs en état de marche. Dans un second projet développé dans le laboratoire Bertus Beaumont à TU Delft, en prenant le BFM en tant que système modèle d’évolution expérimentale, sa modularité et son « évolubilité » ont été explorés pour apprendre les détails au niveau moléculaire de l’évolution de ce type de machine. Les stators de E.coli ont été échangés par un set de 21 stators étrangers homologues. L’expérience a révélé que les protéines du stator peuvent être échangées entre espèces de bactéries distantes et certains stators non compatibles peuvent être modifiés positivement par un procédé d’évolution pour devenir fonctionnels. Au cours de cette évolution, les bactéries ont accumulé des mutations avantageuses dans leurs gènes MotA et MotB étrangers, tout particulièrement dans leur domaine fonctionnel. Des mutations identiques dans des stators différents ont été observées, indiquant que l’évolution peut se reproduire. L’analyse fonctionnelle au niveau d’un seul moteur a révélé que ces mutations avantageuses amélioraient la génération du couple et/ou la capacité du moteur à changer de sens. Les investigations détaillées du génotype et du phénotype du BFM modifié par évolution apportés par cette étude, pourraient donner une idée sur la façon dont des machines moléculaires comme le BFM ont évolué, et les effets fonctionnels des mutations bénéfiques qui facilitent l'intégration fonctionnelle. / The bacterial flagellar motor (BFM) is the macromolecular complex which allows bacteria to swim in liquid media. Located at the base of the flagellum, anchored in the cell membrane, this remarkably small (~45nm) yet powerful rotary motor rotates each flagellum of the cell switching between counterclockwise (CCW) and clockwise (CW) direction. The motor rotation is generated at the interface between the two key components of the motor: the stator protein complexes (each composed of 4 MotA and 2 MotB proteins) and the C- ring protein complex at the base of the rotor. The stator complexes are structurally and functionally discernible modules of the motor, and their dynamical association and dissociation around the rotor controls the generation of torque.The first project of this study aims to investigate how the FP tag on the stator protein modifies the torque generation and switching of the motor. This is particularly important because the fluorescent protein tag lies at the interface between stator and rotor, where torque and switching are produced. Three different FPs (eGFP, YPet, Dendra2) were fused to MotB. Interestingly, despite the high similarity of their structures, our analysis revealed that the three fusion stators generate different torque. Furthermore, in the presence of fusion stators, the motor showed significantly impaired switching abilities. When switching direction of the rotation, the absolute value of the speed of WT motors does not change, whereas this symmetry of speed upon switching is not observed in the fusion stator motors, and switching can be accompanied with a significant (~30%) decrease in absolute speed. Both the impaired torque generation and the switching ability were improved by introducing a rigid linker between the stator and the FP tag. Taken together, this study provides a further insight into the dynamics of the stator and rotor interaction at its interface.When the cells carrying the fluorescently labeled stators were observed in a custom made TIRF-fluorescence microscope with single molecule capability, the fluorescence signals were detected as concentrated clusters in the membrane as expected for these membrane proteins around the motors, together with a population of stators diffusing in the membrane. Fluorescent clusters were visible at the center of rotating cells tethered to the glass slide by a single flagellum, confirming that the fluorescent tags can be visualized in functioning motors.In a second project developed in Bertus Beaumont lab at TU Delft, taking BFM as an experimental evolutionary model system, its modularity and evolvability have been explored to learn the molecular details of the evolution of molecular machines. The stators of E.coli have been exchanged by a set of 21 homologue foreign stators. The experiments revealed that the stator proteins can be exchanged between distant bacteria species, and some of the non-compatible stators can be positively modified by evolution to become functional. Those evolved strains accumulated beneficial mutations in their foreign motA and motB genes, especially on their functional domains. Identical mutations in different stators were common, indicating that evolution is repeatable. The functional investigation at the single motor level revealed that those beneficial mutations improved the torque generation and/or the switching ability of the motor. The detailed genotype and phenotype investigations of the evolutionary modified BFM may bring an insight into how molecular machines such as BFM have evolved as well as the functional effects of the beneficial mutations that facilitate functional integration.

L’objectif de mon travail de thèse a été de caractériser l’adhésion de vésicules géantes lipidiques et de cellules vivantes. Dans le but d’obtenir des informations quantitatives sur l’adhésion, j’ai développé deux techniques de nanoscopie de fluorescence basées sur la microscopie TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). Cette technique repose sur création d’une onde évanescente à proximité d’une interface. J’ai développé pour cela un montage optique, qui permet de contrôler finement les caractéristiques de l’onde évanescente (longueur d’atténuation, état de polarisation, etc.). L’adhésion des vésicules a été étudiée par nTIRF (TIRF normalisé) : les images TIRF sont normalisées par des images en épi-fluorescence. J’ai pu ainsi caractériser l’adhésion non spécifique (interaction électrostatique) et spécifique (interaction biotine-streptavidine) de vésicules sur différentes surfaces fonctionnalisées. Pour quantifier l’adhésion des cellules, j’ai utilisé l’approche VA-TIRF (TIRF à angle variable). Cette dernière consiste à enregistrer une série d’images en régime évanescent à différents angles d’incidence. Ceci nous a permis d’établir une cartographie des distances entre la membrane ventrale d’une cellule et la surface pour différents comportements d’adhésion initiés sur divers substrats : chimiques ou protéiques. Ces deux techniques permettent de mesurer la distance membrane-surface avec une précision nanométrique, ≈20nm, ce qui est particulièrement adapté à l’étude du processus d’adhésion / The aim of my thesis was to characterize the adhesion of Giant Unilamellar Vesicles and living cells. In order to obtain a quantitative information about the state of the adhesion, I developed two fluorescence nanoscopy techniques based on microscopy TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). This technique consist of creating an evanescent wave in the vicinity of an interface. I developed the experimental setup, which allows an accurate control of characteristics of the evanescent wave (penetration depth, polarization state, etc.). The vesicles adhesion was studied by nTIRF (normalized TIRF). TIRF images are normalized by epi-fluorescence images. I was able to characterize the nonspecific adhesion (electrostatic interaction) and specific adhesion (biotin-streptavidin interaction) of vesicles on different functionalized surfaces. To quantify the adhesion of cells, I used the VA-TIRF approach (variable angle TIRF). The latter is to record a series of images at different angles of incidence in the evanescent regime. This allowed us to map the distances between the ventral membrane of a cell and the surface for different adhesion behaviors initiated on various substrates: chemical or protein. These two techniques permit to measure the membrane surface-distance with the nanometer precision ≈20nm, which is particularly suitable for the study of the adhesion process

La relation entre le repliement du génome et les processus cellulaires majeurs, notamment la transcription, la réparation de l’ADN et la réplication est une question biologique centrale. De nouvelles méthodes de la génomique ont révélé un niveau inconnu de l’architecture tridimensionnelle de la chromatine. A l’échelle en dessous de la mégabase, certaines séquences génomiques se trouvent préférentiellement à proximité les unes des autres formant ainsi des domaines topologiques associés (TAD). Les gènes situés dans le même TAD ont des propriétés épigénétiques similaires, et leur expression au cours de la différentiation semble corrélée, ce qui suggère un lien fort entre la structure de la chromatine et la transcription. Les TADs sont à leur tour séparés par des régions avec peu de contacts, appelées frontières, qui sont généralement occupées par des protéines dites isolatrices. Les déterminants de cette organisation chromatinienne particulière et ses implications fonctionnelles sont largement méconnus. Selon une hypothèse récente, les TADs seraient formés par des contacts entre les séquences des frontières, stabilisés par la formation de boucles via les protéines isolatrices. Les travaux présentés ici ont pour but d’étudier le rôle des protéines isolatrices dans le mécanisme de formation des TADs chez la drosophile. La microscopie super-résolue a été implémentée et une série de développements ont été réalisés en microscopie à illumination structurée (SIM) et la microscopie à localisation de molécules uniques (SMLM), avec une attention particulière sur le marquage fluorescent. Ces développements ont directement été appliqués à l’étude de l’organisation nucléaire de la protéine associée aux éléments frontières (BEAF), une des 11 protéines isolatrices identifiées à ce jour chez la drosophile. Le fort enrichissement aux frontières des TADs, ainsi que son activité dans la formation de boucles d’ADN font de BEAF un candidat intéressant pour tester l’hypothèse de regroupement de frontières comme mécanisme général de repliement de la chromatine. La technique SMLM multi-couleurs a systématiquement localisé BEAF à la périphérie des larges domaines portant la marque épigénétique H3K27me3. L’analyse quantitative des images SMLM a révélé que BEAF forme des centaines de foyers d’une taille de 45 nm, composés en moyenne de 5 molécules, ce qui est en désaccord avec la présence de boucles de chromatine à large échelle. Afin de tester le regroupement de gènes directement au niveau de l’ADN, des frontières ont été marquées par des oligonucléotides fluorescents. Le nombre de foyers détectés par SIM s’est à nouveau révélé incompatible avec le modèle de contacts entre les frontières tout le long du génome. Par ailleurs, les distances entre paires de frontières au niveau de deux régions génomiques ont montré <5% de contacts. Ensemble, ces résultats sont en désaccord avec l’établissement d’interactions entre barrières chez la drosophile. Enfin, ces travaux de thèse ont contribué au développement méthodologique de la microscopie super-résolue, ce qui a permis d’apporter des preuves expérimentales invalidant le modèle de regroupement des frontières comme mécanisme général du repliement chromatinien. / The interplay between genome folding and key cellular functions such as transcription, DNA repair and replication is a fundamental question in chromatin biology. Recent genome-wide developments unveiled a new level of three-dimensional chromatin architecture. At the sub-megabase scale, some genome sequences are preferentially found in proximity with one another forming Topologically Associating Domains (TADs). Genes located within the same TAD display common epigenetic properties and tend to have coordinated dynamics of expression during differentiation, suggesting a strong link between chromatin structure and transcription. TADs are in turn separated by regions of low contact, termed TAD borders, which are generally occupied by factors called chromatin insulators. What are the determinants of this particular type of chromatin organization and what are the functional implications is still largely unknown. In an emerging hypothesis, TADs could be formed through contacts between TAD border sequences stabilized by the looping activity of insulator proteins. This thesis investigates the roles of insulator proteins in the TAD formation mechanism using Drosophila melanogaster as model system. Superresolution imaging was implemented and a series of developments were performed in Structured Illumination Microscopy (SIM) and Single-molecule Localization Microscopy (SMLM), with particular attention on fluorescent labeling for single-molecule detection. These developments were directly applied to study the nuclear organization of the Boundary Element Associated Factor (BEAF), one of the 11 insulator proteins discovered to date in Drosophila. The strong enrichment on TAD borders and its demonstrated looping activity make BEAF a potent candidate to test for the clustering of TAD borders as a general mechanism of chromatin folding. Multicolor SMLM systematically located BEAF foci at the periphery of large H3K27me3 chromatin domains. Quantitative analysis of SMLM images indicated BEAF forms hundreds of 45 nm foci, containing a mean of 5 molecules, which argues against a large-scale looping of BEAF-bound chromatin. To directly probe for gene clustering at the DNA level, TAD borders were labeled using fluorescent oligonucleotide probes. The number of foci detected by SIM was once more incompatible with a model of chromosome-wide contacting of multiple TAD borders. Furthermore, TAD border pairs distances were measured in two genomic regions, resulting in <5% of paired contacts among the measured barriers. Taken together, these results are inconsistent with constitutive interactions between consecutive or non-consecutive barriers in Drosophila.In conclusion, this study contributed to the methodological development of super-resolution microscopy which was applied to provide experimental evidence invalidating the TAD border clustering model as a general mechanism of chromatin folding.

Cette thèse concerne l'étude des propriétés de migration et de détachement de lignées cancéreuses du cancer du sein de type mésenchyme, très métastatique et invasif (MDA-MB-231), ou au contraire de type épithélial et peu invasif (MCF-7). Des techniques de vidéomicroscopie et d'analyse d'images automatisées ont été utilisées afin de tirer des informations sur la dynamique cellulaire sur de grandes populations. Nos expériences sur la migration aléatoire des cellules MDA-MB-231 montrent que les propriétés de déplacement de celles-ci sont liées à la fois à la composition de leur milieu environnant, mais aussi à la nature et la quantité de protéines d'adhésion. Nous avons notamment mis en évidence un comportement biphasique de la distance migrée au cours du temps en fonction de la densité de protéines adsorbées sur des surfaces pour deux types de protéines d'adhésion (collagène type IV et fibronectine). Selon le type de protéines d'adhésion, nous avons également mis en évidence un phénotype cellulaire très différent en termes de forme, d'adhésion et de mode de déplacement. Nous avons ensuite utilisé ces résultats pour mettre en place un protocole de migration dirigée de cellules cancéreuses dans un gradient chimiotactique généré par un système microfluidique. Ainsi, en faisant varier les paramètres du système (protéines de surface, concentration maximale en chimioattractants, …), nous avons pu caractériser les bonnes conditions d'obtention de la migration dirigée. Pour finir, nous avons montré la faisabilité d'un tri cellulaire entre cellules de type mésenchyme et épithéliales en utilisant la chimiotaxie à partir de ces systèmes / This thesis investigates migration and detachement properties of different types of breast cancer cell lines : metastatic, invasive MDA-MB-231 and epithelial, low-invasive MCF-7 celles. Videomicroscopy and image analysis techniques were used to obtain dynamic information for large cell populations. Random migration assays performed on MDA-MB-231 cells reveal that their migration properties are related to both medium and surface (substrate adhesion protein type and quantity) conditions. A biphasic behavior for the migrated distance through time was observed to be dependent on the density of adsorbed protein (collagen type IV or fibronectin) on the substrate. Cell shape, detachement and moving properties were also computed as a function of the surface protein characteristics. These results were then used to perform directed migration assays in a chemotactic gradient generated in a microfluidic chamber. Optimal conditions for directed migration of cells were determined by varying the parameters of the system such as gradient maximum concentration, substrate adhesion protein… Lastly, it was experimentally proved that it is possible to separate cancer epithelial cell lines from mesenchymal ones by using chemotactic microfluidic chambers

Comprendre la dynamique des populations marines est essentiel à une gestion efficaceet requiert des connaissances sur la dispersion et la connectivité entre populationsqui sont encore très lacunaires. Beaucoup d’organismes marins ont un cycle de viebipartite avec une phase larvaire pélagique qui représente souvent la seule possibilitéde dispersion. De nouvelles techniques de mesure de la dispersion larvaire, parmarquage ou modélisation, ont été développées durant ces quinze dernières années.Cependant, les résultats de ces deux types d’approches ont rarement été comparésau sein d’un même système marin, limitant l’utilisation des modèles de dispersiondans les modèles de métapopulation. Dans cette thèse, nous utilisons ces deux typesd’approches pour étudier la connectivité larvaire d’un poisson de récif corallien,Dascyllus aruanus, dans le lagon sud-ouest de Nouvelle-Calédonie. Notre modèle dedispersion montre que la rétention larvaire présente une variabilité temporelle élevéeà l’échelle lagonaire et à l’échelle d’un patch de récif, et atteint périodiquement desvaleurs élevées malgré des temps moyens de résidence courts. Le marquage artificieltransgénérationnel des otolithes montre des taux d’auto-recrutement relativementbas à l’échelle de la saison reproductive, suggérant une ouverture importante despopulations, et une variabilité temporelle considérable de l’auto-recrutement. Enfin,les grandes différences entre les résultats du modèle et ceux des marquages appuientle besoin de mieux comprendre les processus qui facilitent la rétention larvaire commeles comportements de homing et la circulation des courants à très petite échelle. / Understanding marine populations dynamics is critical to their effective management,and requires information on patterns of dispersal and connectivity that are still poorlyknown. Many marine organisms have a bipartite life history with a pelagic larvalstage that often represents the only opportunity for dispersal. In the last decade,new empirical and simulation approaches to measuring larval dispersal have beendeveloped, but results from these two different approaches have rarely been comparedin the context of a single marine system, impeding the use of larval dispersal modelsin metapopulation models supporting decision making. In this doctoral research, weused both approaches to investigate larval connectivity for a coral reef fish, Dascyllusaruanus, in the South-West Lagoon of New Caledonia. Our biophysical dispersalmodel shows that larval retention exhibits considerable temporal variability at bothlagoon and patch reef scales and periodically reaches large values despite low averagewater residence time. Artificial transgenerational marking of embryonic otoliths inthe wild also showed relatively low self-recruitment rates indicating high populationopenness at the reproductive season scale, with considerable monthly variability ofself-recruitment. Large quantitative discrepancies between simulations and empiricalresults emphasize the need to better understand processes that facilitate local retention,such as homing behavior and very small scale circulation patterns.

La procédure de Ross: Propriétés biomécaniques de l'artère pulmonaire en fonction du phénotype valvulaire aortique Pierre Olivier Dionne, Evan Wener, Alexander Emmott, Raymond Cartier, Rosaire Mongrain, Richard Leask et Ismail El-Hamamsy OBJECTIFS: Le but de cette étude est de déterminer si les propriétés des artères pulmonaires des patients bénéficiant d'une procédure de Ross ayant une valve aortique bicuspide sont différentes que celles des patients ayant une valve aortique tricuspide. MÉTHODOLOGIE: Trente-deux artères pulmonaires et 20 aortes ont été prélevées chez des patients subissant une procédure de Ross au moment de la chirurgie, dans une cohorte de 32 patients. L'analyse histologique et l'étude tensile equi-biaxiale ex-vivo complétées dans les 8 heures suivant le prélèvement furent utilisées afin d'évaluer les différences entre les groupes de patients et entre les artères pulmonaires et les aortes ascendantes. RÉSULTATS: Il n'y avait aucune différence d'épaisseur au niveau des artères pulmonaires lorsque comparées en fonction du phénotype valvulaire aortique (P = 0.94). Il n'y avait aucune différence au niveau des propriétés tensiles parmi les aortes et les artères pulmonaires lorsque comparées en fonction du phénotype valvulaire. Lorsque comparées en fonction de leur indication chirurgicale, les artères pulmonaires de patients ayant une régurgitation aortique pure étaient moins rigides que leur contre-partie (P = 0.002). Il n'y avait aucune différence au niveau du nombre de lamelles élastiques entre les spécimens d'artère pulmonaire en fonction du phénotype valvulaire aortique (Tricuspide, bicuspide ou unicuspide), ni entre les spécimens aortiques. CONCLUSION: Aucune différence significative ne fut observée au niveau des propriétés biomécaniques des artères pulmonaires lorsque comparées selon leur phénotype valvulaire aortique associé. / The Ross procedure: biomechanical properties of the pulmonary artery according to aortic valve phenotype Pierre Olivier Dionne, Evan Wener, Alexander Emmott, Raymond Cartier, Rosaire Mongrain, Richard Leask and Ismail El-Hamamsy OBJECTIVES: The aim of this study is to determine whether patients undergoing the Ross procedure with bicuspid aortic valves have different pulmonary artery biomechanical properties from those with tricuspid valves. METHODS: Thirty-two pulmonary arteries and 20 aortas were obtained from patients undergoing the Ross procedure at the time of surgery, from a cohort of 32 patients. Histological analysis and ex vivo equi-biaxial tensile testing completed within 8 hours of surgery were used to evaluate differences in patient groups and between the pulmonary artery and the ascending aorta. RESULTS: There was no difference in thickness among pulmonary arteries when compared according to aortic valve phenotype (P = 0.94). There was no difference in the tensile tissue properties among aortas and pulmonary arteries when compared according to aortic valve phenotype, in either the circumferential or longitudinal axis. When compared according to the main surgical indication, pulmonary artery walls from patients with pure aortic regurgitation were less stiff than their counterparts (P = 0.002). There was no difference in the number of elastic lamellae in pulmonary artery specimens from the three different aortic valve phenotypes (Tricuspid, bicuspid or unicuspid), as well as in the aortic specimens. CONCLUSION: No significant differences were observed in the biomechanical properties of pulmonary arteries when compared according to aortic valve phenotype.

Les marches aléatoires avec recherche de cible peuvent modéliser des réactions nucléaires ou la quête de nourriture par des animaux. Dans cette thèse, nous identifions des stratégies qui minimisent le temps moyen de première rencontre d’une cible (MFPT) pour plusieurs types de marches aléatoires. Premièrement, pour des marches symétriques ou avec biais, nous déterminons la distribution des temps de première sortie par une ouverture dans une paroi en forme de secteur angulaire, d’anneau ou de rectangle. Nous concluons sur la minimisation du MFPT en termes de la géométrie du confinement. Deuxièmement, pour des marches alternant entre diffusions volumique et surfacique, nous déterminons le temps moyen de première sortie par une ouverture dans la surface de confine- ment. Nous montrons qu’il existe un taux de désorption optimal qui minimise le MFPT. Nous justifions la généralité de l’optimalité par l’étude des rôles de la géométrie, de l’adsorption sur la surface et d’un biais en phase volumique. Troisièmement, pour des marches actives composées de phases balistiques entrecoupées par des réorientations aléatoires, nous obtenons l’expression du taux de réorientation qui minimise le MFPT en géométries sphériques de dimension deux ou trois. Dans un dernier chapitre, nous modélisons le mouvement de cellules eucaryotes par des marches browniennes actives. Nous expliquons pourquoi le temps de persistance évolue expo- nentiellement avec la vitesse de la cellule. Nous obtenons un diagramme des phases des types de trajectoires. Ce modèle minimal permet de quantifier l’efficacité des processus de recherche d’antigènes par des cellules immunitaires. / Random search processes can model nuclear reactions or animal foraging. In this thesis, we identify optimal search strategies which minimize the mean first passage time (MFPT) to a target for various processes. First, for symmetric and biased Brownian particles, we compute the distribution of exit times through an opening within the boundary of angular sectors, annuli and rectangles. We conclude on the optimizability of the MFPT in terms of geometric parameters. Second, for walks that switch between volume and surface diffusions, we determine the mean exit time through an opening inside the bounding surface. Under analytical criteria, an optimal desorption rate minimizes the MFPT. We justify that this optimality is a general property through a study of the roles of the geometry, of the adsorption properties and of a bias in the bulk random walk. Third, for active walks composed of straight runs interrupted by reorientations in a random direction, we obtain the expression of the optimal reorientation rate which minimizes the MFPT to a centered spherical target within a spherical confinement, in two and three dimensions. In a last chapter, we model the motion of eukaryotic cells by active Brownian walks. We explain an experimental observation: the persistence time is exponentially coupled with the speed of the cell. We also obtain a phase diagram for each type of trajectories. This model is a first step to quantify the search efficiency of immune cells in terms of a minimal number of biological parameters.