Orientador : Prof. Dr. Diogo R. Bazan Ducatti / Coorientadores : Prof. Dr. Miguel Daniel Noseda, Prof. Dr. Alan Guilherme Gonçalves / Sem cópia digital / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 20/03/2015 / Inclui referências : f. 120-134 / Resumo: As carragenanas são polissacarideos extraídos da matriz extracelular de algas vermelhas, pertencentes a família das galactanas sulfatadas, muito utilizadas na indústria alimentícia como espessante, gelificante, estabilizadora de viscosidade e textura. A odificação química de polissacarideos pode alterar caracteristicas fisico-químicas agregando-lhes valor economico. Dentre essas modificações, a oxidação seletiva e de grande interesse porque gera acidos poliuronicos com ampla aplicação na indústria como, por exemplo, na geleificação, complexação, antifloculação, adesão, bem como uma serie de atividades biológicas, como a atividade anticoagulante. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo principal oxidar seletivamente as carragenanas kappa-, iota-, theta-, lambda- e o hibrido iota/nu em diferentes proporcoes utilizando o catalisador N-oxil-2,2,6,6-tetrametilpiperidina (TEMPO) e o co-oxidante acido tricloroisocianurico (TCCA) em solução aquosa tamponada em pH 9,6 para produzir uma carboxila no carbono C6 da unidade monossacaridica (¨3)-ƒÀ-D-alactopiranose. Inicialmente, foi realizado um estudo da reacao de oxidacao seletiva utilizando a kappa-carragenana como substrato e variando os equivalentes de TCCA (0,2; 0,5; 1; 2 e 3). As reacoes foram analisadas atraves de Ressonancia Magnética Nuclear (RMN) 1H indicando a entrada do grupo carboxila de acordo com o aumento do número de equivalentes. Assim, foram realizadas oxidações com 3 equivalentes de TCCA, por 15 horas ou por 2 horas. Foram obtidas oito frações a partir das carragenanas com diferentes graus de oxidação: ƒÈOT, ƒÇ/ƒËOT, ƒÇOP, ƒÇOT, ƒÆOP, ƒÆOT, ƒÉOP e ƒÉOT. Estas fracoes foram caracterizadas utilizando espectroscopia de infravermelho (FTIR) e RMN (1H, 13C e HSQC). Com os dados de literatura e mapas de correlação heteronucleares HSQC foi possivel realizar o assinalamento de RMN das diades produzidas apos a oxidação seletiva C6. A massa molecular relativa das carragenanas nativas e oxidadas foram determinadas utilizando tres curvas padrões de calibração. Análises cromatograficas em HPSEC-MALLS/IR foram utilizadas para a determinação de Mw. As análises revelaram diminuições em Mw após as oxidações e um aumento de solubilidade para a iota- e theta-carragenanas oxidadas, porem com maiores graus de oxidação observa-se diminuicao das taxas de recuperacao para as fracoes ƒÈOT, ƒÇ/ƒËOT, ƒÇOT, ƒÉOP e ƒÉOT sugerindo formação de agregados. As amostras nativas e oxidadas da theta-carragenana (ƒÆN, ƒÆOP e ƒÆOT) foram testadas por aPTT in vitro e apresentaram atividade anticoagulante dose-dependente em potencias diferentes. Os oxidados apresentaram uma potencia maior em relação ao biopolimero nativo, sendo a fracao com oxidação parcial (ƒÆOP) (80% de oxidaço) a que apresentou maior efeito anticoagulante. Palavras-chave: Polissacarideos, galactanas sulfatadas, carragenanas, oxidação seletiva. / Abstract: Carrageenans are polysaccharides extracted from extracellular matrix of red seaweeds that belong to the family of sulfated galactans. They are widely used in food industry as thickening, gelling and stabilizing agents. Chemical modifications of polysaccharides have been reported in order to improve physicochemical properties. The selective oxidation of sulfated polysaccharides can produce polyuronic acids derivatives with defined sulfation pattern and potential biological and technological application. Thus, the aim of this work is the selective oxidation of the kappa-, iota-, iota/nu, theta-, and lambda-carrageenan using 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (TEMPO) and trichloroisocyanuric acid (TCCA) in a carbonate buffer (pH 9.6). Initially, we performed a study of selective oxidation reaction using the kappacarrageenan as substrate and increased amounts of TCCA (0.2, 0.5, 1, 2 and 3 equivalents). The carboxyl group in the polysaccharide backbone was detected using 1H NMR. It was observed that the increase of TCCA amount gave higher oxidation rate in the carrageenan backbone. The preparative reactions were performed using 3 equivalents of TCCA for 2 or 15 hours to give the following fractions with different degree of oxidation: êOT (87%) (from kappa); é/íOT (>95%) (from iota/nu-), éOP (42%) and éOT (>95%) (from iota-); èOP (80%) and èOT (>95%) (from theta-) and ëOP (83%) and ëOT (>95%) (from lambda-). All the fractions were characterized by infrared spectroscopy (FTIR), 1H,13C and HSQC NMR. The anticoagulant activity of native and oxidized fractions of theta-carrageenan (èN, èOP and èOT) were determined by aPTT. The oxidized fractions showed better activity than native polysaccharide, indicating that selective oxidation increased the anticoagulant property. Keywords: Polysaccharides, sulfated galactans, carrageenans, selective oxidation, TEMPO, TCCA.

Coenzimas piridínicos desempenham papel fundamental relacionado à suas propriedades de óxido-redução. Assim, participam da cadeia respiratória, onde se situam, devido ao valor do potencial de óxido-redução do par, logo no início, sendo os primeiros intermediários entre certos substratos e oxigênio. Constituem-se também no primeiro local de síntese de ATP; muito importante, presumivelmente em conexão com a função respiratória, é de fato de os coenzimas piridínicos intervirem nos sistemas de algumas transhidrogenases. / Not available

Orientador : David Alexander Mitchell / Co-orientadores : Miguel Daniel Noseda e Luiz Fernando de Lima Luz Júnior / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 29/01/2010 / Bibliografia: f. 99-106 / A avaliação de espécies de microalgas, assim como a introdução de eficientes regimes de cultivo, meios de recuperação de biomassa e extração de lipídeos são necessários para viabilizar o uso destes organismos na produção de lipídeos como fonte de biocombustível. Neste trabalho foram primeiramente avaliadas diferentes metodologias de extração de lipídeos utilizando duas espécies de microalgas: Nannochloropsis oculata e Phaeodactylum tricornutum. Para isso foram realizadas diferentes adaptações do método de Folch et al. e do método de Bligh e Dyer, os quais são baseados no uso de uma mistura monofásica de clorofórmio, metanol e água. Esta avaliação indicou a metodologia de Bligh e Dyer adaptada como a mais eficiente e levou a seleção da microalga P. tricornutum para as etapas seguintes deste trabalho. Os efeitos do uso de agentes floculantes (NaOH e FeCl3) e soluções de lavagem (NaCl, NH4HCO3 e H2O) na recuperação de biomassa e teor lipídico foram então avaliados. Neste caso, o teor lipídico não foi afetado significativamente pelos processos testados. Levando em consideração simplicidade e baixo custo, foram selecionados o uso do floculante NaOH e da não utilização de solução de lavagem como processo geral de obtenção de biomassa. Como etapa final deste trabalho, foram avaliadas três diferentes maneiras de se cultivar a microalga P. tricornutum: cultivo em minifotobiorreator, cultivos em erlenmeyers de 2L (em regime de batelada e semicontínuo). Para o cultivo em minifotobiorreator, foram realizadas tentativas de cultivo e otimização do sistema e avaliação do efeito do bombeamento nas células. Neste caso não foram alcançadas condições definitivas para utilização deste sistema. Já o cultivo em regime de batelada foi avaliado em relação à concentração inicial de inóculo e fotoperíodo. As melhores condições encontradas foram então aplicadas a um regime de cultivo semicontínuo. De acordo com a comparação dos resultados obtidos, as condições de cultivo definidas neste trabalho foram regime semicontínuo, fotoperíodo de 24 h, concentração de inóculo na faixa de 30×10 elevado a 4 até 50×10 elevado a 4 cél.mL-¹ e taxa de diluição de 0,014 h-¹. / Evaluation of microalgae species as well as the introduction of efficient culture systems, biomass recovering and lipid extraction are necessary for the utilization of these organisms as biofuel source. In this work, we have first evaluated different lipid extraction methodologies on two microalgae species: Nannochloropsis oculata and Phaeodactylum tricornutum. Different adaptations from Folch et al. and Bligh and Dyer methods, which are based on a monophasic mixture of chloroform, methanol and water were tested for lipid extraction. This evaluation indicated the adapted Bligh and Dyer conditions as the most suitable method and led us to select P. tricornutum for the next steps of this work. The effect of the use of flocculant agents (NaOH and FeCl3) and washing solutions (NaCl, NH4HCO3 and H2O) on biomass and lipid content were also evaluated. In this case, the lipid content was not affected by the process utilized. Considering simplicity and low cost, we selected NaOH solution as flocculant and we chose to not utilize any washing step after biomass recovering. We also evaluated three different ways of culturing P. tricornutum: miniphotobioreactor culturing and two types of 2 L erlenmeyer culturing (batch and semicontinuous system). For miniphotobioreactor, culturing attempts and pumping effects were studied; however, definitive culture conditions could not be established. Batch cultures were evaluated in terms of initial cell density and photoperiod. Selected conditions were then applied for semicontinuous system. The overall results indicated that the best culturing conditions were semicontinuous system, 24 h photoperiod, 30×10 to the power of 4 to 50×10 to the power of 4 cel.mL-¹ initial cell density and 0.014 h-¹ renewal rate.

Orientadora : Sheila M. B. Winnischofer / Co-orientadora : Glaucia R. Martinez / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 11/02/2010 / Bibliografia: 91-103 / Resumo: O melanoma e um tipo de tumor que se origina dos melanocitos, sendo altamente resistente as terapias convencionais, especialmente quando se encontra em condicoes de metastase, o que torna necessario a busca por novas alternativas de tratamento. O processo de metastase, em geral, e facilitado pela acao das metaloproteinases de matriz (MMPs), que degradam a matriz extracelular, favorecendo a invasao. Entre os elementos que podem regular a atividade de MMPs esta RECK, uma glicoproteina ancorada a membrana celular. Tendo em vista que as estatinas sao drogas que inibem a sintese de colesterol e isoprenoides podendo interferir na composicao da membrana das celulas, e tambem que varios trabalhos relatam a acao antitumoral destas drogas, inclusive em linhagens celulares de melanoma, este trabalho avaliou o efeito do tratamento de celulas de melanoma humano (SK-MEL 28) com doses variadas de uma estatina (sinvastatina) em relacao aos niveis de RNAm de RECK (e suas isoformas alternativas de splicing), MMPs e TIMPs e aos processos de proliferacao e viabilidade celular. As analises de viabilidade celular (realizadas pelo metodo de cristal violeta) demonstraram que o tratamento com sinvastatina e capaz de provocar reducao de viabilidade das celulas SK-MEL 28, e que esta reducao e dose e tempo dependente. A analise do ciclo celular (realizada por citometria de fluxo) demonstrou a parada das celulas SK-MEL 28 em G1 com a concomitante diminuicao da quantidade de celulas na fase G2-S e o aumento da porcentagem de celulas na fase Sub-G1, apos 72h de exposicao as diferentes doses de sinvastatina. A analise dos perfis de expressao dos genes de interesse foi investigado atraves de ensaios de PCR quantitativo em Tempo Real. Os resultados indicam que nao ocorre modulacao da expressao da forma canonica de RECK (RECK-A) (tanto de mRNA como de proteina), tampouco das isoformas RECK-D e RECK-I apos o tratamento com o agente antitumoral. Ocorre diminuicao dos niveis de RNAm da isoforma B de RECK, apos o tratamento com 1 e 5ƒÊM de sinvastatina por 72h. Nas mesmas doses de sinvastatina observa-se uma tendencia a diminuicao da expressao de MMP-2, MMP-9 e MT1-MMP, embora nao seja estatisticamente significativa. Tambem ocorre tendencia a reducao da quantidade de transcrito de TIMP-1, ao passo que ha reducao significativa da expressao de TIMP-2 apos tratamento com 5ƒÊM de sinvastatina. Foi ainda verificado que as razoes entre as expressoes relativas de RECK-A/MMP-2 e RECK-B/MMP-2 aumentam significativamente quando as celulas SK-MEL 28 sao tratadas com 1ƒÊM de sinvastatina por 72h, sugerindo que o deslocamento do balanco proteolitico a favor de RECK pode contribuir para as acoes antitumorais exercidas pela sinvastatina. Nossos dados sugerem, ainda, que RECK-A e RECK-B sejam regulados de maneira distinta nas celulas de melanoma (pelo menos apos o tratamento com sinvastatina) e talvez a maior ou menor atividade de MMPs nas celulas possa ser devido a uma acao conjunta destas duas isoformas de RECK. Estas observacoes corroboram com os dados obtidos nesse trabalho que mostram uma tendencia evidente de diminuicao de expressao de todas as MMPs avaliadas (MMP-2, MMP-9 e MT1-MMP) apos o tratamento com a droga. / Abstract: Melanoma is a cancer that arises from melanocytes. In its early stages malignant melanoma can be cured by surgical resection, but once it has progressed to the metastatic stage it is extremely difficult to treat and does not respond to current therapies, being necessary the study for new therapeutic approaches to this disease. Matrix metalloproteinases (MMPs) show multiple functions as extracellular/cell surface enzymes, and are broadly recognized for their matrix-degrading ability and involvement in cell motility and invasion. The activity of MMPs is regulated by tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) and RECK (that’s encodes a membrane-anchored protein which suppresses invasion/metastasis by negatively regulating MMP-2, MMP-9 and MT1-MMP). Considering that statins (in addition to downregulating cholesterol levels) exert effects anti-inflammatory and anti-proliferative in several types of tumor cell lines, the main interest of this study was to correlate the action of a statin (specifically: simvastatin) with the modulation of mRNA levels of RECK, its alternative splicing isoforms, MMPs and TIMPs in the melanoma cell line (SK-MEL 28). The cell viability analysis (through crystal violet staining) shows that simvastatin treatment is able to reduction the cell viability in a dose and time dependent way. The effect of the simvastatin treatment in the cell cycle progression of SK-MEL 28 cells was evaluated by flow citometry. Our results show cell arrest in G1, reduction of percentage of cells in the G2-S phase and increased of percentage of cells in the Sub-G1 phase, after simvastatin treatment by 72h. In order to evaluate the molecular mechanism involved in the anti-proliferative effects of simvastatin in melanoma cells, we analyzed the mRNA expression profiles (through quantitative real time RT-PCR assays) of the RECK gene (canonical form and alternative isoforms, namely: RECK B, RECK D and RECK I), MMPs and TIMPs in SK-MEL 28 cells treated with simvastatin at 1ìM and 5ìM for 72h. The results show no modulation of the expression levels of RECK-A, RECK-D and RECK-I after simvastatin treatment. On the other hand, the RECK-B mRNA levels are significantly reduced upon treatment with 1 and 5ìM of simvastatin. The mRNA expression levels of MMP-2, MMP-9, MT1-MMP and TIMP-1 were not significantly altered. We also observed significantly reduced expression of TIMP-2 after treatment with 5ìM of simvastatin. In addition, the expression ratios RECK-A/MMP-2 and RECK-B/MMP-2 are significantly higher upon treatment with 1ìM of simvastatin by 72h. Our results suggest that RECK-B can be modulated in a distinct manner of the canonical form (RECK-A) after simvastatin treatment and, suggest that the control of MMPs activity could involved the synergistic action of both RECK isoforms (RECK-A and RECK-B) and TIMP-2.

Orientador : Prof. Dr. Marcello Iacomini / Co-orientadora : Drª Eliane R. Carbonero / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2008 / Inclui bibliografia / O presente trabalho teve por objetivo elucidar a estrutura química de alguns polissacarídeos presentes no basidioma de Pleurotus pulmonarius, bem como verificar os efeitos antinociceptivos e antiinflamatórios de uma manogalactana isolada e, analisar alguns parâmetros nutricionais. O corpo de frutificação do basidiomiceto seco, moído e deslipidificado foi submetido a extrações aquosas (a frio e a quente) e alcalina (KOH 1%). Os extratos aquosos foram primeiramente submetidos à precipitação com etanol, enquanto o extrato alcalino foi submetido a adição de ácido acético até pH 5,0. Os extratos polissacarídicos obtidos foram submetidos aos processos de purificação por congelamento e degelo, precipitação com solução de Fehling, ultrafiltração e diálise por membranas de diferentes porosidades, de maneira sequencial. A partir destes processos foram purificadas e caracterizadas diferentes estruturas. A fração MG obtida pela extração aquosa a frio apresentou-se pura e composta por manose, galactose e O-metil-galactose. Análises espectroscópicas e de metilação sugerem que essa molécula apresenta cadeia principal constituída de 3-O-Me-a-D-Galp e a-D-Galp ligadas (1 - 6), sendo que ambas as unidades podem estar substituídas em O-2 por terminais não redutores de b-D-Manp. Esse polissacarídeo apresentou um efeito analgésico, porém não demonstrou atividade antiinflamatória, quando avaliado em teste de contração muscular induzida por ácido acético em camundongos. A fração PHW obtida pela extração aquosa a quente, após tratamento com NaOH apresentou glucose como principal componente monossacarídico. Os espectros de RMN-¹³C e HMQC dessa fração apresentaram sinais característicos de uma b-glucana-(1 - 3), substituída em O-6 por b-Glcp, semelhante à lentinana. O extrato alcalino obtido foi tratado com solução de Fehling, originando uma fração sobrenadante (SF-GLC) e uma fração precipitada (PF-GLC) neste reagente. Ambas apresentaram espectros de RMN-¹³C semelhantes e característicos de b-glucanas. Entretanto, a análise de metilação mostrou que SF-GLC é composta por alto teor de ligações (1- 3) e (1 - 6), enquanto PF-GLC é composta principalmente por ligações (1 - 6). A análise dos parâmetros nutricionais desse cogumelo mostrou que este é rico em proteínas e aminoácidos essenciais apresentando baixos teores de lipídios. Além disso, é uma boa fonte de minerais apresentando cálcio, magnésio, cobre, zinco e manganês em sua composição. / The present object work is an elucidation of chemical structures of some polysaccharides extracted from the fruiting bodies of Pleurotus pulmonarius, besides their biological applications and nutritional value. The dried and milled basidiomycete was submitted to aqueous extraction (cold and hot), and alkaline extraction (1% KOH). The aqueous extracts were firstly submitted to ethanol precipitation, and the alkaline extract was neutralized with acetic acid. The resulting polysaccharide extracts were submitted successively to a freezethawing process, precipitation with Fehling solution, ultrafiltration and dialysis with membranes of different Mr cut-offs. After these processes different polysaccharides were characterized. Fraction MG, obtained from the cold water extraction, was homogeneous and was composed of mannose, galactose and O-methyl-galactose. Spectroscopic and methylation analysis suggest that this molecule has a main chain composed of 3-O-Me-a-D-Galp e a-D-Galp (1 - 6)- linked units, with both substituted at O-2 by b-D-Manp non-reducing end units. This polysaccharide presented an analgesic effect, independently of an inflammatory response, when analyzed by a test of abdominal constriction induced by acetic acid in mice. Fraction PHW obtained via hot water extraction, after treatment with NaOH, had glucose as its principal monosaccharide component. The ¹³C-NMR and HMQC spectra of this fraction contained signals characteristic of a (1 - 3)-linked-b-glucan, substituted at O-6 by b-Glcp, similar to lentinan. The alkaline extract was treated with Fehling solution giving rise to a soluble (SF-GLC) and precipitated fraction (PF-GLC). Both fractions had similar ¹³C-NMR spectra and they were characteristic of b-glucans. Although methylation data showed that SF-GLC was composed of a high proportion of (1 - 3) and (1 - 6) linkages, and PF-GLC was composed mostly of (1 - 6) linkages. Analysis of the nutritional value of this mushroom showed that it is rich in protein and essential amino acids, besides containing lower levels of lipids. In addition, it is a good source of minerals such as calcium, magnesium, copper, zinc and manganese.

Orientadora : Prof. Glaucia Regina Martinez / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 12/02/2010 / Bibliografia: 65-74 / Área de concentração: Bioquímica / Resumo / Resumo: O melanoma e um tipo de cancer bastante relevante ja que as opcoes de tratamento eficazes sao limitadas. A presenca da melanina protege os individuos de pele escura contra os efeitos da radiacao solar, a principal causa de formacao do melanoma pela geracao de especies reativas de oxigenio (ROS). Porem, a melanina tambem pode ter um papel duplo, que e a de gerar especies reativas durante sua sintese que podem prejudicar a celula. Portanto, o objetivo deste trabalho foi a avaliacao das caracteristicas de morte celular causadas por uma ROS, o oxigenio singlete (1O2), nas celulas de melanoma murino B16-F10 com e sem estimulo para producao de melanina e nas celulas de melanocito murino Melan-a. O estimulo para a sintese de melanina foi obtido incubando-se as celulas por 48 horas com meio RPMI 1640 enriquecido com 400 ƒÊmol/L de L-tirosina e 10 mmol/L de cloreto de amonio. A concentracao de melanina aumentou em mais de nove vezes nas celulas B16-F10 e as celulas Melan-a tiveram aumento de menos de duas vezes. Foi utilizado o endoperoxido DHPNO2 10 mmol/L por 2 horas para a geracao de 1O2. Essa condicao causou queda na viabilidade avaliada pelo metodo do MTT para 78,0% nas celulas B16-F10, 70,2% nas B16-F10 estimuladas (B16-F10 Y) e 79,3% nas Melan-a. O ensaio foi feito apos 24 horas do inicio do tratamento com DHPNO2 e a viabilidade caiu para 49,7% nas B16-F10, 53,3% nas B16- F10 Y e 72,5% nas Melan-a. A avaliacao da morte celular utilizando laranja de acridina e brometo de etidio mostrou que apos o tratamento por 2 horas, somente as celulas B16- F10 tiveram aumento significativo na quantidade de celulas em apoptose, e as B16-F10 Y tiveram leve queda na quantidade de celulas viaveis, com tendencia ao aumento de celulas em apoptose. As celulas Melan-a nao tiveram diferenca entre os tratamentos. A liberacao do citocromo c foi determinada por HPLC e mostrou-se que apos 2 horas, as celulas B16-F10 tratadas com 1O2 tiveram mais citocromo c liberado para o citoplasma comparado com o controle. Nos demais grupos, nao houve alteracao com o tratamento. Porem, as celulas controle com mais melanina tiveram maior liberacao de citocromo comparado com o controle das celulas nao estimuladas, mostrando que as celulas estavam sofrendo algum dano inerente da sintese de melanina. A analise da fragmentacao do DNA apos 2 e 24 horas mostrou que nao houve aparecimento de quebras caracteristicas de apoptose pelo tratamento com 1O2 em nenhum dos grupos testados. As celulas B16-F10 Y controle apresentaram DNA fragmentado inespecificamente, representado como um arraste no gel de agarose, que nao foi alterado pelo tratamento. A razao entre ADP e ATP foi quantificada para avaliar o estado energetico da celula, que pode refletir algumas caracteristicas de morte. Nenhuma das celulas teve diferenca estatistica apos o tratamento de 2 horas com 1O2, mas foi observado que as razoes ADP/ATP das celulas controle B16-F10 com e sem estimulo apresentaram valores acima do valor considerado para celulas viaveis/proliferativas. Os resultados da celula Melan-a foram bem proximos dos valores ditos normais. O fluxo de calcio tambem foi avaliado e o 1O2 foi capaz de liberar calcio das reservas intracelulares para o citoplasma nas celulas B16-F10, sendo que nas celulas estimuladas, o aumento do calcio citoplasmatico foi menor, indicando a possivel recaptacao do calcio pela melanina. As celulas Melan-a nao sofreram grandes alteracoes na quantidade de calcio liberado para o citoplasma. Nao houve diferenca na liberacao de AIF em nenhuma das celulas. Em conjunto, os resultados mostram que a sintese da melanina estimulada pela suplementacao do meio foi deleteria as celulas, pois causou fragmentacao no DNA, liberacao de citocromo c e aumentou a razao ADP/ATP para valores considerados de celula em apoptose. Por outro lado, a presenca da melanina parece ter protegido as celulas da acao do 1O2, pois alguns resultados indicam uma tendencia de melhora dos parametros avaliados. / Abstract: Melanoma is a relevant type of cancer since the options for efficient treatment are limited. The presence of melanin protects the dark-skinned people against the effects of solar radiation, the main cause for melanoma development by the generation of reactive species of oxygen (ROS). However, melanin may also have a role on the generation of reactive species during its synthesis, which may harm the cell. So, the objective of this work was the evaluation of the characteristics of cell death caused by a ROS, the singlet oxygen (1O2) on murine melanoma cells B16-F10 with or without stimulation for synthesis of melanin and on murine melanocytes cells Melan-a. The stimulus for the synthesis of melanin was obtained treating the cells for 48 hours with medium RPMI 1640 supplemented with 400 ìmol/L of L-Tyrosine and 10 mmol/L of ammonium chloride. The concentration of melanin increased more than nine times in the B16-F10 cells and the Melan-a cells increase was almost twice the amount of the control. It was used the endoperoxide DHPNO2 10 mmol/L for 2 hours for the generation of 1O2. This condition caused the decrease in the viability determined by the method of MTT to 78% in B16-F10, 70,2% in B16-F10 that were stimulated (B16-F10 Y) and 79,3% in Melana cells. The test was performed after 24 hours from the beginning of the treatment with DHPNO2 and the viability decreased to 49,7% in B16-F10, 53,3% in B16-F10 Y and 72,5 % in Melan-a. The evaluation of cell death using acridine orange and ethidium bromide showed that after the two-hour treatment, only the B16-F10 cells had a significant increase of the number of apoptotic cells, and the B16-F10 Y cells had a slight decrease of the amount of viable cells, with the tendency of the increase of apoptotic cells. Melan-a cells did not show difference among the treatments. The release of cytochrome c was determined by HPLC and it showed that after two hours, B16-F10 cells had more cytochrome c released to the cytoplasm compared to the control. There was not any alteration for other groups of cells with the treatment. However, the control cells that had more melanin showed increased cytochrome c release compared to the control of the not-stimulated cells, demonstrating that the previous cells were suffering some kind of damage from the melanin synthesis. The analysis of DNA fragmentation revealed the absence of typical apoptosis fragmentation in any of the groups. B16-F10 Y control cells displayed unspecific DNA damage observed as a smear in the agarose gel, which was not altered by 1O2 treatment. The same result was observed after the treatment for 2 and 24 hours. The ratio between ADP and ATP was quantified to evaluate the energetic state of the cell, which may reflect some characteristics of cell death. None of the cells showed results statistically significant after the two-hour treatment 1O2, but it was shown that the values of ADP/ATP ratio of the B16-F10 control cells with and without stimulation were above of the threshold accepted for viable/proliferative cells. The results of Melan-a cells were very close to the values considered normal. The calcium flux was also evaluated and it was evidenced that 1O2 was capable of releasing calcium from the intracellular stores to the cytoplasm in B16- F10 cells, and the release of calcium was lower in B16-F10 Y, indicating the possibility of the binding of the metal to melanin. The Melan-a cells did not showed much increase in the quantities of calcium released to the cytoplasm. There was no difference in the release of AIF in any group. Over all, the results support that the synthesis of melanin that was stimulated by the supplementation of the medium was deleterious to the cells, since it caused DNA fragmentation, release of cytochrome c and increase of the ratio ADP/ATP to values of cells in apoptosis. On the other hand, the presence of melanin seemed to protect the cells against the action of 1O2, because some results indicate a tendency of improvement in the parameters evaluated.

Orientadora : Profª Drª Carmen Lúcia de Oliveira Petkowicz / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 17/02/2011 / Inclui referências / Resumo: A Metagenômica permite a aplicação de técnicas de biologia molecular em organismos não cultiváveis e têm tido um grande impacto na descoberta de novas enzimas. Para identificação de novos genes de enzimas hidrolíticas foram analisadas duas bibliotecas metagenômicas: uma do solo da Mata Atlântica paranaense (MAF) e outra do solo contaminado por gordura de uma planta de tratamento de resíduos industriais (SLP). Essas bibliotecas foram estocadas na forma de conjuntos de clones contendo 100.000 e 500.000 clones, respectivamente, com um tamanho médio de inserto de 30 kb clonados no vetor osmidial pCC2FOS. A triagem funcional foi realizada em meio sólido LA contendo um substrato específico para proteases (1% leite em pó desnatado), amilases (1% amido), celulases (0.2% carboximetilcelulose) ou quitinases (2% quitina coloidal). Como resultado foram encontrados 23 clones positivos para protease e 17 para quitinase pertencentes às duas bibliotecas. Análise de restrição com as endonucleases BamHI e EcoRI revelou três padrões diferentes para os clones de protease e quatro padrões para os de quitinase. Todos os clones positivos foram retransformados e somente o clone CHI1 manteve atividade quitinolítica. Uma sub-biblioteca de CHI1 foi construída em pUC18 e os plasmídeos dos subclones com atividade foram purificados e submetidos a mutagênese por inserção de transposon. As extremidades dos insertos de DNA de todos os subclones e mutantes com inserção de transposon foram sequenciados para obtenção de sequências consenso estendidas. A comparação dessas sequências com o GenBank através da ferramenta BlastX revelou três genes de quitinase com identidades entre 78 e 93% com Chi1 de Aeromonas punctata (Chit1), um endoquitinase básica de A. hydrophila (Chit2) e uma quitodextrinase de A. hydrophila subsp. hydrophila (Chit3). No PDB poucas estruturas similares estão disponíveis e o programa Modeller foi utilizado para construir um modelo de estrutura por homologia somente para o gene da Chit1, que apresentou 75% de identidade com a sequência de aminoácidos da estrutura de ChiA de Serratia marcescens. Os outros genes apresentaram cerca de 30% de identidade com Chi2 de Carica papaya e ChiB de S. marcescens, respectivamente. Chit1 e 3 pertencem a família 18 das glicosil hidrolases e a análise de suas sequências identificou-as como exoquitinases secretadas. Chi2 pertence a família 19 das glicosil hidrolases, geralmente encontradas em plantas, e também possui um domínio de lisozima que pode fornecer uma atividade antibacteriana. Quitinases podem ter atividade antifúngica e antibacteriana, além de erem utilizadas na produção de quito-oligômeros e N-acetilglucosamina. Essas moléculas são aplicadas como promotores de crescimento em plantas, imunoestimuladores, agentes antitumorais e antibacterianos. Os três genes de quitinases são novos e possuem potencial de aplicação como agentes de biocontrole e na produção de derivados de quitina. / Abstract: Metagenomics allows the application of molecular genomics to consortia of noncultivable microbes and has had substantial impact on the discovery of novel industrial enzymes. In order to identify new genes of hidrolytic enzymes we screened two fosmid metagenomic libraries; one from Atlantic Forest soil (MAF) and another from an animal fat-contaminated soil from an industrial wastewater treatment plant (SLP). These libraries were stored as pools and have 100,000 and 500,000 clones, respectively, with an average insert size of 30 kb cloned into the pCC2FOS fosmid vector. Functional screening was carried out on LB agar plates containing specific substrates for proteases (1% skimmed milk), amylases (1% starch), cellulases (0.2% carboximethylcellulose) and chitinases (colloidal chitin). As a result, 23 protease positive and 17 chitinase positive clones were found in the SLP and MAF libraries. Restriction analysis with BamHI and EcoRI endonucleases revealed three different restriction patterns among the protease activity bearing fosmids nd four patterns mong those conferring chitinase activity. All positive clones were retransformed and only clone CHI1 retained chitinase activity. A plasmid sub-library of CHI1 was constructed in pUC18 and subclone plasmids with activity were purified and submitted to transposon insertion mutagenesis. All subclones and transposon insertions mutants were sequenced. Contigs obtained were analysed with BlastX and three chitinases genes were found revealing identities between 78 and 93% with chiti ase 1 from Aeromonas punctata (Chit1), basic endonuclease from A. hydrophila (Chit2) and chitodextrinase from A. hydrophila subsp. hydrophila (Chit3). On PDB few similar structures were available and the Modeller software was used to construct an homology structure model for Chit1 gene that presents 75% identity with ChiA from Serratia marcescens. Other genes had 30% similarity to structures of Chi2 from Carica papaya and ChiB from S. marcescens, respectively. Chit1 and 3 belong to glycosil hydrolases family 18, and sequence analysis identified them as secreted exochitinases. Chi2 belongs to glycosil hydrolases family 19, generally found in plants, and also have a lysozyme domain that can provide an antibacterial activity. Chitinases may have antifungal and antibacterial activity and are used on chitooligomers and GlcNAc production. These compounds are applied as growth promoters in plants, imunoenhancers, antitumoral and antibacterial agents. The hree chitinases are new genes with potential application as biocontrol agents and on chitin derivatives production.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-24Bitstream added on 2014-06-13T19:49:45Z : No. of bitstreams: 1 barros_rs_me_araiq.pdf: 931248 bytes, checksum: cb6128639cbeba5c7ae65a24a783b21a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / CcdB é uma proteína de 11,7 kDa, com 101 resíduos de aminoácidos, produzida pelo plasmídeo F, como parte de um sistema de morte programada, de dois componentes, para a manutenção do número de cópias do plasmídeo. Neste sistema, CcdB age como uma toxina e o CcdA como um antídoto. Na ausência do CcdA, devido à perda do plasmídeo durante a replicação celular, CcdB pode matar bactéria pela inibição das enzimas DNA-girase e topoisomerase IV (topo IV). Girase e a topo IV são topoisomerases, ATP dependentes, responsáveis pelos processos de replicação e transcrição do DNA bacteriano, de modo que exercem papel fundamental na viabilidade dos microrganismos procariotos. Peptídeos derivados do CcdB têm demonstrado grande capacidade de inibição enzimática in vitro, porém a baixa permeabilidade da membrana celular bacteriana a estes derivados tem prejudicado a atividade in vivo. No intuito de criar um meio para facilitar a inserção de derivados sintéticos do CcdB em células bacterianas, uma série de peptídeos, constituídos de quatros seqüências carreadoras fundidas ao derivado peptídico CcdB1, foi sintetizada pela metodologia da fase sólida. Estes peptídeos foram testados quanto à inibição da girase e topo IV em solução. Dois peptídeos apresentaram inibição, com valores de IC100 abaixo de 100 μM, para ambas as enzimas. Estudos de dicroísmo circular associado aos ensaios de inibição evidenciaram forte dependência da atividade com a presença da hélice C-terminal. O derivado CPP1-CcdB1 apresentou atividade antimicrobiana contra Bacillus subtilis, a uma concentração de 50 μM, mostrando que a inserção de uma seqüência carreadora, pode facilitar o transporte de derivados do CcdB através da membrana celular. Além disso, a molécula de CcdB1 pode servir como um bom modelo para o desenvolvimento de novos CPPs. / CcdB is an 11.7 kDa protein with 101 amino acid residues, produced by the F plasmid as part of a two-component system of programmed cell death for maintaining plasmid copy number. In this system, CcdB acts as a toxin and CcdA as an antidote. In the absence of the CcdA, due to loss of plasmid during cell replication, CcdB can kill bacteria by inhibition of the DNA gyrase and topoisomerase IV (topo IV) enzymes. Gyrase and topo IV are ATP dependent topoisomerases, responsible for the transcription and replication processes in bacterial DNA, so that carries key role in the viability of prokaryotes microorganisms. Peptides derived from CcdB have shown great capacity for in vitro enzyme inhibition, but the low permeability of the bacterial cell membrane to these derivatives has damaged the activity in vivo. In order to create a form to facilitate the insertion of synthetic derivatives of CcdB in bacterial cells, a series of peptides, consisting of four carrier peptide sequences fused to the derived CcdB1, was synthesized by the solid phase methodology. These peptides were tested about inhibition of Gyrase and topo IV activities, in solution. Two peptides showed inhibition, with values of IC100 below 100 mM for both enzymes. Circular dicroism studies associated with inhibition tests showed strong dependence of activity with the presence of the C-terminal helix. The CPP1-CcdB1 derivative showed antimicrobial activity against Bacillus subtilis at a concentration of 50 mM, showing that the insertion of a carrier sequence can facilitate the transport of derivatives of CcdB through the cell membrane. In addition, the CcdB1 molecule is a good model to develop new CPPs.

Orientador : Profª. Drª. Maria Berenice Reynaud Steffens / Coorientador : Prof. Dr. Marcelo Müller dos Santos / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 18/05/2015 / Inclui referências: f. 115-136 / Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria da classe Betaproteobacteria que pode colonizar plantas de forma endofítica e epifítica, e promover o crescimento vegetal. Esta propriedade está relacionada à sua capacidade de fixar nitrogênio atmosférico, produzir fitormônios e colonizar o interior dos tecidos vegetais. Além disso, produz polihidroxialcanoatos (PHAs), uma classe de polímeros biodegradáveis constituídos de resíduos de ácidos 3-hidroxialcanóicos sintetizados como reserva de energia e carbono. O polihidroxibutirato (PHB) é o PHA melhor caracterizado. Este polímero é sintetizado em condições limitantes de crescimento e é armazenado na forma de grânulos no interior da célula bacteriana. O genoma de Herbaspirillum seropedicae SmR1 apresenta 13 genes potencialmente envolvidos no metabolismo de PHA, dentre os quais quatro foram anotados como codificadores de PHA sintases. O objetivo deste trabalho foi investigar o papel das PHA sintases de H. seropedicae codificadas pelos genes phaC1, 2, 3 e 4, bem como, os efeitos fisiológicos causados pela ausência deste polímero. O nível de transcrição destes genes foi avaliado nas estirpes selvagem SmR1 e ?phaC1 (deficiente na síntese de PHB), contendo fusões transcricionais com o gene repórter lacZ. Somente o promotor phaC2 no mutante ?phaC1 apresentou expressão inferior. Um possível efeito da proteína reguladora PhaR ou da proteína sensora de níveis redox, Fnr, na baixa taxa de transcrição de phaC2, na estirpe ?phaC1, foi investigado. Não houve alteração do nível de expressão dos genes phaC no mutante ?phaR. Também não houve expressão diferencial dos genes phaC1, 3 e 4 nos mutantes ?fnr, mas phaC2 foi reprimido principalmente nos mutantes fnr1 e 3. Estes resultados sugerem que a expressão do gene phaC2 seja dependente de Fnr e não de PhaR. Como o gene phaC2 apresentou baixo nível de transcrição nas estirpes ?phaC1 e ?fnr, foi investigado se a expressão diminuída de phaC2 estaria relacionada com a ausência de PHB e se esta ausência poderia afetar negativamente a atividade de Fnr. Todos os mutantes ?fnr produziram quantidades de PHB similares a estirpe selvagem SmR1 e isto indica que que é a deleção dos genes fnr que afeta a transcrição de phaC2 e não a ausência de PHB. Assim, conclui-se que é a deleção dos genes fnr que afeta a transcrição de phaC2 e não a ausência de PHB. Ensaios com fusões transcricionais fnr1-lacZ e fixNlacZ, cujas expressões dependem de Fnr, mostraram que ambos os genes apresentam expressão diminuída na estirpe ?phaC1, indicando um efeito negativo da ausência de PHB na atividade de Fnr. Em relação à fixação biológica de nitrogênio (BNF), a estirpe ?phaC1 apresentou uma redução de 89% na capacidade de reduzir o acetileno e isto indica que a mutação também interfere na BNF. Em relação à sensibilidade ao estresse oxidativo, a estirpe ?phaC1 foi mais sensível ao metilviologênio (gerador de superóxido) e produziu mais EROs que a estirpe SmR1, em condições padrão de crescimento. O ambiente desfavorável provocado pela produção mais elevada de EROs pela estirpe ?phaC1 afeta negativamente os grupamentos Fe-S das metaloproteínas como Fnr e Nitrogenase. Provavelmente, o metabolismo do PHB em H. seropedicae funcione como um ciclo que pode estocar carbono e oxidar NADPH durante sua síntese e liberar carbono e reduzir NAD+ durante sua mobilização. Este metabolismo modula a disponibilidade de equivalentes redutores que reduzem o estresse oxidativo, que é um desiquilíbrio do controle e da sinalização do estado redox. Os resultados desta Tese mostram a importância da produção de PHB no controle oxidativo e na proteção das proteínas Fnr e Nitrogenase e poderão contribuir para a elucidação do controle redox via a produção de PHB também em outras bactérias produtoras deste polímero, sugerindo uma nova função ao PHB além de estoque de carbono e energia. Palavras-chave: Herbaspirillum seropedicae; PHA sintases; PHB. / Abstract: Herbaspirillum seropedicae is a bacterium that belongs to â-proteobacteria class, which is able to establish endophityc associations and to promote plant growth. This property is related to its ability to fix atmospheric nitrogen and to produce phytohormones. Furthermore, it produces polyhydroxyalkanoates (PHAs), which are a class of biodegradable polymers containing 3-hydroxyalkanoic acid monomers synthesized as a carbon and energy source. PHB is the best characterized PHA. This polymer is synthesized under limited nutrient conditions and stored as granules inside bacteria cells. The genome of H. seropedicae SmR1 revealed 13 genes potentially involved in PHA metabolism and 4 of these were annotated as PHA synthases. The aim of this work was to investigate the role of the PHA synthases from H. seropedicae encoded by phaC1, 2, 3 and 4 genes, as well as physiological effects produced by the absence of this polymer. Transcription level of these genes was evaluated in wild-type SmR1 and ÄphaC1, which does not produce PHB, carrying out lacZ transcriptional fusions. The phaC2 promoter showed lower expression only in ÄphaC1 mutant. A possible effect of transcriptional regulators PhaR and/or Fnr in lower transcription in ÄphaC1 strain was investigated. There was not expression change of phaC genes in ÄphaR mutant. There was not expression change of phaC1, 3 e 4 genes in Äfnr mutants either, but phaC2 was repressed mainly fnr1 and 3 mutants. These results suggest that phaC2 showed an Fnr-dependent expression and independent of PhaR. Since phaC2 did shown low transcription in ÄphaC1 and Äfnr mutant strains, it was investigated if low expression of phaC2 would be related to the PHB absence and/or if the lacking of PHB would affect negatively the Fnr activity. The PHB accumulation was measured in Äfnr mutants and all of them produced similar PHB moieties as compared to SmR1. Therefore, it is possible to conclude that the fnr deletions, instead the lack of PHB, affect the phaC2 transcription. Assays with fnr1-lacZ e fixN-lacZ transcriptional fusions, whose expressions depend on Fnr, showed that both genes exhibited lower expression in ÄphaC1 strain, indicating a negative effect of PHB absence in the Fnr activity. With regard to biological nitrogen fixation (BNF), ÄphaC1 strain showed an 89% reduction in acetylene reduction, indicating that the lack of PHB affects BNF as well. Concerning sensitivity to oxidative stress, the ÄphaC1 was more susceptible to methyl viologen (a superoxide generator) and produces more ROS than SmR1. The unfavorable environment created by more elevated production of ROS in ÄphaC1 strain affects negatively the Fe-S cluster of metalloproteins, such as Fnr and nitrogenase. Possibly PHB metabolism in H. seropedicae functions as cycle which can store carbon and oxidize NADPH in its synthesis and, release carbon and reduce NAD+ in its mobilization. This metabolism modulates the availability of reducing equivalents that alleviates the oxidative stress, which is a disruption of redox signaling and control. The results of this work showed the importance of PHB synthesis in oxidative control and possibly for protection of metalloproteins, and may contribute to elucidate the redox control through PHB synthesis in other PHB-accumulating bacteria, bring a new function to PHB further the carbon and energy storage. Key-words: Herbaspirillum seropedicae; PHA synthases; PHB.

Nesse trabalho, foi estudada a produção de endo e exo-poligalacturonases (PG) por Aspergillus oryzae IPT 301, em biorreatores com agitação mecânica (STR) e airlift de circulação interna e externa em escala de bancada. Utilizando um planejamento experimental, foi definida uma formulação de meio isento de sólidos em suspensão (WBE), com o qual foram obtidas atividades máximas de endo e exo-PG comparáveis com as atingidas com um meio formulado com farelo de trigo integral. Com o meio WBE, a produção de PG foi comparada em STR e airlift de circulação interna. Nesses ensaios, foram alcançadas atividades superiores de endo-PG (91,3 unidades por mililitro de meio, U/mL) e exo-PG (65,2 U/mL) com o STR, enquanto que com o biorreator airlift as atividades máximas de endo-PG e exo-PG foram 86,2 U/mL e 60,6 U/mL, respectivamente. Esses resultados demonstram a viabilidade do emprego da configuração airlift na produção de poligalacturonases por A. oryzae. Em cultivos em STR, foi avaliada a influência da presença, no meio WBE, de diferentes concentrações de pectina (0, 10 e 20 g/L) e glicose (0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 g/L) sobre o processo. Adicionalmente, em meios contendo 20 g/L de pectina e 20, 30 e 50 g/L de glicose, o pH foi controlado em um valor mínimo de 2,7. Nos testes em que o pH foi controlado nesse valor mínimo, foi observado um forte incremento das atividades de endo e exo-PG, destacando-se a concentração de glicose de 30 g/L com a qual atividades enzimáticas de 175,0 U/mL de endo-PG e 103,0 U/mL de exo-PG foram obtidas. Em STR, foram ainda testados meios de cultivo formulados com pectina em sua forma normal (WBE) e pectina que sofreu hidrólise enzimática parcial, com o fim de promover a redução da viscosidade do meio e, dessa forma, favorecer a transferência de oxigênio para o cultivo. Numa das condições testadas (WBE5), o meio foi formulado com metade da pectina parcialmente hidrolisada e com a outra metade não tratada. Nessa condição, atividades de endo-PG de 149,0 U/mL e de exo-PG de 82,2 U/mL foram obtidas, enquanto que com o uso do meio com a pectina integral atividades estatisticamente inferiores 130,0 e 78,0 U/mL, respectivamente foram determinadas. A produção de PG foi avaliada na condição WBE5 e na condição WBE6, com pectina não hidrolisada, em que os sais nutrientes foram adicionados parceladamente ao meio durante o cultivo, em biorreatores STR e airlift de circulação interna e externa. Após 96 h de processo, atividade superior de endo-PG (145,0 U/mL) foi atingida no STR, na condição WBE5, seguindo-se a condição WBE6 (140,0 U/mL) no mesmo reator. Em biorreatores airlift, títulos superiores de endo-PG (116,0 U/mL) e exo-PG (80,4 U/mL) foram atingidos no sistema de circulação externa, na condição WBE6, observando-se, para exo-PG, atividade semelhante à obtida no STR. O processo foi avaliado em meios com diferentes concentrações de KH2PO4, (NH4)2SO4, FeSO4, MnSO4, MgSO4 e ZnSO4. Em análises individuais de cada um desses sais, em ensaios em frascos agitados, evidenciou-se a influência nas concentrações de sulfatos de NH4+, Fe2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+ sobre a produção de poligalacturonases. Em STR, sob condições controladas, foi comparada a produção enzimática no meio padrão WBE e com diferentes condições de adição dos sais ao cultivo. Entre as condições avaliadas em STR, as mais altas atividades de endo-PG (175 U/mL) e de exo-PG (86,5 U/mL) foram atingidas quando KH2PO4, (NH4)2SO4, FeSO4, MnSO4, MgSO4 e ZnSO4 foram adicionados parceladamente ao meio durante o processo, com ganho significativo em relação ao meio WBE em que essas atividades alcançaram 130,0 e 78,6 U/mL, respectivamente. Os resultados do presente trabalho demonstram o alto potencial dos biorreatores airlift, como um sistema de relativa simplicidade de construção e operação, para a produção de poligalacturonases em grande escala. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-23T18:29:35Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Roselei Claudete Fontana.pdf: 2842746 bytes, checksum: 81128a000dba545ee34696c43a9146fb (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-23T18:29:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Roselei Claudete Fontana.pdf: 2842746 bytes, checksum: 81128a000dba545ee34696c43a9146fb (MD5) / In this work, the production of endo and exo-polygalacturonase (PG) by Aspergillus oryzae IPT 301 was studied in a stirred tank bioreactor (STR) and in airlift bioreactors with internal and external circulation loop. Using a factorial experimental design, a soluble culture medium (WBE) was defined which allowed the production of exo and endo-PG comparable to that obtained in a medium containing suspended wheat bran. With the WBE medium, the production of PG was compared in STR and internal-circulation-airlift bioreactor. In these tests, superior enzymatic activities for both endo-PG (91.3 units per mL of medium, U/mL) and exo-PG (65.2 U/mL) were obtained in the STR, whereas in the airlift reactor the maximum activities were 86.2 U/mL and 60.6 U/mL, respectively. These results indicate the feasibility of airlift reactors for producing polygalacturonases by A. oryzae. In STR cultivations, the influence of different concentrations of pectin (0, 10, and 20 g/L) and glucose (0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 g/L), in WBE medium, on the process was assessed. Furthermore, in media containing 20 g/L pectin and 20, 30, and 50 g/L glucose, tests where pH was controlled to a minimum value of 2.7 were carried out. In tests where pH was controlled to this minimum value, strong improvement of both endo and exo-PG activities was attained, especially in the run with 30 g/L glucose in which enzyme activities of 175.0 U/mL for endo-PG and 103.0 U/mL for exo-PG. In STR, cultivation media formulated with regular pectin (WBE) and with partially enzyme-hydrolysed pectin to reduce the viscosity of medium and as such to improve the oxygen transfer to the culture were evaluated. In one condition (WBE5), the medium was formulated with half of the pectin partially hydrolysed and half of the pectin untreated. In this condition, activities of endo-PG of 149.0 U/mL and exo-PG of 82.2 U/mL were achieved, whereas with the non-hydrolysed-pectin medium statistically inferior activities 130.0 and 78.0 U/mL, respectively were measured. PG production was compared in STR and in both airlift bioreactors (internal and external circulation loop), using the condition WBE5 and a further condition (WBE6), with non-hydrolysed pectin medium, in which the nutrient salts were fed to the medium in lots during the cultivation. After 96 h of process, a higher activity of endo-PG (145.0 U/mL) was attained in STR followed by the condition WBE6 in the same reactor (140.0 U/mL). In airlift bioreactors, superior titres of endo-PG (116.0 U/mL) and exo-PG (80.4 U/mL) were obtained in the condition WBE6, with the external loop configuration, the activity of exo-PG being similar to that measured in STR. The process was evaluated in media with different concentrations of KH2PO4, (NH4)2SO4, FeSO4, MnSO4, MgSO4 e ZnSO4. In individual analysis of each salt, performed in shake-flasks experiments, the influence of the concentrations of NH4+, Fe2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+ sulphates on the production of polygalacturonases was evidenced. In STR, under controlled conditions, the enzyme production in WBE medium was compared with different conditions of salt feeding to the culture. Among the conditions tested in STR, the highest activities for endo-PG (175.0 U/mL) and exo-PG (86.5 U/mL) were achieved when KH2PO4, (NH4)2SO4, FeSO4, MnSO4, MgSO4 e ZnSO4 were fed to the medium in lots, with a significant improvement in comparison to the use of WBE medium that resulted in activities of 130.0 and 78.6 U/mL, respectively. The results of this work reveal the high potential of airlift bioreactors as a relatively simple building operating system to be used in large-scale polygalacturonase production.