Durante a análise investigativa, duas temáticas foram ressaltadas: tema e projetos. Ambos, em sua maioria, foram propostos pelos alunos do programa de pós-graduação em Bioquímica. Todos os professores envolvidos nos projetos afirmaram que estes trouxeram benefícios importantes, não só para suas disciplinas, como também para o processo de ensino-aprendizagem. É muito importante ressaltar que dos projetos analisados nove foram incorporados às disciplinas de graduação, sendo que um deles gerou uma nova disciplina. É importante destacar que tanto nas atividades teóricas, práticas, e teórico-práticas, ocorreram alterações de natureza metodológica e de conteúdos. A continuidade da disciplina Prática de Ensino em Bioquímica, é de suma importância para a construção pedagógica e aperfeiçoamento de docentes do ensino superior. Este processo é de importância relevante, uma vez que os alunos do programa de pós-graduação, ao concluírem seus cursos, encontram-se geralmente muito distanciados da realidade de ensino-aprendizagem da graduação. / This investigation showed that post graduation students were the main responsible for the elaboration and implemantation of their teaching projects. All teachers responsible for graduation disciplines where the projects were implemented recognized that all projects brought some benefit to their students and to their disciplines of graduation, mainly in the teaching/learning process. The results obtained with practical and theoretical classes were mainly due to the new methodogy and knowledge by the post graduation students. It is important to emphasize that 30% of the projects were incorporated to the graduation disciplines, and one of them generated a new discipline. These results lead all teachers to emphasize the importance of maintain and improve this sort of probation for post graduation students on disciplines of graduation.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências e Tecnologias e Saúde, 2017. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-05-09T16:36:49Z No. of bitstreams: 1 2017_GraziellaSantanaFeitosaFigueiredo.pdf: 2211740 bytes, checksum: c832f72056d451021bd4f1e9261611a2 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2017-05-10T10:16:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_GraziellaSantanaFeitosaFigueiredo.pdf: 2211740 bytes, checksum: c832f72056d451021bd4f1e9261611a2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-10T10:16:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_GraziellaSantanaFeitosaFigueiredo.pdf: 2211740 bytes, checksum: c832f72056d451021bd4f1e9261611a2 (MD5) / A doença de Chagas é endêmica da América Latina, tem como agente etiológico o parasito Trypanosoma cruzi. O tratamento da doença durante a fase crônica gera diversos efeitos colaterais. Nesse sentido, as proteases de tripanossomatídeos têm sido investigadas na busca de novos alvos terapêuticos. A dipeptidil peptidase 8 de Trypanosoma cruzi (DPP8Tc) é uma enzima que faz parte das prolyloligopeptidases, essa família possui membros com conhecida relevância médica, dentre elas está a enzima ortóloga DPPIV humana, cuja inibição é utilizada como uma das formas de tratamento da diabetes tipo II. A DPP8Tc, foi investigada neste trabalho por meio da caracterização bioquímica e por nocaute físico dos alelos do gene dpp8tc do parasito T. cruzi da cepa CL Brener. Os resultados obtidos indicam que a DPP8Tc é uma enzima dimérica, solúvel, ativa em tampão tris 50mM em pH situado entre 7,5 e 8,0 e melhora sua atividade com aditivos. A temperatura ótima para atividade enzimática situa-se em torno dos 28ºC e substrato específico, Gly-Pro-AMC. Com o uso deste substrato, foram obtidos os parâmetros KM de 10,78 μM, Kcat de 1,67x10-3 s-1, Vmax 4,6x10-5 μmol de AMC liberado/min e Kcat/KM:1,55x10μM-1s-1. Os inibidores clássicos de proteases exercem baixa inibição enzimática da DPP8Tc. Em contrapartida, os inibidores de DPPIV exercem maior taxa de inibição entre eles o IB-7, o mais potente, inibe em 96,59% da DPP8Tc, com constante de inibição (Ki) de 8,2 nM. Outros inibidores da DPPIV apresentaram os seguintes ICs-50: KS (IV) com 95,47 nM, IB-4 com 484,9 nM e por último, KAII-23 com 2,7μM. A inibição enzimática ocorre principalmente por inibidores que possuem o grupo adamantil na sua composição química, semelhante à composição do inibidor vidaglipitina da DPPIV humana. A atividade ótima ocorre em torno dos 28ºC, temperatura requerida à sobrevivência da forma epimastigota, indicando potencial função no barbeiro. O nocaute simples do gene dpp8tc, diminuiu em 50% a atividade enzimática, em 20% a fluorescência e aumentou 2,9% a taxa de infecção do parasito DPP8Tc+. As diferenças existentes nas regiões UTRs 5’ e 3’ dos alelos do gene DPP8Tc, impediu o sucesso do nocaute duplo, sendo necessária a construção específica de um cassete direcionado para o nocaute do segundo alelo, visando conhecer por completo a função da DPP8Tc de Trypanosoma cruzi. / Chagas disease is endemic in Latin America, and has the parasite Trypanosoma cruzi as its etiological agent. Treatment of the disease during the chronic phase generates several side effects. In this sense, trypanosomatid proteases have been investigated in the search for new therapeutic targets. The dipeptidyl peptidase 8 of Trypanosoma cruzi (DPP8Tc) is an enzyme that is part of the prolyloligopeptidases, this family has members with known medical relevance, among them is the human orthological enzyme DPPIV, whose inhibition is used as one of the forms of treatment of type diabetes II. DPP8Tc was investigated in this work through the biochemical characterization and physical knockout of the dpp8tc gene alleles of the T. cruzi parasite of the CL Brener strain. The results indicate that DPP8Tc is a soluble dimeric enzyme active in 50mM tris buffer at pH between 7.5 and 8.0 and improves its activity with additives. The optimal temperature for enzymatic activity is around 28ºC and specific substrate, Gly-Pro-AMC. With the use of this substrate, KM parameters of 10.78 μM, Kcat of 1.67x10-3 s-1, Vmax 4.6x10-5 μmol of released AMC / min and Kcat / KM were obtained: 1.55x10μM-1s -1. Classical protease inhibitors exert low enzymatic inhibition of DPP8Tc. In contrast, DPPIV inhibitors exert a greater inhibition rate among them, the more potent IB-7 inhibits in 96.59% of DPP8Tc, with inhibition constant (Ki) of 8.2 nM. Other DPPIV inhibitors showed the following ICs-50: KS (IV) with 95.47 nM, IB-4 with 484.9 nM and, finally, KAII-23 with 2.7 μM. Enzymatic inhibition occurs primarily by inhibitors that possess the adamantyl group in their chemical composition, similar to the composition of the human DPPIV vidagliptin inhibitor. The optimal activity occurs around 28ºC, temperature required to the survival of the epimastigote form, indicating potential function in the barber. The simple knockout of the dpp8tc gene, decreased enzyme activity by 50%, fluorescence by 20% and the infection rate of the parasite DPP8Tc+- increased by 2.9%. Differences in the 5 'and 3' UTRs regions of the DPP8Tc gene alleles prevented the success of double knockout, necessitating the specific construction of a cassette directed to the knockout of the second allele, in order to fully understand the function of DPP8Tc from Trypanosoma cruzi.

Os linfócitos humanos apresentam na sua superfície a enzima NTPDase1 (ecto-apirase, ecto-difosfoidrolase; CD39; EC 3.6.1.5), responsável pela hidrólise do ATP e ADP extracelular e/ou outros nucleotídeos di ou tri fosfatados. A determinação da atividade da enzima foi padronizada através de método colorimétrico, o qual quantifica o fosfato livre liberado durante a reação. A NTPDase1 foi caracterizada através da demonstração de condições ótimas de incubação, como dependência de cálcio, pH, tempo de incubação e temperatura ótimos, além da obtenção de parâmetros cinéticos. Os resultados obtidos foram confirmados por uma baixa expressão de CD39 nos linfócitos humanos, verificada por análise citométrica, com utilização de anticorpo monoclonal correspondente. Este fato indica um baixo estado de ativação dos linfócitos, uma vez que o CD39 é considerado um marcador de ativação destas células. Posteriormente, foi determinada a atividade da NTPDase1 em linfócitos de pacientes imunodeprimidos pela infecção causada pelo HIV, os quais são acompanhados pelo monitoramento de sua carga viral no plasma e contagem de células T CD4+. A infecção pelo HIV resulta em alterações nas células imunes e na secreção de citocinas importantes na resposta patógenos. Nesta situação pode haver alterações bioquímicas na resposta imune, como por exemplo, alterações na hidrólise de nucleotídeos, ou seja, na atividade das enzimas que degradam nucleotídeos extracelulares. Os linfócitos encontram-se em estado de ativação crônica, o que faz com que até mesmo células não-infectadas pelo vírus, possam sofrer apoptose por ativação de caspases efetoras. Através da determinação da atividade da NTPDase nos linfócitos imunodeprimidos, verificou-se um aumento de sua atividade, acompanhado por uma maior expressão de CD39 na superfície destas células. Estes resultados sugerem que a NTPDase1 é importante para a manutenção da resposta imune, mantendo concentrações adequadas de ATP extracelular, o qual é essencial para certas funções imunes, mas também pode ser prejudicial no momento que induz apoptose nos linfócitos, o que poderia aumentar o estado de imunodepressão. Devido ao fato de que muitos dos pacientes HIV-positivos recebem terapia anti-retroviral, foi necessário verificar in vitro possíveis efeitos destas drogas sobre a atividade da NTPDase1. Neste caso, observou-se que as concentrações terapêuticas destas drogas não afetaram a atividade da enzima. Sendo assim, a atividade aumentada da NTPDase1 nestes pacientes, não é devida à interferência da terapia anti-retroviral.

A adenosina está presente em todos os tipos celulares exercendo um papel homeostático. Em sistema nervoso central e periférico seu papel neuromodulador é observado. A presença de adenosina no meio extracelular permite a ativação de receptores adenosinérgicos específicos, classificados em: A1, A2A, A2B e A3. A ativação dos receptores A1 e A2A, receptores de alta afinidade, está diretamente envolvida com o papel neuromodulador, visto que a sua ativação produz inibição e facilitação da liberação de neurotransmissores, respectivamente. A seleção de qual receptor será ativado, visto que exibem co-expressão em muitas regiões neurais, pode ser feita de acordo com os sítios de liberação ou produção de adenosina extracelular. Desta forma, receptores A1 seriam preferencialmente ativados pela adenosina liberada através dos transportadores bidirecionais de nucleosídeos e os receptores A2A preferencialmente ativados pela adenosina proveniente da degradação do ATP realizada por uma cascata enzimática. A hidrólise de ATP a adenosina é realizada pelas enzimas ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolases e ecto-5’-nucleotidase. Em ratos, a ativação do sistema adenosinérgico exerce seus efeitos neuromoduladores desde fases iniciais de desenvolvimento embrionário, alcançando o padrão adulto mesmo antes do nascimento. A ativação de receptores de adenosina na fase fetal e neonatal foi demonstrada ter como conseqüência o retardo no desenvolvimento global dos animais, bem como, ventriculomegalia e perda de massa cerebral branca. Esta informação levanta a questão da suscetibilidade do cérebro imaturo a certas drogas, tais como a cafeína. A cafeína é uma metilxantina com efeitos estimulantes, a qual exibe como base para seus efeitos o bloqueio inespecífico dos receptores de adenosina. No presente estudo, avaliou-se o efeito da administração de cafeína em diversos parâmetros. A administração aguda de cafeína, mas não a crônica, em ratos adultos foi capaz de alterar significativamente as atividades de hidrólise de ATP no hipocampo e de ADP no estriado. Este resultado poderia estar relacionado com a capacidade plástica do sistema adenosinérgico em restabelecer seu tônus em ratos adultos tratados cronicamente com cafeína. Além disto, verificou-se que a ação direta da cafeína afetou a produção de adenosina. A administração crônica de cafeína na água de beber de ratas mães durante a fase gestacional e lactacional alterou o padrão de hiperlocomoção induzido por MK-801, um antagonista de receptores NMDA glutamatérgicos, nos ratos filhotes aos 21 dias de vida, mesmo quando o acesso a cafeína foi retirado sete dias antes do teste. Além disto, o mesmo tratamento não alterou o limiar de dor de filhotes aos 14 e 50 dias de vida, bem como a analgesia induzida nestes animais aos 50 dias. Entretanto, quando os animais ainda recebiam cafeína no dia do teste, foi observado efeito analgésico somente nos ratos de 14 dias. A análise dos efeitos do tratamento sobre a degradação de acetilcolina e sobre a degradação de nucleotídeos em hipocampo de ratos jovens demonstrou que ambas as atividades foram alteradas. O conjunto de resultados desta tese indica que a intervenção no sistema adenosinérgico durante as fases gestacional e neonatal é capaz de desenvolver adaptações, provavelmente relacionadas ao aumento da expressão de receptores para adenosina, na tentativa de restabelecer o controle modulador adenosinérgico, considerada a importância dos sistemas avaliados para a manutenção do organismo.

Glicoesfingolipídios (GSL) são constituintes da membrana plasmática e possuem bases de cadeia longa (bases esfingóides) como componente estrutural lipídico. Açúcares podem ser adicionados à ceramida sintetizada de novo (rota 1), sintetizada pela reciclagem da esfingosina (rota 2) e em GSL reciclados através do Golgi (rota 3). A serina palmitoiltransferase (SPT) é a enzima marca-passo e catalisa o primeiro passo na biossíntese de novo destes componentes. A linhagem celular GRX, representativa das células estreladas hepáticas, expressa o fenótipo miofibroblástico e pode ser induzida in vitro a adquirir o fenótipo lipocítico. Ambos fenótipos possuem gangliosídios da série-a (GM2, GM1 e GD1a) bem como o seu precursor GM3, que são expressos como doublets em HPTLC (bandas 1 e 2, respectivamente). Para o estudo da biossíntese dos GSL neste modelo biológico, foram determinadas as condições ideais para a atividade da SPT, e foi avaliada sua atividade na fração microssomal nos dois fenótipos. Também foi determinada a contribuição de cada rota de biossíntese para as duplas bandas. As células foram pré-incubadas com 5mM de -cloroalanina (inibidor da SPT) ou com 25M de fumonisina B1 (inibidor da ceramida sintase) e então, [U-14C]galactose foi adicionada no meio de cultura na presença contínua dos inibidores. Culturas controles (sem inibidores) foram realizadas simultaneamente. Os lipídios foram extraídos, os gangliosídios purificados em colunas Sep-Pack C18 e analisados por HPTLC, a qual foi revelada por auto-radiografia e após, submetida à análise densitométrica. Em ambos fenótipos, a síntese de novo, a reciclagem da esfingosina e a reciclagem pelo Golgi contribuem com a biossíntese dos GSL No miofibroblasto, os doublets dos gangliosídios complexos (GD1a e GM1) são, principalmente, sintetizados pelas rotas de reciclagem; enquanto as bandas do GM2 e do GM3 têm uma participação importante da síntese de novo. No lipócito, as rotas de reciclagem são as mais importantes. Contudo, no lipócito, ambas bandas do GM2 e a banda 2 do GM3 apresentam considerável síntese pela rota de novo. Esta rota tem uma contribuição menor no lipócito do que no miofibroblasto, o que está de acordo com os níveis da atividade da SPT detectados nestes fenótipos. Isto sugere que os fenótipos miofibroblasto e lipócito utilizam pools de ceramida distintos para a síntese de seus GSL e que apresentam importantes diferenças entre as rotas biossintéticas, o que pode se refletir no seu comportamento celular.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-12-21T17:01:45Z No. of bitstreams: 1 2016_HugoTeixeiraGomes_Parcial.pdf: 2383705 bytes, checksum: 1bf5dc855939eb6127752ec5933d765d (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-26T20:06:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_HugoTeixeiraGomes_Parcial.pdf: 2383705 bytes, checksum: 1bf5dc855939eb6127752ec5933d765d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-26T20:06:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_HugoTeixeiraGomes_Parcial.pdf: 2383705 bytes, checksum: 1bf5dc855939eb6127752ec5933d765d (MD5) / O objetivo do trabalho foi avaliar a utilização de sistemas de imersão temporária na embriogênese somática de dendezeiros (Elaeis guineensis Jacq.), a partir de folhas imaturas de plantas adultas, caracterizar morfoanatômica e bioquimicamente os estádios embriogênicos obtidos no processo, além analisar os clones regenerados por marcadores ISSR e AFLP (MSAP). Num primeiro experimento, calos primários da variedade C2328 foram multiplicados por cinco subcultivos de 30 dias, em quatro diferentes sistemas de cultivo: semi-sólido, líquido sob agitação, além dos biorreatores de imersão temporária R.I.T.A.® e tipo frascos gêmeos (BIT). Em seguida, o biorreator mais eficiente foi avaliado isoladamente na multiplicação de calos de outras três variedades: B35-2932, B35-4323 e B35-1729. Posteriormente, a diferenciação dos embriões somáticos foi realizada em meio de MS suplementado com 12,3 μM de 2-iP e 0,54 μM de ANA. Após esse processo, calos contendo embriões somáticos em estádio torpedo foram cultivados por cinco subcultivos de 30 dias em sistema semi-sólido, R.I.T.A.® e BIT, para a regeneração de plantas. Ao final do cultivo, a fidelidade genética e epigenética dos regenerantes foi avaliada por ISSR e AFLP (MSAP). Num segundo experimento, calos primários, embriogênicos e pró-embriogênicos, calos com embriões diferenciados, embriões somáticos globulares e torpedos, além de embriões zigóticos maduros (controle), foram analisados e caracterizados morfoanatomicamente. Por fim, foram quantificados os níveis de açúcares, amido, ácidos graxos, aminoácidos e proteínas contidos em calos primários e embriogênicos, calos embriogênicos com embriões somáticos diferenciados, embriões somáticos torpedo e em regeneração, e plantas regeneradas. Observou-se que na multiplicação o uso de meio líquido e sistema R.I.T.A.® proporcionou aos cultivos as maiores taxas de propagação, propiciando índices de acúmulo de biomassa fresca de até 293,3%. Já na regeneração, observou-se que os melhores resultados foram obtidos quando o R.I.T.A.® foi utilizado, promovendo em média a regenerarão de 14,1 plantas por grama de material inoculado. Com o uso desse sistema, além de não terem sido constatadas variações na sequência do DNA dos propágulos produzidos, observou-se ainda a redução dos índices de alteração do padrão de metilação do epigenoma dos indivíduos regenerados e a diminuição das taxas de ocorrência de hipometilação do DNA das culturas propagadas. Em relação às análises morfoanatômicas, verificou-se que calos primários são constituídos por células meristemáticas apenas em sua região mais interna, enquanto que calos embriogênicos são compostos inteiramente por este padrão celular. A partir do desenvolvimento destes cultivos foi verificada a formação de embriões somáticos sem conexão com os tecidos de origem, constituídos inicialmente pela protoderme e pelo meristema fundamental. Com a maturação destes propágulos, observou-se também a presença de regiões procambiais dispersas pelo meristema fundamental, característica também constatada nos embriões zigóticos maduros. Quanto às análises bioquímicas, verificou-se que no início da multiplicação os calos primários foram os propágulos que apresentaram as maiores concentrações de açúcares solúveis e amido, e os calos embriogênicos os maiores índices de ácidos graxos, aminoácidos livres e proteínas. Após o fim dessa etapa, verificou-se que os teores de ácidos graxos, aminoácidos livres e proteínas não apresentaram variações expressivas. Por outro lado, constatou-se na diferenciação que os níveis de açúcares solúveis aumentaram consideravelmente ao mesmo tempo em que um significativo processo de mobilização do amido foi observado. Já na maturação, os açúcares solúveis e as proteínas foram os compostos que não apresentaram grandes alterações. Nessa etapa, verificou-se uma queda considerável nos valores dos ácidos graxos e aminoácidos livres concomitantemente a elevação dos níveis de amido. Por fim, na regeneração observou-se que os teores de açúcares solúveis, ácidos graxos e proteínas decaíram enquanto que as taxas de amido e aminoácidos livres aumentaram de forma significativa. / The aim of this study was to evaluate the use of temporary immersion systems in oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) somatic embryogenesis from immature leaves of adult plants, to characterize morphoanatomical and biochemically the embryogenic stages, and assessing regenerated clones through Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) and Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) (MSAP) markers. In a first experiment, primary calli from C2328 variety of oil palm were multiplied by up to five 30-days subcultures in four different culture systems: semi-solid, liquid under agitation, R.I.T.A.® (Recipient for Automated Temporary Immersion) bioreactors, and Twin Flask - TIS (Temporary Immersion System) bioreactors. Then, the most efficient system was evaluate individually for calli multiplication of another three oil palm varieties: B35-2932, B35-4323 e B35-1729. After multiplication, the calli were transferred to a MS medium with 12.3 μM 2-iP and 0.54 μM NAA in order to differentiate somatic embryos. Under these condition, the material was cultivated until most of the somatic embryos reached the torpedo stage, when they were transferred to R.I.T.A.® and TIS systems for additional five 30-days subcultures for plant growth. At the end, ISSR and AFLP (MSAP) were used to evaluate the genetic and epigenetic fidelity among the regenerate plants. In a second experiment, primary calli, embryogenic calli, calli with pro-embryos, calli with differentiated somatic embryos, and globular and torpedo-shaped embryos, as well as mature zygotic embryos (control), were characterized morphoanatomically. Finally, the sugars, starch, fatty acids, amino acids and proteins were extracted, identified and quantified at various stages of embryogenesis: primary and embryogenic calli, embryogenic calli with differentiated somatic embryos, torpedo somatic embryos, including those under regeneration, as well as regenerated plants. It was observed that the calli multiplication using liquid medium and R.I.T.A.® bioreactors provided the highest rates of propagation, providing fresh biomass accumulation rates of up to 293.3%. In the regeneration, the best results were also obtained in the R.I.T.A.® bioreactors, with an average of 14.1 plants per gram of inoculated material. Using this system, variations in the DNA sequence of propagules produced were not found. There was also a reduction of the epigenome methylation and decrease in DNA hypomethylation levels from evaluated regenerants. Regarding morphoanatomical analysis, it was found that primary calli are composed of meristematic cells only in its most inner region, whereas embryogenic calli are entirely composed by this cellular pattern. From these cultures was observed the formation of somatic embryos, without connections with the parental tissue, initially constituted by protoderm and fundamental meristem. With the maturation, the somatic embryos presented procambial regions, a characteristic also observed in mature zygotic embryos. Biochemical analyzes showed that at the onset of multiplication, the primary calli were the propagules with the highest concentrations of soluble sugars and starch, and the embryogenic calli the ones with the highest levels of fatty acids, free amino acids and proteins. At the end of this stage, the levels of fatty acids, free amino acids and proteins showed no significant changes. During the differentiation phase, the soluble sugar levels increased considerably, at the same time as a significant starch mobilization process was observed. In the maturation, soluble sugars and proteins were compounds that did not show significant changes. At this stage, a considerable decrease in the amounts of fatty acids and free amino acids was observed, concomitantly with the increase in starch levels. In the regeneration, the levels of soluble sugars, fatty acids and proteins declined, while the starch and free amino acids increased significantly.

Tesis de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica de proteínas y biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las lacasas son enzimas de la familia de las multi-cobre oxidasas que han suscitado mucho interés debido a su amplia especificidad de sustrato, la variabilidad de sus propiedades entre cada especie, y su todavía elusivo mecanismo de reacción. La presencia de cuatro centros de cobre en su sitio activo la convierte en un modelo interesante para el estudio de la relación entre la estructura y la función de proteínas. Estos átomos de cobre son además responsables de las propiedades catalíticas de las lacasas y exhiben propiedades redox y espectroscópicas que son propias de estas enzimas. Es posible encontrarlas en hongos, plantas y en procariontes. Las lacasas bacterianas poseen muchas ventajas desde el punto de vista aplicado por sobre las lacasas de hongos, que hasta hoy se encuentran mejor caracterizadas. En general poseen una mayor termoestabilidad, y exhiben un perfil de pH distinto, lo que permite ampliar el número de aplicaciones de estas enzimas. Sus propiedades las hacen buenas candidatas para diversas aplicaciones biotecnológicas, que van desde la industria textil hasta la industria de alimentos, e incluyen su aplicación como biosensores, su uso en bioremediación de suelos y aguas entre otros. En este trabajo se caracteriza una lacasa recientemente detectada en el microorganismo termófilo antártico Geobacillus sp. ID17. Esta es la primera lacasa caracterizada de una bacteria antártica, y la primera lacasa intracelular descrita de este género bacteriano. La purificación de la enzima se logró utilizando cromatografía de intercambio aniónico y exclusión molecular. Luego de obtener una muestra pura se determinaron sus propiedades bioquímicas y su rango de sustratos. La lacasa purificada demostró poseer una alta estabilidad térmica a pH neutro y 55 ºC. Se detectó la mayor actividad enzimática en el rango entre 55 y 60 ºC, a pH 7,5. Además la enzima posee una mayor selectividad de sustrato que otras lacasas descritas a la fecha. Adicionalmente, se describe la purificación parcial de una segunda enzima presente en el extracto crudo del Geobacillus sp. ID17, que demostró poseer una actividad peroxidasa dependiente de cobre / Laccases are enzymes from the Multi-Copper Oxidase family that have gathered high attention due to their wide range of substrates, their interspecies variability and their still elusive mechanism of action. The presence of four copper atoms in their active site makes them an interesting model for the study of the relationship between the structure and function of proteins. These copper atoms are responsible for the catalytic properties of laccases and exhibit redox and spectroscopic features unique to this class of enzymes. It is possible to find them in fungi, plants, and prokaryotes. Bacterial laccases display many advantages over fungal laccases for their application. They have, in general, a higher thermal stability and a different pH profile, which contributes to widen the possible application of laccases. In this thesis a new laccase from an Antarctic microorganism, Geobacillus sp. ID17, is purified and characterized. This is the first Antarctic bacterial laccase to be functionally described, and the first intracellular laccase from this bacterial genus. The pH profile, catalytic constants, and thermal behavior of the enzyme is described. A screening of different laccase substrates reveals that this new laccase has different substrate specificity than the commercial laccase from Trametes versicolor. The enzyme was purified using anionic exchange and size-exclusion chromatography. After obtaining a pure enzyme, its biochemical parameters and substrate specificity were determined. The purified laccase showed high thermal stability at neutral pH and 55 ºC. The highest activity was detected between 55 ºC and 60 ºC, at pH 7,5. Additionally, this enzyme shows higher substrate selectivity than other previously described laccases. Additionally, the partial purification of a second enzyme present in the crude extract of Geobacillus sp. ID17, which seems to display a copper dependent peroxidase activity, is described

Resumo: O provável fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado de arqueas a mamíferos e sofre uma modificação pós-traducional única e essencial, em que uma lisina específica é convertida em um resíduo de hipusina. Este fator já foi relacionado a início de tradução, transporte nucleocitoplasmático, decaimento de mRNA e proliferação celular, mas a função crítica de eIF5A na célula ainda não foi totalmente esclarecida. Ainda que o papel de eIF5A na tradução geral tenha sido questionado, dados recentes de nosso laboratório, incluindo os resultados deste trabalho, restabelecem uma função para eIF5A na tradução e evidenciam a sua atuação na etapa de elongação ao invés de início. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi ampliar os estudos do papel de eIF5A na síntese proteica. Para isso, foram realizadas análises de interação genética e de perfil polissomal de linhagens que combinam o alelo mutante de eIF5A, tif51A-3, e de fatores envolvidos na etapa de início (eIF4E, eIF3 e eIF5B) ou elongação (eEF2) da tradução. As análises de perfil polissomal utilizando mutantes duplos de eIF5A e de fatores de início de tradução mostram uma diminuição do efeito de perda de polissomos característico de mutantes de início de tradução. Além disso, o perfil polissomal de mutantes de eIF5A é bastante semelhante ao do mutante de elongação. Foi também observado que a depleção de eIF5A provoca uma diminuição significativa na síntese proteica total e um aumento no tempo de trânsito ribossomal, confirmando os resultados obtidos nas análises de perfil polissomal. Também foi avaliada a influência de eIF5A no processo de elongação da tradução utilizando-se repórteres contendo a IRES do vírus CrPV, a qual é independente de todos os fatores de início de tradução conhecidos. Foi observada uma diminuição... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The putative eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A) is highly conserved from archaea to mammals, essential for cell viability and it is the only cellular protein known to contain the essential amino acid hypusine. eIF5A has also been involved with nucleocitoplasmatic transport, mRNA decay and cell proliferation, however its critical function in the cell is not completely understood. Although a role for eIF5A in general translation has been questioned, our recent findings, including those described in this study, showed that eIF5A has a function in protein synthesis and it is related with the elongation step of translation instead of initiation. Therefore, the aim of this study was to investigate the role of eIF5A in protein synthesis. For this purpose, we tested genetic interactions and performed polysomal profile analysis of yeast strains that combine the eIF5A mutant tif51A-3 with translation initiation (eIF4E, eIF3 and eIF5B) or elongation (eEF2) mutants. The polysome profile analysis of the double mutants of eIF5A and canonical initiation mutants showed a decrease in polysome run-off. In addition, the polysome profile of eIF5A mutant is quite similar to that of the eEF2 mutant. Also, we observed that the depletion of eIF5A causes a significant decrease in total protein synthesis and an increase of the average ribosomal transit time. These results are in agreement with the polysome profile data. The influence of eIF5A in translation elongation was also evaluated using reporters containing the CrPV IRES, which is independent of all factors known to be involved in translation initiation. We observed a decrease in IRES activity in the eIF5A and eEF2 mutants, when compared to the wild type. In addition, two other conditional eIF5A mutants (tif51AK56A and tif51AQ22H/L93F) which produce stable eIF5A at the restrictive temperature were also analyzed... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Sandro Roberto Valentini / Coorientador: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Carla Columbano de Oliveira / Banca: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Banca: Flávio Henrique da Silva / Banca: Mário Henrique de Barros / Doutor

Orientador: Mário Sérgio Palma / Banca: Walter Filgueira de Azevedo Júnior / Banca: João Rugiero Neto / Banca: Shaker Chuck Farah / Banca: Marcos Roberto de M. Fontes / Resumo: Hoje em dia, em todo o mundo, existem algumas doenças responsáveis por uma grande taxa de mortalidade em humanos. Dentre essas doenças, pode-se destacar a tuberculose, infecção provocada pela bactéria Mycobacterium tuberculosis, que é a principal causa de morte em humanos devido a um único agente infeccioso. Dentre as prioridades para o combate à tuberculose, o desenvolvimento de novas drogas é premente para o desenvolvimento de um tratamento quimioterápico eficaz. Sob este aspecto, as enzimas da via do ácido chiquímico, representam bons exemplos da utilidade de tal abordagem aplicada a constituintes enzimáticos de uma rota metabólica. A via do ácido chiquímico é responsável pela síntese dos aminoácidos aromáticos, do ácido p-aminobenzóico e outros metabólitos essenciais, tais como ubiquinona, menaquinona e vitamina K. A via do chiquimato, encontrada em plantas, algas, fungos e bactérias, foi também encontrada recentemente em vários parasitas apicomplexos (Roberts et al.; 1998); entretanto, essa via metabólica não é encontrada em mamíferos. As enzimas Chiquimato Quinase e 5-Enolpiruvilchiquimato-3-Fosfato Sintase (EPSPS), a quinta e a sexta enzimas, respectivamente, nessa via metabólica, têm sido reconhecidas como alvos importantes para o desenvolvimento de herbicidas e drogas antibióticas. No presente estudo, a troca isotópica Hidrogênio / Deutério e a espectrometria de massas com ionização electrospray foram usadas para examinar as mudanças conformacionais em solução, sofridas pelas enzimas Chiquimato Quinase e 5- Enolpiruvilchiquimato-3-Fosfato Sintase (EPSPS) de Mycobacterium tuberculosis, tanto na presença como na ausência de alguns de seus ligantes. A incorporação de deutério foi observada para ambas as enzimas. Para a EPSPS, a apoenzima foi a forma que mais incorporou deutério ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nowadays all around the world there are some diseases that cause a high index of human lethality. Among these it should be highlighted the infectious disease tuberculosis, which is the top deadly disease caused by only one agent, the bacteria Mycobacterium tuberculosis. As the currently available drugs are not suitable for the control of tuberculosis, it became vital the development of novel drugs for this purpose. Useful drugs are being developed to inhibit some enzymes of the shikimic acid pathway. This via is responsible for the synthesis of aromatic amino acids, such as the p-aminobenzoic acid and other essential metabolites, such as ubiquinone, menaquinone and K vitamin. The shikimate pathway exists in plants, algae, fungi, bacteria and was also found in some apicomplex parasites; however, it is not present in mammals. The Shikimate Kinase and 5-Enol-Pyruvyl-Shikimate-3-Phosphate Synthase (EPSPS), the fifth and sixth enzymes, respectively, present in this pathway, have been considered as important targets to development of herbicides and antibiotic drugs. In the present work the isotopic change Hydrogen/Deuterium and the electrospray ionization mass spectrometry were used to investigate the occurrence of conformational in both enzymes, in presence and absence of some of their ligands (substrates /inhibitors). The deuterium incorporation was observed in both enzymes. The apoenzyme of EPSPS, incorporated more deuterium then the enzyme complexed to phosphoenolpiruvate, which in turn incorporated more deuterium than the enzyme compled to glyphosate. The apoenzyme of Shikimate Kinase also incorporated more deuterium than the complexed form with magnesium chloride-shiquimic acid-ADP. In both enzymes, the regions less dynamics were those containing the amino acids residues of the binding sites of substrates and/or inhibitors... (Complete abstract click eletronic access below) / Doutor

Orientador : Prof. Dr. Guilherme Lanzi Sassaki / Coorientador : Prof. Dr. Arquimedes Paixão de Santana Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 29/03/2017 / Inclui referências : f. 52-58 / Resumo: Oligossacarídeos do leite humano (HMOs) apresentam alta homologia com a superfície celular, já que sua biossíntese é feita a partir de mecanismos semelhantes ao da produção de glicolipídeos e glicoproteínas presentes nas células epiteliais. Conhecidas funções dos HMOs já foram relacionadas, dentre elas as principais são: 1- sua capacidade em promover o crescimento da microbiota do neonato 2- competir com a mucosa intestinal pela ligação bacteriana 3- promover a defesa do hospedeiro. No presente trabalho, foi avaliada a atividade anti-inflamatória do 2'-FL (2'- fucosil-lactose) e realizados ensaios de Docking e determinação da conformação absoluta em solução por RMN (ressonância magnética nuclear) desta molécula além do isolamento de outras frações oligossacarídicas. Para o isolamento dos oligossacarídeos foi, primeiramente, realizado um processo de deslipidificação através de centrifugação a 12.000 rpm na temperatura de 4 ºC. Feito isso, o material foi submetido à precipitação etanólica (2:1, v/v) para a remoção de proteínas, onde o sobrenadante foi então coletado e liofilizado, sendo então submetido ao processo de fracionaamento através de cromatografia líquida, em uma coluna de 30 × 4 cm (70 mL) utilizando como fase estacionária carvão ativado-150 mesh e celite 545 (1:1). Como fase móvel, um gradiente contínuo de H2O:EtOH, variando de 100:0 até 40:60 foi utilizado. Após esta etapa, visando diminuir o conteúdo de lactose, as amostras contendo HMOs foram submetidas à cromatografia em coluna de sílica. Neste primeiro processo foi obtida uma quantidade significativa de 2'-FL, porém para a purificação do LDFT foi ainda realizada fracionamento por cromatografia líquida de troca iônica DEAE-Sepharose (Dietilaminoetil Sepharose) utilizando H2O inicialmente e depois uma solução de H2O:Íon amônio como fase móvel. Os oligossacarídeos então isolados foram avaliados quanto a sua capacidade pró e antiinflamatória, através da análise de suas capacidades em estimular receptores TLR (receptores do tipo Toll like). Quando comparado com o tratamento com LPS (Lipopolissacarídeo) (controle positivo) o 2'-FL na concentração de 0,02 mg/mL diminuiu o processo inflamatório 26,26%; 0,2 mg/mL em 24,18%; 2 mg/mL em 31,63%. Mostrando assim a capacidade anti-inflamatória deste HMO. Além disto, a partir da caracterização estrutural e estudos conformacionais por RMN verificou-se uma estrutura semelhante a anzol para o 2'-FL. Ensaios de Docking foram realizados, onde foram encontrados possíveis sítios de ligação, comprovando assim a possibilidade de interação entre receptores TLR (receptor do tipo Toll 4) e 2'-FL. Palavras-chave: Oligossacarídeos do leite humano, TLR, atividade biológica, RMN, Docking. / Abstract: Human milk oligosaccharides (HMOs) bare high homology to cellular surface in part because their biosynthesis occurs with great similarity to glycolipids and glycoproteins production mechanisms. Evidences present three major functions to these oligosaccharides; 1- prebiotic action for infant gut; 2- pathogen anti-adhesive barrier; 3- immunomodulatory activity. In the presented work were evaluated the anti-inflammatory activity of 2'-FL (2 fucosyllactose) and undertaken Docking and conformation NMR assays. The first step of the isolation process was deslipidification through centrifugation process at 12.000 rpm at 4 ºC. After that, the material was subjected to an ethanolic precipitation (2:1, v/v) aiming the protein removal where the supernatant was collected and freeze-dried. The next step was the utilization of a 30 X 4 cm (70 mL) column of activated-charcoal 150 mesh and celite 545 (1:1) seeking to obtain different fractions. A continuum gradient of H2O:EtOH was used varying from 100:0 to 40:60 as mobile phase. In this stage, a great quantitiy of 2'-FL was obtained but to achieve the LDFT fraction purification a further step was necessary. Willing to obtain LDFT, an ionic DEAE Sepharose (GE Healthcare) column was utilized with an initial water elution and later a water solution with a 2% content of amoniun ion. 2'-FL was then evaluated to its pro and anti-inflammatory capacity through the magnitude of activation of NF-kB by QUANTI-Blue measurement. When compared to the LPS treatment (positive control) 2'-FL at 0.02 mg/mL lessen the inflammatory activity by 26.26%; 0.2 mg/mL by 24.18%; 2 mg/mL by 31.63%. This result shows the anti-inflammatory capacity of this HMO. Besides this, Docking and conformational NMR assay proved the interaction between TLR4 (Toll like receptor 4) and 2'-FL and present a fish hook like structure for 2'-FL. Key words: Human Milk Oligosaccharides, TLR, NMR, Docking, Biological activity.