Memoria para optar el título de Bioquímico / Cupriavidus necator JMP134 (pJP4), antes denominada Ralstonia eutropha JMP134 (pJP4), es una bacteria ambiental capaz de utilizar los compuestos contaminantes 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) y 3-clorobenzoato (3-CB) como única fuente de carbono y energía. Las vías metabólicas que permiten dichas capacidades se encuentran codificadas en los genes cromosomales benABC y benD, y en la vía de degradación de clorocatecoles, codificados por los genes tfd del plasmidio pJP4. Se ha descrito que el regulador TfdR/S (familia LysR) activa la expresión de los genes tfd. El regulador de la vía de degradación de catecol, CatR, tiene en común aspectos genéticos, funcionales y evolutivos con el regulador TfdR/S. Estos antecedentes hacen posible proponer que CatR podría estar influyendo en la expresión de los genes tfd. En esta memoria se estudió el papel de CatR en la degradación de 3-CB y 2,4-D. Para esto se identificaron los putativos genes catR en el genoma de C. necator, encontrándose dos, catR1 y catR2, cuyo contexto genómico sugiere que podrían participar diferencialmente en el metabolismo de cloroaromáticos. Estos genes fueron clonados e introducidos en C. necator. Adicionalmente, se obtuvo una cepa de C. necator mutante del gen catR1 mediante una estrategia de doble recombinación homóloga. Esta mutante fue complementada con los genes catR1 o catR2. Estas cepas fueron estudiadas mediante curvas de crecimiento en medios de cultivos con distintas concentraciones de 3-CB, 2,4-D o benzoato (BZ). En cada caso se determinó la densidad óptica en fase estacionaria y la velocidad de crecimiento. Además, se evaluó la degradación de 3-CB y BZ mediante la detección del compuesto por HPLC. Estos estudios permitieron determinar que tanto CatR1 como CatR2 aumentan la degradación de 3-CB, puesto que la sobreexpresión de sus genes aumentó la velocidad de crecimiento (μ) en ±2 veces. Consistente con lo anterior, la ausencia de CatR1 disminuyó la velocidad de crecimiento en ±3 veces en 3-CB y la tasa de degradación de este sustrato disminuyó ±3 veces, lo cual también fue observado durante el crecimiento en BZ. Adicionalmente, los estudios de complementación realizados para corregir la ausencia de CatR1, con los genes catR1 y catR2 por separado, mostraron recuperar el fenotipo silvestre en ambos sustratos. Por otra parte, la degradación de 2,4-D fue mejorada por CatR2, puesto que la sobreexpresión del gen catR2 impidió la disminución en el rendimiento celular que se observa en la cepa silvestre al aumentar la concentración de 2,4-D. En cambio, la velocidad de crecimiento en 2,4-D a altas concentraciones de sustrato se vio desfavorecida por la sobreexpresión del gen catR1. Los resultados de este trabajo indican que los reguladores CatR1 y CatR2 modifican el crecimiento en estos compuestos, probablemente a través de la modulación de la expresión de los genes ben y tfd. Lo anterior se basa en que ambos reguladores poseen cercanía estructural con el regulador TfdR y compartirían la capacidad de interactuar con las respectivas regiones promotoras. En este contexto, se propone un modelo de la regulación ejercida por CatR1 y CatR2 en C. necator. Este modelo sugiere que estos reguladores modulan diferencialmente los genes tfd, de modo que CatR2 activa los módulos génicos tfd I-II y el gen tfdA, mientras que CatR1 activa sólo el módulo tfd I. En base a modelamiento molecular, se predijo que las diferencias observadas entre el regulador CatR1 y CatR2 podrían ser explicadas por la afinidad de unión a DNA y no por la unión del inductor / Cupriavidus necator JMP134 (pJP4) (Ralstonia eutropha) is a soil bacterium that is able to use the pollutants 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), and 3-chlorobenzoate (3-CB), as sole carbon and energy source. The metabolic pathways are encoded in the chromosome by the benABC and benD genes and in the pJP4 plasmid, by the chlorocatechol degrading, ortho ring cleavage pathway tfd genes. It has been reported that the TfdR/S regulator (LysR family) activates the expression of the tfd genes. The regulator of the catechol degradative pathway, CatR, shares genetic, functional and evolutionary aspects with the TfdR/S regulator, making possible that CatR may influence the expression of tfd genes. In this work, the role of CatR in 3-CB or 2,4-D degradation was studied. Two putative genes encoding CatR regulators were identified in the genome of C. necator, catR1 and catR2, genetic contexts at which suggest that they may be differentially involved in chloroaromatic metabolism. These genes were cloned and overexpressed in C. necator. In addition, a catR1 gene mutant was obtained by a double recombination strategy. This mutant was complemented with either the catR1 or catR2 genes. These strains were studied by growth curves in cultures grown at different concentrations of 3-CB, 2,4-D or benzoate (BZ). In each case, the optical density at the stationary phase and the growth rate were determined. In addition, the degradation of 3-CB or BZ was monitored by HPLC. These studies showed that both regulators increase degradation of 3-CB, since overexpression of catR1 or catR2 genes provoked a two-fold increase in growth rate. Accordingly, a three-fold decrease in growth rate and 3-CB degradation rate was determined in the absence of catR1. The same was observed during growth in BZ. In addition, complementation with catR1 or catR2 genes recovered wild type growth phenotype with both substrates. On the other hand, the degradation of 2,4-D was improved for CatR2, because the overexpression of catR2 gene avoided the decrease in cell yield at higher concentrations of 2,4-D. In contrast, the degradation of 2,4-D at higher concentrations of this substrate was impaired by overexpression of catR1. The results of this work show that regulators CatR1 and CatR2 modify growth on 2,4-D or 3-CB, probably through modulation of the expression of the ben and tfd genes. The latter assumption is based on that both regulatory proteins are structurally related to TfdR and that both could interact with the respective promoter regions. In this context, a model for the regulation by CatR1 and CatR2 in C. necator is proposed. This model suggests that both regulatory proteins differentially modulates tfd genes, with CatR2 activating both tfd modules and tfdA gene, whereas CatR1 only activates module tfd- I. Based on molecular modelling, it was predicted that differences between CatR1 and CatR2 would be explained by DNA binding affinity and not by inducer binding

Memoria para optar el título de Bioquímico / El hongo filamentoso Sphaceloma rhois sintetiza giberelinas, principalmentela giberelina A4, metabolitos secundarios diterpénicos activos como fitohormonas.En esta memoria de título se caracterizó la biosíntesis de giberelinas por estehongo a nivel de las reacciones químicas, de las enzimas que las catalizan y de suregulación. Mediante la administración de precursores marcados con 14C a cultivoslíquidos de S. rhois, se determinó la secuencia de reacciones de oxidación de labiosíntesis de GA4a partir del ácido ent-kaurenoico. Los precursores previos alGA12aldehído fueron metabolizados completamente por cultivos líquidos delhongo y se transformaron en los productos 3β-hidroxilados [14C]GA14(giberelinade 20 carbonos) y [14C]GA4(giberelina 19, γ10 lactónica de 19 carbonos). Además,al realizar incubaciones a tiempos cortos, se detectaron los intermediarios ácidoent-7α-hidroxi[14C]kaurenoico y el [14C]GA12aldehído. No se detectaron productosno hidroxilados. La giberelina [14C]GA14agregada a los cultivos fue convertida en[14C]GA4, el producto final de la secuencia. Todo esto permite concluir que el ácidoent 7α-hidroxikaurenoico, el GA12aldehído y el GA14son intermediarios en lasíntesis de GA4. Todos los intermediarios posteriores al GA12aldehído son 3β-hidroxilados debido a que la reacción de hidroxilación en C3 ocurre sobre esteprecursor. No se forman productos no hidroxilados a partir de GA12aldehído, porlo tanto, en este sistema está presente exclusivamente la vía 3β-hidroxilada. Lareacción de oxidación del C20 hasta CO2que forma el producto final GA4, fueinvestigada en detalle a partir de [14C]GA12, encontrándose que los cultivos delhongo metabolizan este sustrato para dar el producto lactónico [14C]GA9(derivadode la oxidación a CO2) junto con el producto C20 carboxilato [14C]GA25. Además,se forma el intermediario C20 aldehído, [14C]GA24, que sería el precursor delproducto lactónico y del producto C20 carboxilato. El nitrato de amonio o laglutamina, presentes en el medio de cultivo, reducen 3 veces la velocidad deoxidación del ácido ent-7α-hidroxikaurenoico, lo que sugiere que la biosíntesis deGAs podría ser regulada por compuestos nitrogenados en este microorganismo. En fracciones microsomales obtenidas del micelio se determinó el requerimiento de cofactores de las reacciones de oxidación del ácido ent- [14C]kaurenoico hasta [14C]GA14, las que dependen en forma absoluta de NADPH, FAD y O2. Esto, junto con la demostración en los cultivos de las reacciones de síntesis de [14C]kaurenolidos y ácidos [14C]fujenoicos a partir de ácido ent- [14C]kauradienoico y de ácido ent-6α,7α-dihidroxi[14C]kaurenoico, indica que la síntesis de [14C]GA14es catalizada por una o más monooxigenasas P450. La secuencia biosintética de GA4encontrada en S. rhois es similar a la descrita en Fusarium fujikuroi que produce principalmente GA3y concentraciones menores GA4y GA7. Las rutas de biosíntesis son similares en cuanto a la reacción de 3β-hidroxilación (que ocurre en una etapa temprana), en los intermediarios de la secuencia y en la naturaleza de las oxidasas. Por otra parte, esta secuencia difiere de la del otro hongo productor de giberelinas, Phaeosphaeria sp., que produce GA4y GA1a través de intermediarios no hidroxilados / The filamentous fungus Sphaceloma rhois synthesizes gibberellins, mainly GA4, diterpenoid secondary metabolites active as phytohormones. In this work, gibberellin biosynthesis by this fungus was characterized at the chemical, enzymatic and regulatory levels. The oxidative reaction sequence of GA4 biosynthesis from ent-kaurenoic acid was determined by adding 14C-labeled precursors to liquid cultures of S. rhois. These were completely metabolized and transformed into the 3-hydroxylated products [14C]GA14 (C20 gibberellin) and [14C]GA4 (C19 lactonic gibberellin). Furthermore, in short term incubations ent-7α-hydroxy[14C]kaurenoic acid and [14C]GA12 aldehyde were detected as intermediates. Non-hydroxylated products were not detected in any incubation. [14C]GA14 added to the cultures was converted into [14C]GA4, the final product of the sequence. This indicates that ent-7α-hydroxykaurenoic acid, GA12 aldehyde and GA14 are intermediates in GA4 synthesis. All intermediates after GA12 aldehyde are 3-hydroxylated due to 3-hydroxylation reaction over this precursor. Non-hydroxylated products are not formed from GA12 aldehyde, thus, the 3-hydroxylated pathway is present exclusively in this fungal system. C20 oxidation to CO2 which gives the lactonic C19 product, was investigated in detail from [14C]GA12. S. rhois cultures metabolized this substrate to the lactonic product [14C]GA9 (derived from oxidation to CO2) together with the C20 carboxylic acid product [14C]GA25. In addition the C20 aldehyde intermediate, [14C]GA24, accumulated, which would be precursor of both the lactonic and C20-carboxylic acid products. Ammonium nitrate or glutamine present in the cultures reduced by a factor of 3 the oxidation rate of ent-7α-hydroxykaurenoic acid, suggesting that GA biosynthesis in S. rhois would be regulated by nitrogen compounds. The cofactor requirement of oxidation reactions involved in [14C]GA14 synthesis from ent-[14C]kaurenoic acid was determined in mycelial microsomal fractions. An absolute requirement of NADPH, FAD and O2 was found for these steps, which together with the demonstration of [14C]kaurenolide and [14C]fujenoic acid synthesis from ent-[14C]kauradienoic acid or ent-6α,7α-dihydroxy[14C]kaurenoic acid, indicate that GA14 synthesis is catalyzed by a P450 monooxygenase in S. rhois. The biosynthetic pathway to GA4 in S. rhois is similar to that described in Fusarium fujikuroi, a GA3, GA4 and GA7 producing fungus. Both microorganisms utilize similar intermediates and the same kind of oxidases. In contrast, this sequence differ from that found in Phaeosphaeria sp. which produces GA4 and GA1 through non-hydroxylated intermediates

Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización en Proteínas Recombinantes y Biotecnología y Memoria para optar Título Profesional de Bioquímico / El manganeso es un componente esencial para los organismos, pues está involucrado en muchos de los procesos elementales de la célula. El estado de oxidación +2 es la forma más abundante de este metal en los sistemas biólógicos, en donde es requerido por una amplia diversidad de enzimas y proteínas. El ion Mn2+ destaca además por su capacidad de controlar especies reactivas del oxígeno al interior de la célula. Aún cumpliendo papeles tan importantes, se ha determinado que altas concentraciones intracelulares de Mn2+ pueden ser tóxicas. Además, su deficiencia también es responsable de ocasionar trastornos metabólicos que influyen en el desarrollo de los organismos. En el marco de comprender la dinámica de la homeostasis del ion Mn2+ en la célula, se han caracterizado varios transportadores que participan en la movilización y almacenamiento de este ion. La existencia de estos sistemas específicos demuestra la importancia que posee el mantener el control estricto de las concentraciones de Mn2+ para la célula. Por otra parte, se ha determinado que este ion es capaz de modular la actividad transcripcional de muchos genes, sin embargo, se desconocen los mecanismos moleculares a través de los cuales es capaz de realizar esta actividad. Ceriporiopsis subvermispora es un hongo que se ha caracterizado por ser un eficiente basidiomicete que degrada la lignina. Nuestro grupo ha caracterizado en profundidad los procesos involucrados en la degradación de este polímero natural y se ha determinado que una de las enzimas que utiliza este hongo es muy dependiente de la disponibilidad del ion Mn2+. A partir de esta y otras evidencias, realizó un estudio de la influencia de este ion sobre la expresión de la maquinaria ligninolitica en C. subvermispora. Los resultados obtenidos permitieron postular la existencia de mecanismos complejos asociados al control transcripcional de la enzima ligninolítica, sin lograr establecer la forma en que participaba el Mn2+. Estos antecedentes sugerían que aspectos fundamentales de la fisiología del Mn2+ en C. subvermispora debían ser abordados. En el trabajo aquí presentado se documenta la identificación de tres componentes de la respuesta a Mn2+, lograda a través del secuenciamiento de regiones genómicas. Estas regiones fueron identificadas parcialmente por estudios previos con la técnica de cDNA-AFLP aplicada para estudiar la homeostasis de Mn2+ en C. subvermispora. Dos de los segmentos identificados en este estudio muestran una alta homología a transportadores que han sido muy bien caracterizadas en la movilización de este metal: un homólogo del transportador de fosfatos inorgánicos de Saccharomyces cerevisiae PHO84, y un transportador de sideróforos. Además, se identificó un segmento que proviene de un marcador inducible por Mn2+, y su función predicha corresponde a una epimerasa que podría participar en el control de especies radicalarias del oxígeno. A partir de las funciones propuestas para estos componentes, se establece un modelo integral del control de la concentración del ion Mn2+ y la actividad ligninolítica de este hongo. Finalmente, se presentan los resultados de la identificación de un motivo presente en promotores de genes que son regulados por Mn2+, que sería específico para este ion. La existencia de este elemento permitiría explicar la respuesta transcripcional previamente estudiada en C. subvermispora, postulando un mecanismo de control transcripcional a través de factores proteicos capaces de reconocer el ion Mn2+. Esta evidencia es contrastada con los hallazgos documentados en el último tiempo para el control ejercido por Mn2+, sugiriendo que este elemento sea funcional / Manganese is a fundamental component for most organisms, because it is involved in many elemental cell processes. This metal is mainly found in biological systems with an oxidation state of +2, being required by an enormous diversity of enzymes and proteins. Mn2+ is highlighted by its ability of controlling reactive oxygen species inside the cell. Although this ion has a fundamental physiological role, it has been determined that high intracellular concentrations of Mn+2 can cause severe toxicity. Besides, the deficiency of this ion is also responsible for metabolic alterations that may affect the development of an organism. Focused on understanding dynamics of cellular Mn2+ homeostasis, there have been characterised several carriers involved in the processes of transport and storage of this ion. These specific systems maintain a strict control of the concentration Mn2+ ion, which is a very important process for the cell. There is evidence that this ion is capable of regulating the transcriptional activity of many genes, however the molecular mechanisms involved in this control are still unknown. Ceriporiopsis subvermispora is a basidiomycete fungus that has been characterised for being very efficient in lignin breakdown. The metabolic machinery employed by this fungus to degrade this compound has been studied by our group and we have determined one of its members, the manganese peroxidase, is widely dependent on Mn2+ availability. This evidence along with other studies, prompted our group to conclude that this ion could influence the expression of ligninolytic enzymes in C. subvermispora. We explored this proposal and the results obtained were not sufficient for establishing the role of Mn2+, but suggested the involvement of complex mechanisms that were capable of regulating ligninolytic enzymes. To investigate the importance of Mn2+ in the expression of ligninolytic machinery, fundamental knowledge about Mn2+ homeostasis had to be understood. In the present work, identification of three components of Mn2+ homeostasis are documented. These results were obtained by sequencing genomic regions, that were partially described in a previous cDNA-AFLP analysis of Mn2+ homeostasis in C. subvermispora. Two of the genomic regions identified showed high homology to well characterised carriers involved in the transport of this ion: a homolog of the inorganic phosphate transporter of Saccharomyces cerevisiae PHO84, and an oligopeptide transporter. The third region was identified from an inducible marker in the cDNA-AFLP study, and its function was predicted to be an epimerase that could be involved in control of reactive oxygen species. Considering predicted functions of the identified regions, an integrative model describing the control of Mn2+ concentration and ligninolytic activity is proposed. Finally, the identification of a specific motif found in promoters of Mn2+ regulated genes is presented. This element could explain the transcriptional response observed in C. subermispora, through a transcription control mechanism involving a transcriptional factors able to bind Mn2+. This result is compared with evidence from recent studies of specific transcriptional control exerted by Mn2+, which suggests that this element is functional

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Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización Toxicología y Diagnóstico Molecular y Memoria para optar al Título de Bioquímica / A pesar de los grandes adelantos científicos y tecnológicos, hoy en día aún hay diversas enfermedades que no poseen un método de diagnóstico y/o de tratamiento temprano y efectivo. Es por ello que actualmente se está explorando el uso de nuevos materiales y tecnologías para resolver tales problemas. En este sentido, cabe mencionar el desarrollo de la nanotecnología, área de la ciencia que se dedica al control y desarrollo de materiales en la escala nanométrica (que incluye a materiales que posean al menos en una de sus dimensiones, tamaños de entre 1 y 100 nm). Los nanomateriales presentan interesantes propiedades que los convierten en una herramienta útil para la biomedicina. Un ejemplo de ello son las nanopartículas de oro (Au-NPs) que absorben la energía que se les suministra y la disipan de manera local, pudiendo además, por su tamaño, distribuirse por todo el organismo llegando a diferentes sitios de acción. Es por ello que en nuestro laboratorio se investiga el posible uso de las mismas para el tratamiento y diagnóstico de la Enfermedad de Alzheimer. Un ejemplo de ello es la conjugación de Au-NPs con el péptido CLPFFD, que reconoce agregados tóxicos de la proteína Aβ, presentes en pacientes que padecen la enfermedad de Alzheimer, para dirigirlas selectivamente a los mencionados agregados y así destruirlos. Sin embargo, tales nanopartículas presentan efectos adversos, debido a su carga superficial negativa, pudiendo generar trombogenicidad y/o opsonización, siendo fácilmente capturadas por el Sistema Fagocítico Mononuclear (MPS, del inglés Mononuclear Phagocyte System), lo que impediría su llegada al blanco terapéutico. Es por ello que al administrar las nanopartículas in vivo, llega al cerebro una muy pequeña proporción de la dosis inyectada acumulándose las mismas en hígado y bazo lo cual debe evitarse considerando futuras aplicaciones farmacéuticas. En la presente tesis, para evitar tales efectos, nanopartículas de oro fueron recubiertas con polímeros derivados del quitosano (Qo). No obstante, es importante destacar que el Qo presenta una elevada energía superficial, lo que se traduce en un efecto trombogénico, por lo que el Qo se entrecruzó con un polisiloxano (PS), polímero de baja energía superficial, con la finalidad de disminuir la energía superficial en el Qo. Dicha reacción de entrecruzamiento se realizó mediante el uso de un agente entrecruzante, EDC, que es capaz de activar el grupo carboxilo del PS para que reaccione con el grupo amino del Qo. Los polímeros derivados del Qo fueron caracterizados por termogravimetría, espectroscopía infrarroja y por medidas de ángulo de contacto. Posteriormente, se evaluó la trombogenicidad de los mismos mediante ensayos de coagulación, como así también sus efectos a nivel de la viabilidad celular en células de neuroblastoma humano, mediante ensayos con MTS. En resumen, se obtuvieron polímeros entrecruzados derivados del Qo que presentaron una menor energía superficial respecto a la obtenida para el Qo solo. A partir de la disminución en la energía superficial se logró eliminar el efecto trombogénico y, al mismo tiempo, se disminuyó el efecto tóxico presentado a nivel de la viabilidad celular. Dichos polímeros se emplearon para recubrir las AuNPs, formándose así los nanocompósitos (NC) correspondientes que no presentaron efectos sobre la coagulación ni sobre la viabilidad celular, respecto del Qo. Los nanocompósitos obtenidos presentaron carga neta positiva, lo cual contribuirá a reducir la interacción con el MPS siendo esto muy relevante para futuras aplicaciones farmacéuticas / Despite of the great scientific and technological advances, there are several diseases that still doesn´t have an early and effective method of diagnosis and treatment. Because of that, today it is exploring about the use of new materials and technologies to solve this issue. In this sense, it is important to mention the development in nanotechnology which is an area of the science dedicated to control and develop materials on nanometric scale (include materials with at least one dimension of size between 1 to 100 nm). This nanomaterials exhibit new properties, an example are the gold nanoparticles (Au-NPs), that are capable of absorbing energy supplied and dissipate it locally, beside its capacity of distribute easily by all the organism due to their small size. For this reason in our laboratory it is investigated the potential use of AuNPs for the treatment and diagnosis of Alzheimer´s disease. One example is the conjugation of AuNPs with the peptide CLPFFD that recognizes the toxic aggregates of Aβ present in the brain of patients that suffer Alzheimer’s disease with the propose to destroy the mentioned aggregates. However, such nanoparticles show adverse effects, because of the negative superficial charge present in them, that could generate thrombogenicity and opsonisation, been easily captured by Mononuclear Phagocytic System (MPS), impeding their arrival to the therapeutic target. For this reason after an injection of nanoparticles the percentage of the injected dose that reaches the brain is very low being necessary to improve the drug delivery for future pharmaceutical applications. In the present thesis, to avoid these side effects, the nanoparticles will be capped polymers derivated from chitosan (Qo). Nevertheless, this polymer shows a high value of superficial energy, involving a thrombogenic effect. That´s why, in this thesis work, Qo was cross-linked with polysiloxane (PMS), a polymer with low superficial energy, expecting a decreasing in this energy, and use it to recover the Au-NPs. This reaction was possible by the use of a cross-linking agent, EDC, whom is capable to activate the carboxyl group of the PMS, to react with the amine group of Qo. The obtained copolymers were characterized by thermogravimetry, infrared spectroscopy and contact angle measures. On the other hand, the thrombogenic effects of the polymers were evaluated by means of a coagulation assay and their effects on cell viability on human neuroblastome cells were evaluated using MTS assay. In summary, in this work it was obtained crosslinked derivates polymers from chitosan that shows a lower surface energy with respect to Qo. The copolymerization of Qo with PMS lead to the elimination of the thrombogenic effects and to a diminution of the effects on the cell viability. These copolymers were used for capping the AuNPs, obtaining nanocomposites, that did not show thrombogenic effects and neither a reduction of cell viability. These nanocomposites presented a positive charge which could contribute to avoid interaction with MPS which is very relevant for future pharmaceutical applications

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Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado Académico de Doctor en Bioquímica / La depresión mayor es uno de los desórdenes del ánimo más comunes. Aunque no se conoce la etiología de la depresión, se ha establecido que esta condición podría producirse como consecuencia de la interacción de los genes y el ambiente. Además, se ha propuesto que en episodios depresivos existe una deficiencia de la neurotransmisión serotoninérgica y/o noradrenérgica en el sistema nervioso central (SNC). De acuerdo con esto, los tratamientos farmacológicos para esta patología aumentan la biodisponibilidad de serotonina (5-HT) o noradrenalina (NA), a través del bloqueo de su recaptura por los terminales nerviosos en distintas estructuras del SNC. El aumento en 5-HT o NA ocurre rápidamente, sin embargo, los pacientes que se encuentran bajo tratamiento con antidepresivos perciben una mejoría sólo tras varias semanas. Por otra parte, los eventos estresantes a lo largo de la vida inician una serie de respuestas fisiológicas que subsecuentemente pueden transformarse en patológicas. Esta última evidencia sugiere la participación de los mecanismos de respuesta al estrés en los desórdenes depresivos. La respuesta al estrés se encuentra bajo el control del eje Hipotálamo-Hipófisis-Suprarrenal (HHS), el cual regula la secreción de Glucocorticoides (GCs). Alrededor del 50% de los pacientes depresivos poseen niveles elevados de GCs. La depresión afecta ciertas regiones del SNC, como el hipocampo, una estructura que posee receptores a GCs (GRs) y que está relacionada con procesos de memoria y aprendizaje. Se ha demostrado que la activación persistente de los GRs reduce la neuroplasticidad hipocampal, y además afecta la capacidad celular para sobrellevar condiciones adversas (reducción en la resiliencia celular). Por el contrario, los antidepresivos son capaces de incrementar la expresión hipocampal de genes neuroprotectores, que se sabe modulan la resiliencia celular y la neuroplasticidad. Además, los antidepresivos mejoran la capacidad de regulación por retroalimentación que ejercen los GCs sobre el eje HHS, disminuyendo de esta forma los niveles de GCs. De acuerdo con esto, si el estrés crónico afecta la función del eje HHS, aumentando los niveles de GCs, afectando de esta manera la función hipocampal a través de una disminución en la resiliencia celular, y si estos efectos inducen características similares a la depresión, es posible postular la siguientes hipótesis: i) En animales de experimentación, el estrés crónico por restricción de movimiento induce conductas similares a la depresión, efecto que es prevenido por el antidepresivo Desipramina; y ii) El antidepresivo promueve cambios en marcadores de resiliencia celular al interior del hipocampo, como ERK1/2, CREB y BCL 2, y además induce cambios en factores tróficos como BDNF y TGF [beta]1. Para estudiar esta hipótesis, ratas macho Sprague- Dawley fueron sometidas a 2,5h diarias de estrés por restricción de movimiento durante 14 días. Estos animales fueron inyectados crónicamente con una solución salina, Desipramina (DMI) 10mg/kg, i.p., o Haloperidol (HAL) 50ug/kg s.c. Este último fármaco corresponde a un antipsicótico que se utilizó para evaluar si los efectos de DMI sobre la conducta correspondían a aquellos reportados para antidepresivos y no a acciones diferentes. El estrés crónico por restricción de movimiento redujo la ganancia de peso, efecto que no fue prevenido por el tratamiento con DMI ni con HAL. De igual forma, el estrés crónico indujo mayores niveles de GCs, efecto que fue parcialmente prevenido por el tratamiento con DMI pero no por el HAL. Con respecto a los efectos del estrés sobre la conducta, los animales estresados crónicamente mostraron conductas similares a la depresión, incluyendo 1) reducción de la preferencia por una solución de sacarosa al 1% como agua de bebida, lo cual asemeja una conducta de anhedonia; 2) reducción en la adquisición de respuestas condicionadas, lo cual se relaciona con deficiencias en las capacidades cognitivas; 3) falla en el escape en la prueba de evitación activa y 4) aumento en la inmovilidad en la prueba de natación forzada, comportamientos que son indicativos de desesperanza aprendida. Estas conductas fueron prevenidas de manera específica por el tratamiento crónico con DMI pero no con HAL. Estos cambios sugieren que el estrés crónico afecta el SNC, y por lo tanto se estudiaron a continuación cambios en marcadores de resiliencia celular en el hipocampo. Estudios de inmunoblot en extractos de proteínas hipocampales revelaron que el estrés incrementó los niveles de P-ERK1/2 y P-CREB. La administración de DMI previno el incremento en P-ERK1/2 inducido por el estrés, pero no el de P-CREB. La evaluación por inmunohistoquímica mostró que, mientras el estrés no modificó los niveles de P-CREB en el área CA y el giro dentado (GD) del hipocampo, estos niveles sí se encontraron aumentados luego del tratamiento sólo con DMI a animales estresados. El HAL redujo la inmunoreactividad relativa de P CREB en cada subárea del hipocampo, independiente de la condición de estrés. Además, la DMI no previno la reducción de los niveles de ARNm de BCL-2 asociada al estrés en el hipocampo. Sin embargo, los análisis de inmunoblot mostraron un aumento en los niveles de proteína de BCL-2 sólo en los animales estresados, efecto que fue prevenido por DMI. Con respecto al ARNm de BDNF, hubo una reducción del transcrito total de BDNF por efecto del estrés, efecto que fue prevenido por DMI, pero no por HAL, solamente en el área CA3. El estrés también disminuyó los niveles de ARNm de TGF [beta]1 en todas las subáreas hipocampales, efecto que fue completamente prevenido por el tratamiento con DMI, pero no con HAL. Estos resultados sugieren una compleja relación entre el comportamiento, fosforilación de ERK1/2 y CREB, la expresión de BCL-2 y BDNF. Además, esta es la primera vez que se demuestra que la expresión del ARNm de TGF [beta]1 se disminuye por el estrés, y que este efecto es prevenido por DMI. Estos datos sugieren que dentro de las acciones de DMI se podría incluir la inducción de TGF [beta]1, para promover cambios que favorezcan la resiliencia celular, o para mejorar la neurotransmisión de NA en el hipocampo. Se ha descrito que algunas citoquinas modulan la liberación de NA en el hipocampo, probablemente a través de efectos sobre el receptor inhibitorio presináptico [alfa]2. Por lo tanto, se evaluaron los efectos del estrés y el tratamiento con DMI sobre la actividad inhibitoria de [alfa]2, así como el efecto de TGF [beta]1 sobre el eflujo de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H NA. El tratamiento crónico con DMI a los animales sin estresar redujo el efecto del antagonista [alfa]2Yohimbina (Yoh), y produjo que el eflujo de 3H desde cortes de hipocampo se volviera insensible al agonista [alfa]2 Clonidina (Clo), cuando fueron estimuladas con K+ 25mM. Además, el estrés crónico redujo el efecto de Yoh, sin embargo, se observó un aumento en el efecto de Clo sobre la liberación hipocampal de 3H. Un patrón similar se observó en animales sometidos a restricción de movimiento y tratados con DMI. Estos datos sugieren que el estrés crónico y el tratamiento crónico con DMI inducen cambios diferenciales en la sensibilidad presináptica de [alfa]2, probablemente como resultado de una interacción compleja entre más de un sistema de neurotransmisores (por ejemplo, glutamato y GABA), sobre el eflujo de 3H desde cortes de hipocampo cargados con 3H NA. Más aún, TGF [beta]1 afecta este eflujo de 3H. En animales control sin estresar, TGF [beta]1 disminuyó la el eflujo de 3H, pero en ratas control tratadas con DMI, y en animales estresados con o sin tratamiento con DMI, el TGF [beta]1 aumentó el eflujo de 3H. Estos efectos no pueden ser relacionados directamente con una modulación de la actividad [alfa]2 presináptica, como se ha sugerido para otras citoquinas, más aún, es probable que TGF [beta]1 module sus efectos modificando la conductancia de iones como Ca2+ y/o K+. Los resultados presentados sugieren que la DMI modula la expresión de ciertos marcadores relacionados con la resiliencia celular, tal como TGF [beta]1, y también afecta la excitabilidad de las células al interior del hipocampo, siendo el último efecto un importante mediador en la acción antidepresiva de DMI.

Memoria para optar el título de Bioquímico / La testosterona, a través de aumentos del Ca2+ intracelular mediado por el receptor para inositol 1,4,5 trifosfato (IP3R), produce hipertrofia del cardiomiocito. La hipertrofia conlleva un cambio metabólico que se asocia a modificaciones del sustrato energético usado para la generación de ATP. Sin embargo, los efectos metabólicos de la testosterona en la célula cardiaca no han sido estudiados. Los PPARs (peroxisome proliferator activated-receptors) son una familia de factores de transcripción que controlan el metabolismo celular y que, activados en forma diferencial, permiten la selección de los sustratos energéticos. En este trabajo se estudiaron los efectos de la testosterona sobre la actividad de PPARs específicos a través de procesos mediados por el IP3R y su efecto sobre enzimas metabólicas. En este estudio se utilizaron cultivos primarios de cardiomiocitos. Para determinar la actividad transcripcional de los PPARs, los cardiomiocitos se co-transfectaron con el plasmidio PPREx3-tk-Luc y con un plasmidio control de transfección (CMV-Renilla). Primero, la efectividad de este plasmidio se evaluó utilizando activadores farmacológicos para el PPARα (Wy 14643, 100 μM) y para el PPARβ (L-165041, 10 μM). El efecto de la testosterona (100 nM) sobre PPARs específicos se determinó estimulando cardiomiocitos transfectados con PPREx-tk-Luc en presencia de inhibidores de PPARα (GW6471, 10 μM) o del PPARβ (GSK 0660, 1 μM). Los cambios en la expresión de las proteínas de los PPARs fueron evaluados por inmunodetección. Para determinar el efecto sobre enzimas metabólicas se realizaron RT-PCR para la hexoquinasa II (HKII), la fosfofructoquinasa (PFK) y la carnitina palmitoil transferasa-1b muscular (mCPT-1b). Para investigar la participación de los procesos mediados por el IP3R se utilizó el 2- aminoetildifenilborato (2-APB). La estimulación con 100 nM de testosterona por 3 horas aumentó la actividad luciferasa de cardiomiocitos transfectados con el plasmidio PPREx3-tk-Luc. Este efecto fue parcialmente inhibido por el tratamiento previo de las células con el inhibidor del PPARβ, GSK 0660, mientras que el inhibidor del PPARα, GW6471, tuvo un efecto menor. Este resultado sugiere que la testosterona podría activar preferencialmente el PPARβ. Consecuente con este resultado la testosterona incrementa la expresión del PPARβ, pero no la del PPARα. Por otra parte, 2-APB aumentó la actividad de los PPARs a las 3 horas de tratamiento. Por el contrario, este inhibidor farmacológico parcialmente previno el incremento de la expresión del PPARβ inducido por testosterona. Estos resultados sugieren una activación diferencial del PPARβ por esta hormona. En diversos modelos celulares se ha demostrado que la activación diferencial de PPARs específicos regula el metabolismo celular, modificando el sustrato energético usado por la célula. Por ello se estudió los niveles del MRNA de la HKII y la PFK, como marcadores de la vía glicolítica, y del mCPT-1b como marcador de la β-oxidación. La testosterona aumentó los niveles del MRNA de la HKII y la PFK, mientras que los niveles del mCPT-1b no fueron modificados. Siendo la PFK un sensor clave de la vía glicolítica, se seleccionó este gen para determinar tanto el efecto de la inhibición de PPARβ como de procesos dependientes del IP3R. De este modo se demostró que la inhibición del PPARβ anuló el aumento de los niveles del MRNA de la PFK inducidos por la testosterona. Mientras que el 2-APB aumentó los niveles del MRNA de esta enzima. Estos datos muestran una regulación de los niveles del MRNA de la PFK inducida por la testosterona. Estos resultados sugieren que la testosterona activa al PPARβ. La participación de los procesos mediados por el IP3R son poco concluyentes, sin embargo es claro la relación entre crecimiento y metabolismo por lo que se requieren estudios más acabados de la vía IP3 para determinar su real participación. Además, esta hormona aumenta el MRNA de las enzimas glicolíticas como la HKII y la PFK, evento dependiente en parte de la activación de la vía del PPARβ. Estos resultados exploratorios sugieren que la actividad del PPARβ estimulada por la testosterona podría aumentar el metabolismo glicolítico, lo que podría ser relevante en el proceso hipertrófico del cardiomiocito inducido por esta hormona. Los resultados muestran la primera evidencia de la acción de la testosterona sobre PPARs y su posible rol metabólico sobre las células cardiacas / Testosterone-induced cardiomyocyte hypertrophy involve intracellular Ca2+ increases mediated by the inositol 1,4,5 trisphosphate receptor (IP3R). Cardiac hypertrophy leads to metabolic changes, which are associated with modifications of energy substrate used for ATP generation. However, metabolic effects of testosterone on cardiomyocytes have not been studied. The PPARs (peroxisome proliferator-activated receptors) are a family of transcription factors that control cell metabolism and, when they are differentially activated, allow the selection of energy substrates used by the cells. In this work, we study the impact of testosterone on the activation of specific PPARs through process mediated by the IP3R and its effect on metabolic enzymes. For this propose we used primary cultures of neonatal cardiomyocytes. To determine the transcriptional activity of PPARs, cardiomyocytes were co-transfected with the plasmid PPREx3- tk-Luc and CMV-Renilla, which was used as control. First, we evaluated the effectiveness of this plasmid using pharmacological activators for either PPARα (Wy 14643, 100 μM) or PPARβ (L- 165041, 10 μM). The effects of testosterone (100 nM) on specific PPARs were determined stimulating PPREx-tk-Luc-transfected cardiomyocytes in the presence or absence of inhibitors for either PPARα (GW6471, 10 μM) or PPARβ (GSK 0660, 1 μM). Second, changes in protein expression of PPARs were assessed by immunoblotting. Third, by RT-PCR we determine the effect of testosterone stimulation on metabolic enzymes including: Hexokinase II (HKII), Phosphofructokinase (PFK) and muscular Carnitine Palmitoyl Transferase-1b (mCPT-1b). Finally, to assess the role of process mediated by IP3R, 2-aminoetildiphenilborate (2-APB, 20 μM) was used. Testosterone (100 nM) stimulation of cardiomyocytes transfected with the plasmid PPREx3-tk-Luc by 3 hours increased the luciferase activity. This effect was partially inhibited by pre-treatment of cells with GSK 0660, while GW 6471 had minor effect. These results suggest that testosterone activates preferentially PPARβ. According to these findings, testosterone also increased the expression of PPARβ protein, but not PPARα. Moreover, 2-APB increased the transcriptional activation of PPARs, and partially inhibited the protein expression of PPARβ. In different cell models have been shown that differential activation of specific PPARs regulate cell metabolism, which can modify the energy substrate used by the cell. Therefore we studied the mRNA levels of HKII and PFK, as markers of glycolysis, and mCPT-1b as β-oxidation marker. Testosterone increased HKII and PFK mRNA levels, whereas mCPT-1b mRNA levels were not modified. Since, PFK is a key sensor for glycolysis, this enzime was selected to determine the effects of both PPARβ and process mediated by IP3R on mRNA PFK levels. Thus, inhibition of PPARβ blocked, while 2-APB increased the PFK mRNA induced by testosterone. Accordingly to this, testosterone regulates the mRNA of PFK by PPARβ. Taken together, these results suggest that testosterone activates PPARβ. Participation of process mediates by IP3R is poor clear; however it is clear the relationship between growth and metabolism so that further studies of the IP3 pathway are required to determine its participation. Furthermore, testosterone increased the mRNA levels of the glycolytic enzymes HKII and PFK. In addition, increased levels of PFK mRNA require the activation of the PPARβ pathway. These primary findings may suggest that PPARβ activity increase glycolysis, which could be relevant in the process of cardiomyocyte hypertrophy induced by testosterone. These results are the first evidence for the action of testosterone on PPARs and show a possible metabolic role for this hormone on cardiac cells

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