Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-04-29T21:04:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 333015.pdf: 4351735 bytes, checksum: 171a59ff0728a6e88fe6fffee6d8a15c (MD5) Previous issue date: 2014 / As proteínas MYB constituem uma importante família de fatores de transcrição e desempenham, em plantas, funções regulatórias no desenvolvimento e nas respostas de defesa. Exemplo importante desta família é a proteína AtMYB30 de Arabidopsis thaliana que está envolvida no início da morte celular, durante o processo de resposta de hipersensibilidade e respostas de defesa vegetal. No processo de sinalização celular, o óxido nítrico pode regular a ligação das proteínas MYB ao DNA de diversas maneiras, entre elas através da S-nitrosilação. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi caracterizar e avaliar a ocorrência da modificação pós-traducional S-nitrosilação no fator de transcrição AtMYB30 de Arabidopsis thaliana, sua interação com o DNA e o efeito estrutural destes fatores. Mutagênese sítio-dirigida foi usada para obter os mutantes C49A, C53A e C49AC53A. O domínio de ligação ao DNA de AtMYB30 foi capaz de ligar-se ao DNA na forma ativa, assim como os seus simples mutantes em cisteína, o que não ocorreu com o duplo mutante, comprovando a importância destes aminoácidos altamente reativo na formação do complexo. Além disso, foi confirmada a S-nitrosilação destas proteínas pela técnica de Biotin-Switch, modificação que provavelmente impediu a formação dos complexos DNA-proteína quando na presença de doadores de NO nos testes de retardamento de migração eletroforética. Utilizando o dicroísmo circular foi observado que o NO, possivelmente através da S-nitrosilação, influencia estruturalmente AtMYB30, alterando seu conteúdo de estrutura secundária, porém com certa reversibilidade ao conteúdo inicial por efeito de um agente redutor. Quando comparadas, a cisteína 49 parece ser mais importante nesta modificação estrutural, ao passo que a cisteína 53 apresenta maior afinidade com a molécula de DNA. Foi possível identificar e confirmar por espectrometria de massa MALDI-TOF a S-nitrosilação no resíduo de cisteína 53. Nos ensaios de desnaturação térmica a proteína selvagem apresentou uma temperatura de desnaturação (Tm) de 38,26 °C enquanto que os mutantes C49A e C53A foram menos estáveis estruturalmente, apresentando uma menor Tm de 32,43 °C e 31,25 °C, respectivamente. Já sob o efeito da S-nitrosilação, o perfil de desnaturação térmica da AtMYB30 selvagem apresentou um leve aumento de 3,69 ± 1,01°C na Tm quando comparado à proteína não S-nitrosilada, assim como para C49A de 33,08 °C a 39,82°C; ~6 °C. Apenas para o mutante C53A a Tm reduziu na presença do doador de NO SNOG, apresentando valores de 29.49°C a 23.15°C. Assim, a S-nitrosilação do resíduo C49 (presente no mutante C53A)promoveu o efeito mais pronunciado na sensibilidade térmica, enquanto a maior estabilidade térmica quando S-nitrosiladas foi observada em AtMYB30 selvagem e mutante C49A, sugerindo que o resíduo C49 pode ser responsável pelas modificações estruturais causadas pela adição do NO à proteína. Quanto ao efeito do DNA nos espectros de fluorescência de AtMYB30, foi observada uma redução de intensidade de fluorescência e uma alteração no comprimento de onda máximo quando na ligação entre AtMYB30 e o DNA, inclusive para as simples mutantes, comprovando a alteração estrutural causada pela ligação devido ao enovelamento da proteína. Finalmente, utilizando a técnica de DNAse footprint foi possível confirmar a sequência de ligação do DNA à AtMYB30.<br> / Abstract : MYB proteins are a family of transcription factors that play an important role in plant development and regulatory defense processes. Arabidopsis thaliana AtMYB30, a member of this protein family, is involved in cell death processes during the hypersensitive response (HR) of plants. HR is characterized by a vast production of reactive oxygen species and nitric oxide (NO). NO may thus influence the binding of AtMYB30 to DNA. In this work we evaluated the effect of NO on AtMYB30 DNA binding activity, and also on the protein structure. A fully active minimal DNA-binding domain (DBD) of AtMYB30 (residues 11?116) containing two cysteine residues (C49 and C53) was overexpressed and purified. Site-directed mutagenesis was used to obtain AtMYB30 mutants C49A, C53A and C49AC53A. The DNA binding activity of AtMYB30 and Cys single mutants was clearly inhibited upon incubation with a NO donor, and S-nitrosylation was confirmed by the biotin-switch assay. In order to understand the mechanism of the NO effect on AtMYB30 DNA binding activity we performed circular dichroism (CD) analysis, to correlate the observed protein function inhibition and a potential structural impairment on AtMYB30. Indeed, NO modification of C49 and C53 residues promotes a subtle modification of the secondary structure of this transcription factor. When compared, cysteine 49 is more important in the structural modification while cysteine 53 exhibits greater affinity with DNA. It was confirmed by Mass Spectrometry MALDI-TOF the S-nitrosylation in cysteine 49. Thermal denaturation analysis by CD indicated for wild type AtMYB30 a melting temperature (Tm) value of 38,26 °C, while for C49A and C53A, 32,43 °C and 31,25 °C, respectively and less structural stability. Following S-nitrosylation, the thermal denaturation profile of wild type AtMYB30 and C49A mutant had the Tm slightly increase when compared to non-nitrosylated protein and decreased to C53A mutant. Fluorescence spectroscopy indicated a substantially decrease intensity in all proteins when in binding to DNA, caused by protein folding in the complex. We thus demonstrated, using various techniques, the in vitro effect of NO on AtMYB30, and thus the potential consequences of NO activity on plant metabolism influenced by this transcription factor. Finally, by DNA footprint assay we were able to confirm the DNA sequence that binds to AtMYB30.

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:34:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 126.pdf: 4674442 bytes, checksum: cc5837dc7103e17302c1970357051e19 (MD5) Previous issue date: 2007 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / Os produtos que requerem a característica de esterilidade tais como medicamentos injetáveis, soros, vacinas entre outros, devem ser submetidos ao ensaio de esterilidade bacteriana e fungica. Nesse estudo avaliamos metodologias de identificação fenotípica e molecular para identificação de bastonetes Gran positivos irregulares - bactérias corineformes e nocardioformes

CRISÓSTOMO, C. V. Polissacarídeo endospérmico de Bauhinia pentandra: caracterização e estudo de interação com lectinas. 2008. 100 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2008. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-10T23:02:38Z No. of bitstreams: 1 2008_tese_cvcrisostomo.pdf: 2270783 bytes, checksum: 81eb613cc20ba4aeb4b550822115fd0e (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-20T13:22:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_tese_cvcrisostomo.pdf: 2270783 bytes, checksum: 81eb613cc20ba4aeb4b550822115fd0e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-20T13:22:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_tese_cvcrisostomo.pdf: 2270783 bytes, checksum: 81eb613cc20ba4aeb4b550822115fd0e (MD5) Previous issue date: 2088 / Due the chemicals properties diferences, such as the ability to make viscous solution or aqueous gels, the study of the galactomanans has been too important. In this study, the endospermic galactomannans from seeds of Bauhinia pentandra was isolated and partially characterized. This polysaccharide is a classical galalactomannan constituted by a linear chain of mannose linked by β(1-4) linkages with galactose substituintions linked by α(1-6) linkages, resulting in a Man:Gal ratio of 2.5:1, and water intrinsic viscosity equal to 10.1 dL/g. Galactomannan was evaluated in ability to interact with galactose-binding lectins. The polysaccharide was treated with epichlorohidrine and the material obtained was utilized to make the affinity chromatography matrix. Lectin-rich extracts from Artocarpus incisa, Artocarpus integrifolia and Bauhinia pentandra were applied and lectin fractions were obtained, thus, the affinity matrix showed to be efficient to isolate them. The retention capacity of the galactomannan from B. pentandra was compared with galactomannan matrix from Adenantera pavonina, Caesalpinea pulcherrima, Sophora japonica and commercial matrix of Sepharose 4B in regards to the isolation of the lectin from B. pentandra (LBp). Although the galactomannan matrix had been showed the smallest retention capacity in comparision with the others, it is equivalent to the commercial matrix, enabling your utilization. / Devido às suas diferentes propriedades químicas tais como capacidade de formar soluções viscosas ou géis em meio aquoso o isolamento e caracterização de galactomananas têm sido de grande importância Nesse trabalho a galactomanana do endosperma da semente de Bauhinia pentandra foi isolada e caracterizada, apresentando-se homogênea por GPC Este polissacarideo foi demonstrado ser uma galactomanana clássica formada por uma cadeia linear de manose unidas por ligações β(1-4) com substituições de galactose em ligação α(1-6) com uma proporção Man:Gal de 2 5.1 e viscosidade intrínseca em água de 10 1 dL/g A galactomanana foi avaliada quanto à capacidade de interagir com lectinas galactose ligante O polissacarídeo foi tratado com epicloridrina e o material obtido foi utilizado para a montagem de coluna cromatográfica de afinidade Extratos ricos em lectinas de Artocarpus incisa Artocarpus integrifólia e Bauhinia pentandra foram aplicados e frações lectinicas purificadas foram obtidas A capacidade da galactomanana de B. pentandra em reter a lectina (LBp) da mesma semente foi comparada com a matriz de galactomanana de Adenantera pavonina Caesalpinea pulcherrima Sophora japonica e com a matriz comercial Sepharose 4B Apesar da galactomanana de B. pentandra ter apresentado a menor capacidade de retenção frente às demais, ela mostrou-se semelhante à matriz comercial sendo viável a sua utilização.

PAIVA, J. R. Estudo do potencial biocatalítico do fungo Rhizopus stolonifer na biotransformação de produtos naturais. 2014. 75 f. Dissertação (Mestrado em Química) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Daniel Eduardo Alencar da Silva (dealencar.silva@gmail.com) on 2014-11-17T19:43:15Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_jrpaiva.pdf: 3168577 bytes, checksum: 2dccc004cc1f31dfdf97995945f8f1db (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2016-01-22T19:59:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_jrpaiva.pdf: 3168577 bytes, checksum: 2dccc004cc1f31dfdf97995945f8f1db (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-22T19:59:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_jrpaiva.pdf: 3168577 bytes, checksum: 2dccc004cc1f31dfdf97995945f8f1db (MD5) Previous issue date: 2014 / In this work the biocatalytic potential of the fungus Rhizopus stolonifer a phytopathogenic fungus in biotransformations of natural secondary metabolites was investigated Two of these metabolites the diterpene 3,12-dioxo-15,16-epoxy-4-hydroxycleroda-13(16),14-diene and the phenolic derivative 6-gingerol was biotransformed and their products was isolated and quantified by HPLC The structural determination of biotransformation products was obtained by analysis of 1H NMR 13C NMR 13C-NMR DEPT 135 IV and MS spectrum The products were obtained by a biorreduction process revealing the potential of this fungus in selective reduction of unconjugated carbonyl groups The products from bioreduction were submitted to antitumor assay against human tumor cell lines OVCAR-8 (ovarian) SF-295 (glioblastoma) and HCT-8 (colon) The biotransformation product 6-gingerdiol showed the highest percentage of inhibition of cell growth: 91,83; 70,90 e 78,56, respectively / Neste trabalho investigou-se o potencial biocatalítico do fungo Rhizopus stolonifer um fungo fitopatogênico em biotransformações de metabólitos secundários naturais Dois desses metabolitos, o diterpeno 3,12-dioxo-15,16-epoxi-4-hidroxicleroda-13(16),14-dieno e o derivado fenólico 6-gingerol foram biotransformados e seus respectivos produtos isolados e quantificados por CLAE A elucidação estrutural dos produtos de biotransformação pelo fungo Rhizopus stolonifer foram realizadas por análise dos espectros de RMN 1H RMN 13C RMN 13C-DEPT 135 IV e EM Identificou-se que os produtos obtidos eram provenientes de uma biorredução revelando o potencial deste fungo na redução quimio e regiosseletivas de grupos carbonilas não conjugados Realizou-se o estudo cinético dos produtos de biorredução por CLAE e ensaios citotoxicidade frente às linhagens tumorais humanas OVCAR-8 (ovário) SF-295 (glioblastoma) e HCT-8 (cólon) O produto biorreduzido 6-gingerdiol apresentou os melhores percentuais de inibição do crescimento celular: 91,83; 70,90 e 78,56 respectivamente

SOUSA, F. D. Propriedades físico-químicas de hemiceluloses vegetais. 2014. 60 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2015-01-20T18:17:18Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_fdsousa.pdf: 1596874 bytes, checksum: 2ffb9cdc3ca894bd0d621e2f15cf9a72 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-02-27T20:14:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_fdsousa.pdf: 1596874 bytes, checksum: 2ffb9cdc3ca894bd0d621e2f15cf9a72 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-27T20:14:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_fdsousa.pdf: 1596874 bytes, checksum: 2ffb9cdc3ca894bd0d621e2f15cf9a72 (MD5) Previous issue date: 2014 / In this work six galactomannans (Adenanthera pavonina, Caesalpinia pulcherrima, Delonix regia, Dimorphera mollis, Prosopis glandulosa, Schizolobium parahyba) and three xyloglucans (Hymenaea courbaril, Mucuna sloanei e Tamarindus indica) were isolated from seed endosperm and cotyledon, respectively, by aqueous extraction followed by precipitation with ethanol. Yield of extraction, monosaccharide ratio, macromolecular parameters as well as molar mass distribution were determined and compared to guar gum (Cyamopsis tetragonoloba), LBG (Ceratonia siliqua) and xanthan (Xanthomonas campestris). Extraction yield in relation to seed mass ranged from 7.0 to 40.63%, with xyloglucan yields higher than the galactomannans ones. Schizolobium parahyba and Caesalpinia pulcherrima galactomannans presented the lowest protein content of 0.05% e 0.08%, respectively. The Mw values ranged from 0.09 – 3.37 x107 g mol-1 Flow curves of hemicelluloses solutions at 1% (w:v) were measured by varying the shear rate from 0.1 to 100 s-1. The resulting data were fit to the Power law e Herschel-Bulkley models. All the hemicelluloses presented shear-thinning behavior. Galactomannan and xyloglucans with different monosaccharide ratio showed similar consistency index; it may be influenced of the galactose distribution pattern on the chains and the interactions among the polysaccharides molecules. Rheological properties were compared and the results suggest new hemicelluloses sources which offer more profound applications in areas such as materials science, medicine e biology. / As hemiceluloses são polissacarídeos presentes na parede celular de vegetais, onde funcionam como polissacarídeos de reserva e possuem uma cadeia principal composta por ligações β-(1→4) em configuração equatorial. Neste trabalho, hemiceluloses de sementes foram avaliadas quanto as suas propriedades reológicas. Como resultado, galactomananas endospérmicas de Adenanthera pavonina, Caesalpinia pulcherrima, Delonix regia, Dimorphera mollis, Prosopis glandulosa e Schizolobium parahyba e xiloglucanas cotiledonárias de Hymenaea courbaril, Mucuna sloanei e Tamarindus indica foram isoladas por extração aquosa, seguida por precipitação em etanol. O rendimento das extrações, razão monossacarídica, parâmetros macromoleculares, assim como distribuição de massa molar foram determinados e comparados às já comercializadas goma guar (Cyamopsis tetragonoloba), LBG (Ceratonia siliqua) e goma xantana (Xanthomonas campestris). O rendimento das extrações em relação à massa das sementes mostrou um intervalo de 7,0 a 40,63%, com os maiores valores para as xiloglucanas. Galactomananas de Schizolobium parahyba e Caesalpinia pulcherrima apresentaram os menores percentuais de proteínas, 0,05% e 0,08%, respectivamente. Valores de Mw variaram dentro de um intervalo entre 0,09 – 3,37 x107 g mol-1. Curvas de fluxo das soluções de hemiceluloses a 1% (m:v) foram obtidas pela variação da taxa de cisalhamento entre 0,1 a 100 s-1. Os dados obtidos foram analisados pelos modelos de Lei das Potências e Hershel-Bulkley demonstrando caráter pseudoplástico para todas as hemiceluloses estudadas nessa concentração. Galactomananas e xiloglucanas com diferentes razões monossacarídicas apresentaram índice de consistência similar, provavelmente influenciado pelo padrão de distribuição de galactose nas cadeias e as interações entre as moléculas desses polissacarídeos. As propriedades reológicas foram comparadas e os resultados sugerem novas fontes de hemiceluloses que permitem mais aplicações em áreas como ciência dos materiais, medicina e biologia.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-06-27T04:23:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 345983.pdf: 6571309 bytes, checksum: eff889a321cea8a94cbde6e36c5b4a0d (MD5) Previous issue date: 2017 / Os ecossistemas costeiros fornecem bens e serviços valiosos. Entretanto, a maioria destes ecossistemas já apresentam impactos antropogênicos. Historicamente os ecossistemas costeiros são alvo do descarte de resíduos industriais, agrícolas e de efluentes urbanos. Esta contaminação, além de gerar riscos à saúde humana, modifica a ecologia dos ecossistemas marinhos. Esta dissertação está dividida em dois capítulos. O primeiro trata do sequenciamento e caracterização do transcriptoma de glândula digestiva de vieiras da espécie Nodipecten nodosus. As leituras passaram por verificação de qualidade e foram montadas através de três diferentes métodos. A montagem de melhor qualidade (Velvet k = 45) apresentou um tamanho de contig N50 de 2.301 pares de base (pb), compreendendo 76.861 transcritos. Destes,33,72% foram anotados em bancos de dados públicos. Diversos transcritos de genes envolvidos na biotransformação de xenobióticos e com atividade antioxidante foram identificados. No segundo capítulo foram apresentados os resultados da classificação dos 33 transcritos citocromos P450 (CYP) buscados no transcriptoma de glândula digestiva da vieira N. nodosus. Seis novas famílias CYP foram identificadas. Além disso, a proteína CYP30E1 foi caracterizada estruturalmente, através de métodos computacionais. As sequências analisadas apresentaram, em geral, os motivos característicos desta superfamília conservados. A caracterização do CYP30E1 revela uma altas emelhança com o CYP3A4 humano, indicando funções semelhantes no metabolismo de alguns xenobióticos. Esta dissertação apresenta importantes contribuições na caracterização do transcriptoma da vieira N. nodosus e de seus transcritos CYP.<br> / Abstract : Coastal ecosystems provide valuable goods and services. However, most of these ecosystems already show anthropogenic impacts. Historically, coastal ecosystems have been subject to the disposal of industrial, agricultural and urban wastes. This contamination, in addition to producing risks to human health, modifies the marine ecosystem's ecology. This work is divided into two chapters. The first deals with the sequencing and characterization of the transcriptome of the digestive gland of scallops from the species N. nodosus. High-throughput sequencing reads went through quality checking and were assembled through three different methods. The assembly with the highest quality (Velvet k = 45) had a N50 contig size of 2,301 base pairs, comprising 76,861 transcripts. Of these, 33.72% were annotated in public databases. Several transcripts from genes involved in xenobiotic transformation or that had antioxidant activity were identified. In the second chapter, the results of the classification of 33 cytochrome P450 transcritos, searched in the digestive gland transcriptome of the scallop N. nodosus, were presented. Six new CYP families were identified. In addition, the protein CYP30E1 was characterized structurally, by computational methods. The analyzed sequences presented, in general, well conserved motifs from this superfamily. The characterization of the CYP30E1 revealed a high similarity with the human CYP3A4, indicating similar function in the metabolism of xenobiotics. This dissertation produced important contributions in the transcriptome characterization of the scallop N.nodosus and its CYP transcripts.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-07-25T04:10:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347086.pdf: 3854750 bytes, checksum: e6af7349d6ed0a5ab753475f5ba612fe (MD5) Previous issue date: 2017 / Diversos compostos com potencial antidepressivo vêm sendo investigados atualmente para o tratamento da depressão. Dentre eles, destaca-se a agmatina, uma amina endógena considerada um neuromodulador no sistema nervoso central (SNC), dotada de propriedades neuroprotetoras. Estudos pré-clínicos demonstraram que essa amina possui efeito tipo-antidepressivo, mas ainda existe a necessidade de se investigar os mecanismos envolvidos nesse efeito. Nesse sentido, um dos objetivos deste estudo foi avaliar a capacidade da agmatina em aumentar a potência de antidepressivos convencionais monoaminérgicos e MK-801, um antagonista de receptores N-metil-D-aspartato (NMDA). Foi observado que a agmatina em sua dose sub-efetiva (0,0001 mg/kg, p.o.) foi capaz de potencializar o efeito dos antidepressivos convencionais (duas vezes o efeito da fluoxetina e 10 vezes o efeito da imipramina e bupropiona) e MK-801 (100 vezes), diminuindo o tempo de imobilidade de camundongos no teste de suspensão pela cauda (TSC), o que sugere que ela pode ter uma maior afinidade por receptores NMDA do que por alvos monoaminérgicos. Considerando que o efeito tipo-antidepressivo da agmatina ocorreu em maior escala mediante antagonismo de receptores NMDA, e a existência e importância de um antidepressivo dessa classe que possui ação rápida (cetamina), um segundo objetivo desse estudo foi avaliar vias de sinalização intracelular envolvidas no efeito da agmatina com base nas vias relacionadas com o efeito tipo-antidepressivo rápido da cetamina. Os resultados mostraram que a agmatina exerce seu efeito tipo-antidepressivo no TSC através da modulação de receptores alfa-amino-3-hidroxi-metil-5-4-isoxazolpropiônico (AMPA) e tropomiosina cinase B (Tr?B), da sinalização mediada pelo fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fosfatidilinositol 3 cinase (PI3K), proteína cinase B (Akt), glicogênio sintase cinase 3ß (GSK-3ß), proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), além de ocasionar um rápido aumento do imunoconteúdo de BDNF e das proteínas sinápticas de densidade pós-sináptica de 95KDa (PSD-95) e GluA1 no córtex pré-frontal dos camundongos, de forma semelhante ao que ocorre com a cetamina. Este trabalho também realizou uma análise comparativa dos efeitos da agmatina com os de um antidepressivo convencional monoaminérgico (fluoxetina) e um de ação rápida (cetamina) em modelosde estresse crônico. Camundongos expostos ao estresse crônico imprevisível (ECI) por 14 dias receberam uma dose única por via oral de agmatina (0,1 mg/kg), cetamina (1 mg/kg) ou fluoxetina (10 mg/kg) 24 h antes de serem submetidos ao TSC. Apenas a agmatina e a cetamina foram capazes de reverter o comportamento tipo-depressivo induzido pelo ECI no TSC, mas não houve alteração no comportamento anedônico dos animais em nenhum dos grupos. Além disso, nenhuma alteração foi encontrada no imunoconteúdo de PSD-95, sinapsina 1 e GluA1 nos diferentes grupos experimentais (animais estressados ou não, tratados ou não). Posteriormente, a comparação entre os efeitos da agmatina, cetamina e fluoxetina se deu em um modelo de depressão induzida pela administração crônica de corticosterona (20 mg/kg, p.o., 21 dias). Tanto a agmatina (0,1 mg/kg, p.o.), quanto a cetamina (1 mg/kg, i.p.) reverteram o comportamento tipo-depressivo induzido pelo modelo no TSC. No entanto, de forma similar ao modelo do ECI, o efeito anedônico não foi observado neste protocolo e em nenhum dos grupos experimentais (tanto no teste de borrifagem de sacarose quanto no de consumo de sacarose). Os animais submetidos ao protocolo da corticosterona apresentaram uma redução no peso das glândulas adrenais, mas esse efeito não foi revertido por nenhum dos tratamentos utilizados. Quanto às análises bioquímicas, foi observado que nos animais controle, os tratamentos com agmatina, cetamina ou fluoxetina aumentaram o imunoconteúdo de GluA1 no hipocampo, sem alterar a fosforilação desta proteína (Ser831 e Ser845). Também não foram observadas alterações no imunoconteúdo de PSD-95 e na fosforilação da cinase ribossomal S6 de 70 kDa (p70S6K) nessa mesma estrutura. Além disso, os animais submetidos ao protocolo da corticosterona apresentaram uma diminuição no imunoconteúdo de sinapsina, efeito que foi revertido apenas pelo tratamento com fluoxetina. Em conjunto, os resultados fornecem evidências de que a agmatina possui um mecanismo de ação similar ao da cetamina quanto às vias de sinalização intracelular, bem como a capacidade de reverter, com uma única administração, o comportamento tipo-depressivo induzido por modelos de estresse crônico. Esses resultados sugerem que essa amina endógena pode ser um agente promissor para o tratamento da depressão.<br> / Abstract : Several compounds with antidepressant potential have been investigated for the treatment of depression. One of them is agmatine, an endogenous amine considered as a neuromodulator in the central nervous system (CNS) that exhibits several neuroprotective properties. Previous studies from our group demonstrated that this amine elicits antidepressant-like effects in predictive animal models of depression. However, the mechanisms underlying its antidepressant effects need to be further investigated. Therefore, one purpose of this study was to evaluate the extent of the antidepressant synergism induced by a fixed sub-effective dose of agmatine (0.0001 mg/kg, p.o.) to shift the antidepressant potency of monoaminergic conventional antidepressants and MK-801, an N-Methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonist. The present study found that a sub-effective dose of agmatine increased the potency by which fluoxetine, imipramine, bupropion and MK-801 decreased immobility time in the tail suspension test (TST): 2-fold (fluoxetine), 10-fold (imipramine and bupropion) and 100-fold (MK-801), suggesting that agmatine substantially augmented the antidepressant-like effect of MK-801. This result reinforces the notion that this compound modulates NMDA receptor activation with a higher affinity when compared to monoamines. Taking into account the involvement of antagonism of NMDA receptors in the antidepressant-like effect of agmatine, and the existence of fast-acting antidepressants (like ketamine, an NMDA receptor antagonist), a second purpose of this work was to evaluate the possibility that agmatine elicits antidepressant effects through the modulation of intracelular signaling pathways implicated in fast antidepressant responses, as occurs with the fast-acting antidepressant ketamine. Our results demonstrated that the antidepressant-like effect of agmatine in the TST depends on the modulation of a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors and tropomyosin receptor kinase B (Tr?B), and signaling pathways mediated by brain-derived neurotrophic factor (BDNF), phosphoinositide 3-kinase (PI3K), protein kinase B (Akt), glycogen synthase kinase 3ß (GSK-3ß), mechanistic target of rapamycin (mTOR), besides increasing the immunocontent of BDNF and the synaptic proteins postsynaptic density protein 95 (PSD-95) and GluA1 in the prefrontal cortex of mice. Of note, these alterations were observed just 1 h after agmatine administration. Finaly, this study also performed a comparative analysis of theantidepressant-like effect of agmatine with a conventional antidepressant (fluoxetine) and a fast-acting drug (ketamine), using models of chronic stress. Mice exposed to chronic unpredictable stress (CUS) received a single oral dose of agmatine (0.1 mg/kg), ketamine (1 mg/kg), or fluoxetine (10 mg/kg) 24 h before being submitted to the TST. Only agmatine and ketamine were able to reverse the depressive-like behavior induced by CUS in the TST. No anhedonic behavior was observed in any experimental group. Moreover, no alteration was found in the immunocontent of PSD-95, synapsin and GluA1 in the CUS protocol and/or treatments in the prefrontal cortex of mice. After that, the comparative analysis of the antidepressant-like effect of agmatine, ketamine or fluoxetine was performed in another chronic stress model: the administration of cortiscosterone. A single administration of agmatine (0.1 mg/kg, p.o.) or ketamine (1 mg/kg, i.p.), but not fluoxetine 10 mg/kg, p.o.), was able to reverse the depressive-like behavior induced by corticosterone in the TST. No anhedonic behavior was found in any experimental group in splash test or sucrose comsuption test. Additionaly, reduced size and weight of adrenal glands were observed in mice submitted to corticosterone exposure, but none of the treatments were able to reverse these effects. Regarding biochemical analysis, treatment of control animals with agmatine, ketamine or fluoxetine increased the immunocontent of GluA1 in hippocampus, but caused no alteration in the phosphorylation of this protein (Ser831 and Ser845). In addition, none of the treatments were able to alter hippocampal immunocontent of PSD-95 and phosphorylation of p70S6 kinase (p70S6K). However, corticosterone administration was able to decrease the immunocontent of synapsin, and this effect was reversed only by fluoxetine. Altogether, the results of the present study provide evidence for the ability of agmatine to prevent depressive-like behavior in models of chronic stress with a single administration, similar to ketamine (fast-acting antidepressant response) suggesting that this amine could be a promising compound to the treatment of depression.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-09-05T04:10:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 348186.pdf: 2585353 bytes, checksum: 5430fc248541baa48a5dca4cff84f6cf (MD5) Previous issue date: 2017 / A frutose é um monossacarídeo presente naturalmente em alimentos como frutas, cana-de-açúcar, beterraba, mel, entre outros. Por ter sabor mais doce que a glicose e a sacarose, a indústria alimentícia utiliza a frutose como um de seus principais adoçantes, fazendo com que o consumo de frutose tenha aumentado de forma alarmante nas últimas décadas. O consumo de bebidas adoçadas contendo grandes quantidades de frutose, principalmente refrigerantes, é considerado um dos principais fatores associados ao desenvolvimento de síndrome metabólica e diabetes. Além disso, por ser uma molécula mais reativa que a glicose, o consumo de frutose está associado ao aumento na formação de metabólitos intermediários tóxicos, dentre os quais, o metilglioxal (MGO). O MGO parece estar associado ao desenvolvimento e a progressão de diabetes e doença de Alzheimer, uma vez que indivíduos portadores dessas patologias apresentam concentrações aumentadas de MGO no plasma e no líquido cefalorraquidiano. Além disso, dados prévios do nosso grupo e da literatura já demonstraram que o MGO prejudica os sistemas antioxidantes da glioxalase (Glo1/Glo2) e da tiorredoxina (Trx/TRxR), levando a degradação das proteínas tiorredoxina e glioxalase 2. Porém, estes efeitos foram investigados somente em linhagens celulares, e não há dados com o uso de sistemas mais complexos, como estudos in vitro com tecidos ou in vivo. Além disso, o efeito do MGO sobre a enzima antioxidante GR ainda é desconhecido e, visto que a GR apresenta estrutura muito similar a TrxR, e também por possuir cisteínas reativas, é possível que o MGO também afete a atividade e expressão da GR. Dessa forma, no presente trabalho objetivou-se investigar os efeitos do consumo crônico de frutose in vivo sobre o perfil metabólico e os parâmetros comportamentais de camundongos. Além disso, foram investigados em modelos in vitro de fatias hipocampais os efeitos do MGO sobre os sistemas da glioxalase, da tiorredoxina e da glutationa redutase. E ainda, investigou-se em modelo de células neurais HT22, se as diminuições dos níveis de Trx1 e Glo2, induzidos pelo MGO, poderiam ser mediados por degradação proteassomal ou autofágica, bem como se esses efeitos são mediados pela indução da ativação da proteína cinase ativada por AMP (AMPK). Os dados obtidos demonstram que o consumo de frutose em camundongos causa diminuição do consumo alimentar, aumento do consumo calórico e do peso corporal, aumento de colesterol total e da fração LDL, aumento dos níveis de glutationa e da atividade da Glo1 no fígado, aumento da atividade da glutationa peroxidase no córtex pré-frontal, bem como induz aumento da atividade locomotora. Com relação ao MGO, foi demonstrado que o tratamento in vitro de fatias de hipocampo com MGO compromete a atividade e o imunoconteúdo de GR em fatias hipocampais, diminui os níveis de glutationa (GSH) e induz uma rápida e robusta resposta das proteínas GR, Glo1, Glo2, Gr e TrxR1. Além disso, nossos dados demonstram que existe um claro efeito sinérgico entre e toxicidade induzida pelo MGO e a inibição da GR e da TrxR, sugerindo a toxicidade induzida pelo MGO é mediada pela depleção de antioxidantes celulares. Com relação aos estudos in vitro com células HT22, foi demonstrado que o MGO induz autofagia via ativação de AMPK, e que a Trx1 e a Glo2 são degradadas através da autofagia. Dessa maneira, a partir dos dados apresentados neste estudo, conclui-se que o consumo de frutose está relacionado a alterações no perfil lipídico e causa alterações comportamentais relacionadas ao aumento da locomoção. Além disso, nossos dados reforçam a hipótese de que alterações no ambiente redox podem ser o principal mecanismo de toxicidade induzido pelo MGO através de sua ação sobre os sistemas redutores de tiol GSH/GR e Trx/TrxR, bem como a indução da degradação proteica através da ativação de autofagia, mediada via AMPK. <br> / Abstract : Fructose is a monosaccharide naturally present in foods such as fruits, sugarcane, beets, honey, among others. Because it tastes sweeter than glucose and sucrose, the food industry uses fructose as one of its main sweeteners, causing fructose consumption to rise alarmingly in the last decades. The consumption of sweetened beverages containing large amounts of fructose, mainly soft drinks, is considered one of the main factors associated with the development of metabolic syndrome and diabetes. In addition, because fructose is a more reactive molecule than glucose, the consumption of fructose is associated with an increase in the formation of toxic intermediate metabolites, among them methylglyoxal (MGO). MGO appears to be associated with the development and progression of diabetes and Alzheimer's disease, since individuals with these conditions have increased concentrations of MGO in the plasma and cerebrospinal fluid. Furthermore, previous data from our group and the literature have demonstrated that MGO seems to impair the antioxidant systems of glyoxalase (Glo1/Glo2) and thioredoxin (Trx/TRxR), leading to the degradation of the proteins thioredoxin and glioxalase 2. However, these effects were investigated only in cell lines, and there are no data with the use of more complex systems, such as in vitro studies with tissues or in vivo studies. Also, the effect of MGO on the antioxidant enzyme glutathione reductase (GR) is still unknown and, since GR has a structure very similar to TrxR, and also because it has reactive cysteines, it is possible that MGO also affects the activity and expression of GR. Thus, the present work aimed to investigate the effects of chronic consumption of fructose in vivo on the metabolic profile and behavioral parameters of mice. In addition, the effects of MGO on the glyoxalase, thioredoxin and glutathione reductase systems were investigated in in vitro models of hippocampal slices. Furthermore, it was investigated in a neural HT22 cell model if the MGO-induced decreases in the levels of Trx1 and Glo2 was mediated by proteassomal or autophagic degradation, as well as whether those effects were mediated by the induction of the AMP-activated protein kinase (AMPK) activation. The data obtained demonstrate that the consumption of fructose in mice causes a decrease in food consumption, an increase in caloric intake and body weight, increase in total cholesterol and LDL fraction, increase of glutathione (GSH) levels and Glo1 activity in the liver, increase in the activity of the glutathione peroxidase in the prefrontal cortex, as well as an increase in locomotor activity. With respect to MGO, we found that in vitro treatment of hippocampal slices with MGO has compromised the activity and immunocontent of GR, decreased GSH levels and induced a rapid and robust response of GR, Glo1, Glo2, and TrxR1. In addition, our data demonstrate that there is a clear synergistic effect between MGO-induced toxicity and inhibition of GR and TrxR, suggesting that MGO-induced toxicity is mediated by depletion of cellular antioxidants. With respect to in vitro studies with HT22 cells, it has been shown that MGO induces autophagy via AMPK activation, and that Trx1 and Glo2 are degraded through autophagy. Thus, from the data presented in this study, it is concluded that the consumption of fructose is related to changes in the lipid profile and causes behavioral changes related to increased locomotion. In addition, our data reinforce the hypothesis that changes in the redox environment may be the main mechanism of toxicity induced by MGO through its action on GSH / GR and Trx / TrxR thiol reducing systems, as well as the induction of protein degradation through autophagy activation, mediated through AMPK activation.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos, Algas e Plantas, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-12-05T03:15:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 348748.pdf: 1269425 bytes, checksum: 3c1e8a307d9c4eed6b63ab24341ed589 (MD5) Previous issue date: 2017 / Os efeitos da radiação solar nos processos químicos e biológicos nos ambientes marinhos dependem principalmente da intensidade e do comprimento de onda. Os ambientes costeiros sempre estiveram sujeitos às altas radiações, porém a redução da camada de ozônio e o aumento do fluxo de UVR incidente são prejudiciais para organismos marinhos, principalmente aos fotossintetizantes. Para se protegerem desta variação, macroalgas adaptaram mecanismos de fotoproteção que são relacionados com a síntese de compostos que absorvem radiação UV/PAR atenuando estes efeitos deletérios. Atualmente, a busca por compostos bioativos naturais provenientes do ambiente marinho vem crescendo. Algas pardas são reconhecidas por sintetizar metabólitos secundários com potencial biotecnológico. O Brasil é rico em recursos aquáticos e apresenta uma costa com uma alta biodiversidade de espécies. Isso acarreta em um elevado potencial de espécies com compostos bioativos. O presente estudo teve como enfoque a prospecção de compostos que absorvem radiação UV/PAR com potencial biotecnológico, atrelando sua variação aos fatores abióticos. As algas foram coletadas na costa brasileira em vinte e três locais, provenientes de três regiões do Brasil. Todas as amostras foram condicionadas em sílica-gel. Foi obtido um extrato em metanol:clorofórmio dessas espécies e feita uma varredura de sua capacidade de absorver radiação UV-VIS, correlacionando esse aspecto aos fatores abióticos. As espécies de Phaeophyceae apresentaram um perfil característico do grupo com sete regiões principais de absorbância. As substâncias com maior interesse no grupo são os florotaninos e cumarinas absorvendo na região UV e carotenoides e clorofilaxiiabsorvendo na região PAR. Foi identificada a região 1 (Nordeste) com os maiores índices de compostos que absorvem radiação UV/PAR. Nesta avaliação, observou-se que temperatura, nebulosidade e nitrato estão diretamente correlacionadas aos compostos que absorvem a radiação UV/PAR. Como uma continuação do trabalho, recomenda-se que as substâncias fotoprotetoras, como fenólicos ou carotenoides, sejam extraídas e separadas / purificadas para maior detalhamento das moléculas e suas potencialidades. / Abstract : The effects of solar radiation on chemical and biological processes in marine environments depend mainly on intensities and wavelengths. Coastal environments have always been subject to high radiation, but the loss of the ozone layer and the increased flux of incident UVR are detrimental to marine organisms, especially photosynthesizers. To protect them from this variation, macroalgae adapted photoprotection mechanismsincluding the synthesis of UV / PAR absorbing compounds, attenuating these deleterious effects. Currently, the search for natural bioactive compounds from the marine environment has been growing. Brown algae are recognized for synthesizing secondary metabolites with biotechnological potential. Brazil is rich in aquatic resources and presents a coast with a high biodiversity of species. This leads to a high potential of finding species with bioactive compounds. The present study focused on the prospection of compounds that absorb UV/PAR radiation with biotechnological potential, linking its variation to abiotic factors. The algae were collected on the Brazilian coast in twenty-three sites, from three regions of Brazil. The samples were conditioned on silica gel. An extract was obtained in methanol: chloroform from these species and a scan of its capacity to absorb UV-VIS radiation, correlating this aspect with the abiotic factors. The silica gel method is not the most recommended for analysis of the metabolomics, and the percentage of degradation could compromise the significance of analyzes. The species of Phaeophyceae presented a characteristic profile of the group with seven main regions of absorbance. The substances of greatest interest in the group are the phlorotannins and coumarins absorbing in the UV region and carotenoids and chlorophyll absorbingxivin the PAR region. Region 1 (Northeast) was identified with the highest indexes of UV / PAR absorbing compounds. In this evaluation, it was observed that temperature, cloudiness and nitrate are directly correlated to these compounds variability. As a continuation of the work, it is recommended that photoprotective substances, such as phenolics or carotenoids, could be extracted and separated / purified for further detailing of the molecules and their potentialities.

Memoria para optar el título de Bioquímico / La presencia de asimetrías neuroanatómicas y funcionales en el cerebro de vertebrados es un rasgo ampliamente conservado que juega un papel importante en el comportamiento animal. El desarrollo diferencial de las mitades izquierda y derecha del cerebro se observa desde estados tempranos de la embriogénesis, lo que sugiere una regulación genética. Se ha descrito que la vía de señalización comandada por el factor de crecimiento TGFβ Nodal está involucrada en el establecimiento de asimetría de órganos internos en vertebrados. En pez cebra y medaka, los genes efectores de la vía Nodal, como el factor de transcripción pitx2c, se expresan en forma asimétrica a la izquierda del cerebro, precediendo el desarrollo de asimetrías neuroanatómicas. En pez cebra estas asimetrías incluyen al núcleo habenular y al complejo pineal. Al respecto, se sabe que el núcleo habenular izquierdo es más grande que el núcleo habenular derecho y que el órgano parapineal se localiza en la izquierda del diencéfalo. Estudios preliminares indican que el pez teleósteo medaka presenta un desarrollo de asimetrías neuroanatómicas similares a aquellas del pez cebra. De esta forma pez cebra y medaka son herramientas genéticas que nos permitirán comenzar a descifrar los mecanismos del desarrollo que participan en el establecimiento de las asimetrías neuroanatómicas en vertebrados. El objetivo de esta tesis fue determinar si las asimetrías neuroanatómicas de pez cebra y medaka se correlacionan con diferencias en la tasa de proliferación celular entre las habénulas izquierda y derecha, y si estas diferencias podrían estar controladas por el factor de transcripción pitx2c. Para el primer objetivo se realizaron experimentos de inmunoflurorescencia indirecta contra histona H3 fosforilada. Para el segundo objetivo, se midió la expresión de pitx2c mediante hibridaciones in situ sucesivas. Al respecto, en medaka, el ensayo contra histona H3 fosforilada muestra que existe una diferencia estadísticamente significativa en el número de células en proliferación entre ambas habénulas, a modo que el núcleo izquierdo presenta mayor número de éstas. Los resultados obtenidos sugieren la existencia de una asimetría izquierda/derecha en la tasa de proliferación celular, que es mayor para la mitad izquierda de la habénula. En pez cebra no fue posible realizar este ensayo, debido a que no se logró encontrar un marcador habenular que delimitara esta región en el embrión completo. En esta búsqueda se logró identificar un gen denominado cxcr4b, como un marcador de la zona más anterior de la habénula, donde su expresión muestra una clara tendencia a la asimetría. Por otro lado, se observó que tanto en pez cebra y en medaka, pitx2c se expresa unilateralmente en el epitálamo, específicamente en el lado izquierdo, desde estadios muy tempranos del desarrollo hasta estadios tardíos. La expresión más tardía no había sido descrita y está a favor de un posible papel de pitx2c en la morfogénesis asimétrica cerebral. Finalmente, se pudo establecer una correlación espacial y temporal entre la expresión de pitx2c y las asimetrías en la proliferación celular en la habénula de medaka, ya que los precursores habenulares izquierdos expresan pitx2c en el momento donde se observan las asimetrías en proliferación celular. Estos hallazgos deben ser en el futuro corroborados con experimentos de ganancia y pérdida de función de pitx2c / Neuroanatomical and functional asymmetries of the brain are conserved among vertebrates and play important roles in animal behaviour. Differences between the right and left sides of the brain have been described at early developmental stages, suggesting a genetic regulation of asymmetry. The Nodal pathway is one of many signalling pathways involved in the establishment of organ asymmetry in vertebrates. In zebrafish and medaka, effectors of the Nodal signaling pathway, such as the transcription factor pitx2c, are asymmetrically expressed in the left side of the brain, preceding the development of neuroanatomical asymmetries. Genetic studies in zebrafish have reported asymmetries within the epitalamic habenular nuclei and pineal complex. It is known that the left habenular nucleus is larger than the right nucleus, and that the parapineal organ is located on the left side of the diencephalon. Preliminary data indicate that medaka, a teleost similar to zebrafish, shows a similar pattern of neuroanatomical asymmetries in the brain. Therefore, zebrafish and medaka have emerged as genetic tools that will facilitate our understanding of the developmental basis of brain asymmetry. The aim of this thesis was to investigate whether the development of neuroanatomical asymmetries is associated with a differential rate of cell proliferation between the left and right habenular nuclei in zebrafish and medaka. In this thesis we also investigated whether differences in cell proliferation correlate with asymmetric expression of the transcription factor pitx2c. The first aim was approached using indirect immunofluorescence against phosphorylated histone H3. For the second aim, the pattern of expression of pitx2 was determined through in situ hibridization. The antibody essay against phosphorylated histone H3 in medaka revealed a difference in the number of proliferating cells within the habenulae, the left nucleus showing a larger amount of proliferating cells. These results suggest an asymmetric pattern of cell proliferation, in favor of the left habenular nucleus. It was not possible to perform the same assay in zebrafish due to the lack of an habenular marker that would allow us to circumscribe this region in the whole embryo. In this research, we were able to identify cxcr4b as a marker of the anterior habenular region, where its expression was clearly asymmetric. pitx2c was expressed unilaterally in the left epitalamic region of zebrafish and medaka, from early to late developmental stages. The late expression of pitx2c, which was not described before, supports a possible role of pitx2c during asymmetric morphogenesis of the brain. Finally, a spatial and temporal correlation was established between pitx2c expression and asymmetries in cellular proliferation in the habenulae of medaka. Precursors of the left habenular nucleus express pitx2c at the same time when asymmetries in cell proliferation are observed. These findings must be investigated further using pitx2c gain and loss of function experiments