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Caracterización de una Tiosulfato Azufre Transferasa (Rodanasa) del Microorganismo Quimiolitoautotrófico Acidithiobacillus FerrooxidansPonce Barrera, José Antonio January 2007 (has links)
Memoria para optar el título de Bioquímico / Acidiothiobacillus ferrooxidans es una bacteria quimiolitoautotrófica acidófila, que
obtiene su energía a partir de la oxidación del ion ferroso, azufre elemental y otros
compuestos de azufre reducidos. La habilidad de este microorganismo para solubilizar
los sulfuros metálicos es aprovechada en operaciones de biominería.
Se ha propuesto al tiosulfato como el intermediario principal en la oxidación de los
sulfuros metálicos. En el ciclo biológico de este compuesto están involucrados diversos
tipos de enzima, tales como la tiosulfato deshidrogenasa, tiosulfato reductasas y las
rodanasas (tiosulfato azufretransferasas). Estas últimas son una familia de enzimas
ampliamente distribuidas que catalizan la transferencia de un átomo de azufre sulfano
desde el tiosulfato al cianuro como aceptor. La actividad rodanasa ha sido descrita en
A. ferrooxidans, lo que sugiere la existencia de una o varias proteínas pertenecientes a
esta familia.
Mediante análisis bioinformáticos se encontraron ocho secuencias nucleotídicas que
contenían un dominio rodanasa simple en el genoma de Acidiothiobacillus ferrooxidans
ATCC 23270: p11, p14, p14.3, p15, p16, p16.2, p21, y p28. De estos ocho genes, se
aislaron seis desde el ADN total de A.ferrooxidans, se clonaron y sobreexpresaron en
Escherichia coli.
Posteriormente se determinó que las proteínas P15 y P16.2 presentaban claramente
actividad rodanasa, medida en extractos crudos de E. coli recombinantes. De estas dos
rodanasas, se purificó la proteína P15 a través de cromatografía de afinidad en columnas
de níquel-NTA. Una vez purificada esta proteína se procedió a caracterizarla preliminarmente, midiéndo el pH óptimo, la Km y la Vmax para dos de sus sustratos,
tiosulfato y cianuro.
Los resultados obtenidos en esta tesis ayudarán a entender el posible papel de las
rodanasas en el metabolismo u oxidación de los compuestos azufrados, lo que puede ser
importante para el funcionamiento óptimo de las operaciones de biominería.
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Sinalização purinérgica induz estresse oxidativo e altera captação e metabolismo do glutamato em testículos de ratos imaturosCenci, Vitoria Hayduck January 2016 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:50:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2016 / Muitas das respostas fisiológicas mediadas por purinas dependem de uma integração contínua entre diferentes vias de sinalização. No sistema reprodutor masculino, além da regulação hormonal, evidências sugerem uma participação importante na modulação da função testicular por nucleotídeos de adenina extracelulares, não apenas pela presença de purinoceptores nestas células, como também pela liberação de purinas no meio extracelular, mediada por células testiculares. O objetivo deste estudo foi demonstrar que o trifosfato de adenosina extracelular (ATPe) exerce efeitos modulatórios na fase imatura testicular, promovendo aumento do influxo de cálcio (Ca2+), estresse oxidativo, modulação da atividade da gama-glutamil transferase (y-GT) associado à alteração na disponibilidade de glutamato para as células testiculares. Foi desenvolvido um estudo in vitro em porções testiculares de ratos de 15 dias de idade foram expostos ao ATP em uma concentração de 1mM durante 30 minutos. Coomassie brilliant blue G, Suramina e 2MeSATP foram utilizados como antagonistas P2X e P2Y e o BzATP como agonista seletivo P2X7, inibidores das vias de sinalização da via ERK1/2, PKA e PI3K (PD98059, H89 e Wortmanina, respectivamente), bem como bloqueador de canal de Ca2+ dependente de voltagem do tipo-L (nifedipina) e quelante de Ca2+ intracelular e extracelular (BAPTA-AM e EGTA), e ainda o envolvimento de aminoácidos neutros (MeAIB) foram utilizados para determinar os mecanismos envolvidos na ação do ATP sobre células testiculares. Também foram determinados marcadores bioquímicos (atividade das aminotransferases) e de dano oxidativo, assim como alterações no influxo de 45Ca2+ e captação de [14C]-glutamato em testículo de ratos imaturos. O ATP em concentrações elevadas leva ao acúmulo de Ca2+ intracelular e induz estresse oxidativo sem alterar a atividade de enzimas antioxidantes e o conteúdo de GSH. Evidenciou-se também que o ATP interage com receptores de superfície do tipo P2X7 e ativa rotas de transdução de sinal (ERK1/2 e PI3K). Estes eventos acarretam em diminuição da atividade da y-GT, estímulo na captação de [14C]-glutamato, aumento da atividade da glutamina sintetase (GS) sem resultar em inviabilidade celular. Considerando-se estes dados, hipotetiza-se que elevadas concentrações de ATP, como ocorre em condições patológicas, em que as células liberam elevadas concentrações dessa purina no meio extracelular, podem estar relacionadas com um mecanismo de indução de estresse oxidativo em uma tentativa de compensar a condição patológica pré-existente.<br> / Abstract: Many of the physiologic responses mediated by purines depend on a seamless integration between different signaling pathways. In the male reproductive system, as well as hormonal regulation, evidence suggests an important role in the modulation of testicular function by adenine extracellular nucleotides, not only by the presence of purinoceptores in these cells, but also by the release of purines in the extracellular medium, mediated testicular cells. The aim of this study was demonstrate that the extracellular purine adenosine triphosphate (ATP) has modulatory effects on testicular immature stage, causing increased calcium (Ca2+) influx, oxidative stress, modulation of gamma-glutamyl transferase activity (y-GT) associated with change in glutamate availability for the testicular cells. Fifteen-day-old rat testis were exposed to ATP at a concentration of 1 mM for 30 minutes. Coomassie Brilliant Blue G, Suramin and 2MeSATP were used as P2X and P2Y antagonists and BzATP as a selective P2X7 agonist. Moreover, inhibitors of ERK1/2, PKA and PI3K (PD98059, H89 and wortmannin, respectively), L-type voltage-dependent Ca2+ channel blocker (nifedipine), Ca2+ chelators (BAPTA-AM and EGTA), and a(methylamino)isobutyric acid (MeAIB) were used to determine the mechanisms involved in the action of ATP on testicular cells. Biochemical markers such as aminotransferase activity and oxidative damage, as well as alterations in influx of 45Ca2+ and uptake of [14C]-glutamate in the immature rat testis. Were also determined the ATP in high concentrations leads to accumulation of intracellular Ca2+ and induces oxidative stress without changing the activity of antioxidant enzymes and the content of GSH. It is also evident that ATP interacts with P2X7 subtype of purinoceptors and activates signal transduction pathways (ERK1/2 and PI3K). These events lead to decreased activity of y-GT, as well as increased [14C]-glutamate uptake and glutamine synthetase (GS) activity without altering cell viability. Taken together, these data suggest that high extracellular ATP concentrations may be associated with an oxidative stress in attempt to compensate a pre-existing pathological condition.
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Papel da neopterina sobre a ativação do complexo inflamassoma no sistema nervosoMartins, Roberta de Paula January 2016 (has links)
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:51:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2016 / A inflamação é um processo essencial à proteção do organismo,entretanto, pode tornar-se prejudicial quando persistente. Neste contexto, vários estudos têm sugerido a ativação do inflamassoma,complexo que processa as citocinas pró-inflamatórias pró-IL-1ß e pró-IL-18 em suas formas maduras, como um evento determinante na patogênese de condições inflamatórias. Evidências têm demonstrado quea produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) deve induzir a ativação do inflamassoma NLRP3. A neopterina, uma pteridinaendógena, é considerada um biomarcador precoce e sensível de ativação do sistema imune. Concentrações elevadas de neopterina podem ser encontradas nos fluidos biológicos de pacientes com doenças neurológicas/neurodegenerativas. Entretanto, as concentrações da neopterina no líquido cefalorraquidiano parecem não corresponder diretamente com as concentrações observadas no plasma, sugerindo que a pteridina tenha uma produção no sistema nervoso central (SNC) de maneira independente da periferia. Apesar de elevadas concentrações de neopterina terem sido associadas a estresse oxidativo e inflamação durante décadas, seu papel nestas condições ainda não está elucidado.Assim, investigou-se a produção de neopterina no SNC e seus efeitossobre a ativação do inflamassoma em condições inflamatórias.Inicialmente, investigou-se se os astrócitos contribuem para a síntese de neopterina e qual o efeito da neopterina exógena em condições de mitotoxicidade induzida por azida sódica. Observou-se que astrócitoscorticais produzem e secretam neopterina para o meio extracelular em condições de mitotoxicidade. Além disso, neopterina (50 nM) inibiu a produção de ERO e aumentou o conteúdo de heme-oxigenase-1 induzido pela mitotoxina. A fim de avaliar a produção central de neopterina, induziu-se a inflamação aguda através da administração intraperitoneal de lipopolissacarídeo bacteriano (LPS; 0,33 mg/kg) emcamundongos suíços adultos. Foi observado que o LPS aumentou rapidamente a produção de neopterina no hipocampo e a secreção damesma no soro, fenômenos que aconteceram em paralelo à ativação do inflamassoma. Com o objetivo de melhor compreender as consequências da produção de neopterina no SNC, avaliou-se também o papel do précondicionamento com neopterina na ativação do inflamassoma induzida por LPS em cultura primária de células nervosas humanas. Observou-seque o pré-condicionamento com neopterina reduziu a ativação do inflamassoma em astrócitos humanos, além de inibir a expressão gênica de pró-caspase-1 em neurônios. Ainda, a neopterina aumentou as ecreção astrocitária das citocinas anti-inflamatórias IL-10 e IL-1Ra. Considerando que além de biomarcador da ativação do sistema imune, a neopterina deve exercer funções neuro protetoras em condições inflamatórias no SNC, analisou-se a secreção de neopterina e mediadores inflamatórios no soro de pacientes diagnosticados com Transtorno do Espectro Autista (TEA). Observou-se concentrações elevadas de neopterina e das citocinas anti-inflamatórias IL-10 e IL-1Ra em pacientes diagnosticados com TEA, porém as citocinas próinflamatórias IL-1ß, TNF-a e IL-6 não aumentaram significativamente.Em conclusão, a produção de neopterina anterior ou em paralelo à estímulos inflamatórios no SNC pode exercer funções neuroprotetoras, favorecendo a resistência ao estresse oxidativo e inibindo a ativação do inflamassoma, provavelmente devido a ativação da via Nrf2/OH-1.<br> / Abstract: Inflammation is an essential process for host defense; however, it canbecome harmful when sustained. Several studies have suggested that inflammasome activation, a protein complex responsible for thematuration of pro-inflammatory cytokines, pro-IL-1ß and pro-IL-18, is akey event in the pathogenesis of inflammatory diseases. It has been demonstrated that reactive oxygen species (ROS) production maytrigger NLRP3 inflammasome activation. Neopterin, an endogenouspteridin, is considered an early and sensitive biomarker of immunesystem activation. Elevated neopterin levels can be found in thebiological fluids of patients affected by neurological/neuro degenerative diseases. The origin of the metabolite in the brain is still not completed defined, but there is some evidence suggesting that neopterin synthesisin the central nervous system (CNS) is independently of the periphery. Although elevated neopterin levels have been associated with oxidativestress and inflammation for decades, the role of the pteridine in these conditions remains also unclear. Initially, it was investigated whetherastrocytes could contribute to neopterin synthesis and the effects ofexogenous neopterin on azide-induced mitotoxicity. It was observed that rat cortical astrocytes produced and released neopterin under mitochondrial stress. In addition, extracellular neopterin (50 nM)inhibited ROS production and increased heme-oxygenase-1 (HO-1)content. Thus, we investigated neopterin production in the CNS under lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory conditions. A singleLPS (0.33 mg/kg; intraperitoneal) injection in adult Swiss mice elicitedan early hippocampal and serum increase of neopterin levels, phenomenon that occurred in parallel with inflammasome activation. Aiming to better understand the role of neopterin under inflammatoryconditions in the CNS, we evaluated the effect of pre-conditioninghuman primary nerve cells on LPS-induced inflammasome activation.Neopterin pre-conditioning inhibited the inflammasome activation inastrocytes and neurons. Moreover, neopterin conditioning increased theastrocytic release of anti-inflammatory cytokines IL-10 and IL-1Ra.Finally, considering that neopterin showed the above mentionedcytoprotective effects and that it is a clinical biomarker for inflammation, we then analyzed the levels of neopterin and cytokines inthe serum of patients affected by Autism Spectrum Disorders (ASD),which physiopathology is still virtually known. Higher neopterin andanti-inflammatory IL-10 and IL-1Ra levels were observed in ASDpatients, while IL-1ß, TNF-a and IL-6 did not change. In conclusion,neopterin may exert neuroprotective functions when produced before orin parallel with the inflammatory stimulus in the CNS by favoring oxidative stress resistance and inhibiting inflammasome activation,probably by activating the Nrf2/HO-1 cytoprotective pathway.
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Investigação de aspectos neuroquímicos e comportamentais em modelos animais e pacientes com epilepsiaLopes, Mark William January 2016 (has links)
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016 / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:53:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2016 / A epilepsia é uma doença crônica caracterizada por ataques epilépticos recorrentes. A maioria dos pacientes com epilepsia do lobo temporal (ELT), que é o tipo mais comum de epilepsia, além de apresentarem crises convulsivas são acometidos por transtornos neuropsiquiátricos. Estes distúrbios neurocomportamentais e os episódios de crise são provenientes de alterações nos circuitos neurais e maquinaria neuroquímica/celular utilizada para eventos fisiológicos. Além disso, sistemas de sinalização inter e intracelular que são fundamentais para a atividade sináptica são passíveis de regulação e podem estar envolvidos na fisiopatologia da epilepsia. Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivos: 1) caracterizar alterações específicas da transmissão glutamatérgica e vias de sinalização intracelular no hipocampo dorsal e ventral e córtex temporal de ratos Wistar adultos submetidos ao modelo da pilocarpina de epilepsia; 2) investigar a relação temporal entre a ELT e comorbidades psiquiátricas através de testes comportamentais realizados nas fases de maturação e epilepsia crônica de ratos Wistar adultos submetidos ao modelo da pilocarpina; 3) caracterizar alterações específicas da transmissão glutamatérgica e vias de sinalização intracelular em amostras de neocortex, amígdala e hipocampo dos pacientes com ELT submetidos ao processo cirúrgico, e especificamente na amígdala, investigar os efeitos da administração de dexametasona; 4) através do uso de ferramentas de manipulação genética investigar o papel da enzima carboxipeptidase A6 (CPA6) e moléculas de sinalização celular no modelo de crises convulsivas induzidas por pentilenotetrazol (PTZ) e pilocarpina em zebrafish. Os principais resultados incluem: 1) diminuição na fosforilação de PKA/GluA1-Ser845, aumento na expressão de GFAP e diminuição na expressão do transportador GLT1 no hipocampo dorsal na fase crônica do modelo da pilocarpina. Em contraste, no hipocampo ventral ocorreu diminuição na fosforilação de PKC/GluA1-Ser831. Estes resultados sugerem um desequilíbrio região específico da transmissão glutamatérgica e de vias de sinalização em resposta a Pilo-SE; 2) déficits na discriminação olfatória e memória social de curto prazo nos períodos de maturação e epilepsia crônica de ratos submetidos ao modelo da pilocarpina; 3) diminuição na fosforilação de CaMKII/GluA1-Ser831 na amígdala de pacientes com ELT tratados cirurgicamente após uma única dose de dexametasona; 4) larvas de zebrafish geneticamente modificadas (knockdown para CPA6), apresentaram resistência a crises convulsivas induzidas por PTZ e pilocarpina. Alterações na sinalização peptidérgica e a supressão de inputs excitatórios após a perda de função da enzima CPA6 podem estar envolvidos no mecanismo de resistência. Em conjunto, as alterações neuroquímicas identificadas em regiões cerebrais específicas podem ser valiosas para a compreensão da fisiopatologia da epilepsia e podem ajudar a estabelecer alvos terapêuticos para o tratamento desta neuropatologia. Por fim, os modelos animais aplicados neste estudo reproduziram características específicas da doença, podendo assim ser utilizados como ferramenta para estudar estratégias neuroprotetoras, bem como os mecanismos neurobiológicos e psicopatológicos associados a epileptogênese. <br> / Abstract : Epilepsy is a chronic disease characterized by recurrent seizures. The majority of patients with temporal lobe epilepsy (TLE), which is the most common type of epilepsy, have to live not only with epileptic episodes but also with neuropsychiatric disorders. These neurobehavioral disorders and seizures come from changes in neural circuitry and neurochemistry/cellular machinery used in physiological events. In addition, inter- and intracellular signaling systems that are critical to synaptic activity are subject to regulation and may be involved in the pathophysiology of epilepsy. Thus, this study aimed to: 1) characterize specific changes of glutamatergic transmission and intracellular signaling pathways in the dorsal and ventral hippocampus and temporal cortex of adult Wistar rats submitted to the pilocarpine model of epilepsy; 2) investigate the temporal relationship between TLE and psychiatric comorbidities through behavioral tests performed in the maturation and chronic epilepsy phases of adult Wistar rats submitted to the pilocarpine model; 3) characterize specific changes of glutamatergic transmission and intracellular signaling pathways in the samples of neocortex, amygdala and hippocampus of TLE patients undergoing surgical process, and specifically at amygdala, investigate the effects of dexamethasone administration; 4) using tools of genetic engineering, investigate the role of enzyme carboxypeptidase A6 (CPA6) and cellular signaling molecules in the model of seizures induced by pentylenetetrazole (PTZ) and pilocarpine in zebrafish. The main results include: 1) decrease of PKA/GluA1-Ser845 phosphorylation, increase of GFAP expression and decrease in GLT1 transporter expression in the dorsal hippocampus in the chronic period of the pilocarpine model. In contrast, in the ventral hippocampus the phosphorylation of PKC/GluA1-Ser831was decreased. These results suggest an imbalance region-specific of glutamatergic transmission and signaling pathways in response to Pilo-SE; 2) deficits in olfactory discrimination and short-term social memory during maturation and chronic epilepsy periods of rats submitted to the pilocarpine model; 3) decrease in phosphorylation of CaMKII/GluA1-Ser831 in the amygdala of TLE patients surgically treated after a single dose of dexamethasone; 4) zebrafish larvae genetically modified (knockdown to CPA6) showed resistance to seizures induced by PTZ and pilocarpine. Changes in peptidergic signaling and suppression of excitatory inputs following CPA6 loss of function may be involved in mechanisms of resistance. Taken together, the neurochemical changes identified in specific brain regions may be valuable for understanding the pathophysiology of epilepsy and can help establish therapeutic targets for the treatment of neuropathology. Finally, the animal model used in this study reproduces specific characteristics of the disease, and thus can be used as a tool to study neuroprotective strategies as well as psychopathological and neurobiological mechanisms underlying to epileptogenesis.
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Efeito antitumoral dos extratos hidroalcoólico e supercrítico da semente de Passiflora edulis f. flavicarpa Degener (Passifloraceae)Mota, Nádia Sandrine Ramos Santos January 2015 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:06:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1
340548.pdf: 3484014 bytes, checksum: 75fa077316c96f5c32e7614011e08bcf (MD5)
Previous issue date: 2015 / A utilização da extração supercrítica para a obtenção de compostosbioativos a partir das sementes da P. edulis f. flavicarpa Degener,consideradas como resíduos da indústria agroalimentar, demonstrou seruma forma eficiente de usar estas sementes por recicla-las, além de seruma excelente alternativa à extração convencional (maceraçãohidroalcoólica). Estudos prévios já evidenciaram o potencial efeitoantitumoral da P. edulis f. flavicarpa Degener, contudo os prováveismecanismos de ação responsáveis por tal efeito não estão totalmenteelucidados. Neste contexto, o presente trabalho objetivou avaliarcomparativamente o potencial antitumoral dos extratos hidroalcoólico(EtOH) e supercrítico (300bar/40°C/CO2/5% etanol, ESC) da torta desementes da P. edulis f. flavicarpa Degener, utilizando para issomodelos in vitro (MCF-7), moleculares (CT-DNA e DNA plasmidial) ein vivo (camundongos Balb/c inoculados com células do tumor ascíticode Ehrlich - TAE). Para tanto, avaliou-se a citotoxicidade (MTT), ainteração com o CT-DNA (espectrofotometria UV-Vis e fluorescência),a capacidade de induzir fragmentação ao DNA plasmidial, a capacidadeantiproliferativa (efeito sobre o ciclo celular), o efeito pró-apoptótico(coloração com EtBr/LA), a atividade antitumoral in vivo (avaliaçõesmorfológicas) e por fim, o efeito antiangiogênico in vivo (contagem dosvasos). A citotoxicidade dos extratos foi avaliada sobre as células deMCF-7 tratadas por 72h (10 a 500 µg/mL), no qual o ESC foi maiscitotóxico que o EtOH (CI50ESC = 291,07±16,15µg/mL; CI50EtOH =320,63±1,15µg/mL). Ambos os extratos apresentaram compostosintercalantes no CT-DNA (hipocromismo e redução da fluorescência doEtBr) e causaram fragmentação simples do DNA plasmidial(FIIEtOH50µg/mL = 59,81%; FIIESC50µg/mL = 87,30%). Nos ensaios in vivo,ambos os extratos diminuíram o peso corporal dos animais e o volumede líquido ascítico em decorrência do aumento na proporção de célulastumorais inviáveis. O que culminou no aumento da inibição docrescimento tumoral (EtOH200mg/kg/dia = 27,32±5,19% e ESC200mg/kg/dia =48,45±7,19%) e a sobrevida dos animais tratados (ESC200mg/kg/diaaumentou em 12,0% a probabilidade dos animais estarem vivos em 30dias; contra 17 dias de vida dos tratados com EtOH200mg/kg/dia). Acoloração com EtBr/LA revelou que o provável tipo de morte celularinduzida pelos tratamentos foi por apoptose, uma vez que as célulasadquiriram uma coloração laranja, característica de células apoptóticas(EtOH200mg/kg/dia = 30,57% e ESC200mg/kg/dia = 48,22%). Ambos osextratos apresentaram o efeito antiproliferativo por bloquear o ciclocelular. No entanto, o ESC apresentou tal efeito mais pronunciado doque o EtOH por induzir um atraso na fase G1 seguida de um bloqueiodo ciclo celular na fase G2. Por fim, ambos os extratos exibiramatividade antiangiogênica in vivo, onde o ESC apresentou tal efeito maisacentuado (ESC200mg/kg/dia = 90%). Os resultados obtidos demonstramque ambos os extratos da P. edulis f. flavicarpa Degener apresentaramatividade citotóxica, antiproliferativa, pró-apoptótica e antitumoral tantoin vitro com in vivo, mediado pelo bloqueio do ciclo celular em respostaaos danos no DNA, com respectiva sinalização de apoptose.Adicionalmente, o efeito antiangiogênico contribuiu na atividadeantitumoral observada. Ressaltando-se que, o ESC apresentou o feitoantitumoral mais eficaz que o EtOH provavelmente devido a presençados alcaloides ß-carbolínicos, harmana e harmina. Concluindo-se que aextração supercrítica confere maior citotoxicidade e efeito antitumoralaos extratos obtidos por essa técnica, por aumentar o poder de extraçãode compostos com provável atividade antitumoral.<br> / Abstract: The use of supercritical extraction to obtain bioactive compounds fromthe seeds of P. edulis f. flavicarpa Degener, considered as waste of thefood industry, proved to be an efficient way to use these seeds byrecycling them. Besides being an excellent alternative to conventionalextraction (hydro-alcoholic maceration). Previous studies havehighlighted the potential antitumor effect of P. edulis f. flavicarpaDegener. However, the mechanisms of action responsible for this effectare not fully elucidated. In this context, this study aimed tocomparatively evaluate the antitumor potential of hydro-alcoholic(EtOH) and supercritical extract (300bar/40°C/CO2/5% ethanol, SFE) ofseed cake of P. edulis f. flavicarpa Degener. For this purpose wasconducted in vitro (MCF-7), molecular (CT-DNA and plasmid DNA)and in vivo (Balb/c mice inoculated with Ehrlich ascites carcinoma cells- EAC) models. Therefore, we assessed the cytotoxicity (MTT),interaction with the CT-DNA (UV-Vis spectrophotometry andfluorescence), ability to induce plasmid DNA fragmentation,antiproliferative activity (effect on cell cycle), pro-apoptotic effect(staining with EtBr/OA), antitumor activity in vivo (morphologicalevaluation) and finally the antiangiogenic effect in vivo (microvesselcounting). The extracts cytotoxicity was determined on MCF-7 cellstreated for 72 hours (10 to 500 µg/mL), where ESC was more cytotoxicthan the EtOH (IC50SFE = 291.07±16.15µg/mL; IC50EtOH =320.63±1,15µg/mL). Both extracts showed intercalating compounds onCT-DNA (hypochromism and fluorescence reduction of EtBr) andcaused fragmentation of plasmid DNA (single strand break,FIIEtOH50µg/mL = 59.81%; FIISFE50µg/mL = 87.30%). In the in vivo assays,both extracts decreased the body weight of the animals and the volumeof ascites due to an increase in the proportion of unviable tumor cells.What led to increased inhibition of tumor growth (EtOH200mg/kg/day =27.32±5.19% e SFE200mg/kg/day = 48.45±7.19%) and survival of thetreated animals (ESC200mg/kg/day increased in 12.0% the probability ofanimals were alive at 30 days compared to 17 days of life those treatedwith EtOH200mg/kg/day). The staining with EtBr/OA revealed thatapoptosis was the type of cell death induced by treatments, since thecells have acquired an orange color, characteristic of apoptotic cells(EtOH200mg/kg/day = 30.57% e SFE200mg/kg/day = 48.22%). Both extractsshowed antiproliferative effect by blocking the cell cycle. However,ESC has a more pronounced effect than the EtOH by inducing a delay inthe G1 phase followed by a block of the cellular cycle in the G2 phase.Finally, both extracts exhibited antiangiogenic activity in vivo, whereESC had a greater effect (SFE200mg/kg/day = 90.0%). Indeed, the resultsshowed that both extracts of P. edulis f. flavicarpa Degener showedcytotoxic, antiproliferative, pro-apoptotic and antitumor activity in vitroand in vivo, mediated by blocking the cell cycle in response to DNAdamage, with relative apoptosis signaling. Additionally, theantiangiogenic effect has contributed to the observed antitumor effect.Emphasizing that ESC had showed the most effective antitumor effectthan EtOH probably due to the presence of ß-carboline alkaloids harmanand harmine. In conclusion, the supercritical extraction provides greatercytotoxicity and antitumor effect to the extracts obtained by thistechnique due to increased power of extraction of compounds withpossible antitumor activity.
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Análise metagenômica do microbioma de mangue do Litoral do ParanáSeccon, Denny Marcel January 2016 (has links)
Orientador : Prof. Fábio Oliveira Pedrosa / Coorientador : Helisson Faoro / Coorientador : Profª. Roseli Wassem / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 27/09/2016 / Inclui referências : f. 24-27;71-75;78-88 / Resumo: A descrição da penicilina revelou que microrganismos eram a fonte primária de muitos produtos naturais com aplicações farmacológicas. Sua bem-sucedida adoção medicamentosa foi seguida por um período prolífico de isolamento de novas drogas obtidas a partir de microrganismos encontrados no ambiente. Entretanto, a velocidade de novas descobertas diminuiu quando se observou que a grande maioria dos microrganismos não era prontamente cultivável em condições laboratoriais, ao mesmo tempo em que os organismos patogênicos alvo das drogas que vinham sendo usadas desenvolviam resistência. Logo ficou evidente que a empreitada deveria buscar novas estratégias. Pesquisadores passaram a estudar novas classes de metabólitos secundários, entre os quais chamou a atenção os produtos das sintetases de peptídeos não-ribossomais (NRPS) e sintases de policetídeos (PKS). Os módulos que compõem esses sistemas enzimáticos são formados por alguns domínios básicos e outros opcionais, que a partir de precursores simples - aminoácidos e acetato, respectivamente - são capazes de sintetizar moléculas com grande variedade estrutural, muitas com atividade biológica igualmente diversa. Outra frente de investigação se aproveitou dos avanços nas técnicas de isolamento e pesquisa independente de cultivo para explorar ambientes antes negligenciados, como o mar, que logo revelou hospedar uma nova gama de microrganismos e produtos derivados. Além de informações funcionais específicas, a exploração eficiente e sustentável desses ambientes exige uma melhor caracterização de suas comunidades microbianas; microrganismos são componentes essenciais de seu funcionamento, mas essa literatura ainda é escassa. Em virtude disso, esse trabalho propôs a investigação do microbioma de sedimentos de mangue da região da Baía de Paranaguá, Paraná, Brasil, através de metagenômica. No primeiro capítulo, usamos técnicas de sequenciamento de amplicons gerados a partir do gene de rRNA 16S para caracterizar a comunidade presente e determinar os fatores ambientais que moldam essa estrutura. Encontramos um predomínio dos filos Proteobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria, Chloroflexi e Acidobacteria, quase todos significativamente afetando as estruturas intralocais. As classes mais abundantes foram Deltaproteobacteria, Gammaproteobacteria e Alphaproteobacteria. Revelamos forte influência da composição química derivada da proximidade do mar, sendo os fatores pH (SMP), H++Al3+, Ca2+, Mg2+, Na+, T, P, Na% e Ca/Mg significativos, mas não encontramos efeito de presença de planta, possibilidade descrita na literatura. Comparamos essa comunidade com a de outros mangues e encontramos similaridades que apontam para um perfil característico dependente de bioma, dominado pelos mesmo filos abundantes encontrados no mangue paranaense. No segundo capítulo, realizamos o sequenciamento shotgun de duas amostras do mangue pertencentes a localizações quimicamente diversas para determinar seu perfil funcional. As funções prevalentes eram relacionadas a subsistemas baseados em formação de cluster, carboidratos, aminoácidos e derivados, e funções variadas. Em níveis hierárquicos mais baixos, a abundância relativa de funções é geralmente balanceada. As diferenças funcionais também se mostraram dependentes de fatores ambientais, mas essa influência é menor do que no perfil taxonômico, o que indica resiliência funcional frente a alterações externas. As similaridades do mangue frente a outros biomas se mostraram mais dependentes de tipo de matriz (onde solo > água) do que de composição química (onde salina > não-salina); as dissimilaridades funcionais também foram menores que as taxonômicas, mas sua intensidade manteve relação com o grau de diferença de ambiente. No terceiro capítulo, o sequenciamento e processamento de amplicons provindos dos domínios A e C de enzimas NRPS, e KS de enzimas PKS, confirmou o mangue estudado como fonte potencial de metabólitos secundários. As medidas de diversidade não mostraram um padrão entre domínios enzimáticos, mas sugerem os melhores grupos para prospecção: verão | localização B para domínios A, inverno | localização B para domínios C, e inverno | localização A para domínios KS. Apesar de muitas sequências encontradas terem sido taxonomicamente afiliadas a gêneros reportadamente envolvidos na síntese desses metabólitos secundários, a descoberta de novos produtores é esperada dado o número de OTUs reportados e a presença de muitas sequências relacionadas a bactérias não caracterizadas. Os resultados apresentados devem servir de base para futuros estudos de prospecção direcionada. / Abstract: The description of penicillin revealed that microorganisms were the primary source of many natural products with pharmacological application. Its successful adoption as a medicament was followed by a prolific period in the isolation of new drugs obtained from microorganisms found in the environment. However, the pace of new discoveries decreased when it was noticed that the vast majority of microorganisms was not readily cultivable in laboratorial conditions, while the pathogenic organisms targeted by drugs in use developed resistance. It soon became evident that the enterprise should try new strategies. Researchers started studying new classes of secondary metabolites, among which much attention was given to the products of non-ribosomal peptide synthetases (NRPS) and polyketide synthases (PKS). The modules building these enzymatic systems are formed by some basic and optional domains, which, from simple precursors - amino acids and acetate, respectively - are able to synthetize molecules with an incredible structural variety, many with equality diverse biological activity. Another front of investigation took advantage of the advances in isolation and cultivation-independent research techniques to explore environments previously neglected, like the ocean, which soon revealed to host a whole new range of microorganisms and derived products. Besides specific functional information, the efficient and sustainable exploration of such environments demands a better characterization of their microbial communities; microorganisms are essential components of their functioning, yet this literature is scarce. Following from these, this work proposed investigating the microbiome of mangrove sediments from the region of Paranaguá Bay, Paraná, Brazil, through metagenomics. In the first chapter, we used 16S rRNA gene-amplicon sequencing to characterize the community present and to determine the environmental factors shaping this structure. We found a predominance of phyla Proteobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria, Chloroflexi and Acidobacteria, almost all significantly affecting the intralocal structures. The most abundant classes were Deltaproteobacteria, Gammaproteobacteria and Alphaproteobacteria. We revealed a strong influence of the chemical composition derived from the proximity to sea, being significant the factors pH (SMP), H++Al3+, Ca2+, Mg2+, Na+, T, P, Na% and Ca/Mg, but we found no plant effect, a possibility described in the literature. We compared this community with those of other mangroves and found similarities that point to a biome-dependent characteristic profile, dominated by the same abundant phyla found in the mangrove from Paraná. In the second chapter, we performed the shotgun sequencing of two mangrove samples from different environments to determine their functional profile. Prevailing functions were related to clustering-based subsystems, carbohydrates, amino acids and derivatives, and miscellaneous functions. In lowest hierarchy levels, the relative abundance of functions is generally balanced. The functional differences were also dependent on environmental factors, but this influence was smaller than in the taxonomic profile, which indicates functional resilience in front of external changes. The similarities of mangroves to other biomes were more dependent on matrix type (where soil > water) than on chemical composition (where saline > nonsaline); the functional dissimilarities were also smaller than the taxonomical, but the intensity kept its relation to the degree of environmental difference. In the third chapter, sequencing and processing of amplicons derived from A and C domains from NRPS, and KS from PKS, confirmed the studied mangrove as a potential source of secondary metabolites. The diversity measures showed no pattern among the enzymatic domains, but suggest the most suitable groups for prospection: summer | location B for A domains, winter | location B for C domains, and winter | location A for KS domains. Even though many sequences were taxonomically affiliated to genera reportedly involved in the production of such secondary metabolites, the discovery of new producers is expected given the number of OTUs reported and the presence of many sequences affiliated to uncharacterized bacteria. The results presented will be the basis for future studies of directed prospection.
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Estudo fitoquímico e biológico de Aristolochia ridiculaMachado, Marcos Batista [UNESP] 13 March 2009 (has links) (PDF)
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machado_mb_dr_araiq.pdf: 6272175 bytes, checksum: f9deb39987b1028beb05e731c8a72429 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente trabalho descreve o isolamento, a identificação e a elucidação estrutural dos constituintes químicos de Aristolochia ridicula H.B.K., bem como a avaliação das potenciais atividades inseticidas, antiplasmódicas e antimicobacterianas dos extratos e das substâncias isoladas dessa espécie. Os extratos acetônico de folhas e etanólico de caules foram fracionados por partição, lavagem e métodos cromatográficos, resultando em seis e quatorze substâncias, respectivamente. Dentre essas substâncias estão uma nova biflavona (ridiculuflavona D), uma nova chalcona-flavona (ridiculuflavonilchalcona B) e um tetraflavonóide com esqueleto carbônico inédito (ridiculuflavonilchalcona C), juntamente com a ridiculuflavona C e o proto-quercitol, os quais foram previamente isolados dessa espécie. Além desses compostos, isolou-se um flavonóide (luteolina), três alcalóides [()-coclaurina, (−)-cloreto de N-steponina e (−)-metilwarifteina], uma alcamida (N-trans-feruloi-tiramina), duas ribonolactonas [(+)-2-desoxi-D-ribono-1,4-lactona e seu derivado 3,5-bis(tripolifosfato)], um derivado glucosídico (etil--D-glucopiranosídio) e o ácido 2-butinodióico. Além disso, identificou-se os íons 3-hidroxipropanoato, acetato e formiato por RMN 1D e 2D, sugerindo que esses compostos são derivados do ácido 2-butinodióico, o qual não foi detectado por RMN de 1H. As estruturas de todos os compostos isolados foram determinadas por métodos espectrométricos (RMN 1D e 2D, EMAR, IV, UV e DC). Transformações químicas (metilações e/ou acetilações) dos flavonóides ridiculuflavona C e ridiculuflavonilchalcona B, bem como dos alcalóides cloreto de N-steponina e metilwarifteina e da alcamida N-trans-feruloil-tiramina também auxiliaram na elucidação estrutural dessas substâncias. A susceptibilidade do inseto Anticarsia gemmatalis às soluções de extratos e de flavonóides... / This work describes the isolation, identification, and structural elucidation of the chemical constituents of Aristolochia ridicula H.B.K., as well as the evaluation of insecticidal, antiplasmodial, and antimycobacterial activities of extracts and the chemical constituents from this species. The acetone extract of the leaves and ethanol extract of the stems were fractionated by partitions and washing, followed by chromatographic column, PTLC, and/or HPLC methods to give, respectively, six and fourteen compounds. These included a new biflavone (ridiculuflavone D), a new chalcone-flavone (ridiculuflavonylchalcone B), and a tetraflavonoid with a new carbon skeleton (ridiculuflavonylchalcone C), together with a biflavone (ridiculuflavone C) and a cyclitol (proto-quercitol), which were previously isolated from this species. In addition, a flavonoid (luteolin), three alkaloids [()-coclaurine, (−)-N-steponine chloride, and (−)-methylwarifteine], an alkylamide (N-trans-feruloyl tiramine), two ribonolactones [(+)-2-deoxy-D-ribono-1,4-lactone and its derivative 3,5-bis(tripolyphosphate)], a glucose derivative (ethyl -D-glucopyranoside), and 2-butynedioic acid were isolated. Moreover, 3-hydroxypropanoate, acetate, and formate were detected by NMR techniques, which suggests that they are derivatives from 2-butynedioic acid, which is not detected by 1H NMR. The structures of all isolated compounds were determined by spectrometric method (1D and 2D NMR, HRMS, IR, UV, and CD). Chemical transformations (methylations and/or acetylations) of ridiculuflavone C, ridiculuflavonylchalcone B, N-steponine chloride, methylwarifteine, and N-trans-feruloyl tiramine, also provide further evidences in the structural elucidations of these compounds. The susceptibility of Anticarsia gemmatalis to solutions of extracts and several flavonoids from A. ridicula were evaluated by topical... (Complete abstract click electronic access below)
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Caracterización de la isla genómica IG-asnT de Salmonella enterica y su papel en la interacción del serovar Enteritidis con macrófagos murinosQuezada Bustos, Carolina Paz January 2009 (has links)
Salmonella Enteritidis es actualmente el serovar de Salmonella más prevalente a nivel
mundial. Mediante el análisis bioinformático de los genomas de distintos serovares de
Salmonella identificamos una región genómica que se encuentra presente en S.
Enteritidis, así como en S. Gallinarum y S. Dublin (serovares filogenéticamente
cercanos a S. Enteritidis). Esta región corresponde a una Isla de Patogenicidad, la cual
denominamos IG-asnT. Resultados obtenidos en nuestro laboratorio sugieren que
varias de las proteínas codificadas en IG-asnT de S. Enteritidis participarían en la
colonización de órganos internos de ratón en un modelo de virulencia in vivo. Entre
ellas se encuentran proteínas estructurales de un pilus tipo IV (SEN1977), una proteína
involucrada en movilización de plasmidios (SEN1980) y TlpA (TIR-like protein A), la
cual presenta un dominio con homología a proteínas que participan en respuestas
inflamatorias de células del sistema inmune. Debido a que la capacidad de Salmonella
para sobrevivir en los macrófagos de su hospedero es un factor indispensable para su
diseminación sistémica y la posterior colonización de órganos blanco, en este proyecto
nos propusimos determinar si la isla IG-asnT codifica productos génicos que cumplen
un papel en la interacción de S. Enteritidis con macrófagos murinos y definir si al
menos uno de ellos participa en la producción y/o secreción de la proteína TlpA. Para
esto, se estudió la capacidad de varias mutantes de genes presentes en IG-asnT para
sobrevivir al interior de macrófagos murinos, de las cuales las mutantes SEN1977,
SEN1980 y tlpA presentaron una capacidad disminuida de supervivencia en estos
macrófagos en comparación a la cepa silvestre. Por otra parte, nuestros resultados
indican que tlpA participa en el proceso que lleva a la muerte celular de los macrófagos
infectados con S. Enteritidis. Pudimos determinar que TlpA se produce en distintas
condiciones de cultivo in vitro, además de expresarse al interior de los macrófagos
infectados. El resto de los genes presentes en la isla no participan en la expresión ni en
la producción de la proteína TlpA en las condiciones estudiadas. Estos resultados
entregan nueva evidencia sobre factores de virulencia de S. Enteritidis involucrados en
su adaptación a células hospederas, que podrían explicar en parte su prevalencia
sobre otros serovares.
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Caracterização molecular dos genes PSO2 e PSO4 de Saccharomyces cerevisiae envolvidos na reparação do DNA : análise funcional e identificação de interações proteína-proteínaRevers, Luis Fernando January 2003 (has links)
O alelo mutante termo-condicionalmente letal pso4-1 do gene PRP19, que codifica uma proteína associada ao spliceossoma, permitiu investigar a influência deste gene no processamento de pré-mRNA, reparação do DNA e esporulação. Fenótipos relacionados a genes portadores de introns foram correlacionados à temperatura. Sistemas repórteres para processamento de pré-mRNA e RT-PCR mostraram que eficiência de processamento de mRNA no mutante pso4-1 é inversamente correlacionada com a temperatura de crescimento. Uma mutação pontual, substituindo uma leucina por uma serina foi identificada dentro da região codificadora N-terminal do alelo Pso4-1 e afeta as propriedades bioquímicas de Pso4-1p. Entre 24 clones isolados utilizando o sistema doishíbridos, 7 foram identificados como partes dos genes RAD2, RLF2 e DBR1. RAD2 codifica uma endonuclease indispensável para a via reparação por excisão de nucleotídeos (NER), RLF2 codifica a subunidade maior do fator de montagem da cromatina I, cuja deleção resulta em sinsibilidade à radiação UVC, enquanto que DBR1 codifica uma enzima que atua sobre substratos de RNA na forma lariat, degradando estruturas lariat em introns durante o processamento de mRNA. A caracterização dos fenótipos após tratamentos com mutágenos em linhagens mutantes simples e duplos de rad2∆, rlf2∆ e pso4-1 mostraram sensibilidade aumentada para para mutantes rad2∆/pso4-1 e rlf2∆/pso4-1, sugerindo uma interferência funcional destas proteínas no processo dereparação do DNA em Saccharomyces cerevisiae. O mecanismo exato de reparação de pontes inter-cadeia (ICL) em S. cerevisiae não é ainda totalmente conhecido. Identificando novos fenótipos e isolando proteínas potencialmente capazes de interagir com Pso2p através da técnica do sistema dois-híbridos, foi possível extender a caracterização deste gene específica para reparação de pontes intercadeia. Tratamentos com acetaldeído (ACA), um metabólito natural da via glicolítica, foi mais tóxico a linhagem mutante pso2 em comparação com a linhagem selvagem e também capaz de induzir a expressão da fusão contendo o promotor de PSO2 à lacZ (PSO2-lacZ) por um fator comparável à tratamentos com outros agentes indutores de ICLs, indicando que o metabólito natural ACA pode causar danos do tipo ICL em S. cerevisiae. A utilização do sistema dois-híbridos permitiu isolar partes de proteínas codificadas por nove diferentes genes, entre eles a proteína quinase Pak1p, um supressor de mutações termosensíveis da DNA Polimerase alfa. Pak1p interage com a extremidade C-terminal conservada de Pso2p, uma região da proteína recentemente nomeada β-CASP entre v ortólogos conhecidos do gene PSO2. A integridade do domínio β-CASP é essencial para a reparaçãode DNA proficiente como demonstrado em ensaios de complementação com mutantes pso2 ∆. Comparação da sobrevivência após tratamento com agentes mutagênicos de simples mutantes pso2 ∆ e pak1 ∆ assim com o dulpo mutante pso2 ∆/pak1 ∆ revelaram que o gene PAK1 é necessário para reparação do DNA proficiente como na linhagem selvagem. A interação epistática dos dois alelos mutantes na linhagem duplo mutante sugere que Pak1p atua na mesma via de reparação a qual PSO2 pertence e que PAK1 constitui um novo locus envolvido na reparação do DNA em S. cerevisiae.
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Estudo do processamento das memórias de curta e longa duraçãoQuevedo, João Luciano de January 2002 (has links)
(João Quevedo - Estudo do Processamento das Memórias de Curta e Longa Duração) - Este trabalho apresenta a compilação dos 4 principais experimentos carreados ao longo de 1999-2002: 3 deles envolvem o modelo animal e um quarto utilizase de voluntários humanos. Entretanto, o uso desses diferentes paradigmas não prejudica a unidade do conjunto. O Capítulo 1 apresenta sucintamente o marco teórico dos 4 trabalhos. Inicialmente são discutidos aspectos modulatórios da consolidação da memória. Após, alguns elementos da bioquímica da consolidação da memória são apresentados no intuito de permitir establecer um entendimento das vias da PKA e da MAPK e suas correlações com a via final comum – a síntese protéica. Adicionalmente, a dissociação STM e LTM é discutida a partir do referencial farmacológico. Uma última unidade apresenta conceitos primitivos do papel da amígdala na modulação da memória e das evidências da implicação das emoções, via amígdala, na modulação da memória em humanos. Os experimentos utilizando a esquiva inibitória como paradigma e o rato como sujeito ocupam os Capítulos 2, 3 e 4. No Capítulo 2 é apresentado um corpo de resultados que permite observar uma dissecção farmacológica da STM e LTM. Os dados demonstram um envolvimento de fenômenos dependentes de PKA em ambas STM e LTM, dependentes de MAPK apenas na STM, e dependentes de síntese protéica apenas na LTM. O Capítulo 3 apresenta um trabalho realizado em colaboração com o Prof. Steven P. R. Rose (Open University, UK), que envolve a determinação dos momentos sensíveis à inibição da síntese protéica na consolidação da LTM. Foram observados dois momentos: um inicial, junto ao treino, e um tardio apos 3h. Além disso, foi possível demonstrar que um treino prévio de baixa intensidade, mas não a pré-exposição ao aparato, pode impedir o estabelecimento de amnésia induzida pelo bloqueio da síntese protéica. O Capítulo 4 estende os achados com anisomicina observados no Capítulo 3, estudando também o inibidor da PKA, Rp-cAMPs, e o inibidor da MAPKK, PD 098059. Os dados obtidos confirmam também para essas cascatas a indução em um treino prévio de baixa intensidade de algum fenômeno celular de longa duração que torna o aprendizado de um segundo treino independente de PKA, MAPK ou síntese protéica. O estudo da dissociação da STM e LTM foi ampliado, agora no modelo humano, no experimento descrito no Capítulo 6. Nesse experimento, observamos uma clara influência do conteúdo emocional na LTM, mas a ausência desse efeito na STM. A discussão geral (Capítulo 7) busca integrar esses achados descritos nos capítulos anteriores dentro da nova perspectiva molecular da neurobiologia da memória. Além disso, abre discussão acerca de possíveis novas possibilidades de pesquisa.
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