Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-05-17T15:55:22Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3652908 bytes, checksum: 5659a8779947e080c2cd957f4f69a051 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-17T15:55:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3652908 bytes, checksum: 5659a8779947e080c2cd957f4f69a051 (MD5) Previous issue date: 2010-01-27 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Peptídeos antimicrobianos (AMPs) são expressos por muitos organismos e apresentam uma função multifacetada. Estudos os têm revelado como potenciais agentes antibacterianos, defensivos agrícolas, medicamentos cicatrizantes, imuno-moduladores, agentes quimiotáticos, entre outros. Defensinas, a maior família dos peptídeos antimicrobianos, são moléculas com prevalência catiônica, ricas em cisteínas, apresentando em geral três ou quatro pontes dissulfídicas. São constituídas de 45 a 54 resíduos de aminoácidos, encontradas em organismos vertebrados e invertebrados, apresentam atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos e vírus encapsulados. Essas moléculas apresentam baixa toxicidade a animais e plantas, justificando assim seu uso como drogas ou defensivos agrícolas. As defensinas atuam por meio de atrações eletrostáticas com a face externa das membranas celulares alvo, gerando poros e ocasionando morte celular. Elas também atuam, segundo estudos recentes, como sinalizadores primários e secundários em vias apoptóticas e como agentes potencializadores das defesas imunológicas, sendo o mecanismo de atuação molecular ainda desconhecido. A busca por AMPs de plantas tem sido realizada no Laboratório de Proteômica e Bioquímica de Proteínas (DBB/UFV) visando à caracterização estrutural desses peptídeos. O isolamento de peptídeos antimicrobianos de extratos solúvel (ES) e de parede celular (EP) de folhas de pimentão da variedade Sunshine foi realizado por etapas pré-cromatográficas (centrifugações, fracionamento salino e por ultrafiltrações) e por cromatografia líquida multidimensional offline. As frações de interesse obtidas de ES e de EP foram testadas em relação à sua atividade antimicrobiana contra o fungo Alternaria solani e contra as bactérias Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Gram positiva, e Ralstonia solanacearum, Gram negativa, pela técnica de microplacas, evidenciando a inibição do crescimento desses microrganismos. Os resultados sugerem a ocorrência de aglomerações dos AMPs nos extratos, dadas as características de hidrofobicidade e cargas desses peptídeos, e que as etapas de separação por massas moleculares devem ser realizadas visando reduzir esses efeitos. O procedimento experimental proposto ao final do trabalho, que envolve o fracionamento por sal e por ultrafiltração, seguindo-se cromatografia de fase reversa em C4, permitiu a separação das amostras em frações com atividades antimicrobianas diferentes e potencialmente de interesse para a exploração comercial na defesa de plantas. A construção de um banco de dados que agrupe informações sobre defensinas, possibilitando evidenciar relações entre as moléculas já conhecidas e sequências não identificadas, apresenta-se de grande importância para a complementação dos estudos crescentes sobre esses peptídeos. As bases de dados do DefDB já estão disponíveis e podem ser utilizadas para identificação de sequências obtidas por métodos de sequenciamento, seja pelo alinhamento com a sequência obtida, ou pela identificação comparativa utilizando ferramentas computacionais específicas, como programas e pipelines utilizados para análises de dados de espectrometria de massa. Assim, as informações obtidas desse banco de dados, com a ajuda de ferramentas de análises já disponíveis na rede mundial de computadores, podem colaborar para a identificação de novas sequências, para a elucidação do mecanismo de atuação molecular, além de contribuir para direcionar estudos iniciais sobre esses peptídeos. Portanto, a obtenção de frações com alta atividade antimicrobiana, juntamente com o desenvolvimento de bases de dados específicas, que facilitem a identificação dos possíveis peptídeos antimicrobianos presentes nessas frações, pode ser o caminho para o estudo e o isolamento de novos compostos naturais, capazes de substituir defensivos agrícolas danosos ao ambiente, e/ou serem utilizados como base de medicamentos para combater infecções e doenças imunológicas. / Antimicrobial peptides (AMPs) are expressed by many organisms and have a multifaceted role. Studies have revealed the AMPs as potential antibacterial agents, pesticides, drugs, healing, immune modulators, chemotactic agents, among others. Defensins, the largest family of antimicrobial peptides, are cationic molecules, rich in cysteines, with four disulfide bridges. They consist of 45 to 54 amino acid residues, found in vertebrate and invertebrate organisms, presenting activity against Gram-positive and Gram- negative bacteria, fungi and encapsulated virus. These molecules have low animals and plants toxicity, thereby justifying their use as drugs or pesticides. The defensins act by means of electrostatic attractions with the external surface of the target cell membranes, creating pores and causing the cell death. They also operate, according to recent studies, such as primary and secondary signs in the apoptosis via and as enhancers of immune defenses, being the molecular mechanism of action still unknown. The search for AMPs in plants has been performed at the Laboratório de Proteômica e Bioquímica de Proteínas (DBB / UFV) aiming to characterize the structure of these peptides. The process of separation of peptides was performed by pre-chromatographic step (centrifuging, saline precipitation and ultrafiltration) and offline multidimensional liquid chromatography. The fractions of interest obtained from ES and EP were tested about their antimicrobial activity against the fungus Alternaria solani and against the bacteria Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Gram positive, and Ralstonia solanacearum, Gram negative, the microplate technique, showing the inhibition of growth of these microorganisms. The results indicated the occurrence of possible agglomeration of AMPs in the extracts, given the characteristics of hydrophobicity and charges of these peptides, and that the separation steps by molecular weight should be carried out to reduce these effects. The experimental procedure proposed by the latter, which involves the fractionation by salt and by ultrafiltration followed by reverse- phase chromatography on C4, allowed the separation of samples into fractions with different antimicrobial activities and potentially of interest to the commercial exploration to the plants defense. The construction of a data bank to collate information about defensins, allowing the construction of relations between the molecules that have been discovered and unidentified sequences, presented as a very important achievement for the complementation of studies about these peptides. The DefDB databases are available and can be used to identify the sequences obtained by sequencing methods, either by aligning the sequence obtained, or by the comparative identification using specific computational tools, such as programs and pipelines used for data analysis of MS. Thus, the information of this data bank, helped by analysis tools already available on the World Wide Web, may contribute to the identification of new sequences, to elucidate the molecular mechanism of action, and contributes to guide initial studies about these peptides. Therefore, the obtation of fractions with high antimicrobial activity, together with the development of specific databases, to facilitate the identification of potential antimicrobial peptides in these fractions, may be the way to the study and isolation of new natural compounds that can replace harmful pesticides to the environment, and/or be used as the basis for drugs to fight against infections and immune disorders. / Dissertação antiga, falta ficha catalog.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-05T13:01:32Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 663177 bytes, checksum: ffa992f1521764da943dc8672729f08e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T13:01:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 663177 bytes, checksum: ffa992f1521764da943dc8672729f08e (MD5) Previous issue date: 2003-07-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A ingestão de grãos de leguminosas, como a soja e derivados, resulta no aparecimento de sintomas desagradáveis, destacando-se a flatulência. Flatulência é resultante do metabolismo anaeróbico de α-1,6-galactosídeos de rafinose (RO: oligossacarídeos de rafinose) presentes nos grãos das leguminosas em geral. A remoção desses açúcares poderia aumentar o consumo de alimentos derivados de soja. A hidrólise enzimática dos RO, catalisada por α-galactosidases, parece ser o tratamento mais promissor para a redução do conteúdo de RO em produtos derivados de soja. O objetivo deste trabalho foi verificar a eficiência de α-galactosidases de várias fontes para hidrolisar os RO presentes no extrato desengordurado de soja e nos produtos melaço leve e pesado. Foram testadas α-galactosidase de sementes germinadas de soja e de Tachigali multijuga , α-galactosidases de Aspergillus terreus e de Penicillium griseoroseum. O processo de purificação do extrato enzimático, obtido de sementes de soja var. Monarca, embebidas por 60 h, consistiu das etapas de crioprecipitação, precipitação ácida, fracionamento com sulfato de amônio e cromatografias de filtração em gel e de troca iônica, resultando numa preparação contendo atividade de α-galactosidase. A enzima foi purificada 19,74 vezes, com rendimento de 36,64%. Atividade máxima de α- galactosidase foi detectada em pH 5,0 a 50 °C. Cerca de 90% da atividade enzimática original foi mantida, após pré-incubação por 4 h a 40 °C. Os valores de K M ap para ρNPGal, melibiose e rafinose foram de 0,47 mM, 1,46 mM e 3,43 mM, respectivamente. A enzima hidrolisou com maior intensidade o ρNPGal, seguido por rafinose, estaquiose e melibiose. Galactose, SDS, CuSO 4 , rafinose, estaquiose e melibiose atuaram como inibidores da atividade de α-galactosidase. Os resultados dos tratamentos do extrato desengordurado de soja com a preparação enzimática contendo atividade de α-galactosidase, mostraram redução de 100% de rafinose e 53% de estaquiose, após incubação por 8 h, a 40 °C. Quando o extrato desengordurado de soja foi tratado com a α-galactosidase de Tachigali multijuga, a S1 de A. terreus e a de P. griseoroseum, constatou-se redução no teor de rafinose de 72%, 100% e 66%, e no teor de estaquiose de 49%, 100% e 100%, respectivamente, após incubação por 8 h, a 40 °C. A redução no teor de RO nos produtos melaço leve e pesado de soja, tratados com a preparação enzimática contendo atividade de α-galactosidase, foi de 100% para rafinose e 58% para estaquiose, após incubação por 8 h, a 40 °C, para ambos os produtos. Conclui-se que as α-galactosidases testadas hidrolisaram substancialmente os carboidratos não- digeríveis, rafinose e estaquiose, do extrato desengordurado de soja e dos produtos melaço leve e pesado de soja, indicando uma possível utilização destas enzimas em processos industriais, visando a diminuição dos RO e o aumento do uso da soja como fonte protéica vegetal na alimentação humana e animal. / The intake of legume seeds, like soybean and its derived products, results in unpleasant symptoms, including flatulence. It results from the anaerobic metabolism of α-1,6-galactosides of raffinose (RO: Raffinose Oligosaccharides) that is generally present in legume seeds. The removal of these sugars would have a positive impact in soybean food consumption. The enzymatic hydrolysis of RO by α-galactosidase, seems to be the most promising treatment, for the reduction of RO content in derived soybean products. The objective of this work was to verity the efficiency of α-galactosidases from various sources in hydrolyze RO present in soybean extract and soybean molasses. The α-galactosidases tested were purified from germinating seeds of soybean and seeds of Tachigali multijuga, of the Aspergillus terreus and of Penicillium griseoroseum cultures. The purification process of the enzymatic extract from germinating soybean seeds at 60 h was submitted to cryoprecipitation, acid precipitation, fractionation with ammonium sulphate, gel filtration and ion exchange chromatographys, resulting in a preparation with activity for α-galactosidase. The purification factor was 19.74 fold with enzymatic activity recovery of 36.64%. Maximum α-galactosidase activity was detected in pH 5.0 and 50 °C. The enzyme maintained near 90% of its original activity after pre-incubation for 4 h at 40 °C. The K M ap values for hydrolysis of ρNPGal, melibiose and raffinose were of 0.47 mM, 1.46 mM and 3.43 mM, respectively. The highest enzyme activity was observed with ρNPGal, followed by raffinose, stachyose and melibiose. Galactose, SDS, CuSO 4 , raffinose, stachyose and melibiose inhibited the enzyme activity. The results of the treatment of soybean extract with the enzymatic preparation of α- galactosidase, after incubation for 8 h at 40 °C, showed a reduction of 100% and 53% in the raffinose and stachyose contents, respectively. When the soybean extract was treated with α-galactosidases of T. multijuga, S1 of A. terreus and P. griseoroseum, a reduction of 72%, 100% and 66%, and of 49%, 100% and 100%, it was verified in the raffinose and stachyose contents, respectively, after incubation for 8 h, at 40 °C. The reduction in the level of RO in the soybean molasses, treated with the enzymatic preparation with α- galactosidase activity, was from 100% for raffinose and 58% for stachyose, respectively, after incubation for 8 h, at 40 °C. In conclusion, it was observed that the α-galactosidases tested in this study, were able to hydrolyze substantially the non digestible carbohydrates (raffinose oligosaccharides) present in soybean extract and soybean molasses, indicating a possible use of these enzymes in the industrial process, seeking the decrease of RO and the increase of the use of the soybean as a source of vegetable protein for human and animal feeding. / Dissertação importada do Alexandria.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-06T18:00:08Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2095342 bytes, checksum: 836e140d6c09e19f6272573eb8e50aef (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-06T18:00:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2095342 bytes, checksum: 836e140d6c09e19f6272573eb8e50aef (MD5) Previous issue date: 2004-07-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Peptídios antimicrobianos (AMPs) são produzidos por animais, plantas, insetos e outros organismos como estratégia de defesa eficiente, flexível, com consumo mínimo de energia e biomassa, em função de seu pequeno tamanho. Em vegetais, foram identificadas dez famílias de AMPs como parte da barreira constitutiva de defesa da planta, com massas moleculares que variam de 2 a 9 kDa. Este trabalho visou identificar e purificar peptídios de sementes de soja sintetizados durante a germinação e avaliar a atividade antibacteriana, com o objetivo de desenvolver defensivos agrícolas naturais e agentes antimicrobianos para as indústrias farmacêutica e veterinária. Sementes de soja da variedade UFV 16 (Glycine max [L.] Merrill) foram germinadas por 24, 48, 72 e 96 h, trituradas e maceradas em 2,5 volumes do tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0 contendo EDTA, PMSF e benzamidina. As sementes não germinadas foram moídas e adicionadas de tampão fosfato de sódio 25 mM na proporção de 1:5, contendo KCL, EDTA, tiouréia, PMSF e benzamidina. Os homogenatos de ambas foram mantidos sob agitação branda em geladeira por 2 h, centrifugados, e os sobrenadantes foram precipitados com sulfato de amônio. Cada sobrenadante foi aquecido a 80oC/15 min para precipitação diferencial de proteínas, e centrifugado. Seguiu-se cromatografia de troca aniônica em coluna DEAE-Sepharose com tampão Tris-HCl 25 mM, pH 7,0, em equipamento tipo FPLC. O pool catiônico obtido foi submetido à cromatografia de troca catiônica em coluna CM-Sepharose com tampão MES 25 mM, pH 6,0, em equipamento tipo FPLC, e o pico eluído em 0,35 M de NaCl foi submetido à cromatografia de fase reversa em coluna C18-HPLC. Os perfis obtidos após cromatografia de fase reversa das sementes germinadas e não germinadas foram comparados para análise dos AMPs sintetizados durante a germinação. A semente germinada por 48 h mostrou duas regiões de síntese de diferentes proteínas. Foram realizados testes de atividade antimicrobiana utilizando o pool catiônico após troca aniônica e o pico eluído com 0,35 M de NaCl após troca catiônica, para as bactérias fitopatogênicas Ralstonia solanacearum (gram-negativa) e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (gram- positiva), mostrando inibição parcial e total para os extratos após troca aniônica e catiônica, respectivamente. Paralelamente, análises de espectrometria de massa com os extratos obtidos após RP-HPLC indicaram a presença de peptídio de 1 a 9 kDa e de proteína de massa maior que 20 kDa, em regiões do perfil cromatográfico correspondentes à eluição em concentrações inferiores e superiores a 40% de acetonitrila, respectivamente. Outros picos peptídicos sintetizados durante a germinação por 48, estão sendo submetidos a análises de espectrometria de massa, seqüenciamento e testes antimicrobianos, visando selecionar peptídios efetivos contra fitopatógenos de interesse. / Purification and Antibacterial Activity of Synthesized Peptides During the Germination of Soybean Seeds (Glycine Max [L.] Merrill). Adiver: Maria Cristina Baracat Pereira. Committee Members: Elizabeth Pacheco Batista Fontes and Reginaldo da Silva Romeiro. Antimicrobial peptídes (AMPs) they are produced by animals, plants, insects and other organisms as strategy of efficient, flexible defense, with minimum consumption of energy and biomass, in function of its small size. In plants, they were identified ten families of AMPs as part of the constituent barrier of defense of the plant, with molecular masses that vary of 2 to 9 kDa. This work aiming t to identify and to purify peptides of soybean seeds synthesized during the germination and to evaluate the antibacterial activity, objectifying the development of defensive agricultural natural and agents antimicrobial for the pharmaceutical and veterinary industries. Soybean of seeds of the variety UFV 16 (Glycine max [L.] Merrill) they were germinated by 24, 48, 72 and 96 h, triturated in the proportion of 1:2,5 using Tris-HCl buffer 0,1 M, pH 7,0 contends EDTA, PMSF and benzamidine. The no germinated seeds were triturated and added of phosphate of sodium buffer 25 mM in the proportion of 1:5, containing KCL, EDTA, thiourea, PMSF and benzamidine. . Both obtained extracts were maintained under agitation and ice-bath in refrigerator for 2 h, and centrifuged . As the first step of purification procedure, protein extracts were recovered after ammonium sulfate precipitation and centrifugation, heating up to 80oC/15 min for precipitation of proteins and a new centrifugation. Anion-exchange chromatography was followed in column DEAE-Sepharose using Tris-HCl buffer, 25 mM, pH 7.0 in equipment type FPLC. The obtained cationic pool was submitted to the cationic exchange cromatography in column CM Sepharose using MES buffer 25 mM, pH 6,0, in equipment type FPLC, and a fraction were recovered in NaCl 0,35 M, that was submitted to a C18- RP-HPLC. The obtained RP-HPLC profiles of the germinated and no-germinated seeds were compared each other and two different groups of proteins were observed when seeds were germinated by 48 h, if compared with no-germinated seeds, indicating expression of different proteins. Tests of antimicrobial activity were realized using the anionic-exchange pool and the cationic exchange-pool, against the plant pathogens Ralstonia solanacearum (Gram-negative) and Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Gram-positive), showing partial- or full-inhibition, respectively . Simultaneously, analysis of mass spectrometry with the C18-RP-HPLC extracts shows peptides (1 to 9 kDa) and proteins (20 kDa in areas of the profile cromatography corresponding to the eluted in inferior and superior concentrations at 40% of acetonitrile). Other peptide fractions were submitted to the mass spectrometry analysis, amino acids-sequence determination, and antimicrobial test, aiming to select effective peptides to control important plant patogens of commercial interest. / Dissertação importada do Alexandria

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2018-01-09T03:22:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 349094.pdf: 1891020 bytes, checksum: ade596640a1f6d33af4c10b90f3ec9ef (MD5) Previous issue date: 2017 / Tióis celulares estão entre os principais alvos das espécies reativas de oxigênio (ERO), portanto, estão no centro dos processos redox celulares. A oxidação de tióis proteicos pode levar à perda de função de enzimas, modulação de vias de sinalização e morte celular; assim, a manutenção do estado redox destes tióis é crucial para a homeostasia celular. Os sistemas da glutationa (GSH) e da tiorredoxina (Trx) são considerados os principais tampões redox celulares e são os principais sistemas envolvidos na manutenção do estado redox celular. A contínua reciclagem das formas oxidadas da GSH e Trx pelas enzimas glutationa redutase (GR) e tiorredoxina retudase (TrxR) é crucial para este processo, mantendo o contínuo fluxo de elétrons para peroxidases. A glutationa peroxidase (GPx) e as peroxirredoxinas (Prx) estão entre as peroxidases mais eficientes. As Prx são consideradas sensores de H2O2, participando de vias de sinalização redox, sendo o estado de oxidação de sua cisteína catalítica um marcador de estresse oxidativo. A perda da homeostasia redox tem sido correlacionada com diversas situações patológicas, como inflamação e câncer. Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo analisar a importância dos sistemas da GSH e Trx na proteção de células contra oxidantes, além de estudar a modulação redox das Prx durante a fagocitose em neutrófilos. No primeiro trabalho investigamos o efeito de 2-acetylamino-3-[4-(2-acetylamino-2- carboxyethylsulfanylthiocarbonylamino)phenylthiocarbamoylsulfanyl] propionic acid (2-AAPA), um inibidor da GR, sobre parâmetros de viabilidade celular e balanço redox em células derivadas de glioblastoma humano A172. Nossos dados demonstram que o 2-AAPA, além de inibir a GR, também é um potente inibidor da TrxR. A inibição dessas enzimas por 2-AAPA diminuiu drasticamente a capacidade dessas células em metabolizar peróxidos orgânicos, deixando as células mais vulneráveis a este peróxido. 2-AAPA apresentou um perfil de toxicidade tempo- e concentração-dependente. A oxidação da Prx 1, Prx2 e Prx3 foi observada apenas na concentração tóxica de 100µM, após 30 min de incubação. 2-AAPA também causou uma severa disfunção mitocondrial, afetando o potencial de membrana e respiração acoplada a produção de ATP. Apresentamos evidências de que a oxidação de peroxirredoxinas e disfunção mitocondrial são eventos precoces na toxicidade de 2-AAPA a células A172. Coletivamente, esses dados reforçam a hipótese do papel central dos sistemas da GSH e Trx na proteção de células a agentes oxidantes, e reforça a hipótese de que a inibição conjunta de GR e TrxR pode ser uma estratégia interessante para o tratamento de câncer. No segundo trabalho, estudamos a modulação redox de Prx durante o burst oxidativo em células pró-mielocíticas HL60 diferenciadas em neutrófilos. Demonstramos que a diferenciação dessas células com DMSO diminui a expressão da Prx2 de uma maneira tempo dependente, mas não alterou os níveis de Prx1, indicando um possível papel regulatório da Prx2 na diferenciação dessas células por DMSO. Enquanto isso, a diferenciação com ATRA não alterou os níveis de Prx2. A estimulação das células diferenciadas com forbol miristato acetato ou staphylococcus aureus induziu o burst oxiativo nas células diferenciadas, levando à oxidação da Prx1 de uma maneira tempo-dependente. A oxidação da Prx1 foi dependente da atividade da NADPH oxidase, já que a sua inibição aboliu esse efeito. Além disso, demonstramos que a inibição da NADPH oxidase por Diphenyleneiodonium chloride diminui a oxidação basal da Prx1. Por último, discutimos os resultados apresentados com dados obtidos em neutrófilos durante a minha estadia no Center for Free Radical Research da Nova Zelândia, sob orientação da Christine Winterbourn. Mostramos que as Prx estão completamente oxidadas em condições basais, um fenômeno nunca antes observado. Assim, apresentamos dados relevantes que podem ter implicações importantes para a sinalização redox e, consequentemente, para a função de células inflamatórias. De modo geral, os dados apresentados ressaltam a importância da modulação do ambiente redox na função e morte celular. / Abstract : Thiol groups are amongst the main targets of reactive oxygen species (ERO), therefore they are at the center of all redox processes in the cell. Protein thiol oxidation can lead to loss of function, response signaling and cell death and, hence, the maintenance of thiols in cell is critical for cellular homeostasis. The glutathione (GSH) and thioredoxin (Trx) systems are the main redox buffers in cells. The continuous recycling of the oxidized forms of GSH and Trx is achieved by the action of glutathione reductase (GR) and thioredoxin reductase (TrxR), which keep the constant supply of electrons for the peroxidases. Among these, the peroxiredoxins (Prx) have a special role, acting as a peroxide sensor and marker of oxidative stress. The loss of redox homeostasis has been linked to several pathologies such as inflammation and cancer. Therefore, this work aims at study the importance of the GSH and Trx systems to cell protection against oxidants, and to analyze the redox modulation of Prx during inflammatory processes. In the first work, we investigated the effect of 2-acetylamino-3-[4-(2-acetylamino-2- carboxyethylsulfanylthiocarbonylamino)phenylthiocarbamoylsulfanyl]propionic acid (2-AAPA), an inhibitor of GR and TrxR, on parameters of cell viability and redox balance in A172 glioblastoma cells. The inhibition of these enzymes drastically reduced cell?s capacity to metabolized organic peroxides (but not H2O2) and, consequently, rendered cells more susceptible to organic peroxide. 2-AAPA also displayed a time and concentration dependent toxicity. We observed a marked oxidation of Prx 1, 2 and 3, as well as a severe mitochondrial dysfunction. Collectively, our results highlight the importance of GSH and Trx systems to cell?s protection against oxidants. Also, we present evidence that oxidation of Prx and mitochondrial dysfunction are early events in 2-AAPA toxicity to A172 cells. In the second work, we studied the redox modulation of Prx during oxidative burst in differentiated promyelocytic HL60 cells. We demonstrated that the differentiation of these cells to a neutrophil-like phenotype with dimethylsulfoxide (DMSO) greatlydiminished Prx2 expression in a time-dependent manner, but didn´t change Prx1 expression. Pharmacological stimulation or exposure to microbes induced the oxidative burst in the differentiated cells, leading to Prx1 oxidation in a time-dependent manner. Oxidation of Prx1 was dependent on NADPH oxidase, because inhibition of this enzyme abolished this effect. Furthermore, inhibition of the oxidase by Diphenyleneiodonium chloride reduced the basal oxidation of Prx1 in unstimulated cells. Lastly, we discuss the presented results with data obtained from human neutrophils during my stay at the Center for Free Radical Research in New Zealand under supervision of Christine Winterbourn. We show for the first time that the Prx are completely oxidized under unstimulated conditions. Therefore, the presented results may have important implications for the role of Prx in inflammatory cells function. Overall, this thesis highlights the central role of the modulation of the redox environment to cell function and death, as well as shows, for the first time, a Prx fully oxidized in unstressed conditions.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2018-01-09T03:24:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 349092.pdf: 3180449 bytes, checksum: 35a901a7c9ca1f0f4a4f37c9384ff1d0 (MD5) Previous issue date: 2017 / A intensificação de atividades industriais e agrícolas na margem de corpos d?água tem imposto aos ambientes aquáticos uma crescente carga de resíduos. Dentre esses, poluentes orgânicos persistentes (POPs) e metais-traço, os quais se concentram no ambiente e nos organismos em decorrência de sua difícil degradação. POPs são biomagnificados através da dieta, alcançando níveis elevados em tecidos adiposos de predadores de topo, como cetáceos. POPs são frequentemente relacionados à maior incidência de doenças oportunistas e de carcinomas e à diminuição das taxas reprodutivas em cetáceos. Faz-se necessário o emprego de biomarcadores que permitam identificar antecipadamente quadros de exposição a tais compostos. O presente trabalho mensurou biomarcadores de biotransformação de xenobióticos, do sistema de defesa antioxidante e defesa imunológica em amostras tegumentares de botos da tainha, residentes no Complexo Estuarino de Santo Antônio dos anjos-Imaruí-Mirim, SC (CEL), e no estuário da Lagoa dos Patos, RS (ELP). Valores de contaminantes bioacumulados e resposta de biomarcadores foram comparados entre locais, machos e fêmeas, adultos e juvenis e entre botos amostrados no inverno e no verão. Níveis de resposta de biomarcadores também foram correlacionados aos níveis de organoclorados (OCs), bifenilas policloradas (PCBs) e éteres difenílicos polibromados (PBDEs) bioacumulados. Botos de CEL e ELP apresentaram padrão de PCBs e pesticidas similares. Botos de CEL apresentaram valores médios de ?DDTs/?PCBs significativamente maiores que os animais de ELP, e correlação negativa (r=-0,57) entre a o tamanho da área de concentração de vida e ?POPs bioacumulados. No ELP, os botos apresentaram concentrações mais elevadas de Mirex e PCBs. Dentre os biomarcadores avaliados, níveis de transcrição de metalotionéina 2A (MT2) foram significativamente mais elevados em botos de CEL. Local não exerceu influência significativa sobre níveis de resposta dos demais biomarcadores, Além do local, estação de coleta e sexo influenciaram significativamente concentrações de POPs bioacumulados e níveis de resposta de biomarcadores. Concentração de PCBs, DDTs e hexaclorobenzeno (HCB) foram menores em botos amostrados no inverno. Similarmente, atividade glutationa-S-transferase (GST) foi menor em botos amostrados no inverno. Variação sazonal também foi observada para níveis de transcrição de interleucina 1 (IL1), glutationa redutase (GR), glutationa peroxidase (GPx), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), beta-actina (B-ACT), receptor aril de hidrocarboneto (AHR) e glutationa-S-transferase, isoforma pi (GST-pi), com valores mais elevados de transcrição em botos amostrados no inverno. Em relação ao sexo, concentração de PCBs, DDTs e Mirex foram significativamente maiores em machos. O número de transcritos do complexo principal de histocompatibilidade classe II (MHCII) e beta-actina (B-ACT) também foram significativamente maiores em machos. As atividades superóxido dismutase (SOD), GPx e GR não variaram de acordo com local, sexo, faixa etária ou estação de coleta. Apesar de não terem sido obtidos valores de correlação significativos entre as classes de POPs e os níveis de resposta de biomarcadores, a análise de componentes principais (PCA) permite observar variação similar entre PBDEs, PCBs, Mirex e HCB e atividade GST, SOD e, em menor grau, atividade GPx. Resultados da PCA também indicam variação similar entre DDTs e níveis de transcritos de ARNT e, em menor grau, atividade GR. Atividade EROD e catalase ficaram abaixo do limite de detecção, assim como níveis de transcrição de CYP1A, interleucina-2 (IL-2) e interferon gama (IFN-g) ficaram abaixo do limite de detecção. Portanto, tais biomarcadores não foram incluídos em análises subsequenrtes. Os resultados indicam que níveis de POPs mensurados estão abaixo de valores críticos obtidos em áreas extremamente poluídas e reforçam o papel do Rio Tubarão como fonte de POPs para CEL. A análise de biomarcadores reflete os níveis de contaminação dos botos, apresentando variação também moderada entre as amostras. Níveis de transcrição de MT2, no entanto, indicam maior contaminação por metais-traço em CEL, embora tais elementos não tenham sido mensurados no presente trabalho. Os dados obtidos reforçam o potencial de uso dos níveis de transcrição de ARNT bem como atividade de GST como biomarcadores de exposição a POPs. Níveis de transcrição de MHCII sugerem maior resposta imune em botos com maiores níveis de POPs bioacumulados, possivelmente decorrente de uma maior exposição destes animais a patógenos. Por fim, nossos resultados enfatizam a necessidade de levar em conta a variação sazonal e de sexo quando da realização de estudos de biomonitoramento em cetáceos. / Abstract : Intensified industrial and agricultural development around waters bodies imposes upon aquatic environments an increasing load of chemical residues. Among these, persistent organic pollutants (POPs) and trace metals that accumulate on the environment and its organisms due to its resistance to degradation. POPs are biomagnified through diet, reaching high levels in adipose tissue of top predator, such as cetaceans. POPs are frequently associated to higher occurrence of opportunistic diseases, genetic alterations and diminishing reproductive rates on cetaceans. As such, is necessary to use biomarkers that indicate early-on exposure to POPs. The present study measured biomarkers of xenobiotic biotransformation, antioxidant defense system and immune response in integument tissue of bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) resident to the estuarine complex of Santo Antonio dos anjos-Imaruí-Mirim, SC (CEL) and to Patos lagoon estuary, RS (ELP). Contamination levels and biomarkers response values were compared between locations, males and females, adults and juveniles and dolphins sampled in the summer or winter. Biomarkers response values were also correlated to levels of bioaccumulated organochlorine pesticides, polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and polychlorinated biphenyls (PCBs). Dolphins from CEL and ELP present a similar PCB congeners and pesticides pattern. CEL dolphins showed significantly higher ?DDTs/?PCBs values than ELP dolphins, and present a negative correlation (r= -0.57) between concentration area and ?POPs bioaccumulated. For ELP, dolphins showed higher Mirex and PCBs levels. Among analyzed biomarkers, transcription levels of metallothionein 2A (MT2) were significantly higher in dolphins from CEL. Location did not influence significantly other biomarkers. Besides location, sampling season and gender influenced significantly the concentration of POPs bioaccumulated and biomarkers response. PCBs, DDTs and hexachlorobenzene (HCB) levels were significantly lower in dolphins sampled in the winter. Similarly, glutathione-S-transferase (GST) activity was lower in dolphins sampled in the winter. Seasonal variation was also observed for transcription levels of interleukin-1 (IL-1), glutathione reductase (GR), glutathione peroxidase (GPx), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), beta-actin (B-ACT), aryl hydrocarbon receptor (AHR) and glutathione-S-transferase pi (GST-pi), with significantly higher values in samples obtained in the winter. Regarding gender, PCBs, DDTs and Mirex levels were significantly higher in males. Transcription levels of major histocompatibility complex class II (MHCII) and beta-actin (B-ACT) were also significantly higher in males. Superoxide dismutase (SOD), GPx and GR activity did not vary significantly with location, gender or sampling season. Despite the absence of significant correlation values between POPs classes and biomarkers response, principal component analysis (PCA) exhibits similar variation patterns among PBDEs, PCBs, Mirex and HCB and GST, SOD and GPx activity. PCA results also indicate similar variation pattern between DDTs and ARNT transcription levels and, to a minor extent, GR activity. EROD and catalase activity remained below detection limit, as did the transcription levels of CYP1A, interleukin-2 (IL-2) and interferon-gamma (IFN-g). As such, these biomarkers were excluded from further analysis. Results indicate that measured POPs levels are moderate, below critical values obtained in highly polluted areas and reinforce the role of Tubarao River as a main source of POPs to CEL. Biomarkers response reflected POPs levels and showed moderate variation between samples. However, results indicated a possibly higher contamination of CEL by trace metals and support the usage of ARNT and GST activity as biomarkers to POPs exposure. Also, MHCII transcription rates suggested an increased immune response in contaminated animals, possibly due to a higher exposure to pathogens. Finally, our results emphasize the need to consider seasonal variability upon using molecular biomarkers in cetaceans biomonitoring studies.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2018-01-09T03:24:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 349093.pdf: 3720270 bytes, checksum: 3800594c491e81d970ecd6dea19e24e4 (MD5) Previous issue date: 2017 / O consumo e transporte de petróleo está diretamente ligado à contaminação ambiental por hidrocarbonetos em diversas regiões do mundo. Uma vez no ambiente aquático, o petróleo e seus derivados podem produzir alterações variadas nos organismos expostos, tais como alterações biológicas de caráter molecular, celular, fisiológico ou ecológico, resultando em efeitos danosos às comunidades naturais, incluindo os organismos destinados ao consumo humano. Desta forma, a investigação dessas alterações é urgente como forma preventiva e de avaliação de ambientes aquáticos contaminados. Nesse sentido, o presente trabalho teve como principais objetivos avaliar os efeitos no perfil de proteínas em ostras após exposição à fração de óleo diesel acomodada em água, buscar genes normalizadores em ostras expostas às diferentes condições experimentais e avaliar os efeitos da contaminação do derivado foto-oxidado de petróleo 6-hidroxicriseno em peixes Danio rerio. Para atingir esses objetivos, primeiramente, ostras do mangue Crassostrea brasiliana foram expostas à fração de óleo diesel acomodada em água durante 24h e 72h com intuito de identificar biomarcadores moleculares. Entre as 11 proteínas expressas diferencialmente, podemos destacar sete: citocromo P450 6A (CYP6A), NADPH citocromo P450 redutase (envolvidas no metabolismo lipídico / xenobiótico), alfa e beta tubulina (envolvidas na formação de fagossomo mediados por retículo endoplasmático - RE), tiorredoxina e proteína ubiquitina ligase E3 (envolvidas no processamento e degradação de proteínas no RE). A avaliação de respostas em compartimentos subcelulares mostrou-se bastante sensível e viável para estudos ecotoxicológicos, além de auxiliar na compreensão dos mecanismos que envolvem o RE frente à exposição. Esses dados indicam um papel promissor da avaliação do RE em programas de biomonitoramento ambiental. Entretanto, como muito pouco é conhecido sobre a biologia molecular de C. brasiliana, surgiu a necessidade de utilizar genes normalizadores ideais para diferentes condições experimentais para adequada análise da transcrição gênica. Neste trabalho foram identificados diferentes conjuntos de genes adequados para a normalização de dados de PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) em cada desenho experimental testado. O gene anquirina teve maior estabilidade de transcrição e foi considerado candidato promissor como gene normalizador em estudos posteriores. Por fim, com o intuito de aumentar as informações sobre os efeitos de compostos foto-oxidados do petróleo, avaliou-se a exposição de embriões de D. rerio ao 6-hidroxicriseno. Foram observadas respostas dos genes relacionados com transportadores iônicos (nck1 e kchna), associadas à bioacumulação e deformidades cardiácas nos animais nas fases de desenvolvimento embrionário de 74 hpf de exposição. / Abstract : The consumption and transportation of petroleum are directly linked to the contamination by hydrocarbons in many regions around the world. Once in the aquatic environment, petroleum and its derivatives can produce many alterations to exposed organisms such as biological, cellular, physiological or ecological biological alterations, resulting in harmful effects to natural communities including organisms destined for human consumption. Then, it is urgent the investigation of these impacts in an attempt to prevent and evaluate contaminated aquatic environments. In this context, the main goal of this work was to evaluate the effects of diesel oil water accommodated fraction on the proteomic profile in oysters, search for normalizing genes in oysters submitted to different experimental conditions, and evaluate the effects of photo-oxidized petroleum derivative 6-hydroxycrysene in D. rerio. In order to achieve these goals, firstly, the mangrove oyster C. brasiliana were exposed to diesel oil water accommodated fraction for 24h and 72h. Among the 11 differentially expressed proteins, we pointed out seven: cytochrome P450 6A (CYP6A), NADPH cytochrome P450 reductase (involved in lipid / xenobiotic metabolism), alpha and beta tubulin (involved in the formation of RE-mediated phagosome), tioredoxin containg-protein and ubiquitin ligase E3 protein (involved in the processing and degradation of proteins in RE). Subcellular compartments responses had shown to be sensitive and feasible for ecotoxicological studies, besides helping to understand the mechanisms that involve ER in relation to exposure. These data indicate a promising role for ER evaluation in environmental biomonitoring programs. However, few studies had focused on molecular biology of C. brasiliana, there is a necessity to use select normalizing genes ideal for different experimental conditions for adequate analysis of gene expression. In this work, different sets of genes suitable for the normalization of qRT-PCR data were identified in each experimental design tested. The ankyrin gene had greater transcriptional stability and was considered a promising candidate as a normalizing gene in later studies. Finally, in order to increase the information about the effects of photo-oxidized petroleum derivative compounds, the exposure by 6-hydroxychrisene in the embryonic development of D. rerio was evaluated. In summary, the responses of the genes related to the ionic transporters (nck1 and kchna), together with chemical aspects of bioaccumulation, have been shown to play an important role in the cardiac deformities generated during morphogenesis in the embryonic development stages in 74 hpf of exhibition.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:32:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 331665.pdf: 2088502 bytes, checksum: e7f0cdc51ccc72417fd1f4dcd884500a (MD5) Previous issue date: 2014 / Os camarões possuem importância econômica, distribuídos por todo tropical e subtropical em todas as regiões do mundo. Por causa da pressão contínua sobre os estoques pesqueiros de camarões para consumo humano, a carcinicultura em muitos países se desenvolveu como uma importante ferramenta para suprir fonte de proteína de crustáceos. A espécie Litopenaeus vannamei ou camarão branco do Pacífico é uma espécie oriunda do pacífico que foi introduzida com maior sucesso nas fazendas de cultivo devido suportarem grande variação de salinidade. Possui intestino anterior e posterior de origem ectodérmica e intestino médio de origem endodérmica o que faz esta região uma região de secreção e absorção de nutrientes. No intestino médio dos peneídeos, assim como em insetos, ocorre a presença da membrana peritrófica, sendo que nos insetos lhe foi aferida uma função fisiológica importante: a circulação endo ectoperitrófica. Na presente tese, através do conhecimento da bioquímica da digestão de proteínas e pelo conhecimento do comportamento das enzimas ao longo do intestino médio do camarão, foi possível identificar o mesmo padrão de decréscimo de atividade ao logo deste, que foi desfeito, ao ser suplementado a dieta com proteínas (ovoalbumina nas concentrações de 60% e 80% m/m). Estas atividades enzimáticas foram observadas através de reação de digestão com substratos sintéticos (suc-AAPF-pNA, bz-R-pNA e L-pNA), substrato proteico (Azoalbumina) e zimograma em SDS-PAGE 12% contendo 0,1% de gelatina. Na tentativa de purificar e identificar algumas enzimas foi utilizado cromatografia de troca iônica em coluna do tipo Mono - Q. Em outros experimentos que corroboram a hipótese de circulação endo ectoperitrófica em camarões foi utilizado o processo de gavagem que através de filmagens foi possível visualizar o processo acontecendo, fundamentando assim a circulação endo ectoperitrófica em camarões.<br> / Abstract: Prawns and shrimps have economic importance, distributed throughout tropical and subtropical regions in the world. Because of continued pressure on fish stocks of shrimps for human consumption, shrimp farming in many countries has developed as an important tool to meet protein source crustaceans. The Litopenaeus vannamei species or Pacific white shrimp is a species from Pacific which was introduced more successfully in cultivation farms due withstand large variations in salinity. Shrimps have anterior and posterior intestine from ectodermal and endodermal origin, which it makes this region a region of secretion and absorption of nutrients. The midgut of penaeids, as in insects, the presence of the peritrophic membrane occurs, and it was measured in insects an important physiological function: the endo ectoperitrophic circulation. In this thesis, through the knowledge of the biochemistry of protein digestion and knowledge of the behavior of the enzymes along the midgut of juvenile shrimp, it was possible to identify the same pattern of decrease of the enzyme activities, which were shifted, when the diet was supplemented with a protein (ovalbumin at the concentrations of 60% and 80% w / w). These enzyme activities were assessed by digestion reaction with synthetic substrates (suc-AAPF-pNA, bz-R-L-pNA and pNA) protein substrate (azoalbumina) and zymogram on SDS-12% PAGE containing 0.1% gelatin. In an attempt to purify and identify some enzymes it was used ion-exchange chromatography on Mono-type column - Q. Other experiments support the hypothesis that the endo ectoperitrophic circulation takes place in shrimps by using the gavage process, through which it was possible to document the process.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:38:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 328840.pdf: 1962015 bytes, checksum: f9c31db016f4d9a0a403abed6e0281ea (MD5) Previous issue date: 2014 / Durante a produção industrial de álcool combustível, um dos fatores limitantes no processo é o estresse promovido às células de levedura pelas altas concentrações de etanol presentes no meio. Este trabalho teve por objetivo incrementar a tolerância ao etanol de uma linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae através da modificação da região promotora de dois genes: o gene TRP1 envolvido na síntese de triptofano, ou o gene MSN2 que codifica para um fator de transcrição que regula a resposta ao estresse geral em S. cerevisiae. As linhagens recombinantes foram desenvolvidas usando técnicas de engenharia genômica baseadas em PCR, para inserir o promotor forte e constitutivo PADH1 na região promotora dos genes alvo. Embora a linhagem industrial utilizada (CAT-1) seja diplóide, apenas um dos alelos do gene alvo foi modificado. Após confirmação por PCR das modificações realizadas no genoma das linhagens recombinantes, a sobre-expressão dos genes foi quantificada por qRT-PCR. Os resultados mostraram que a linhagem de levedura industrial é mais tolerante ao etanol (podendo crescer em até 14% do álcool), quando comparado com uma linhagem de laboratório (nessa última 10% de etanol inibe totalmente o crescimento). Em ambas a linhagens a sobre-expressão do gene TRP1 claramente incrementou a tolerância ao etanol. As linhagens industriais sobre-expressando o gene MSN2, ou uma versão truncada do gene (MSN2-T, sem os primeiros 48 aminoácidos), mostraram-se igualmente mais tolerantes ao etanol. A linhagem que sobre-expressa o gene MSN2 mostrou-se também mais resistente ao estresse salino, mas mais sensível ao estresse oxidativo, enquanto que a linhagem que sobre-expressa o gene MSN2-T foi mais resistente a esse último estresse. A análise dos níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (ROS) revelou que o estresse provocado pelo etanol aumenta significativamente os níveis de ROS nas células, sendo que ocorreu uma redução na quantidade desses compostos nas linhagens modificadas no gene MSN2. Em seguida, foi investigado se essa melhora no crescimento celular na presença de altas concentrações de etanol leva a produtividades mais elevadas de etanol durante a fermentação de altas concentrações (200 g/L) de sacarose, inclusive na presença de diferentes concentrações estressantes de etanol no início das fermentações. Os resultados revelaram que não ocorreram diferenças significativas entre a linhagem industrial CAT-1 e as linhagens recombinantes nos diferentes parâmetros fermentativos analisados, tanto em processos de bateladaXsimples quanto na batelada alimentada, com reciclo celular. O estresse alcoólico afetou principalmente o consumo dos monossacarídeos (glicose e frutose) produzidos na hidrólise da sacarose. Em conclusão, os resultados sugerem que uma maior tolerância ao etanol (através das modificações genômicas realizadas neste trabalho), não significa necessariamente uma maior produção de etanol pela linhagem industrial de S. cerevisiae.<br> / Abstract : During fuel alcohol industrial production, one of the limiting factors in the process is the stress promoted to yeast cells by high ethanol concentrations in the medium. This study aimed to improve the ethanol tolerance of an industrial Saccharomyces cerevisiae strain by modifying the promoter region of two genes: the TRP1 gene involved in the synthesis of tryptophan, or the MSN2 gene encoding for a transcription factor that regulates the general stress response in S. cerevisiae. The recombinant yeast strains were developed using PCR-based genomic engineering techniques, to insert the strong and constitutive PADH1 promoter in the promoter region of the target genes. Although the industrial strain used (CAT-1) is diploid, only one allele of the target gene was modified. After confirmation by PCR of the changes made in the genome of the recombinant strains, gene overexpression was quantified by qRT-PCR. Our results show that the industrial yeast strain is more tolerant to ethanol (being able to grow in up to 14% alcohol), when compared to a laboratory strain (10% ethanol completely inhibited growth of these cells). In both types of strain overexpressing the TRP1 gene clearly improved ethanol tolerance. The industrial strains overexpressing the MSN2 gene, or a truncated version of the gene (MSN2-T, without the first 48 amino acids), were also more ethanol tolerant. The strain that overexpresses the MSN2 gene was also more resistant to a salinity stress, but more sensitive to an oxidative stress, while the strain that overexpresses MSN2-T was more resistant to this last stress. The analysis of the intracellular levels of reactive oxygen species (ROS) revealed that stress promoted by ethanol significantly increases the levels of ROS in cells, and there was a reduction in the amount of these compounds in the strains modified in the MSN2 gene. Afterwards, it was investigated whether this improvement in the cellular growth under high ethanol concentrations leads to higher ethanol productivity during fermentation of high (200 g/L) sucrose concentrations, even in the presence of different stressful ethanol concentrations at the beginning of fermentation. The results revealed that there were no significant differences between the industrial strain CAT-1 and the recombinant strains in the different fermentation parameters analyzed, both in simple batch and fed batch processes with cell recycle. The alcoholic stress affected mainly the consumption of monosaccharides (glucose and fructose) produced by the hydrolysis of sucrose. In conclusion, the results suggest that increased tolerance toXIIethanol (through genomic modifications carried out in this work), does not necessarily mean a higher ethanol production by an industrial S. cerevisiae strain.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:54:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327371.pdf: 1125608 bytes, checksum: 7ac4b965330f57171329e6fc3e46c102 (MD5) Previous issue date: 2014 / O hipertireoidismo está relacionado a diversas manifestações neurológicas. Todavia, os mecanismos precisos pelos quais os HT induzem seus efeitos no cérebro durante o desenvolvimento ainda são controversos. Os objetivos deste trabalho foram analisar o efeito desta patologia sobre a indução de estresse oxidativo, bem como as defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas e o desenvolvimento de alterações neuroquímicas relacionadas com a captação de glutamato, de cálcio e de glicose, além do transporte de aminoácidos e atividades enzimáticas. Além disso, foram avaliadas possíveis alterações histológicas no hipocampo. Para tal, o hipertireoidismo foi induzido em ratos Wistar machos, através de injeção intraperitoneal de T3 80 µg/Kg de peso corporal durante 7 dias, a partir do 8º dia de vida pós-natal. Os experimentos foram realizados com fatias de hipocampo quando os animais completavam os 15 dias de idade. Em conjunto, nossos resultados apontam que o hipertireoidismo devido ao excesso de T3, induz aumento na captação de glutamato, bem como de sua metabolização a glutamina, por ação da glutamina sintetase em astrócitos de ratos imaturos. Este evento diminui a concentração de glutamato na fenda sináptica, levando ao menor influxo de Ca2+, corroborando o T3 como um agente neuroprotetor. Uma vez nos astrócitos, o glutamato pode ser ainda convertido, por transaminação, a alfa-cetoglutarato (a-KG), e este ser oxidado no ciclo de Krebs, ou ainda, ser utilizado para a síntese de GSH ou proteínas, dentre outras funções. Os dados obtidos neste estudo demonstraram ainda, que o hipertireoidismo diminuiu a atividade da Catalase (CAT) e da Glutationa Peroxidase (GPx) e elevação nos níveis de glutationa reduzida (GSH), bem como na atividade da glutationa redutase (GR) e da gama-glutamil transferase (GGT), envolvidas respectivamente na redução da glutationa oxidada (GSSG) em GSH e no  turnover de GSH, reforçando o papel protetor do T3 no cérebro. Por outro lado, o aumento na peroxidação lipídica e na carbonilação de proteínas induzidos pelo hipertireoidismo, sugerem a presença de dano oxidativo, reforçando a hipótese proposta de que o T3 possui um efeito  duplo protegendo o cérebro da excitotoxicidade glutamatérgica e aumentando os níveis de GSH, enquanto aumenta o dano oxidativo.<br> / Abstract : Hyperthyroidism leads to severe neurological manifestations. Altered levels of thyroid hormones (TH) have been associated with decrease in the synaptic plasticity, changes in neurotransmission, depression and anxiety. However, the precise mechanisms by which HT induces its effects in the brain during development are still controversial. The objectives of this study were to analyze the effect of this disease on the induction of oxidative stress, as well as on enzymatic and nonenzymatic antioxidant defenses and the development of neurochemical changes associated with the uptake of glutamate, calcium and glucose, in addition to the transport of amino acids and enzymatic activities. Morphological analyzes were also performed in this experiment. Thus, hyperthyroidism was induced in male Wistar rats by intraperitoneal injection of T3 80µg/kg body weight for 7 days, from the 8th day of postnatal life. The experiments were performed with slices of hippocampus when animals completed 15 days of age. The results achived in this experiment show that hyperthyroidism, due to the excess of T3 induces to an increase in the intake of glutamate and metabolization of glutamine by the action of glutamine synthetase in astrocytes of immature rats. This event decreases the concentration of glutamate in the synaptic cleft leading to lower Ca2+ influx,  supporting the T3 as a neuroprotective agent. In astrocytes, the glutamate can also be converted by transamination, alpha-ketoglutarate (a -KG), which is oxidized in the Krebs cycle, or even it is used for the synthesis of GSH or proteins, among other functions. Data from this study also demonstrated that hyperthyroidism caused an increase in GSH, as well as in the GR and GGT activity, respectively involved in the reduction of GSSG to GSH and in the "turnover" of GSH, reinforcing the protective role of T3 in brain. On the other hand, increased lipid peroxidation and protein carbonylation suggest the presence of oxidative damage, reinforcing the hypothesis proposed that T3 has a "double" effect protectsthe brain glutamatergicexcitotoxicity and increasing GSH levels, while increasing oxidative damage.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-04-29T21:03:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327368.pdf: 3063519 bytes, checksum: c6a97882368c09a154ff5d56dc381fc3 (MD5) Previous issue date: 2014 / A biomassa lignocelulósica é uma atrativa matéria prima para a produção de bioetanol, visto que este é um resíduo abundante, renovável e que não compete com a produção de alimento. Saccharomyces cerevisiae, entretanto, não é capaz de fermentar o principal açúcar presente nesta biomassa, a xilose. Para solucionar este problema é necessária a inserção da via para metabolismo de xilose nesta levedura, mas o transporte deste açúcar, todavia persiste como um dos passos limitantes para a sua eficiente fermentação. A levedura Spathaspora arborariae, por outro lado, é naturalmente capaz de fermentar xilose com alta capacidade. Neste trabalho analisamos diversas sequências no genoma de S. arborariae, relacionadas ao transporte e metabolismo de xilose. Paralelamente, estudamos o papel dos transportadores de hexose codificados pelos genes HXT no transporte de xilose em linhagens de S. cerevisiae deletadas para um dos genes HXT1-HXT5 (linhagens hxt-knockout) ou para todos os genes HXT1-HXT7 e GAL2 (linhagem hxt-null). Avaliamos também o impacto da hidrólise extracelular de sacarose na co-fermentação de xilose em duas linhagens industriais recombinantes de S. cerevisiae. Os resultados indicaram que S. arborariae possui pelo menos dez sequências que codificam para possíveis transportadores de açúcar, embora possua apenas uma cópia dos genes para o metabolismo de xilose e via das pentose-fosfato. Com relação aos transportadores codificados pelos genes HXT, constatamos que somente através da sobre-expressão destes genes foi possível observar melhorias no desempenho fermentativo das linhagens hxt-knock ou hxt-null. Quando sobre-expresso na linhagem hxt-null, o transportador codificado pelo gene HXT1 permitiu o máximo consumo de açúcar e produção de etanol, mas foi incapaz de permitir o consumo de somente xilose. O gene HXT7 possibilitou a eficiente fermentação de xilose, mas em co-fermentações de glicose e xilose mostrou uma clara preferência por glicose. O gene HXT5 não possibilitou a utilização de xilose, enquanto que HXT2 codificou para o transportador que permitiu o consumo e fermentação de xilose com a mesma velocidade que glicose, mesmo em co-fermentações de glicose e xilose, embora tenha apresentado fermentações incompletas com consumo de apenas 58% da xilose. Com relação às linhagens industriais, foi observado que ambas as linhagens industriais consumiram xilose mais rapidamente nas co-fermentações, embora este consumo tenha sido mais eficiente em co-fermentações de sacarose com xilose. Foi observado ainda uma produção de etanol 23% superior para a linhagem que não hidrolisa sacarose extracelularmente nas co-fermentações de sacarose e xilose. Concluindo, os transportadores de açúcar de S. arborariae encontrados no genoma apresentam grande potencial para a expressão heteróloga em S. cerevisiae, e a sobre-expressão dos genes HXT1, HXT2 ou HXT7 endógenos de S. cerevisiae, aliado ao emprego de linhagens que hidrolizem a sacarose preferencialmente de maneira intracelular, permitirão a produção de etanol integrando as tecnologias de primeira e segunda geração no Brasil.<br> / Abstract : The lignocellulosic biomass is an attractive feedstock for bioethanol production, since this is an abundant and renewable waste that does not compete with food production. Saccharomyces cerevisiae, however, is not able to ferment the main sugar present in this biomass, the xylose. To solve this problem the insertion of the pathway for xylose metabolism is required in this yeast, the transport of sugar, however, remains as one of the limiting steps for the efficient xylose fermentation. The yeast Spathaspora arborariae, on the other hand, is naturally capable of fermenting xylose with high capacity. In this work we analyzed several sequences in the genome of S. arborariae related to the transport and metabolism of xylose . Parallel to this, we have studied the role of hexose transporters encoded by the HXT genes for the transport of xylose in S. cerevisiae strains deleted for the HXT1-5 genes (hxt-knockout strains) or all HXT1-7 and GAL2 genes (hxt-null strain). We also investigated the impact of extracellular hydrolysis of sucrose in fermentation and co-fermentation of xylose using two recombinant industrial strains of S. cerevisiae. Our results indicate that S. arborariae has at least ten sequences encoding for sugar transporters, although has only one copy of the genes for the metabolism of xylose and pentose phosphate pathway. Regarding the transporters encoded by the HXT genes, we saw that only by the overexpression of these genes it was observed improvements in the fermentation performance of the hxt-knockout or hxt-null strains. When overexpressed in the hxt-null strain, the transporter encoded by the HXT1gene achieved the higher sugar consumption and ethanol production, but was unable to grow on xylose only, HXT7, however, enabled the efficient fermentation of xylose, but in co-fermentation of glucose and xylose showed a clear preference for glucose. HXT5 was not able to consume xylose, while the transporter encoded by HXT2 gene allowed the consumption of xylose at the same rate as glucose, even in glucose and xylose co-fermentation, albeit exhibited truncated fermentation with less than 58% of the xylose consumption. Regarding the industrial strains, we observed a 23% higher ethanol production from the strain that does not hydrolyze sucrose extracellularly in sucrose and xylose co-fermentation assays. We also observed that both industrial strains consumed xylose faster in co- fermentations, although this consumption has been more efficient in sucrose co-fermentation rather than in glucose. In conclusion, the S. arborariae sugar transporters found here have great potential for heterologous expression in S. cerevisiae, furthermore the overexpression of the endogenous HXT1, HXT2 or HXT7 genes from S. cerevisiae and strategies employing strains that preferentially hydrolyze sucrose intracellularly will contribute in a scenario for ethanol production using technologies from the first and second generation in Brazil.