Nos últimos anos, diversos protocolos e tecnologias têm sido propostos a fim de viabilizar ou otimizar a micropropagação de diversas culturas, bem como reduzir custos de produção. Dentre eles, tem ganhado destaque, o uso do meio de cultura líquido e do sistema de biorreator de imersão temporária (BIT). No entanto, observam-se diferenças de resposta entre espécies e metodologias, sendo necessários maiores estudos para um melhor conhecimento dos fatores que afetam os sistemas de micropropagação. Estudos recentes, baseados em técnicas moleculares, têm revelado que as culturas in vitro não são axênicas, como se acreditava, apresentando comunidades endofíticas onipresentes. Sabendo-se da importância desses microrganismos em plantas a campo, passou-se a questionar o papel destes no desenvolvimento e multiplicação de plantas in vitro. Diante deste cenário, este trabalho se propôs a comparar o desempenho de culturas in vitro em diferentes condições de cultivo: meio semissólido, meios líquido estático, sob agitação e, avaliando-se o crescimento/ multiplicação das plântulas e, naqueles onde houve diferença no desempenho, foram realizadas análises moleculares para a caracterização da comunidade microbiana presente na parte aérea das plantas. Foram utilizadas culturas de bromeliáceas e cana-de-açúcar, buscando sistemas que permitissem as avaliações pretendidas. Para isto foram instalados experimentos com Ananas comosus var. comosus (\'Imperial\' e \'Pérola\') e Aechmea nudicaulis, sob cultivo em meio líquido estático e sob agitação; e com Vriesea hieroglyphica E. Morren, sob cultivo em meio líquido estático, sob agitação e em BIT. Para a gramínea, cana-de-acúcar (Saccharum spp., variedade SP80-3280), foram avaliados o cultivo em meio líquido estático e em BIT. Foram também realizadas análises moleculares de plântulas de Dyckia distachya, que haviam sido cultivadas em meios de culturas semissólido, líquido sob agitação e estático. As culturas que apresentaram diferenças de desempenho entre os sistemas avaliados foram D. distachya, (sendo o melhor tratamento o meio líquido sob agitação) e cana-de-açúcar (melhor tratamento foi BIT) e estas foram consideradas como sistemas adequados para o estudo de como diferentes sistemas de cultivo in vitro podem influenciar na comunidade bacteriana das plantas. A caracterização da comunidade bacteriana de D. distachya foi realizada por T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) e mostrou que o tratamento meio líquido sob agitação, o qual teve a maior produção de brotos em relação aos demais, diferiu quanto à abundância relativa das unidades taxonômicas operacionais (UTOs) encontradas. Para cana-de-açúcar foram realizadas a construção de bibliotecas de clones do gene 16S rRNA e PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Estas análises mostraram não haver diferença significativa entre as bibliotecas dos tratamentos avaliados, no entanto, BIT apresentou 3,54 vezes mais cópias do gene 16S rRNA em relação ao tratamento meio líquido estático, nos permitindo inferir que também possui uma maior número de bactérias. Este estudo apresenta fortes indícios de que o sistema de cultivo in vitro utilizado influencia a comunidade microbiana presente nas plantas / In recent years, several protocols and technologies have been proposed for feasibility and optimization of micropropagation of different cultures as well as to reduce production costs. Among these, the use of liquid culture medium and the temporary immersion bioreactor system (TIB) have gained special attention. However, differences are observed among species and methodologies, being necessary more detailed studies for a better knowledge of the factors that affect the micropropagatiion systems. Recent studies, based on molecular techniques, have revealed that in vitro cultures are not axenic, as thought, presenting ubiquitous endophytic community. Knowing the importance of these microorganisms to field plants we would like to know more about their role in in vitro plants. In this scenario, this work proposes to compare the performance of in vitro cultures under different culture conditions: semisolid medium culture, liquid static and liquid medium under agitation, and where differences in in vitro performance were observed comparative molecular analysis of microbial community in the plantlets was performed. Bromeliads and sugarcane cultures were used seeking for model systems for these analyses. These experiments were conducted with Ananas comosus var. comosus (\'Imperial\' and \'Pérola\') and Aechmea nudicaulis cultured under liquid static medium and liquid under agitation, and with Vriesea hieroglyphica, we compared liquid static medium, liquid medium under agitation and TIB. For sugarcane (Saccharum spp. variety SP80-3280), liquid static medium and TIB was compared. Molecular analyses of Dyckia distachya plantlets, which had been grown in semisolid medium liquid static and liquid medium under agitation, were also carried out. Cultures that showed differences in performance among the systems evaluated were D. distachya, (with liquid medium under agitation as the best condition) and sugarcane (best treatment was BIT) and these were considered adequate to study the differences in the bacterial comunity of plants when grown in different in vitro conditions. The characterization of the microbial community of D. distachya was performed by T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) and showed that the liquid medium under agitation, which had the highest number of shoots compare to the other culture conditions, also differed as to the relative abundance of Operational Taxonomic Units (OTUs). For sugarcane 16S rRNA gene clone libraries, as well as real-time PCR (qPCR) were performed. These analyses showed no significant differences between the libraries of the two treatments, however, BIT showed 3.54 times more copies of the 16S rRNA gene compared to cultures from static liquid medium, allowing us to infer a higher number of bacteria. This study provides strong evidence that the in vitro system used influences the microbial community present in plants

O interesse em estudar o cultivo das células de inseto está relacionado entre outros usos a sua utilização na produção de biopesticidas. Há muitos anos os pesticidas químicos vêm contribuindo no controle de pragas na agricultura. Entretanto, o uso desses compostos prolongadamente tem resultado na seleção de insetos resistentes e em poluição ambiental. Diante disso, torna-se necessário o desenvolvimento e aprimoramento dos bioinseticidas. No Brasil, o baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) foi o principal agente de controle biológico da praga da soja Anticarsia gemmatalis. Assim, estudos que viabilizem a produção desses vírus in vitro possibilitariam uma produção mais controlada e de melhor qualidade desses biopesticidas. Neste trabalho, investigou-se a suscetibilidade à infecção por AgMNPV de diferentes linhagens celulares de Sf21 e o crescimento dessas células em diferentes sistemas: cultivos em schotts, em spinner e em biorreator, variando-se a idade do inóculo (IA) e a concentração celular inicial (X0). Constatou-se variação no perfil de infecção das linhagens, sendo as linhagens mais adequadas para a produção de bioinseticida as linhagens de Sf21 denominadas EMBRAPA, UFRN e GibcoG, uma vez que estas apresentaram mais do que 40 % das células com poliedros em cultivos em suspensão, enquanto a linhagem denominada GibcoSF teve menos de 2 % das células infectadas com poliedros. Ao se estudar o efeito do número de subcultivos na morfologia e crescimento celular, foi averiguado um aumento no diâmetro de 10 % e no volume de 26 % das células UFRN em relação às células GibcoSF. Além disso, o crescimento das células UFRN foi 49% menor do que das células GibcoSF. Quando realizado o Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) para se analisar o efeito da IA e a X0 na taxa de crescimento específica máxima (?max) e na concentração celular máxima (Xvmax) em cultivos em schott com células UFRN, obteve-se um modelo empírico. Quando analisadas as variáveis IA e X0 separadamente, não foram encontradas diferenças significativas para as respostas Xvmax e ?max em relação a X0. Para a IA, entretanto, obteve-se os resultados mais satisfatórios para os inóculos com IA de 72 e 96 horas: Xvmax de 5,97.106 cel/mL e 5,99.106 cel/mL, e ?max de 0,70 dia-1 e 0,63 dia-1, respectivamente. Nos cultivos em spinner com células UFRN, foi observada a formação de grumos, o que levou a Xvmax de 2,00.106 cel/mL. No cultivo em biorreator com células UFRN, foi obtido um Xvmax de 6,21.106 cel/mL, ?max de 0,70 dia-1, Qo2 na fase exponencial de 67,3 ± 3,6 .10-18 molO2/cel/s, rendimento de glicose em célula igual a 1,0.109 cel/g de glicose e um rendimento de glutamina em células de 3,0.109 cel/mL. Comprovou-se, portanto, a existência de alterações na infecção entre diferentes linhagens de Sf21; a importância do estado fisiológico da célula nos subcultivos, a ocorrência de mudanças no crescimento celular de acordo com os sistemas de cultivo e o efeito do número de subcultivos na morfologia e crescimento de células Sf21. / Investigate the cultivation of insect cells is related to its use in the production of biopesticides among others. For many years, chemical pesticides have contributed in pest control in agriculture. However, the use of these compounds for prolonged periods has resulted in the selection of resistant insects and environmental pollution. Therefore, it is necessary the development and improvement of biopesticides. In Brazil, the baculovirus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) is the main biological control agent of the plague of soy Anticarsia gemmatalis. Thus, studies that enhance the production of these viruses in vitro would allow a more controlled production and better quality of biopesticides. In the present research, it was investigated the susceptibility of different Sf21 cell lines to infection by AgMNPV and the growth of these cells in different systems: cultivations in schotts, in spinner flasks and in bioreactor, varying the inoculum age (IA) and initial cell concentration (X0). Variation was observed in the lineage\'s infection profile. The most appropriate lineage for the production of biopesticida where the ones denominated EMBRAPA, UFRN and GibcoG, since these showed more than 40% of the infected cells with polyhedra, while the one denominated GibcoSF had less than 2% of the infected cells with polyhedra. When studying the effect of the number of subcultures in morphology and in cell growth, an increase of 10% of the diameter and 26% in the volume of the UFRN cells was observed compared to the GibcoSF cells. Moreover, the cell growth of UFRN was 49% lower than the GibcoSF\'s. When performed the Rotational Central Composite Design (RCCD) to analyze the effect of IA and X0, the maximum specific growth rate (?max) and the maximum cell concentration (Xvmax) in cultures in schott with UFRN cells, it was obtained an empirical model. When the IA and X0 were separately analysed, it was not found significant differences for Xvmax and ?max in relation to X0. For IA, however, it was achieved the most satisfactory results for inocula with IA of 72 and 96 hours: Xvmax equals to 5.97x106 cells/mL and to 5.99x106 cells/ml, and ?max of 0.70 day-1 and 0.63 day-1, respectively. Cultures in spinner with UFRN cells clumped what led to Xvmax of 2.00x106 cells/mL. In cultivation in bioreactor with UFRN cells, was reached Xvmax of 6.21x106 cells/mL, ?max of 0.70 day-1, Qo2 in the exponential phase of 67.3 ± 3.6x10-18 molO2/cell/s, glucose to the cell yield equal to 1.0x109 cell/g of glucose and glutamine to cell yield of 3.0x109 cell/g of glutamine. It was shown, therefore, the existence of the infection alterations among different lineages of Sf21, the importance of the physiological state of the cell for the subcultivation, the occurrence of changes in cell growth according to the cultivation systems and the effect of the number of subcultivation in morphology and in growth of Sf21 cells.

Submitted by (ana.araujo@ufrpe.br) on 2017-02-16T15:50:30Z No. of bitstreams: 1 Gemima Manco de Melo.pdf: 1128164 bytes, checksum: 2e667a493ac00163fb5ae1d774736709 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-16T15:50:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gemima Manco de Melo.pdf: 1128164 bytes, checksum: 2e667a493ac00163fb5ae1d774736709 (MD5) Previous issue date: 2011-02-16 / The sugarcane culture has great importance in the socio-economic development of Brazil, being one of the earliest economic activities in the country's history. The proliferation of commercial varieties of sugarcane has been successfully accomplished by applying techniques of tissue culture, as an example the system of temporary immersion bioreactor (TIB). In this system the plant material is immersed in liquid medium for controlled intervals of time, which favors the absorption of nutrients from the culture medium by stimulating the production of seedlings. During the in vitro culture the plant material is submitted to unusual environmental conditions that can cause physiological morphological, biochemical and molecular imbalances. Such imbalances can lead to large losses in the production of biofactories, as well as in research institutions. Therefore, the evaluation both biochemical and molecular in vitro plants has great importance for the production of seedlings genetically faithful to matrix plant. In order to assess the causes of physiological disorder observed in sugarcane RB872552 variety which caused the uncontrolled growth of small buds, forming a cluster of shoots known a "green mass" were performed biochemical and molecular analysis. The "masses" green "and the plants were collected by the TIB and subcultured in flasks containing MS liquid medium supplemented or not with 1.5 mg L-1 6-benzylaminopurine (BAP), following the conventional micropropagation of sugarcane. The activity of catalase and peroxidase was higher in samples of "green mass” cultured on TIB. The ascorbate peroxidase activity was higher in the "green masses cultured in the presence of BAP in the two micropropagation systems. The ascorbate peroxidase activity was higher in the "green masses” grow in the presence of BAP in the two micropropagation systems. The DNA fragments obtained after amplification of the whole plant material analyzed showed monomorphism, suggesting genetic fidelity of cloned material. The profile of enzymatic antioxidative system associated with the molecular analysis showed that the physiological disorder that resulted in the emergence of "green masses" was not caused by genetic variation but a result of stress conditions to which the material was submitted during cultivation in vitro. / A cultura da cana-de-açúcar destaca-se por apresentar grande importância no desenvolvimento sócio-econômico do Brasil, sendo uma das primeiras atividades econômicas da história do país. A multiplicação comercial de variedades de cana-de-açúcar tem sido realizada com sucesso mediante a aplicação de técnicas de cultura de tecidos, como exemplo o sistema de biorreator de imersão temporária (BIT). Nesse sistema o material vegetal fica imerso em meio líquido por intervalos controlados de tempo, o qual favorece a absorção dos nutrientes do meio de cultura estimulando a produção das mudas. Da introdução in vitro até a aclimatização, o material vegetal é submetido a condições ambientais incomuns que podem provocar desajustes fisiológicos, morfológicos, bioquímicos ou moleculares. Tais desajustes podem gerar grandes perdas na produção de biofábricas, como também em instituições de pesquisa. Sendo assim, a avaliação tanto a nível bioquímico quanto molecular de plantas cultivadas in vitro apresenta grande importância para produção de mudas geneticamente fiéis a planta matriz. Com o objetivo de avaliar a causa da desordem fisiológica observada na variedade RB872552 de cana-de-açúcar que provocou o crescimento desordenado de pequenas brotações, formando um aglomerado de brotos conhecido como “massa verde”, foram realizadas análises bioquímica e molecular. As “massas verdes” e as plantas coletadas dos BITs foram subcultivadas em frascos contendo meio MS líquido suplementado ou não com 1,5 mg L-1 de 6-benzilaminopurina (BAP), seguindo o sistema convencional de micropropagação de cana-de-açúcar. A atividade da catalase e da peroxidase foi mais elevada nas amostras de “massa verde” cultivadas em BIT. A atividade da peroxidase do ascorbato foi maior nas “massas verdes” cultivadas na presença de BAP nos dois sistemas de micropropagação. Os fragmentos de DNA obtidos ápos a amplificação de todo o material vegetal analisado apresentou monomorfismo, sugerindo fidelidade genética do material clonado. O perfil enzimático do sistema antioxidativo associado à análise molecular evidenciam que a desordem fisiológica que resultou no surgimento das “massas verdes”, não foi provocada por variação genética e sim resultado das condições de estresse ao qual o material foi submetido durante o cultivo in vitro.

The L-asparaginase (ASNase) obtained from yeasts species has been poorly studied and a new yeast ASNase could be an alternative to minimize the side effect in the treatment of lymphoblastic leukemia. The Antarctic ecosystems have a great potential to obtain novel enzymes produced from psychrophilic and psychrotolerant microorganisms. Yeasts isolated from samples collected in the Antarctic Peninsula by the PROANTAR expedition team were tested for the production of ASNase and L-glutaminase (GLNase). From this screening, the strain Leucosporidium scottii L115 presented the highest ASNase activity (6.24 U g-1 of dried cell weight (dcw)) with a combination of low GLNase activity (0.41 U g-1 dcw). The ASNase belonging to L. scottii L115 (LsASNase) was purified 227 fold with a specific activity of 137.01 U mg-1 at 37 ºC, and with 0.93 U mg-1 for GLNase. Moreover, the maximum activity was observed at pH 7.5 at 55 ºC. The enzyme is a multimer presenting a single band of 54.5 kDa of molecular weight in reduced conditions and 462 kDa by size exclusion chromatography. The LsASNase is a glycosylated enzyme that presented a band lower at 25 kDa when was treated with PGNase F. The enzymatic kinetic reveals an allosteric regulation of the enzyme and the kinetic parameters were determined at 37º C, pH 7.0 as K0.5 = 233 µM, kcat = 54.7 s-1 and nH = 1.52 demonstrating a positive cooperativity by the enzyme and the substrate. The ASNase production by L. scottii L115 was improved by applying DoE for the culture medium development. The PB and CDD designs were used to optimize the ASNase production providing the nutrient values of 6.15 g L-1 of proline, 28.34 g L-1 sucrose, and 15.61 g L-1 of glycerol for a maximal production. The synthetic medium containing the optimized quantities was added with the salts: KCl, 0.52 g L-1; MgSO4.7H2O, 0.52 g L-1; CuNO3.3H2O, 0.001 g L-1; ZnSO4.7H2O, 0.001 g L-1; FeSO4.7H2O, 0.001 g L-1.The optimized medium produces a 23.75 ULh-1 of ASNase in shake flask culture. Furthermore, L. scottii is characterized as an oleaginous yeast that accumulates lipids with a suitable fatty acid profile. The production of ASNase and lipids were scaled up in the 1 L bioreactor to evaluate the initial cell concentration, carbon source, and oxygen transfer rate (kLa).The experiments were performed at 15ºC in the bioreactor BIOSTAT®Q plus (Sartorius Stedim, Germany) in batch mode, using 0.5 L of the optimized medium culture in phosphate buffer 50 mM pH 7.0. The initial cell concentration was evaluated at 1%, 3%, and 5% (v/v). Sucrose and glycerol were tested alone to examine if the combination of both is mandatory to produce ASNase. All these assays were carried in duplicate. The kLa was assessed through a CCD design in the range of 1.42 - 123.0 h-1. The performance in bioreactor showed the productivity of 36.95 ULh-1of ASNase under the optimized conditions (growth temperature 15º C, X0: 5 g L-1, pH 7.0, 48 h, kLa 89-92 h-1). The cultivation of L. scottii L115 at 15ºC in sucrose and glycerol as carbon sources generate an interesting lipid profile, where it presents monounsaturated and polyunsaturated lipids. / A L-asparaginase (ASNase) obtida a partir de espécies de leveduras tem sido pouco estudada e uma nova ASNase de levedura pode ser uma alternativa para minimizar os efeitos adversos no tratamento da leucemia linfoblástica. Os ecossistemas Antárticos têm um grande potencial para obter novas enzimas produzidas a partir de microorganismos psicrofílicos e psicotrolerantes. As leveduras isoladas de amostras coletadas na Península Antártica pela equipe de expedição do PROANTAR foram testadas para a produção de ASNase e L-glutaminase (GLNase). A partir desta triagem, a cepa Leucosporidium scottii L115 apresentou a maior atividade de ASNase (6,24 U g-1 dcw) com uma combinação de baixa atividade de GLNase (0,41 U g-1 dcw). A ASNase pertencente a L. scottii L115 (LsASNase) foi purificada 227 vezes com uma atividade específica de 137,01 U mg-1 a 37 ºC e com 0,93 U mg-1 de GLNase. A atividade máxima foi observada a pH 7,5 a 55 ºC. A enzima é um multímero que apresenta uma banda única de 54,5 kDa de peso molecular em condições redutoras e 462 kDa por cromatografia de exclusão molecular. A LsASNase é uma enzima glicosilada que apresentou uma banda menor a 25 kDa quando tratada com PGNase F. A cinética enzimática revela uma regulação alostérica da enzima e os parâmetros cinéticos foram determinados a 37º C, pH 7,0 como K0,5 = 233 µM, kcat = 54,7 s-1 e nH = 1,52 demonstrando uma cooperatividade positiva pela enzima e o substrato. A produção de ASNase por L. scottii L115 foi melhorada aplicando DoE para o desenvolvimento do meio de cultura. Os desenhos experimentais de PB e CDD forma usados para otimizar a produção de ASNase e forneceram os valores de nutrientes de 6,15 gL-1 de prolina, 28,34 gL-1 de sacarose e 15,61 gL-1 de glicerol para uma produção máxima. O meio sintético contendo as quantidades otimizadas foi adicionado com os sais: : KCl, 0.52 g L-1; MgSO4.7H2O, 0.52 g L-1; CuNO3.3H2O, 0.001 g L-1; ZnSO4.7H2O, 0.001 g L-1; FeSO4.7H2O, 0.001 g L-1.O meio otimizado produz 23.75 ULh-1 de ASNase em cultivo em frasco agitado. Além disso, L. scottii é caracterizada como uma levedura oleaginosa que acumula lipídios com um perfil adequado de ácidos graxos. A produção de ASNase e lipídios foi ampliada no biorreator de 1 L para avaliar a concentração celular inicial, fonte de carbono e taxa de transferência de oxigênio (kLa). Os experimentos foram realizados a 15ºC no biorreator BIOSTAT®Q plus (Sartorius Stedim) em modo batelada, utilizando 0,5 L da cultura de meio otimizado em tampão fosfato 50 mM pH 7,0. A concentração celular inicial foi avaliada em 1%, 3% e 5% (v / v). Sacarose e glicerol foram testados isoladamente para examinar se a combinação de ambos é obrigatória para produzir ASNase. Todos esses ensaios foram realizados em duplicado. O kLa foi avaliado através de um planejamento CCD na faixa de 1,42-123,0 h-1. O desempenho no biorreator mostrou a produtividade de 36,95 ULh-1 de ASNase sob condições otimizadas (temperatura de crescimento 15º C, X0: 5 g L-1, pH 7,0, 48 h, kLa 89-92 h-1). O cultivo de L. scottii L115 a 15ºC em sacarose e glicerol como fontes de carbono gera um perfil lipídico interessante, onde apresenta lipídios monoinsaturados e poliinsaturados.

O interesse em células de inseto para a produção de proteínas complexas se deve a sua maior facilidade de cultivo e ao padrão equivalente de glicosilação quando comparado aos sistemas com células de mamíferos. O objetivo deste trabalho foi identificar fatores que limitam ou inibem a produção da glicoproteína do vírus rábico (GPV) expressa na membrana citoplasmática de células de Drosophila melanogaster transfectadas, quando cultivadas em biorreator de bancada agitado e bubble-free, operado em modo descontínuo. Avaliaram-se as influências de oxigênio dissolvido (5 < pO2 <80%), da glicose (1 < GLC0 < 15g/L) e da glutamina (0.6 < GLN0 < 7g/L). Essas variáveis afetaram de forma diferenciada o crescimento celular (produção de células e velocidades específicas-µX), o metabolismo celular (fatores de conversão - YX/GLC, YX/GLN, YLAC/GLC, YALA/GLC, YNH4/GLN, YALA/GLN), assim como a expressão da proteína recombinante (concentração, teor celular e produtividade). O aumento do pO2 reduziu em 9 vezes o crescimento celular mas aumentou o teor celular de GPV em 1,4 vezes. Baixos valores de GLC0 e GLN0, claramente, limitaram o crescimento, de modo que incrementos na concentração desses substratos, até valores intermediários, aumentaram µX,MAX em 3 vezes e 2,5 vezes, respectivamente, e a produção de células em 11 vezes e 3 vezes, respectivamente. O teor celular de GPV máximo não foi afetado pela GLC, mas aumentou em 100% para valores de GLN0 igual ou superiores a 3,5 g/L. As concentrações de lactato produzidas foram consideradas baixas (inferiores a 0,8 g/L) para exercer qualquer efeito de inibição sobre o crescimento ou a expressão da proteína. Por sua vez, as concentrações de amônio parecem inibir tanto a produção de GPV (NH4+~50mg/L) quanto o crescimento celular (NH4+~80mg/L). A condição de cultivo com de 30% de pO2, 10 g/L de GLC0 e 3,5 g/L de GLN0 resultou nos maiores valores de produtividade (9,1 µg/L.h) e de concentração de GPV (1,2 mg/L). O metabolismo de GLC e GLN apresentou grande interdependência, com alterações em GLC0 afetando o metabolismo de GLN e vice-versa. Assim, em condições de excesso de GLC0, as células apresentaram um metabolismo mais ineficiente com reduções nos fatores YX/GLC (2,3 vezes) e YX/GLN (4,6 vezes) e maior geração de subprodutos, caracterizada por incrementos nos valores de YALA/GLC (51%), YLAC/GLC (11%) e YNH4/GLN (15%). O metabolismo da GLN apresentou resposta característica de substrato em excesso para toda a faixa de valores ensaiada, com redução de 25 vezes no valor de YX/GLN e inesperadamente também uma redução na geração de subprodutos de 7 vezes para YNH4/GLN e 12 vezes para YALA/GLN. O efeito sobre o metabolismo da GLC foi mais acentuado para valores mais elevados de GLN0, com redução de 3,6 vezes para YX/GLC e incrementos de 70% para YALA/GLC e para YLAC/GLC. Os resultados sugerem ainda que a célula utiliza duas vias para metabolizar a glutamina: glutaminólise, em condição de limitação em GLC; ou glutamato sintase - NADH-GOGAT, em condição de excesso em GLC. A célula demonstrou também capacidade de sintetizar GLN, a partir de amônio ou outros aminoácidos, quando atingiu concentrações abaixo de 50 mg/L. / The interest in using insect cells to produce complex proteins is due to its ease of cultivation and its glycosylation pattern equivalent to that of mammalian cells systems. The objective of this work was to identify the limiting or inhibiting factors for the production of a rabies virus glycoprotein (RVGP), expressed in the cytoplasmatic membrane of a transfected Drosophila melanogaster S2 cells, when cultivated in a bench stirred bubble-free bioreactor, in batch mode. The influence of dissolved oxygen (5 < pO2 < 80%), of initial glucose concentration (1 < GLC0 < 15 g/L) and of initial glutamine concentration (0.6 < GLN0 < 7 g/L) was evaluated. These variables affected in a different way cell growth (cell production and specific growth rate - µX), cell metabolism (yield factors - YX/GLC, YX/GLN, YLAC/GLC, YALA/GLC, YNH4/GLN and YALA/GLN), as well as the recombinant protein expression (RVGP concentration, RVGP cell content and RVGP productivity). pO2 increase reduced 9 times cell growth, but increased 1.4 times RVGP cell content. Low initial glucose and glutamine concentrations clearly limited the cell growth, in such a way that raising these substrates concentrations up to intermediate values, increased µX,MAX 3 times and 2.5 times, respectively, and increased cell production 11 times and 3 times, respectively. The maximum RVGP cell content was not affected by GLC0, but improved 100% when GLN0 was 3.5 g/L or higher. The concentrations of produced lactate were considered low (below 0.8 g/L) to cause any inhibition effect on growth or protein expression. On the other hand, ammonium concentrations seem to inhibit RVGP production (NH4+~50 mg/L), as well as cell growth (NH4+~80 mg/L). Maximum productivity values (9.1 µg/L.h) and RVGP concentration (1.2 mg/L) were attained for 30% pO2, 10 g/L of GLC0 and 3.5 g/L of GLN0 run. The metabolism of GLC and GLN showed a great interdependence, with GLC0 changes affecting the GLN metabolism, and viceversa. Thus, in glucose excess condition, cell metabolism was less efficient. This implied in reduction of yield factors - YX/GLC (2.3 times) e YX/GLN (4.6 times) - and in higher by-products generation, characterized by augmentation in YALA/GLC (51%), YLAC/GLC (11%) and YNH4/GLN (15%). The glutamine metabolism showed a substrate excess response pattern to the whole range of concentration studied, with reduction of YX/GLN (25 times) and, unexpectedly, a reduction of by-products liberation - YNH4/GLN (7 times) and YALA/GLN (12 times). The effect on glucose metabolism was more intense when the glutamine concentration was higher, showing a 3.6 times diminution YX/GLC and a 70% augmentation for YALA/GLC and YLAC/GLC. The results suggest that cells metabolize glutamine through two different pathways glutaminolysis, under glucose limitation, or glutamate synthase - NADH-GOGAT, under glucose excess. The cell, proved also to be able to synthesize glutamine from ammonium or other amino acids, when it reached concentrations below 50 mg/L.

Orientadora: Prof.ª Dra Luisa Helena dos Santos Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Ambiental, 2016. / Biorreatores com Membranas Submersas (BRMS) são, atualmente, reconhecidos como opção viável para o tratamento de esgotos sanitários e o reúso de águas. Apesar disso, a tecnologia é geralmente vista como de alto investimento quando comparado a sistemas convencionais de tratamento de esgoto, sobretudo pelo maior gasto energético com aeração do sistema. Porém, BRMS quando operados sob condições específicas para nitrificação e desnitrificação simultâneas (NDS), é possível obter um efluente de elevada qualidade com menor custo, devido a menor necessidade de aeração. Nesse sentido, a operação do sistema de BRMS com o processo de NDS pode aumentar a utilização desta tecnologia no tratamento de esgoto sanitário. Neste contexto, este trabalho teve por objetivo principal avaliar a remoção de nitrogênio via NDS em diferentes concentrações de oxigênio dissolvido (OD) em uma unidade piloto de um Biorreator de Membranas Submersas tratando esgoto sanitário. Para isso, o experimento foi dividido em três Fases de acordo com a concentração de oxigênio dissolvido no licor misto: Fase I (2,3 mgO2/L), Fase II (0,8 mgO2/L e Fase III (0,3 mgO2/L). Foram alcançadas elevadas eficiências de remoção de material orgânico, independente das variações na concentração de OD, DBO5 com valores médios de 98%, 97% e 98% e DQO de 95%, 96% e 95% para as Fases I, II e III, respectivamente. A remoção média de nitrogênio total obtida foi 33% na Fase I, 60% na Fase II e 50% na Fase III. Onde a remoção via NDS foi responsável por 60%, 78% e 74% do total removido para as Fases I, II e III, respectivamente. A remoção de nitrogênio amoniacal não foi limitada devido as baixas concentrações de OD e houve acúmulo de NO2-. O sistema operou sob baixos valores de pressão transmembrana durante todo o período, porém foi encontrada diferença significativa nos valores da Fase III em relação às Fases I e II. Houve uma redução significativa na permeabilidade da membrana quando a concentração de OD no licor misto foi reduzida para 0,3 mg/L, porém sem efeito significativo quando a concentração de OD foi de 0,8 mg/L. Foram observados maiores valores de SPE ligado na Fase III em relação às demais, principalmente na fração de carboidratos que pode estar diretamente ligada a taxa de fouling. Foi possível alcançar remoção de NT em OD de 0,8 mg/L (Fase II) sem causar um impacto negativo no desempenho das membranas, sendo esta fase a mais adequada para a ocorrência do processo de NDS em BRMS. / Submerged Membrane Bioreactors (SMBR) are actually, recognized as viable option for wastewater treatment and reuse. Nevertheless, this technology is generally viewed as a high investment compared to conventional sewage treatment systems, especially for greater energy requirement for aeration system. However, SMBR when operated under specific conditions for simultaneous nitrification and denitrification (SND) it is possible to obtain a high quality effluent with lower compared to the conventional configuration because of less need for aeration. Therefore, the operation of the system SMBR with the NDS process can increase the utilization of this technology in the wastewater treatment. In this context, this study aimed to evaluate the removal of nitrogen via SND under different dissolved oxygen concentrations (DO) in a pilot of a SMBR treating wastewater. For this, the experiment was divided into three phases according to the concentration of dissolved oxygen in the mixed liquor: Phase I (2,3 mgO2/L), Phase II (0,8 mgO2/L and Phase III (0,3 mgO2/L). Were achieved high organic matter removal efficiencies regardless of fluctuations in DO concentration in terms of BOD5 average values of 98%, 97% and 98% and COD average values of 95%, 96% and 95% for Phases I, II and III respectively. The average total nitrogen removal was 33% in Phase I, 60% in Phase II and Phase III 50%. Where the removal means SND is responsible for 60%, 78% and 74% of the total removed for Phases I, II and III respectively. The removal of ammoniacal nitrogen is not limited by the low DO concentrations and there was accumulation of NO2- in Phase III. The system operated under low transmembrane pressure values throughout the period, but significant difference was found in the values of Phase III in relation to phases I and II. There was a significant reduction in membrane permeability when the DO concentration in the mixed liquor was reduced to 0.3 mg/L, but without significant effect when the DO concentration was 0.8 mg/L. It was observed highest bound EPS values in Phase III in relation to the others, mainly in the fraction of carbohydrates that can be directly linked to fouling rate. Satisfactory NT removal was achieved when concentration DO was 0.8 mg/L (Phase II) without causing a negative impact on the performance of membranes, being this phase the most suitable for the occurrence of the SND process in SMBR.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5178.pdf: 2466586 bytes, checksum: be50519a129b12383d84e69ae25b54db (MD5) Previous issue date: 2013-02-28 / Universidade Federal de Sao Carlos / The use of mesenchymal stromal cells (MSCs) for clinical therapy has been limited by the low amount of cells that can be obtained directly from tissue, making it necessary to develop techniques for in vitro cell number expansion. The current methods of expansion are laborintensive, exhibit unfavorable environments for cell growth, show still modest levels of expansion and low yield in the recovery of these cells. In the search for better alternatives, several types of bioreactors have been assessed, however, with results still discreet. A littlestudied system, which has showed itself very effective in the use with other types of animal cells, is the hollow fiber bioreactor. This bioreactor has relatively homogeneous culture environment, low level of hydrodynamic stress on cells and the process control is made through manipulation external to the culture. Thus, it is proposed in this work the study of the in vitro expansion of MSCs in 15 mL hollow fiber prototype bioreactor designed and built with a configuration specifically conceived for expansion of MSCs for use in therapeutic applications. The inoculum was prepared with MSCs precultured adhered to microcarrier Cultispher-S at concentration of 4 g/L in spinner flask containing 50 mL of α-MEM culture medium with 15% v/v fetal bovine serum. The preculture was performed in CO2 incubator at pH close to 7.3 and temperature of 37°C. For bioreactor expansion cultures, it was used the same culture medium, with addition of 12 g/L of alginate and 4.25-4.50 mM of CaCl2 as gelling agents to immobilize and keep in suspension the microcarriers, in the conditions of pH and temperature used in the preculture. The oxygenation of the culture medium continuously recirculated through the intracapilar space was carried out by air bubbling in an external flask. The oxygenation levels were of 70 to 90% of saturation with air. The experimental results obtained show that the used configuration of hollow fiber bioreactor promoted good conditions for expansion of MSCs without cell aggregation, reaching 15.3-fold expansion and cell recovery levels of 82%. These results also demonstrate the possibility of improving the efficiency of MSCs expansion through the renewal of medium to maintain suitable levels of arginine, nutrient present in limiting amounts, and ammonium, growth inhibitor metabolite. / A utilização de células estromais mesenquimais (MSCs em inglês) para a terapia clínica tem sido limitada pela baixa quantidade de células que podem ser obtidas diretamente do tecido, tornando necessário o desenvolvimento de técnicas de expansão do número de células in vitro. Os métodos atuais de expansão apresentam necessidade de intensa mão de obra, ambientes desfavoráveis para o crescimento celular, níveis de expansão ainda modestos e baixo rendimento na recuperação destas células. Na procura de melhores alternativas, diversos tipos de biorreatores vêm sendo avaliados, porém, com resultados ainda discretos. Um sistema pouco estudado que tem se mostrado muito eficiente no uso com outros tipos de células animais é o biorreator de fibra oca. Este biorreator apresenta ambiente de cultura relativamente homogêneo, baixo nível de forças hidrodinâmicas sobre as células e o controle do processo é feito através de manipulação externa à cultura. Assim, é proposto neste trabalho o estudo da expansão in vitro de MSCs num protótipo de biorreator de fibra oca de 15 mL projetado e construído com uma configuração especialmente concebida para expansão de MSCs a serem utilizadas em aplicações terapêuticas. O inóculo foi preparado com MSCs précultivadas aderidas ao microcarregador Cultispher-S na concentração de 4 g/L em frasco spinner contendo 50 mL de meio de cultura α-MEM com 15% v/v de soro fetal bovino. O précultivo foi realizado em incubadora de CO2 a pH próximo a 7,3 e temperatura de 37°C. Para os cultivos de expansão no biorreator foi utilizado o mesmo meio de cultura, com adição de 12 g/L de alginato e 4,25-4,50 mM de CaCl2 como agentes geleificantes para imobilizar e manter suspensos os microcarregadores, nas condições de pH e temperatura utilizadas no précultivo. A oxigenação do meio de cultura continuamente recirculado pelo espaço intracapilar foi realizada mediante borbulhamento de ar em um frasco externo. Os níveis de oxigenação foram de 70 a 90% da saturação com ar. Os resultados experimentais obtidos mostram que a configuração utilizada propiciou boas condições para a expansão sem agregação celular das MSCs, chegando-se a fatores de expansão estimados de 15,3 vezes e níveis de recuperação de células de 82%. Esses resultados também evidenciam a possibilidade de melhora da eficiência da expansão das MSCs através da renovação do meio de cultivo para a manutenção de níveis adequados de arginina, nutriente presente em quantidades limitantes, e amônia, metabólito inibidor de crescimento.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6615.pdf: 4694610 bytes, checksum: 288df2441cd04d5e5e4c36da49c66cb9 (MD5) Previous issue date: 2015-03-05 / Financiadora de Estudos e Projetos / Mesenchymal stromal cells (MSCs) are required by the scientific community in the development and enhancement of therapeutic techniques in different fields of medicine. The MSCs are present in small concentrations in tissues, which makes necessary the expansion in vitro for enable studies and therapeutic applicability. These are cells with high sensitivity to environmental conditions of cultivation. So, for increase productivity in vitro is used the technology of bioreactors in the development of processes in order to produce high cell densities in less time, with reduce use of resources and maintaining a safe operation. The new concepts of "disposable bioreactors", as the wave-induced motion bioreactor or Wave bioreactor, with possibility operating in a closed system, controlled and automated, reduced investment cost and operation, less risk of contamination, higher level biosecurity, added to the fact of being a underexplored technology and already approved by the FDA (Food and Drugs Administration) becomes a highly attractive alternative bioprocessing for cultivation of animal cells in large scale. In this context, the present work aims to develop a protocol for cultivation of MSCs in the Wave Bioreactor System 2/10. Experiments were performed to characterize the CEMs's culture behavior in the Wave bioreactor to obtain high cell productivity while maintaining the therapeutic potential of the CEMs. The experiments were carried out with 2 L Cellbag and Cultispher-S microcarrier with 300 ml of α-MEM medium culture supplemented with glucose, glutamine, and arginine and 15% v/v fetal bovine serum at 37 ° C and pH between 6,9-7,4. In the preliminary experiments it was verified that most of the inoculated cells did not adhere to the microcarriers. It was shown that such behavior is due to low relation between adhesion area (AMC = total projected area of the microcarriers) and wet surface area of Cellbag (ASMCellbag), which in the normal condition of operation results an adhesion between 25,7 and 61,7% of the inoculated cells. To solve the problem were performed experiments reducing ACellbag which enabled improvements in cell adhesion by up to 100%. It was also found low performance of the cell expansion phase, presumably linked to operational problems like: microcarriers segregation in certain regions of the bioreactor causing depletion of nutrients, formation of aggregates of MCs colonized with cells and adhesion of MCs to Cellbag. In addition, it was observed that reducing CEM/MC ratio at the start of the culture, the cell expansion factor could be increased to values equal to or greater than 10. These results show that the Wave bioreactor has good potential for expansion of MSCs and that the same can be improved. / As células estromais mesenquimais (CEMs) estão sendo visadas pela comunidade científica no desenvolvimento e aprimoramento de técnicas terapêuticas em diferentes ramos da medicina. As CEMs estão presentes em pequenas concentrações nos tecidos, o que torna necessário a sua expansão in vitro para viabilizar pesquisas e a aplicabilidade terapêutica. Tratam-se de células com elevada sensibilidade em relação às condições do ambiente de cult ivo. Assim, para o aumento da produtividade in vitro utiliza-se a tecnologia de biorreatores no desenvolvimento de processos com objetivo de produzir altas densidades celulares em curto tempo, de forma econômica e respeitando as normas impostas pelos órgãos reguladores. O novo conceito de biorreator descartável, como o do biorreator com movimento induzido em forma de ondas, ou biorreator Wave, apresenta possibilidade de operação em sistema fechado segundo as boas práticas de fabricação (BPF), controlado e automatizado. O custo de investimento e operação reduzido, com menor risco de contaminação, maior nível de biossegurança, somado ao fato de utilizar uma tecnologia pouco explorada e já aprovada pelo FDA (Food and Drugs Administration) se transforma numa alternativa de bioprocessamento altamente atrativa para cultivo de células animais em larga escala. Nesse contexto, o presente trabalho tem por meta avaliar o desempenho do biorreator Wave 2/10 na expansão das CEMs. Para tal, foram realizados experimentos visando caracterizar o comportamento do cultivo nesse biorreator a fim de obter alta produtividade celular mantendo a potencialidade terapêutica das CEMs. Os experimentos foram realizados com saco plástico (doravante Cellbag) de 2 L e microcarregador (MC) Cultispher-S com 300 mL me io de cultivo α-MEM suplementado com glicose, glutamina e arginina e 15% v/v de soro fetal bovino a 37°C e pH entre 6,9-7,4. Nos experimentos preliminares constatou-se que grande parte das células inoculadas não aderiam aos microcarregadores. Comprovou-se que tal comportamento se devia à baixa relação entre área de adesão (AMC = área total projetada dos microcarregadores) e área de superfície molhada da Cellbag (ASMCellbag) que na condição normal de operação resultava numa adesão entre 25,7 e 61,7% das células inoculadas. Para melhorar a adesão foram realizados experimentos reduzindo a ASMCellbag, o que possibilitou melhoria na adesão celular em até 100%. Na etapa de expansão celular verificou-se baixo desempenho, presumivelmente vinculado a problemas de operação como: segregação de microcarregadores em determinadas regiões do biorreator provocando o esgotamento de nutrientes, formação de agregados de MCs colonizados com células e adesão dos MCs à Cellbag. Em adição, notou-se que diminuindo a relação CEM/MC no início do cultivo a expansão celular podia ser aumentada para valores iguais ou maiores que 10. Ao todo, os resultados mostraram que o biorreator Wave possui bom potencial para a expansão de CEMs e que o mesmo ainda pode ser melhorado.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5744.pdf: 5142793 bytes, checksum: 72f54c78f587dd8a944d3e9cfc2aaee2 (MD5) Previous issue date: 2013-09-20 / Financiadora de Estudos e Projetos / The main challenge on the conversion of lignocellulosic biomass into liquid fuels is the economic viability of this process. Thus, the commercialization of lignocellulosic ethanol is hindered mainly by the high costs of the enzyme preparations currently available cellulases - enzymes used in the saccharification step. Some strategies that can be adopted to reduce the enzymes costs include selecting microorganisms, use of cheaper raw materials and more efficient fermentation strategies such as the solid state fermentation (SSF) and efficient techniques for saccharification and fermentation. The aim this work was evaluate the use of the whole fermentation medium containing lignocellulosic biomass, fungal mycelium and enzymes in the hydrolysis of sugarcane bagasse pretreated by steam explosion for cellulosic ethanol production. In this context, a selection of filamentous fungi highly producing cellulases and hemicellulases, optimization operating conditions, such as humidity and temperature, were carried out for in house enzyme production using an instrumented bioreactor. Then, the efficiency of the whole fermentation medium and enzyme extract in enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass for cellulosic ethanol production was evaluated. Among the 40 fungal strains evaluated, two strains of A. oryzae (P6B2 and P27C3A) stood out. In addition, one strain of A. niger 3T5B8 and another of T. reesei RUT C30 were also evaluated in this study. The influence of the substrate initial moisture content and temperature on efficiency of cellulase and xylanase production by strains of A. oryzae, A. niger and T. reesei grown in SSF under conditions of forced aeration and static were evaluated. The initial moisture content of the substrate did not affect the production of cellulases and xylanases by strain of A. oryzae P27C3A, however higher moisture was better for enzyme production by strains of A. oryzae P6B2 and A. niger and lower moisture were better for the production of cellulases and xylanases by T. reesei in both cultive systems. Temperature 28°C was best for xylanase production by all the fungal strains, while higher temperatures was better cellulases production in both culture systems. The use of whole fermented medium of A. niger or T. reesei obtained in the bioreactor were better in the hydrolysis sugarcane bagasse pretreated by steam explosion (BPSE) than the enzymatic extract with a final conversion of 41.3 and 24.9% of theoretical, respectively. The combination of whole fermentation medium of strains of A. oryzae (P6B2 or P27C3A) obtained in flasks and ½ commercial enzyme hydrolysis also were efficient on BPSE hydrolysis (26.1 and 42.4% of theoretical, respectively). Nevertheless, the combination of whole fermented medium of A. oryzae P6B2 and enzymatic extract of A. niger obtained in flasks promoted a conversion of 65% and an ethanol yield of 84% of the theoretical value. As overall conclusion it was found that the use of whole fermented medium produced by fungi cultivated under solid state fermentation (SSF) in the BPSE hydrolysis resulted in similar or higher yields compared to the hydrolysis using the enzyme extract, giving clear indication that the extraction/filtration step of the enzyme can be eliminated. The use of the enzyme complex of A. oryzae P6B2 in combination with the enzymes of A. niger resulted in a BPSE hydrolysis more efficient when compared with other combinations, showing the importance of selecting microorganisms for high enzymes production. Moreover, the use of a single reactor system for performing enzyme production steps by SSF, saccharification and alcoholic fermentation may be performed, avoiding the need for steps separation. / A discussão dominante sobre a transformação da biomassa lignocelulósica a combustível líquido é a sua viabilidade econômica. Assim, a comercialização do etanol a partir de biomassa lignocelulósica é dificultada principalmente pelos custos proibitivos das preparações de celulases enzimas usadas na sacarificação. Algumas estratégias que podem ser adotadas para a redução do custo das enzimas utilizadas na degradação da biomassa incluem a seleção de micro-organismos altamente produtores de celulases e hemicelulases, utilização de matéria-prima mais barata e estratégias de fermentação a um custo efetivo - como a fermentação em estado sólido (FES) e técnicas mais eficientes de sacarificação e fermentação alcoólica. O objetivo deste trabalho foi avaliar a utilização do meio fermentado integral (MFI), contendo biomassa lignocelulósica, micélio fúngico e enzimas na hidrólise do bagaço de cana pré-tratado por explosão a vapor para produção de etanol celulósico. Neste contexto, realizou-se a seleção de fungos filamentosos isolados do solo de madeira em decomposição da Região Amazônica produtores de celulases e hemicelulases, otimizou-se as condições operacionais, como umidade e temperatura para a produção de enzimas in house utilizando biorreator de coluna instrumentado e por fim, avaliou-se a eficiência do MFI e (EE) na hidrólise enzimática da biomassa lignocelulósica para produção de etanol celulósico. Entre os 40 fungos caracterizados quanto à produção de enzimas envolvidas na degradação da lignocelulose, duas linhagens de A. oryzae (P6B2 e P27C3A) se destacaram em relação às demais. Além das linhagens de A. oryzae outras duas linhagens de fungos, uma de A. niger 3T5B8 e outra de T. reesei RUT C30 foram avaliadas neste trabalho, a fim de verificar a eficiência das linhagens isoladas do solo da Floresta Amazônica. A umidade inicial do substrato não influenciou na produção de celulases e xilanases pela linhagem de A. oryzae P27C3A, no entanto umidades elevadas foram melhores para a produção de enzimas pelas linhagens de A. oryzae P6B2 e A. niger e umidades baixas foram melhores para a produção de celulases e xilanases por T. reesei em ambos os sistemas de cultivo, forçado e estático. Com relação à temperatura de fermentação, 28ºC foi melhor para a produção de xilanases por todas as linhagens fúngicas e temperaturas mais elevadas favoreceram a produção de celulases pelos fungos. A utilização do MFI de A. niger ou T. reesei obtido em biorreator de coluna instrumentado foram melhores na hidrólise do bagaço de cana pré-tratado por explosão a vapor (BEX) do que o EE, com uma conversão final de 41,3 e 24,9% do valor teórico, respectivamente. A combinação de MFI das linhagens de A. oryzae (P6B2 ou P27C3A) obtida em Erlenmeyer e ½ de enzima comercial também favoreceram a hidrólise do BEX (26,1 e 42,4% do valor teórico, respectivamente). No entanto, a combinação de MFI de A. oryzae P6B2 e EE de A. niger obtido em Erlenmeyer promoveram uma conversão final de 65% e um rendimento de etanol de 84% do valor teórico. Vale salientar que foi utilizado na fermentação alcoólica o meio hidrolisado na íntegra, contendo açúcares, enzimas, biomassa lignocelulósica e micélio fúngico. Como conclusões gerais, constatou-se que a utilização de MFI produzido pelos fungos por FES na hidrólise do BEX resultou em rendimentos semelhantes ou mais elevados quando comparado com a hidrólise do BEX utilizando EE, dando a clara indicação de que o passo de extração/filtração das enzimas pode ser eliminado; a utilização do complexo enzimático de A. oryzae P6B2 em combinação com o complexo enzimático de A. niger resultou em uma hidrólise mais eficiente do BEX quando comparado com outras combinações, mostrando a importância da seleção de micro-organismos produtores de enzimas envolvidas na degradação da lignocelulose, para que a produção de etanol celulósico possa se tornar economicamente viável; e por fim, a utilização de um único sistema de reator para a realização das etapas de produção de enzimas por FES, sacarificação e fermentação alcoólica pode ser realizada, evitando-se a necessidade de etapas de filtração.

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No. of bitstreams: 1 TeseJBCS.pdf: 2225419 bytes, checksum: d3ec7a73f461b658739175f8e171c762 (MD5) Previous issue date: 2016-08-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Cell-associated lipases have been considered biocatalysts economically advantageous because they are produced at low cost, avoiding further recovery or purification steps. Few studies regarding Streptomyces clavuligerus lipase have reported the production of extracellular enzyme, although at first this had been considered a cell-associated enzyme. In this context, the aim of this work was the production of the cell-associated lipase from Streptomyces clavuligerus (whole-cell lipase, Sc-WCL) by submerged fermentation, the biochemical characterization of the enzyme and its use in the synthesis of butyl butyrate, an aroma ester with industrial importance. The culture conditions on rotary shaker and the operational parameters for cultivation in bioreactor were evaluated in order to establish a protocol for Sc- WCL production. The conditions for S. clavuligerus cultivation in rotary shaker that resulted in maximal hydrolytic activity of Sc-WCL (3,000 U.L-1) were: baffled flask, free-glycerol production medium, pH 6.8 and 28 °C. The operational parameters in bench reactor that resulted in maximal volumetric productivity of Sc-WCL (54 U.L-1.h-1) were agitation of 400 rpm and aeration of 1 vvm. The maximal volumetric productivity in bioreactor operated under selected conditions (52.5 U.L-1.h-1) was reached after 24 h, while similar productivity in rotary shaker (54.8 U.L-1.h -1) was achieved only after 48 h fermentation. The catalytic potential of Sc-WCL in hydrolysis reactions was comparable to the commercial lipase preparations. Sc- WCL was more active at 60 °C and pH 10.7, and stable at 30-40 °C after 1 h incubation at pH 10. For butyl butyrate synthesis catalyzed by Sc-WCL, the reaction conditions that resulted in higher ester conversion (85%) were: 5 g of Sc-WCL/ L, molar ratio of fatty acid: alcohol 1:1 in heptane and 8 h reaction. The stability at alkaline pH and organic medium (leastwise in heptane and butanol), associated with the low cost, make Sc-WCL attractive in industrial applications, such as flavors synthesis, detergent formulations, hydrolysis of vegetable oils, among others. / Lipases associadas à célula têm se destacado como biocatalisadores economicamente vantajosos, pois são produzidas a baixo custo, dispensando etapas posteriores de recuperação ou purificação. Poucos estudos sobre lipase de Streptomyces clavuligerus relatam a produção da enzima extracelular, embora esta tenha sido, a princípio, considerada uma enzima associada à célula. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi a produção de lipase associada à célula de Streptomyces clavuligerus (lipase “whole-cell”, Sc-WCL) por fermentação submersa, a caracterização bioquímica da enzima e sua aplicação na síntese de butirato de butila, um éster de aroma com importância industrial. As condições de cultivo em shaker e os parâmetros operacionais para cultivo em biorreator foram avaliados com o intuito de estabelecer um protocolo para a produção de Sc-WCL. As condições de cultivo de S. clavuligerus em shaker que resultaram em maior atividade hidrolítica de Sc-WCL (3.000 U.L- 1) foram: frasco aletado, ausência de glicerol no meio de produção, pH 6,8 e 28 ºC. Os parâmetros operacionais em reator de bancada que resultaram em maior produtividade volumétrica de Sc-WCL (54 U.L-1.h-1) foram: agitação de 400 rpm e aeração de 1 vvm. A máxima produtividade volumétrica em biorreator operado nas condições selecionadas foi alcançada após 24 h de cultivo (52,5 U.L-1.h-1), enquanto que produtividade similar em shaker foi obtida somente após 48 h de cultivo (54,8 U.L-1.h-1). O potencial catalítico de Sc-WCL em reações de hidrólise foi comparável ao de preparações comerciais de lipase. Sc-WCL foi mais ativa a 60 ºC e pH 10,7, e mais estável na faixa de 30 a 40 ºC após 1 h de incubação a pH 10. Na síntese de butirato de butila catalisada pela Sc-WCL, as condições reacionais que resultaram em maior conversão (85%) foram: 5 g de Sc-WCL/ L, razão molar ácido graxo/álcool 1:1 em heptano e 8 h de reação. A estabilidade em pH alcalino e em meio orgânico (pelo menos em heptano e butanol), associada ao baixo custo, tornam a Sc-WCL atrativa em aplicações de interesse industrial, tais como, síntese de aromas, formulações de detergentes, hidrólise de óleos vegetais, dentre outras.