Orientador: Elenice Deffune / Resumo: A Hemorragia feto-materna (HFM) se dá pela transferência do sangue fetal para o compartimento intravascular materno, devido à ruptura na membrana vásculo-sincicial da placenta. A HFM pode ser responsável pela alosensibilização do sistema imune materno, levando a morbidade e mortalidade de gravidez corrente e/ou de futura, assim como também constitui a base da etiopatogenia de várias afecções, como se verifica na doença hemolítica perinatal que expõe a complicações fetais como, hidropsia, danos cerebrais hipóxicos e morte fetal. Detectar e quantificar hemácias fetais ajuda a prevenir as consequências devida a ocorrência da HFM. Entre os testes diagnósticos utilizados na detecção e quantificação têm - se os mais sensíveis o teste quantitativo de Kleihauer e Betke e o de Citometria de fluxo, sendo o primeiro considerado padrão ouro. Tendo em vista a importância do diagnóstico laboratorial da HFM foi desenvolvida a proposta da construção de imunossensor para detecção de amostras de sangue fetal na corrente sanguínea materna. Foi realizada a produção de anticorpo monoclonal com objetivo de produzir anticorpos contra antígenos de superfícies de hemácias fetais humana e também foram realizadas a construção de unidades sensoriais para detecção de sinal biológico de imunoafinidade entre anticorpos que detectam hemácias fetais e a hemoglobina fetal presente nestas células, a fim de se diagnosticar a ocorrência da HFM. Foram obtidos como resultados a produção de anticorpo monoclonal que... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Fetomaternal hemorrhage (FMH) occurs through the transfer of fetal blood into the maternal intravascular compartment, due to rupture in the placenta-syncytial membrane. FMH may be responsible for the alosensitization of the maternal immune system, leading to morbidity and mortality of current and / or future pregnancies, as well as being the basis of the etiopathogenesis of various conditions, as in perinatal haemolytic disease that exposes to fetal complications such as hydrops, hypoxic brain damage, and fetal death. Detecting and quantifying fetal erythrocytes helps to prevent the consequences due to the occurrence of FMH. Among the diagnostic tests used in the detection and quantification are the most sensitive the quantitative test of Kleihauer and Betke and the one of Flow cytometry, being the first considered gold standard. Considering the importance of the laboratory diagnosis of FMH, the proposal of the construction of immunosensor for the detection of fetal blood samples in the maternal blood was developed. The production of a monoclonal antibody was carried out with the objective of producing antibodies against antigens on human fetal red blood cells and also the construction of sensorial units for the detection of biological signal of immunoaffinity between antibodies that detect fetal red blood cells and the fetal hemoglobin present in these cells, in order to diagnose the occurrence of FMH. The results obtained are the production of monoclonal antibody that detec... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Com a evolução tecnológica há nos dias de hoje um aumento de dispositivos eletrônicos presentes ao nosso redor. Com o passar dos anos diversas funcionalidades vêm sendo agregadas a estes inclusive com maior poder de processamento. Em particular, para sistemas embarcados houve um crescimento da quantidade de sensores para diversos propósitos. Seguindo esta tendência, na área de saúde também houve um aumento significativo de aparelhos e dispositivos de monitoramento, tais como glicosimetros, oxímetros, monitoramento de pressão e batimento cardíaco por exemplo, que através de sensores realizam transdução dos dados pertinentes ao parâmetro envolvido. Este trabalho apresenta a pesquisa e o desenvolvimento de um sistema embarcado com a propriedade de multiplexação de sensores, ou seja, foi desenvolvido um dispositivo microcontrolado o qual visa multiplicar a capacidade de monitoramento de analitos, conseguindo analisar múltiplos sensores para um mesmo experimento. Ao decorrer deste desenvolvimento foram utilizados quatro sensores dispostos simetricamente em um béquer, os dados são coletados e tratados de forma sequencial e individual. Inicialmente utilizamos um sistema embarcado com um microcontrolador (PIC 18F2550) que é responsável por digitalizar a informação e pela conexão via terminal USB. Posteriormente um microprocessador (Raspberry Pi Zero, placa embarcada) fez-se necessário devido ao melhor processamento de dados. Os sensores aqui estudados tratam-se de sensores químicos, que são introduzidos a uma célula eletroquímica, onde se encontram um eletrodo de referência (Prata em uma solução de Cloreto de Prata) e os outros quatro filmes finos que irão compor o sistema multiplexado. Para este estudo em específico o material escolhido para fabricação dos filmes finos foi um polímero condutivo, mais especificamente polianilina (PANI). Esta foi depositada sobre um substrato de oxido de estanho dopado com flúor (FTO) através da eletrodeposição. Para sensores não específicos (não imobilizados para um analito alvo) os dois sistemas embarcados apresentaram respostas satisfatórias. Prosseguindo com o estudo e usando filmes finos para analitos biológicos (ureia e glicose) o microcontrolador não conseguiu separar os sinais de cada filme fino. Apenas o sistema com a Raspberry Pi obteve sucesso, devido a maior resolução no conversor analógico para digital e sua maior capacidade de processamento para determinar com uma maior precisão os valores obtidos. O sistema pode ser facilmente expandido para um maior número de sensores. / With the evolution of technology there is nowadays an increase in the number of electronic devices present around us. Over the years various functionalities have been added to these devices including the increased processing power. In particular, for embedded systems there has been an increase in the number of sensors for various purposes. Following this trend, in the area of health, there has also been a significant increase in systems and monitoring devices, such as glycosimeters, oximeters, pressure monitoring and heart rate, for example, which, through sensors, transduce data pertinent to the parameter involved. This work presents the research and development of an embedded system with the property of multiplexing sensors, that is, a microcontrolled device was developed which aims to multiply the capacity of analytes monitoring, being able to analyze multiple sensors for the same experiment. During this development four sensors were used symmetrically arranged in a beaker, the data were collected and treated sequentially and individually. Initially we used an embedded system with a microcontroller (PIC 18F2550) that is responsible for scanning the information and for the connection via USB terminal. Subsequently a microprocessor (Raspberry Pi Zero, embedded board) was made necessary due to the better processing of data. The sensors studied here are chemical sensors, which are introduced to an electrochemical cell, where a reference electrode is found (Silver in a Silver Chloride solution) and the other four thin films that will make up the multiplexed system. For this specific study the material chosen for the manufacture of thin films was a conductive polymer, more specifically polyaniline (PANI). This was deposited on a substrate of fluorine-doped tin oxide (FTO) by electrodeposition. For non-specific sensors (not immobilized for a target analyte) the two embedded systems presented satisfactory responses. Proceeding with the study and using thin films for biological analytes (urea and glucose) the microcontroller failed to separate the signals from each thin film. Only the system with Raspberry Pi has been successful, due to the higher resolution in the analog to digital converter and its greater processing capacity to determine with greater precision the obtained values. The system can be easily expanded to a larger number of sensors.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:41:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KatharinaCSO.pdf: 335583 bytes, checksum: 310be6d6efd0d5b30fba5cfe67eb903b (MD5) Previous issue date: 2008-02-29 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / In this work, the objective in study was the development of a biossensor potencyometric for urea detection, starting from the extracted urease of soy grains. Initially, was made a chemometrics study, through a planning factorial 24, objectified to find great conditions for the extraction of the urease without its properties were affected. Starting from this study, the best conditions were determined for the obtaining of rich extracts in urease, allowing the biossensors making with good characteristics. These were made using a platinum electrode as transducer with the dispersed urease in chitosan head office and reticulated in glutaraldehyde vapor. The biossensors obtained presented a limit of urea detection the same to 0,33 mM and lineal strip between 0,33 and 3 mM of the substratum. The time of answer was considered loud, mainly, in low concentrations of the substratum, where it was taken about 5 minutes by analysis. For high concentrations that time was reduced for not more than one minute. The time of life was limited by the adherence of the enzymatic membrane to the transducer, but it was possible to maintain the biossensor with operation for one month with about 50 accomplished measures. Application of the biossensor for analyses of fertilizers to the urea base presented excellent result for a sample with few interfering, but it was different when the used fertilizer was originating from of a complex sample. Even so the label was not expressed the text of nitrogen it was totally coming of the urea. An evaluation of the kinetic parameters of the catalytic reaction of the biossensor showed coherence with the results exposed in the literature / Neste trabalho, o alvo em estudo foi o desenvolvimento de um biossensor potenciom?trico para detec??o de ur?ia, a partir da urease extra?da de gr?os de soja. Inicialmente, fez-se um estudo quimiom?trico, atrav?s de um planejamento fatorial 24, objetivando-se encontrar condi??es ?timas para a extra??o da urease sem que suas propriedades fossem afetadas. A partir deste estudo, determinaram-se as melhores condi??es para a obten??o de extratos ricos em urease, permitindo a confec??o de biossensores com boas caracter?sticas. Estes foram confeccionados usando um eletrodo de platina como transdutor com a urease dispersa em matriz de quitosana e reticulada em vapor de glutaralde?do. Os biossensores obtidos apresentaram um limite de detec??o de ur?ia igual a 0,33 mM e faixa linear entre 0,33 e 3 mM do substrato. O tempo de resposta foi considerado alto, principalmente, em concentra??es baixas do substrato, onde se levou cerca de 5 minutos por an?lise. Para concentra??es altas esse tempo foi reduzido para pouco mais de um minuto. O tempo de vida foi limitado pela ader?ncia da membrana enzim?tica ao transdutor, mas foi poss?vel manter o biossensor com funcionamento por um m?s com cerca de 50 medidas realizadas. A aplica??o do biossensor para an?lises de fertilizantes ? base de ur?ia apresentou excelente resultado para uma amostra com poucos interferentes, mas foi diferente quando o fertilizante utilizado era oriundo de uma amostra complexa. Por?m o r?tulo n?o expressava se o teor de nitrog?nio era totalmente proveniente da ur?ia. Uma avalia??o dos par?metros cin?ticos da rea??o catal?tica do biossensor mostrou coer?ncia com os resultados expostos na literatura

Submitted by Liliane Ferreira (ljuvencia30@gmail.com) on 2018-04-05T11:33:30Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rafael Souza Antunes - 2018.pdf: 1117552 bytes, checksum: 7b6b38df98706830495a6656969aa5e7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-04-05T12:47:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rafael Souza Antunes - 2018.pdf: 1117552 bytes, checksum: 7b6b38df98706830495a6656969aa5e7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-05T12:47:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rafael Souza Antunes - 2018.pdf: 1117552 bytes, checksum: 7b6b38df98706830495a6656969aa5e7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-03-05 / The use of plant enzymes for analytical purposes is increasing every day, especially in the field of biotechnology linked to the development of new and more specific analytical instruments. In this way, the development of biosensors has been increasing since these allow the measurement of the analyte of interest to be performed by the selective transduction of a parameter of the target-analyte reaction that can be monitored. For this reason, the biological element that makes up the instrument, becomes an essential component for its construction. Polyphenoloxidase is an enzyme that catalyzes the conversion of a phenolic compound to a quinone, which can be reduced electrochemically and thus allows the detection (quantification) of the analyte of interest. This enzyme is widely distributed in plants and is widely used in the production of biosensors and the selective evaluation of phenolic drugs in pharmaceutical formulations and total phenols in industrial effluents. The polyphenoloxidases in this specific work were extracted from the fruit of Jurubeba (Solanum paniculatum L.) and used in the development of carbon paste electrochemical biosensors in the determination of phenolic drugs, such as paracetamol, ascorbic acid, salicylic acid and or methyldopa. Under experimental conditions the effect of the amount of enzymatic extract in the carbon paste ranging from 50 to 200 μL and the optimum pH of 3.0 to 9.0 using the differential pulse voltammetry technique was investigated. After optimization, the intermediate precision of the biosensor was tested through its reproducibility through the tests of repeatability, time of conditioning, stability and linearity. Soon after, used in the determination of the drugs, obtaining a better response in the detection of paracetamol, in this way, the calibration curve was realized and consequently applied in the determination of paracetamol of commercial samples in tablets. The biosensor had a linearity in the range of 5 to 245 μM, with a detection limit of 3 μM. The polyphenoloxidase extracted from the fruit of Jurubeba showed peculiar characteristics that it provided in the technological development of biosensors with application in the quality control of phenolic drugs, exhibiting high sensitivity, satisfactory selectivity, good repeatability and adequate stability. / O uso de enzimas vegetais para fins analíticos vem aumentando a cada dia, principalmente no ramo da biotecnologia ligada ao desenvolvimento de novos instrumentos de análises cada vez mais específicos. Desta forma, o desenvolvimento de biossensores vem crescendo, já que estes permitem que a medida do analito de interesse seja realizada pela transdução seletiva de um parâmetro da reação analito-alvo passível de ser monitorado. Por este motivo, o elemento biológico que compõe o instrumento, torna-se um componente essencial para a sua construção. A polifenoloxidase é uma enzima que catalisa a conversão de um composto fenólico a uma quinona, que pode ser reduzida eletroquimicamente e permite assim a detecção (quantificação) do analito de interesse. Esta enzima é amplamente distribuída nos vegetais e bastante utilizada na produção de biossensores e na avaliação seletiva de fármacos fenólicos em formulações farmacêuticas e de fenóis totais em efluentes industriais. As polifenoloxidases, neste trabalho em específico, foram extraídas do fruto da Jurubeba (Solanum paniculatum L.) e utilizadas no desenvolvimento de biossensores eletroquímicos de pasta de carbono na determinação de fármacos fenólicos, tais como o paracetamol, o ácido ascórbico, o ácido salicílico e o metildopa. Sob condições experimentais foram investigados o efeito da quantidade de extrato enzimático na pasta de carbono que variou-se de 50 a 200 μL e o pH ótimo de 3,0 a 9,0, utilizando a técnica de voltametria de pulso diferencial. Após otimizado, foi testado a precisão intermediária do biossensor através de sua reprodutibilidade por meio dos teste de repetibilidade, tempo de condicionamento, estabilidade e linearidade. Logo em seguida, empregado na determinação dos fármacos, obtendo uma melhor resposta na detecção do paracetamol, dessa forma, foi realizado a curva de calibração e consequentemente aplicado na determinação do paracetamol de amostras comerciais em comprimidos. O biossensor apresentou uma linearidade na faixa de 5 a 245 μM, com um limite de detecção de 3 μM. Frente aos resultados alcançados foi evidenciado que a polifenoloxidase extraída do fruto da jurubeba apresentou características peculiares que proporcionou no desenvolvimento tecnológico dos biossensores com aplicação no controle de qualidade dos fármacos fenólicos, exibindo alta sensibilidade, seletividade satisfatória, boa repetibilidade e estabilidade adequada.

Sensores são dispositivos capazes de captar um determinado sinal físico -químico do meio e converte-lo num sinal elétrico mensurável por meio de um transdutor. Biossensor é um sensor que tem como parte funcional um receptor biológico específico a determinado analito alvo. Os sinais físico-químicos experimentados por estes dispositivos são convertidos em sinais elétricos de magnitude proporcional à concentração de um ou mais compostos químicos. Neste trabalho, foi construído um sensor de pH utilizando filmes finos comerciais de óxido de estanho dopado com flúor (FTO) como receptor a íons. O sensor foi feito ligando-se amostras de FTO ao terminal de porta de um transistor de efeito de campo do tipo MOS (Metal Oxide Semiconductor). Quando colocado em solução, os íons presentes interagem com a amostra sendo adsorvidos na superfície do filme de FTO. O potencial gerado pelos íons adsorvidos modulam a tensão na porta do transistor e, desta maneira, pode -se determinar a concentração dos íons presentes na solução de acordo com a magnitude da resposta do transistor. A este tipo de dispositivo dá -se o nome de EGFET (Extended Gate Field Effect Transistor). O EGFET construído apresentou responsividade de 55 mV/pH e resposta linear em soluções de pH 2 ao 12. Através de técnicas de imobilização enzimática foi possível ligar covalentemente proteínas urease sobre a superfície dos filmes de FTO, convertendo o sensor de pH em biossensor de ureia. Soluções tampão com diferentes pHs e concentrações foram testadas e determinou -se que as condições ideais para o uso deste biossensor de ureia são soluções tampão com pH = 6 e concentração de 10mM. Nessas condições, o biossensor apresentou uma responsividade de 114,5 mV/p(ureia) e linearidade no intervalo de concentrações de ureia entre 3,2.10 -4 e 3,2.10 -2 mol/L. / Sensors are devices capable of capturing a certain physical-chemical signal from environment and convert it into a measurable electrical signal by a transducer. Biosensor is a sensor which has a biological sensing element as receptor specific to a particular target analyte. The physical-chemical signals experienced by these devices are converted into electrical signals with magnitude proportional to the concentration of one or more chemical compounds. In this work, we built a pH-sensor using commercial thin films of tin oxide doped with fluorine (FTO) as ions receptor. The sensor was made by linking FTO samples to the gate of a field effect transistor MOS type. In solution, the ions interact with the sample being adsorbed on the surface of FTO film. The potential generated by the ions adsorbed on film\'s surface modulate the gate voltage of the transistor and, in this way, we can determine the concentration of ions present in solution correlated with the magnitude of the transistor response. This kind of device is given the name of EGFET (Extended Gate Field Effect Transistor). The EGFET built exhibits sensitivity of 55 mV/pH and linear response in the range of pH 2 to 12. Through enzyme immobilization techniques we could covalently bind urease proteins on the surface of FTO film, changing the pH-sensor in urea biosensor. Buffer solutions with differents pHs and concentrations were tested and was determined that optimal environment conditions for this urea biosensor is buffer solutions with pH = 6 and 10mM of concentration. Under these conditions, the biosensor showed sensitivity of 114.5 mV/p(urea) and linear response in the range of 3,2.10 -4 to 3,2.10 -2 mol/L

Este trabalho descreve a preparação, a caracterização e o uso de um biossensor de pasta de carbono modificado com a enzima acetilcolinesterase para a quantificação de carbamatos em alimentos, bem como o estudo das constantes de velocidade para a reação enzima/substrato (iodeto de acetiltiocolina) em solução. Inicialmente foram realizados testes de estabilidade, tanto para o substrato quanto para a enzima. Nestes testes, a absorção na região do UV-vis do substrato não apresentou diminuição significativa em 11 dias de análises, já a enzima apresentou uma grande perda de sua atividade com apenas três dias de preparo da solução. Na preparação do eletrodo de trabalho alguns parâmetros foram otimizados, tais como: quantidade de enzima e de ftalocianina de cobalto (CoPC) no eletrodo, bem como a porcentagem de glutaraldeído utilizada. A melhor resposta ocorreu para adição de 2,40x10-3g de enzima, 0,90x10-3g de CoPC (referentes à massa de 0,017g de pasta de carbono) e solução de glutaraldeido 1%. A seguir, realizou-se um experimento baseado na inibição da atividade da enzima, causada pela imersão do eletrodo na solução contendo o pesticida carbaril nas concentrações 5,00x10-5 e 1,00x10-4 mol L-1. Notou-se que, com o aumento da concentração do carbaril, houve aumento na inibição da atividade enzimática. Desta forma o eletrodo apresentou-se apto para determinação analítica de pesticidas. Estas medidas foram realizadas em meio de tampão fosfato 0,1 mol L-1, pH 7,4 e com tempo de incubação para o carbaril, metomil e aldicarbe foram de 8, 12 e 15 minutos, respectivamente. Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) obtidos utilizando-se o biossensor amperométrico para o carbaril foram de 2,00x10-6 mol L-1 (0,40 mg L-1) e 6,70 x 10-6 mol L-1 (1,30 mg L-1), para o metomil de 1,88 x 10-7mol L-1 (30,45 micro g L-1) e 6,26 x 10-7 mol L-1 (0,10 mg / L-1) e para o aldicarbe de 1,10x10-6 mol L-1 (0,20 mg L-1) e 3,60x10-6 mol L-1 (0,70 mg L-1). Para a formulação comercial Lannate (metomil) os LD e LQ foram 2,13x10-7 mol L-1 (34,50 micro g L-1) e 7,09x10-7 mol L-1(0,12 mg L-1), respectivamente. As medidas de HPLC apresentaram LD e LQ de 1,58 x 10-8 mol L-1 (3,18 micro g L-1) e 5,27x10-8 mol L-1 (10,60 micro g L-1) para o carbaril e de 9,02 x 10-10 mol L-1 (0,15 micro g L-1) e 3,00 x 10-9 mol L-1 (48,60 micro g L-1) para o metomil. Testes de recuperação foram realizados usando ambas as técnicas para o carbaril e Lannate. As recuperações utilizando-se o biossensor mostraram-se eficientes, variando de 76,83 a 106,67% para o carbaril e de 78,00 a 96,50% para a Lannate, enquanto que nas medidas de HPLC, as recuperações foram de 78,00 a 108,33% para o carbaril e de 57,00 a 99,50% para o Lannate. A recuperação para o aldicarbe no tomate foi de 62,40 %. As análises da enzima em solução mostraram que a metodologia empregada neste estudo é adequada para a determinação das constantes de velocidade para a etapa lenta da reação AchE/AchI. Observou-se que os valores destas constantes são dependentes da concentração dos pesticidas fenitrothion (organofosforado) e carbaril (carbamato), em baixa concentração ambos apresentaram constantes de velocidade similares, mas com o aumento dessa concentração, o fenitrothion apresentou menor constante de velocidade em relação ao carbaril, sugerindo que este apresenta maior inibição da enzima e por conseqüência maior toxicidade no organismo. Esses resultados mostraram uma possível metodologia analítica para a quantificação destes pesticidas, obtendo-se os valores das constantes de velocidade enzimática e suas dependências com as concentrações dos pesticidas em solução. / This work describes the development, characterization and utilization of a carbon paste biosensor based in the acetylcholinesterase enzyme for carbamates determinations in foodstuff, as well as the study of rate constants for enzyme/substrate reaction in solution. Stability tests were initially performed for both the substrate and the enzyme. In these tests, the signal for UV-vis adsorption for the substrate shows no inhibition during 11 days while for the enzyme it has been demonstrated that a considerable loss of activity occurs after three days from the solution preparation. In the electrode preparation, some experimental parameters were optimized, such as the amount of enzyme and the content of cobalt ftalocyanine (CoPC) in the electrode, as well as the employed percentage of glutaraldehide. The highest analytical signals were obtained for the addition of 2.40x10-3 g enzyme, 0.90x10-3 g CoPC (related to the massa of 0,017g of carbon paste) and a 1% glutaraldehide solution. The next step was to carry out an experiment based in the inhibition of enzyme activity by the pesticide. For this, the biosensor was immersed in 5.00x10-5 e 1.00x10-4 mol L-1 carbaryl solutions. It was observed that, by increasing the carbaryl concentration, the electrochemical signal of the sensor was inhibited proportionally. This was indicative that the sensor was adequate to be used in carbaryl monitoring and analytical determinations. The analytical determinations of carbamate pesticides were performed in 0.1 mol L-1 phosphate buffer, pH 7,4, with incubation time of 8, 12 and 15 minutes for carbaryl, metomil and aldicarb, respectively. The detection (LD) and quantification (LQ) limits obtained with the biosensor were 2.00x10-6 mol L-1 (0.40 mg L-1) and 6.70 x 10-6 mol L-1 (1.30 mg L-1) for carbaryl, 1.88x10-7mol L-1 (30.45 micro g L-1) and 6.26x10-7 mol L-1 (0.10 mg / L-1) for metomil and 1.10x10-6 mol L-1 (0.20 mg L-1) and 3.60x10-6 mol L-1 (0.70 mg L-1) for aldicarb. For the commercial formulation of metomil, Lannate, LD and LQ obtained were 2.13x10-7 mol L-1 (34.50 microg L-1) and 7.09x10-7 mol L-1(0.12 mg L-1), respectively. The HPLC measurements showed LD and LQ of 1.58x10-8 mol L-1 (3.18micro g L-1) and 5.27x10-8 mol L-1 (10.60 micro g L-1) for carbaryl and 9.02x10-10 mol L-1 (0.15 micro g L-1) and 3.00x10-9 mol L-1 (48.60 micro g L-1) for metomil. Recovering tests were also done with both analytical techniques for carbaryl and Lannate. The obtained recoveries using the biosensor were in the range of 76.83 to 106.67% for carbaryl and 78.00 to 96.50% for Lannate, while using the HPLC, the recoverings were 78.00 a 108.33% for carbaryl and 57.00 to 99.50% for Lannate. The recovering of aldicarb in tomatoes, with HPLC, were 62.40 %. The study of the enzymatic reaction in solution showed that the employed methodology allows to obtain the rate constant values for the rate determining step of the AchE/AchI reaction. It was observed that these rate constant values were strongly dependent in the pesticide concentrations for fenitrothion (organofosforous) and carbaryl (carbamate). At low concentration levels of the pesticide in the electrolyte, all the rate constants showed similar values but, when the pesticide concentration was raised, fenitrothion was found to exert a more powerful inhibition action for the enzyme activity than carbaryl, thus suggesting its higher toxic character. These results showed the development of a possible analytical methodology for quantification of these pesticides, by calculating the rate constant value and its dependence to the pesticide concentration in solution.

Orientador: Valber de Albuquerque Pedrosa / Resumo: O desenvolvimento de novos dispositivos para monitorar o metabolismo celular e o diagnóstico de doenças expandiu as pesquisas com biossensores, que aliados à nanotecnologia possibilitaram a criação de novos elementos com alta sensibilidade de detecção, especificidade e capacidade de multiplexação, mostrando grande potencial para sua aplicabilidade no diagnóstico clínico. O trabalho foi desenvolvido em duas etapas. A primeira, referiu-se no desenvolvimento de uma metodologia para acoplar o aptâmero conjugado com as nanopartículas de ouro sobre o sensor da Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR). Foi utilizado MUA para formação das monocamadas auto-organizadas; ativação dos grupos carboxílicos utilizando solução de EDC/NHS e a imobilização do aptâmero conjugado. Após este processo, foram realizadas as injeções de Mucina Epitelial Polimórfica tipo 1 (MUC1). A segunda etapa, consistiu na mesma metodologia de acoplamento do aptâmero, porém substituindo a MUC1 por sobrenadante da linhagem celular LNCaP (células prostáticas tumorais). Desse modo, foi desenvolvida uma metodologia analítica utilizando aptâmeros e biomarcadores para diagnosticar o Câncer de Próstata (PCa) através da SPR. / Mestre

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2018-02-05T18:15:30Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Catarina Alfaya Moreira.pdf: 3840507 bytes, checksum: 842c5cfecee2c3b039e0c031feb67016 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-05T18:15:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Catarina Alfaya Moreira.pdf: 3840507 bytes, checksum: 842c5cfecee2c3b039e0c031feb67016 (MD5) / As abordagens de Biologia Sintética possuem potencial de aumentar a produção de ferramentas diagnósticas adequadas para utilização na prática, como os biossensores de DNA. O controle dos sistemas biológicos permite o aprimoramento de tecnologias em uso e surgimento de novas tecnologias, como o diagnóstico molecular através da identificação de sequências específicas de DNA. A maioria dos métodos moleculares de diagnóstico de DNA se baseiam em hibridização. Contudo, atualmente, as proteínas ligadoras de DNA tem tido destaque, devido às suas numerosas vantagens. As principais vantagens são a identificação de sequências em DNA dupla-fita, eliminando o passo de desnaturação, e a alta especificidade pelo alvo. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver uma proteína sintética quimérica para aplicação em sistema biossensor de DNA que permitirá rápida identificação de uma sequência específica de DNA de Corynebacterium striatum, um importante patógeno emergente. Foi construída, neste estudo, uma proteína quimérica biossensora composta por: (I) um domínio de ligação ao DNA derivado de proteínas TALEs (proteínas efetoras do tipo ativadores transcricionais) o qual reconhece especificamente uma sequência de 18 pb de um gene único de C.striatum codificador de uma permease para transporte de ferro; combinado a (II) uma cromoproteína tsPurple (Tinsel Purple) para permitir detecção visual da sequência alvo. Para construção do gene codificador da proteína TALE específica, o gene específico de C. striatum foi analisado com a ferramenta Tal Effector Nucleotide Targeter (Cornell University) e uma sequência-alvo de 18pb foi definida. A construção de domínios TAL foi realizada utilizando a ferramenta GeneArtTM Perfect Match TAL (Thermo Scientific); o gene sintético encontra-se clonado no plasmídeo pTALE. Para construir as sequências gênicas quiméricas, foram desenhados primers de PCR para isolamento da sequência da tsPurple com a adição de sítios artificiais de restrição para EcoRI e BamHI; os produtos de PCR digeridos foram clonados no plasmídeo pTALE, downstream à sequência da TALE específica. Essas sequências fusionadas foram então sub-clonadas em um vetor de expressão pDESTTM17, através de recombinação utilizando tecnologia Gateway para expressão das proteínas quiméricas. A expressão da proteína quimérica foi induzida pela adição de 1mM de IPTG. A expressão da proteína quimérica foi confirmada através de análises de SDS PAGE 10% , que demonstraram a superexpressão da proteína esperada de 151kDa; além disso, foi observada a forte coloração roxa no precipitado bacteriano, em razão da funcionalidade da cromoproteína TsPurple.

The cholinesterase (ChE) play an important role in the organophosphates and carbamates detection substances that are of high interest for environmental control, because these compounds are present in most pesticides applied to crops. The development of ChE biosensors to detect these contaminants with greater speed, sensitivity and selectivity, has the ability to quantify from a suitable transducer, the reduction of enzyme activity caused by contaminants. This study aimed to purify and characterize AChE of Prochilodus brevis brain for use in electrochemical tests. Gradients of pH, ionic strength and temperature, showed high activities in pH 8,5, 0,08M at ionic strength, 28Cº of temperature optimum and 37ºC of thermal stability for cell-free extract. Was applied salting out method in fractions 0-70% followed by 0-40% of (NH4)2SO4 as a refinement to liquid chromatography. The purification protocol 1 showed specific activity of 1.41 U/mg in 0-70% and 0-40% was 1.94 U/mg. The purification protocol 2, the 0-70% fraction had specific activity of 0.31 U/mg and 0-40% with 1.77 U/mg. After Sephacryl S-200 chromatography, showed specific activity for protocols 1 and 2 of 0,128U/mg and 0.2869 U/mg, respectively. The next stage of the Protocol 2 with DEAE-Sepharose was eluted peak with specific activity of 0.01326 U/mg. In the purification protocol 3, 0-70% have specific activity 0.310 U / mg, followed by 1,774 U/mg in 0-40%. After Sephacryl S-100, was obtain two peaks with a specific activity of 0.194 U/mg (ChE1) and 0.0873 U/mg (ChE2). SDS-PAGE of ChE 1 showed somewhat visible band of approximately 67kDa. Inhibition assays with ChE 1 had higher specificity for BW 284c51. Electrochemical tests with cell-free extract, dialyzed, ChE1 and ChE2, showed thiocholine (TCh) oxidation with better limits of detection and quantification limits for ChE1 and ChE2. The molecular modeling experiments showed favorable results in complex formation ChE-NTCPM. The study showed the isolation of ChE with catalytic activity for both enzymes, AChE and BuChE, with favorable adsorption properties in NTCPM in the development of enzymatic biosensor for environmental monitoring. / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / As colinesterases (ChE) desempenham um papel importante na detecção de organofosforados e carbamatos que são substâncias de alto interesse para o controle ambiental, pois estes compostos estão presentes na maioria dos pesticidas aplicados em lavouras. O desenvolvimento de biossensores a base de ChE para a detecção destes contaminantes com maior rapidez, sensibilidade e seletividade, tem a capacidade de quantificar, a partir de um transdutor adequado, a diminuição da atividade enzimática causada pelos contaminantes. Este trabalho teve como objetivo de purificar e caracterizar AChE de cérebro de Prochilodus brevis para o emprego em testes eletroquímicos. Os gradientes de pH, força iônica e temperatura, mostraram maiores atividades em pH 8,5, força iônica de 0,08M, temperatura ótima 28°C e estabilidade térmica de 37°C para extrato livre de células. Foi aplicado o método de precipitação salina em frações de 0-70% seguido de 0-40% de (NH4)2SO4 como refinamento para cromatografia líquida. O protocolo de purificação 1 apresentou atividade específica de 1,41 U/mg em 0-70%, enquanto 0-40% apresentou 1,94 U/mg. O protocolo de purificação 2, a fração 0-70% teve atividade específica de 0,31 U/mg e 0-40% de 1,77 U/mg. Após a cromatografia de sephacryl S-200 apresentou atividade específica para os protocolos 1 e 2 de 0,128U/mg e 0,2869 U/mg, respectivamente. Na continuidade do protocolo 2 com DEAE-sepharose o pico eluído apresentou atividade específica de 0,01326 U/mg. No protocolo de purificação 3, 0-70% tem atividade específica 0,310 U/mg, seguido de 1,774 U/mg em 0-40%. Após Sephacryl S-100 foi obtido dois picos com atividade específica de 0,194 U/mg (ChE1) e 0,0873 U/mg (ChE2). Eletroforese SDS-PAGE de ChE1 apresentou banda pouco visível de aproximadamente 67KDa. Os ensaios de inibição com ChE1 apresentaram maior especificidade para BW 284c51. Os testes eletroquímicos com extrato livre de célula, dialisado, ChE1 e ChE2, mostraram oxidação de tiocolina (TCh) com melhores limites de detecção e quantificação para ChE1 e ChE2. Os experimentos de modelagem molecular apresentaram resultados favoráveis na formação do complexo ChE-NTCPM. O estudo mostrou o isolamento de ChE com atividade catalítica para as duas enzimas, AChE e BuChE, com propriedades de adsorção favoráveis em NTCPM no desenvolvimento de biossensor enzimático para monitoramento ambiental.

The gold nanoparticles (NPAus) and silver (NPAgs) exhibit a variety of effects and applications in the biomedical field. In this study, silver and gold nanoparticles were synthesized and characterized in order to evaluate its effect on wound healing and sensing eotaxin, an analyte of great relevance to inflammatory events. . In a first case, NPAgs were synthesized by chemical reduction method and dispersed in copaiba oil. It was observed that all NPAgs had spherical shapes and dispersed in copaiba oil. This composition NPAgs more copaiba oil was more effective to heal skin wounds than Dermazine, a reference medicinal product. With gold nanoparticles (NPAu) were synthesized by chemical methods by citrate reduction. Then, these nanostructures are functionalized for making a biosensor, with the purpose of identifying the analyte of choice (eotaxin) by identifying the displacement of the surface plasmon resonance band. The results with this prototype of the great potential of biosensor proved to detection of eotaxin in small quantities 15μL. The particles used in this study were characterized by UV-vis spectroscopy and transmission electron microscopy, while those associated with quartz are characterized with UV-vis spectroscopy and atomic force microscopy. Together, this study revealed the potential installed in UFAL for synthesis, characterization and application in the biomedical field of metal nanoparticles. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As nanopartícula de ouro (NPAu) e de prata (NPAg) exibem uma variedade de efeitos e aplicações na área biomédica. No presente estudo, nanopartículas de prata e ouro foram sintetizadas e caracterizadas com objetivo avaliar seu efeito sobre a cicatrização de feridas e sensoriamento de eotaxina, um analito de grande relevância para eventos inflamatórios. Em um primeiro caso, NPAg foram sintetizadas por método químico de redução, e dispersas em óleo de copaiba. Observou-se que todas NPAg tinham formas esféricas e se dispersaram no óleo de copaiba. Essa composição NPAg mais óleo de copaiba mostrou-se mais eficaz para cicatrizar feridas cutâneas do que a Dermazine, um medicamento de referência. Com as nanopartículas de ouro (NPAu) foram sintetizadas por método químico de redução por citrato. Em seguida, estas nanoestruturas foram funcionalizadas para confecção de um biossensor, com finalidade de identificar o analito de escolha (eotaxina) por meio da identificação do deslocamento da banda de ressonância de plasmon de superfície. Os resultados com este prótotipo do biosensor se mostraram de grande potencial para deteccção da eotaxin em pequenas quantidades 15µL. As partículas utilizadas neste estudo foram caracterizadas por espectroscopia de UV-vis e microscopia eletrônica de transmissão, enquanto que aquelas associadas ao quartzo são caracterizadas com espectroscopia UV-vis e microscopia de força atômica. Em conjunto, este estudo revelou o potencial instalado na UFAL para síntese, caracterização e aplicação na área biomédica de nanopartículas metálicas.