Orientador: Jorge Fernando Brandão Pereira / Coorientador: Valéria de Carvalho dos Santos Ebinuma / Banca: João Vitor Dutra Molino / Banca: Marcel Otavio Cerri / Resumo: A proteína verde fluorescente (GFP, do inglês Green Fluorescent Protein) é um biomarcador utilizado na produção de proteínas de fusão, amplamente empregado in vivo e in vitro. Este trabalho avaliou a produção da GFP expressa em Escherichia coli BL21 (DE3) [pLysS; pET28(a)] em mesa incubadora rotativa e biorreator, e sua posterior extração utilizando Sistemas Micelares de Duas Fases Aquosas (SMDFA). Na etapa de produção em mesa incubadora rotativa, estudou-se a influência da taxa de agitação, tempo de indução e concentração do composto indutor, isopropil-β-1-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG), sobre a produção da GFP, e apenas a variação da taxa de agitação e o tempo de indução alteraram a produção de GFP. A melhor produção de GFP (314,59 mg/L) foi obtida a 30°C após 22 h de cultivo a uma agitação de 150 rpm, induzindo com 0,5 mM de IPTG realizada 10 h após o início do cultivo (meio da fase exponencial de crescimento). Posteriormente, avaliou-se menores concentrações de IPTG (0,25; 0,125 mM) na produção de GFP e observou-se que os níveis de produção foram mantidos. Estes estudos iniciais, foram a base para as condições empregadas em biorreator tanque agitado, que operou no modo batelada a uma agitação de 200 rpm, aeração de 2 vvm (volume de ar/ volume de meio) e indução com 0,125 mM de IPTG após 6 h de cultivo. Nas condições citadas, obteve-se apenas uma produção de 128,13 mg/L de GFP, desse modo, apesar da potencialidade da ampliação de escala na produção desta biomolécula, estud... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Green Fluorescent Protein (GFP) is a in vivo and in vitro biomarker widely used in the production of fusion proteins. This work evaluated the production of GFP expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) [pLysS; pET28 (a)] in shaker and bioreactor, and its subsequent extraction using Aqueous Micellar Two-Phase Systems (AMTPS). The influence of the agitation rate, induction time and concentration of the inductor, isopropyl-β-1-D-thiogalactopyranoside (IPTG), on GFP production, was studied using a shaker. The results shown that only the agitation rate and the induction time have affect the GFP production. The best GFP production (314.59 mg/L) was obtained at 30°C after 22 h of culture at 150 rpm, induced with 0.5 mM IPTG after 10 h after of the start of cultivation (at half of exponential growth). Subsequently, lower IPTG concentrations (0.25, 0.125 mM) were evaluated for the GFP production, being maintained the production levels. From these conditions, a cultivation using agitated tank bioreactor was then carried out. The bioreactor operated in batch mode at 200 rpm with a 2 vvm aeration (air volume / volume of medium), being the GFP production induced with 0.125 mM IPTG after 6 h of microorganism' growth. Under that conditions, a production of 128.13 mg/L of GFP was obtained. Thus, despite the potential of scale-up in the production of this biomolecule, further studies are still required. After the GFP production studies, the bacterial cells were disrupted using continuous freezing / thawing cycles. GFP recovered from the cell lysate was then used to perform stability studies at different pHs (3 - 12) and temperatures (25°, 37° and 50°C). The stability studies shown that GFP was stable between pHs 7 to 11 and at temperatures of 25°C and 37°C, but not stable at a temperature of 50°C. Afterwards, liquid-liquid extraction... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Valber de Albuquerque Pedrosa / Resumo: O câncer de próstata é uma das principais causas de mortalidade masculina. Na atualidade, a detecção do câncer depende fortemente de métodos tradicionais baseados na análise da morfologia celular por meio de biopsias e análise do tecido. Por isso, o desenvolvimento de novos dispositivos para monitorar o metabolismo celular no diagnóstico de doenças é necessário. Atualmente pesquisas utilizando biossensores para esta finalidade possibilitaram a criação de novos dispositivos com alta sensibilidade de detecção, especificidade e capacidade de multiplexação em dispositivos portáteis para uso em diferentes áreas. Aqui iremos abortar o monitoramento dos produtos secretados por células cancerígenas utilizando biossensores. O trabalho se desenvolveu em duas frentes de pesquisa para o estudo dos compostos liberados por células cancerígenas. A primeira tratou-se de uma plataforma de biossensor integrada para monitorar a detecção de multi-analitos (glicose, lactato, superóxidos e peróxido de hidrogênio) onde o microambiente celular pode ser definido com precisão. O biossensor eletroquímico para detecção de glicose, lactato e superóxidos se baseou na utilização do hidrogel de polietileno glicol (PEG) acoplado com as enzimas: glicose oxidase (GOX), lactato desidrogenase (LOX) e superóxido dismutase (SOD) e ferroceno (Fc) como par redox utilizado nas análises eletroquímicas, em adição, a enzima peroxidase (HRP) foi conjugada com nanopartículas de ouro (par redox nas análises eletroquímicas)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

OLIVEIRA, Thiago Mielle Brito Ferreira. Biossensores Enzimáticos para Detecção e Quantificação de Carbamatos em Amostras de Alimentos. 2013. 132 f. Tese (Doutorado em química)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2013. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-06-03T17:51:56Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_tmbfoliveira.pdf: 3146756 bytes, checksum: dd6ca8c6563502962d82fee708c73bb2 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-20T20:40:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_tmbfoliveira.pdf: 3146756 bytes, checksum: dd6ca8c6563502962d82fee708c73bb2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-20T20:40:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_tmbfoliveira.pdf: 3146756 bytes, checksum: dd6ca8c6563502962d82fee708c73bb2 (MD5) Previous issue date: 2013 / This work contemplates three strategies for carbamate pesticides (CBM) biosensing in natural food, using polyphenoloxidases based biosensors as analytical device: (i) carbon nanotubes paste electrode (CNPE) modified with laccase from Tramites versicolor (LACC), namely as LACC-CNPE; (ii) graphene paste electrode (GPE) modified with Prussian Blue films (PB), followed by the LACC immobilization by drop coating, namely as LACC/PB/GPE; and (iii) GPE modified by the electrodeposition of a hybrid film composed for chitosan (CS), gold nanoparticles (AuNp) and a mixing of LACC and tyrosinase from Agaricus bisposrus (TYR), namely as LACC-TYR-AuNp-CS/GPE. Based on 4-aminophenol (4-AMP) redox process, the presence of carbon nanotubes and graphene allowed several advantages to the devices, such as: increase of the peak currents values, catalysis of the redox process, improvement of the reversibility and electronic-transfer kinetic. PB films (direct enzymatic immobilization without cross-linking reagent), CS (suitable biocompatibility, higher immobilization and fixation of the enzymes) and AuNp (reduction of the charge-transfer resistance) also showed important role on biosensors electrodic configuration. Analytical curves were constructed by square-wave voltammetry, based on CBM (carbofuran, carbaryl, formetanate, pirimicarb, propoxur and ziram) capability to inhibit the polyphenoloxidase activity. In general, the proposed procedures had sensitivity (detection limits ranging from 0.001 to 0.093 mg kg-1) in compliance with the maximum limit established by Brazilian and European food surveillance and control agencies for the analysis of CBM residues in vegetable crops (tomato, lettuce and potato) and citrus fruits (orange, tangerine and lemon), with negligent interfering effect. Recuperation experiments were carried out with QuEChERS extracts of the samples, allowing recuperation values from 91.0 ± 0.1% to 101.1 ± 0.1%; for spiking levels from 0.01 to 3.14 mg kg-1. Thus, LACC-CNPE, LACC/PB/GPE and LACC-TYR-AuNp-CS/GPE are promisor tools for CBM analysis in food matrices. / Este trabalho contempla três estratégias para o biossensoriamento de pesticidas da classe dos carbamatos (CBM) em alimentos naturais, utilizando biossensores à base de polifenoloxidases como dispositivos analíticos: (i) eletrodo de pasta de nanotubos de carbono (EPNC) modificado com lacase de Tramites versicolor (LAC) por entrapment da enzima diretamente no material compósito, definido como LAC-EPNC; (ii) eletrodo de pasta de grafeno (EPG) modificado com filmes de Azul da Prússia (AP), seguido da imobilização de LAC por drop coating, definido como LAC/AP/EPG; e (iii) EPG modificado por eletrodeposição de filme híbrido composto por quitosana (CS), nanopartículas de ouro (NpAu) e mistura das enzimas LAC e tirosinase de Agaricus bisporus (TIR), definido como LAC-TIR-NpAu-CS/EPG. Tomado por base o processo redox do substrato 4-aminofenol (4-AMF), a presença dos nanotubos de carbono e do grafeno proporcionou uma série de vantagens aos dispositivos, a saber: aumento nos valores de corrente de pico, catálise do processo redox, melhoria na reversibilidade e, consequentemente, na cinética de transferência eletrônica. Filmes de AP (imobilização direta da enzima sem a necessidade de regente para cross-linking), CS (biocompatibilidade adequada, maior imobilização e fixação das enzimas) e NpAu (redução da resistência a transferência de carga) também apresentaram importante papel na configuração eletródica dos biossensores. As curvas analíticas foram construídas por voltametria de onda quadrada, baseando-se na capacidade dos CBM (carbofurano, carbaril, formetanato, pirimicarbe, propoxur e ziram) de inibir a atividade das polifenoloxidases. Em geral, os procedimentos propostos apresentaram sensibilidade (limites de detecção variando de 0,001 a 0,093 mg kg-1) que contempla os limites máximos estabelecidos pelas agências de segurança e controle alimentar brasileira e europeia para resíduos de CBM em hortaliças (tomate, alface e batata) e frutas cítricas (laranja, tangerina e limão), com baixo nível de interferentes. Os ensaios de recuperação foram realizados em extratos QuEChERS das amostras, com porcentagens de recuperação variando de 91,0 ± 0,1% a 101,10 ± 0,1%; para contaminações de 0,01 a 3,14 mg kg-1. Portanto, LAC-EPNC, LAC/AP/EPG e LAC-TIR-NpAu-CS/EPG podem ser ferramentas promissoras na análise de CBM em matrizes alimentares.

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-05Bitstream added on 2015-05-14T16:59:06Z : No. of bitstreams: 1 000826915_20151206.pdf: 375653 bytes, checksum: adf2f78838ae81a4890f0a8019e9a279 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-12-07T09:44:40Z: 000826915_20151206.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-07T09:45:18Z : No. of bitstreams: 1 000826915.pdf: 1970838 bytes, checksum: 21816dd741b5f8f0d7c95dc3e252725a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Rede Nanobiotec / A cisticercose bovina é uma zoonose cosmopolita e presente nos rebanhos bovinos de corte no Brasil, que ocorre em países em desenvolvimento, onde a infraestrutura sanitária inadequada e as más práticas na criação de gado permitem a contaminação de pastagem e água com fezes humanas contendo ovos do parasita. Os prejuízos financeiros decorrem da condenação ou tratamento (salga ou da congelação) das carcaças infectadas, dependendo da intensidade da infecção. O diagnóstico da cisticercose bovina é realizado durante o abate, pela inspeção das carcaças e realização de cortes em locais de predileção do parasita como a língua, masseter, coração e diafragma. Assim, a fim de promover o diagnóstico ante-mortem e permitir o tratamento adequado de animais infectados, muitos estudos foram realizados utilizando-se técnicas de detecção de anticorpos ou antígenos em amostras de soro bovino. O teste ELISA baseado em anticorpos monoclonais (MAbs) para a detecção de antígeno circulante (Ag-ELISA) tem sido estudado, mas apresenta baixa sensibilidade em animais com infecção leve, e permite a sua realização apenas em laboratórios bem equipados. O uso de biossensores em medicina tem crescido nos últimos anos, permitindo a detecção e quantificação de metabólitos, bem como o uso de diversos biopolímeros como matriz de imobilização como quitosana e fibroína da seda. Imunossensores são biossensores cuja resposta bioquímica relaciona-se à interação antígeno-anticorpo, que podem ser utilizados para detectar anticorpos ou antígenos, tendo sido utilizados no diagnóstico de enfermidades. Nesta pesquisa, desenvolveu-se o primeiro imunossensor para o diagnóstico da cisticercose bovina, com filmes produzidos camada por camada (LbL) contendo um MAb dirigido contra antígeno bruto de metacestódeos de T. saginata (TAEB) e fibroína de seda (SF), imobilizados, que mostrou-se promissor ... / Bovine cysticercosis is a cosmopolitan zoonosis and very widespread in the Brazilian beef cattle. Cysticercosis usually occurs in developing countries, where poor sanitation and bad raising cattle practices allows the contamination of the pasture and water with human feces containing eggs. The financial losses are due to condemnation or treatment (salting or freezing) of infected carcasses, depending on the intensity of infection. Diagnosis of bovine cysticercosis is routinely done during slaughter by meat inspection of carcasses and incisions in predicted sites of muscles such as tongue, masseter, heart and diaphragm. Thus, in order to promote the ante-mortem diagnosis and allow appropriate treatment of infected animals, many studies have been performed using techniques to detect antibodies or antigens in bovine serum. ELISA using monoclonal antibodies (MAbs) for the detection of circulating antigen (Ag-ELISA) has been studied, but presents low sensitivity in animals with low parasite burden, and allows its realization only in well-equipped laboratories. The use of biosensors in medicine has grown in recent years, allowing detection and quantification of numerous metabolites, such as immobilization matrix having the most diverse biopolymers such as chitosan and silk fibroin. Immunosensors are biosensors which biochemical response is related to antigen-antibody interaction and can be used to detect antibodies or antigens, and has been tested for diseases diagnosis. In this research, we developed the first immunosensor for bovine cysticercosis diagnosis, produced with layer-by-layer (LbL) films containing a monoclonal antibody against crude Taenia saginata metacestode antigens (TAEB) and silk fibroin (SF) immobilized. Immunosensor showed to be a promising tool for further application in the ante-mortem bovine cysticercosis diagnosis

Made available in DSpace on 2015-07-13T12:10:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-13T12:25:39Z : No. of bitstreams: 1 000835304_20160227.pdf: 212015 bytes, checksum: 4239a29974e7283099c5644a6d4c1cab (MD5) Bitstreams deleted on 2016-02-29T12:16:25Z: 000835304_20160227.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-29T12:17:24Z : No. of bitstreams: 1 000835304.pdf: 777267 bytes, checksum: b62e29e562e8912b4690345d42ebc6e1 (MD5) / O diagnóstico precoce desempenha um papel importante no sucesso do tratamento da maioria das doenças. O desenvolvimento de dispositivos label free aliados às técnicas eletroanalíticas permite o desenvolvimento de métodos rápidos e de baixo custo para avaliar o estágio de doenças e/ou a eficácia do tratamento. Biossensores redox capacitivos foram recentemente introduzidos como uma plataforma de ensaios eletroanalíticos com grande potencial para o desenvolvimento deste tipo de dispositivo. No presente trabalho foram sintetizados peptídeos marcados com uma sonda redox, no caso o ferroceno (fc), capazes de formarem monocamadas auto-organizadas em interfaces metálicas, para utilização em ensaios de diagnósticos. Os peptídeos de sequências: Ac-Cys-Ala-Ala-Lys(fc)-Ala-Ala-COOH e Fc-Lys-Ala-Ala-Cys-NH2, foram sintetizados em fase sólida de modo que: 1) a cadeia lateral do resíduo de cisteína foi ligada covalentemente ao eletrodo de ouro (grupo enxofre); 2) a extremidade C-terminal ou a cadeia lateral do resíduo de Lys foram responsáveis, individualmente, pelo acoplamento do anticorpo anti-CRP; 3) a cadeia lateral do resíduo de Lys ou a extremidade N-terminal foram utilizadas, individualmente, para fixar o grupo ferroceno na cadeia peptídica. Apesar das sínteses terem mostrado dificuldade, os peptídeos puderam ser obtidos com sucesso. Após a fixação do peptídeo contendo ferroceno ao ouro, o anticorpo, que identifica a proteína C-reativa, foi acoplado ao sistema. A proteína C-reativa é importante, pois age como um biomarcador de processos inflamatórios e doenças cardiovasculares. Técnicas eletroquímicas como voltametria cíclica, espectroscopia de impedância e capacitância eletroquímica foram utilizadas para a caracterização do sistema e para a determinação da ligação da proteína ao anticorpo. O sistema desenvolvido utilizando a capacitância foi eficaz... / Early diagnosis plays an important role in the successful treatment of diseases. The development of label free devices, coupled with the electroanalytical techniques allows the development of low cost and fast methods for evaluating the stage of disease and/or treatment efficacy. Redox capacitive biosensors have recently been introduced as a platform of electroanalytical assays with great potential for the development of this type of device. In this study peptides labeled with a redox probe, in the case ferrocene (fc), were synthesized capable to form self-assembled monolayers on metal interfaces for use in diagnostic assays. The sequences of peptides: Ac-Cys-Ala-Ala-Lys(fc)-Ala-Ala-Fc-COOH and Lys-Ala-Cys-NH2 were synthesized on solid phase: 1) the side chain of the cysteine residue is covalently bound to the gold electrode (sulfur group); 2) the C-terminal or side chain of Lys accounted individually by coupling the anti-CRP; 3) the side chain of Lys or the N-terminal were used individually to fix the ferrocene group in the peptide chain. Despite the syntheses have shown difficulty, the peptides were successfully obtained. After peptide attachment to gold containing ferrocene, the antibody which identifies C-reactive protein, was attached to the system. C-reactive protein is important because it is a biomarker of inflammation and cardiovascular disease. Electrochemical techniques such as cyclic voltammetry, electrochemical impedance and capacitance spectroscopy were used to characterize the system and determinate the protein binding to the antibody. The system was developed using the capacitance to detect C-reactive protein, detection limits of 0.8 nmol L-1 and 0.31 nmol L-1 were found for the peptides Ac-Cys-Ala-Ala-Lys(fc)-Ala-Ala-Fc-COOH and Fc-Lys-Ala-Ala-Cys-NH2, respectively, and stable redox capacitive signal. Thus, the number of amino acids that forms the monolayer has shown a correlation...

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-06-06Bitstream added on 2014-11-10T11:57:27Z : No. of bitstreams: 1 000790893.pdf: 3580842 bytes, checksum: 8e21b24ec71bb11cfd19592e7dce78a6 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O intuito desta pesquisa foi caracterizar eletrodos quimicamente modificados (EQM) pela formação de monocamadas auto-organizadas (SAM) com os tióis (11- mercaptoundecil)-N’,N’’,N’’’-trimetilamônio e 6-(ferrocenil)hexanotiol sobre a superfície do eletrodo de ouro. E, ainda, verificar seu comportamento de transferência eletrônica com solução de hexacianoferrato(II) e (III) e sua aplicação como biossensor para glicose. As monocamadas auto-organizadas vêm sendo comumente usadas devido ao seu comportamento homogêneo, o que confere ao eletrodo maior sensibilidade e reprodutibilidade, tornando-se possível desenvolver eletrodos para vários fins e aplicações. Neste trabalho, foram estudadas as monocamadas formadas a partir dos tióis (11-mercaptoundecil)-N’,N’’,N’’’- trimetilamônio e 6-(ferrocenil)hexanotiol. A caracterização eletroquímica e morfológica das monocamadas auto-organizadas foi realizada através da voltametria cíclica e microscopia eletrônica de varredura, respectivamente. Foi notado que as monocamadas mistas na proporção (1:2) apresentaram maior efeito catalítico, uma vez que se obtiveram maiores sinais analíticos, através do incremento das correntes anódicas e catódicas. A viabilidade da molécula de hexacianoferrato (III) foi verificada através da troca iônica destas moléculas eletroativas com as monocamadas auto-organizadas. Para a aplicação dos eletrodos modificados com monocamadas como biossensor para glicose, optou-se pela modificação na proporção (1:2) de (11-mercaptoundecil)-N’,N’’,N’’’-trimetilamônio e 6- (ferrocenil)hexanotiol, respectivamente, assim como a utilização do mediador hexacianoferrato pré-concentrado por troca iônica durante 2 horas, em virtude que, neste tempo ocorreu uma maior concentração de espécies eletroativas sobre a superfície do ouro, tendo como favorecido o processo de transferência eletrônica. A construção do biossensor .. / The purpose of this research was to characterize chemically modified electrodes (CME) by the formation of self-assembled monolayers (SAMs) with thiols (11- mercaptoundecyl)-N’,N’’,N’’’trimethylammonium and 6-(ferrocenyl)hexanethiol on the surface of gold electrode. And also verify their behavior of electron transfer in solution with hexacyanoferrate (II) and (III) and its application as a biosensor for glucose. The self-assembled monolayers have been commonly used due to its homogenous, which gives the electrode higher sensitivity and reproducibility, becoming possible to develop electrodes for various purposes and applications. In this research, it was studied the monolayers formed from the thiols (11-mercaptoundecyl)- N’,N’’,N’’’trimethylammonium and 6-(ferrocenyl)hexanethiol. Electrochemical and morphological characterization of self-assembled monolayers were performed using cyclic voltammetry and scanning electron microscopy, respectively. The electrochemical characterization of the different SAMs under study occurred in a solution of 0.10 mol L-1 hexacyanoferrate(II) and (III) potassium, verifying the electronic transfer mechanisms involved. It was noted that the self assembled monolayers in proportion (1:2) showed higher catalytic effect, since obtained higher analytical signals by increasing the anodic and cathodic currents. The viability of the hexacyanoferrate (III) molecule was verified by ion exchange these electroactive molecules with self-assembled monolayers. For the application of electrodes modified with monolayers as a biosensor for glucose, we opted for the change in the ratio (1:2) of (11-mercaptoundecyl)-N’,N’’,N’’’trimethylammonium and 6- (ferrocenyl)hexanethiol, respectively, as well as the use of pre-concentrated by ion exchange mediator hexacyanoferrate for 2 hours, because that, this time there was a greater concentration of electroactive species on the surface of gold having favore / FAPESP: 12/21703-7

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-09-26Bitstream added on 2015-03-03T12:07:20Z : No. of bitstreams: 1 000810636_20150926.pdf: 759916 bytes, checksum: d4b5292c2aac0b9890748c7d6629af0f (MD5) Bitstreams deleted on 2015-09-28T16:42:47Z: 000810636_20150926.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-28T16:43:42Z : No. of bitstreams: 1 000810636.pdf: 1721873 bytes, checksum: 20210132a4c05e6c94ac03533459759a (MD5) / A dengue é uma doença infecciosa, não contagiosa, causada por um Flavivirus, transmitido pela picada do mosquito Aedes aegypti infectado. Sua evolução é rápida, o diagnóstico é baseado em sintomas clínicos imprecisos e laboratorial demorado e inespecífico, o tratamento é paliativo, trata-se os sintomas e não a infecção. Neste contexto, a proteína NS1, glicoproteína não estrutural do vírus da dengue, tem sido utilizada comercialmente como alvo para diagnóstico, pelo método ELISA. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um biossensor eletroquímico para diagnóstico da dengue baseado na detecção da proteína NS1, por técnica impedimétrica e capacitiva. Pela técnica impedimétrica, monocamadas auto-organizadas de alcanotióis, sobre os eletrodos de ouro, formadas pelo ácido 11-mercaptoundecanóico e 6-mercapto-1-hexanol foram usadas para ancorar o anticorpo anti-NS1 e minimizar o impedimento estérico entre as proteínas, respectivamente. Esta camada funcionalizada e sua interação com o analito, proteína NS1, geram um bloqueio para reações redox da espécie eletroativa [Fe+2(CN)6]4-/Fe+3(CN)6]3- contidas na solução de PBS, resultando em um aumento da resistência a transferência de carga em função da concentração do analito alvo. Para a abordagem capacitiva, foram utilizados os alcanotióis ácido 16-mercaptohexadecanoico e 11-ferrocenil-undecanotiol sobre o eletrodo de ouro para ancorar o anticorpo anti-NS1 e as medidas foram realizadas em TBAClO4 dissolvido em acetonitrila. Nesta técnica, esta camada funcionalizada e sua interação com o analito, proteína NS1, geram uma variação do sinal de capacitância redox ( ). Por Espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE) e Voltametria Cíclica (CV), pôde-se verificar que a capacidade impedimétrica à transferência de carga foi gradativamente aumentada pela construção da monocamada, imobilização do anticorpo... / Dengue is a non-contagious infectious disease caused by a Flavivirus transmitted by a bite of infected mosquito Aedes aegypti. The evolution is fast, the diagnosis is based on clinical symptoms inaccurate and prolonged and nonspecific laboratory, the treatment is palliative, is treated the symptoms and not the infection. In this context, NS1 protein, nonstructural glycoprotein of dengue virus has been used commercially as a diagnostic target by ELISA. The aim of this study was to develop an electrochemical biosensor for dengue diagnosis based on the detection of this protein, by impedimetric and capacitive technique. Through impedimetric technique, self-assembled monolayers of alkanethiols on gold electrodes formed by 11-mercaptoundecanoic acid and 6-mercapto-1-hexanol were used to anchor the anti-NS1 antibody and minimize steric hindrance between the proteins, respectively. This functionalized layer and its interaction with the analyte, the NS1 protein, generate a lock for redox reactions of electroactive species [Fe+2(CN)6]4-/Fe+3(CN)6]3- contained in the PBS solution, resulting in an increase in charge transfer resistance due to the concentration of the target analyte. For capacitive approach, alkanethiols acid 16-mercaptohexadecanoico and 11-ferrocenyl-undecanotiol on gold electrode were used to anchor the anti-NS1 antibody and measurements were performed in TBAClO4 dissolved in acetonitril. In this technique instead of a steric hindrance, this functionalized layer and its interaction with the analyte, the NS1 protein, generate a variation of signal redox capacitance ( ). Initially ELISA test was performed to verify and confirm the specificity of interaction anti-NS1 by NS1. Through Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and cyclic voltammetry (CV) can be verified that impedimetric ability to transfer load was gradually increased by the construction of the monolayer, immobilization of...

Orientador: Ivana Cesarino / Abstract: A new biosensor was developed by a simple electrocodeposition of reduced graphene oxide (rGO), polypyrrole (PPy) and the enzyme acetylcholinesterase (AChE) on surface of platinum (Pt) electrode. In potential range of -0.2 to +0.5 V vs. Ag/AgCl/KCl (3.0 mol L-1), using differential pulse voltammetry (DPV), it was observed a process in + 0.1 V and this corresponds to the dimerization of electrochemical oxidation products of thiocholine, resulting in ditio-bis-choline. The biosensor developed was evaluated using DPV in the analysis of carbaryl, which inhibits the AChE enzyme action. The best results achieved were with the followings optimized conditions: 75 mV pulse amplitude, step potential of 4 mV, and a phosphate buffer solution (PBS) 0.2 mol L-1 and pH 6.0. Using these parameters was observed a linear response to carbaryl in a range of 0.1 to 0.5 µmol L-1, with a detection limit of 11.6 nmol L-1 (2.3 µg/kg), which is an appropriate limit for determination of carbaryl in the cultures which these pesticide is applied, considering the maximum reside limit allowed by Brazilian legislation. The biosensor proposed, Pt/rGO/PPy/AChE, was applied successfully in the determination of carbaryl in samples of cabbage and tomato. / Resumo: Um novo biossensor foi desenvolvido baseado na simples eletrocodeposição do óxido de grafeno reduzido (rGO), polipirrol (PPy) e da enzima acetilcolinesterase (AChE) na superfície do eletrodo de platina (Pt). No intervalo de potencial -0,2 a +0,5 V vs. Ag/AgCl/KCl (3,0 mol L-1), utilizando voltametria de pulso diferencial (DPV), observou-se um processo em +0,1 V e este corresponde a dimerização dos produtos de oxidação eletroquímica da tiolcolina, formando ditio-bis-colina. O biossensor desenvolvido foi avaliado utilizando DPV na análise do pesticida carbaril, o qual inibe a ação da enzima AChE. Os melhores resultados obtidos foram com as seguintes condições otimizadas: 75 mV amplitude de pulso, incremento de potencial de 4 mV, e uma solução tampão fosfato (PBS) 0,2 mol L-1 pH 6,0. Usando tais parâmetros observou-se uma resposta linear para o carbaril no intervalo de 0,1 a 0,5 mol L-1, com um limite de detecção de 11,6 nmolL-1 (2,3 µg/kg), que é um limite adequado para determinar carbaril nas culturas em que este pesticida é aplicado considerando o limite máximo de resíduo permitido pelas legislações brasileiras. O biossensor proposto, Pt/rGO/PPy/AChE, foi aplicado com sucesso na determinação de carbaril em amostras de tomate e repolho. / Mestre

Submitted by Aelson Maciera (aelsoncm@terra.com.br) on 2017-05-11T17:29:15Z No. of bitstreams: 1 TeseTAN.pdf: 1864712 bytes, checksum: 75782f61cc6526aa709949101798707e (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-18T20:22:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseTAN.pdf: 1864712 bytes, checksum: 75782f61cc6526aa709949101798707e (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-18T20:22:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseTAN.pdf: 1864712 bytes, checksum: 75782f61cc6526aa709949101798707e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-22T20:17:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseTAN.pdf: 1864712 bytes, checksum: 75782f61cc6526aa709949101798707e (MD5) Previous issue date: 2016-06-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Bovine babesiosis and anaplasmosis are distinct diseases, which constitute the syndrome called tick fever, characterized by infection of red blood cells. Its distribution in herds causes the reduction in productivity and high economic losses to livestock worldwide. Anaplasma marginale, Babesia bovis, and Babesia bigemina are the predominant species in Brazil. Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the biological vector of babesiosis and anaplasmosis may be transmitted by ticks, hematophagous flies, and fomites. It is known that the water buffalo can become infected with Babesia and Anaplasma, but little is known the extent of the infection and how it affects the health of these animals. Thus, the present study aimed to determine the frequency and the level of infection by B. bovis, B. bigemina and A. marginale in 108 water buffalo (50 calves and 58 adult females), naturally infested with the tick R. (B). microplus raised in farms located in areas of endemic stability in São Paulo state. From each animal, a blood sample from the jugular vein was taken for DNA extraction and packed cell volume (PCV) determination. Samples from auricular vessels were taken for blood smears. The body temperature was measured with a mercury thermometer column. Electrochemical impedance spectroscopy technique was used to differentiate the serum of uninfected animals from the serum of animals infected with B. bovis. To this end, antigens derived from culture were immobilized on gold electrodes (150 nm thick) to give a biosensor device using the compound [Fe (CN) 6] 3- / 4-proof redox. The peripheral blood smears were stained with May-Grunwald-Giemsa for research of hemoparasites by optical microscopy. DNA extractions were performed using the Easy DNA TM Kit (Invitrogen). DNA amplification protocols were tested with primers specific to B. bigemina, B. bovis, and A. marginale using nested PCR (nPCR) and quantitative real-time PCR (qPCR). qPCR was used to estimate the number of copies of the gene cytochrome b (mt-cytB) of both babesias and Anaplasma msp 1b gene in all samples. Merozoites of B. bigemina were seen in blood smears of three calves from the Alambari herd (all less than 0.1 of parasitemia). Molecular techniques, nPCR, and qPCR, were more sensitive in the detection of parasites that direct examination of the blood smears and the frequencies of infection were 20:37% and 100% for B. bovis and 59.26% and 100% to B. bigemina, respectively. CN of the mt-cytB gene of B. bovis and B. bigemina showed significant effects (p <0.05) of herd age, species, and their interaction. The CN values were higher (p≤0.05) for B. bovis (2.81 ± 0:07) when compared to B. bigemina (2.61 ± 12:07) and A. marginale (0:57 ± 0:07). These data suggest a high frequency of infection by B. bovis and B. bigemina in the population of water buffalo studied. Preliminary testing of diagnosing infection with B. bovis device showed changes in the impedance in the system used and clearly demonstrated that the biosensor can detect infected animals, which can be exploited for rapid detection of B. bovis infections and also extended for the test to other parasites. / A babesiose e anaplasmose bovina são enfermidades distintas, que constituem o complexo chamado de Tristeza Parasitária Bovina (TPB), caracterizada por infecção das células vermelhas do sangue. Sua distribuição nos rebanhos ocasiona redução na produtividade e grandes perdas econômicas para a pecuária mundial. Anaplasma marginale, Babesia bovis e Babesia bigemina são as espécies prevalentes no Brasil. O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o vetor biológico das babesioses, e a anaplasmose, além do carrapato pode ser transmitida por moscas hematófogas ou fômites. Sabe-se que, os búfalos podem se infectar com os agentes da TPB, porém pouco é conhecido a extensão dessa infecção e como ela afeta a saúde desses animais. Assim o presente estudo teve o objetivo de determinar a frequência e o nível de infecção por B. bovis, B. bigemina e A. marginale em 108 búfalos d’água (50 bezerros e 58 fêmeas adultas), naturalmente infestados com o carrapato R. (B). microplus, oriundos de fazendas localizadas em áreas endêmicas para as babesioses no estado de São Paulo. Foram colhidas amostras de sangue dos capilares auriculares para confeccção de esfregaços em lâminas de vidro e sangue da veia caudal para extração de DNA e determinação do volume globular (VG) pela técnica do microhematócrito. A técnica de espectroscopia de impedância eletroquímica foi realizada com o soro dos bovinos, com o objetivo de diferenciar animais saudáveis dos animais infectados com B. bovis. Para tanto, antígenos provenientes de cultura foram imobilizados em eletrodos de ouro (150 nm de espessura) dando origem a um dispositivo biossensor utilizando o composto [Fe (CN)6]3-/4-como prova redox. Os esfregaços de sangue periférico foram corados com May Grunwald-Giemsa para a pesquisa dos hemoparasitas por meio de microscopia óptica. As extrações de DNA foram feitas usando o Easy-DNATM Kit (Invitrogen). Foram testados protocolos de amplificação do DNA com primers específicos para B. bigemina, B. bovis e A. marginale por meio de Nested PCR (nPCR) e PCR em tempo real quantitativo (qPCR), usado para estimar o número de cópias (NC) do gene do citocromo b (mt-cytB) de ambas as babesias e do gene de superfície 1b (msp1b) de Anaplasma em todas as amostras. Foram visualizados merozoítas de B. bigemina nos esfregaços sanguíneos de três bezerros do rebanho de Alambari (todos com menos de 0,1 de parasitemia). As técnicas moleculares, nPCR e qPCR foram mais sensíveis para a detecção dos parasitas que o exame direto das lâminas, sendo que as frequências de infecção foram de 20.37% e 100% para B. bovis e 59.26% e 100% para B. bigemina, respectivamente. O NC do gene do mt-cytB de B. bovis e B. bigemina mostrou efeitos significativos (p<0.05) para rebanho-idade, espécies e sua interação. Os valores de NC foram superiores (p≤0.05) para B. bovis (2.81 ± 0.07) quando comparado a B. bigemina (2.61 ± 0.07) e A. marginale (0.57 ± 0.07). Estes dados sugerem uma elevada frequência de infecção por B. bovis e B. bigemina na população de búfalos estudada. Os testes preliminares do dispositivo de diagnóstico da infecção por B. bovis mostraram alterações na impedância do sistema usado e evidenciaram claramente que o biossensor é capaz de diferencia/detectar os animais infectados, podendo ser explorado para a detecção rápida da B. bovis e estendido também para a detecção de outros parasitas.

Made available in DSpace on 2016-08-12T18:48:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-28. Added 1 bitstream(s) on 2016-08-12T18:51:01Z : No. of bitstreams: 1 000854402.pdf: 1252402 bytes, checksum: 39240062d51578fcff0dfe01d1f5a15f (MD5) / A construção de filmes pela técnica layer-by-layer com fibroína de seda (SF) e amiloide β de 40 aminoácidos (Aβ40) para aplicação em imunossensores eletroquímicos e ópticos foi investigada. O crescimento desses filmes foi confirmado por voltametria cíclica (VC) pela área dos voltamogramas e também por espectroscopia na região ultravioleta-visível (UV-vis) pela absorbância do filme em 230 nm. O recobrimento completo do eletrodo pela SF foi verificado por VC utilizando solução de ferri/ferrocianeto de potássio. A distorção dos voltamogramas foi observada com maior tempo de adsorção e o tempo de 30 minutos foi considerado como cobertura completa do eletrodo. Também foi verificada uma mudança de estrutura do peptídeo em filme juntamente com a SF por dicroísmo circular (CD). Em solução a Aβ40 apresentou um espectro característico de α-hélice, e quando incorporada no filme observou-se uma predominância de folhas-β. Para o imunossensor óptico, utilizou-se nanopartículas de YVO4:Eu3+ para monitorar a emissão do íon európio. Os filmes tiveram máximo de excitação em 270 nm e a emissão do Eu3+ em 619 nm e também uma emissão em 300 nm associada à SF e ao peptídeo. Após a adição dos anticorpos houve uma diminuição da emissão em 300 nm e um aumento da emissão em 619 nm, associada à uma transferência de energia entre SF e Aβ40 e o európio. Na detecção óptica foi verificado que o anticorpo era incorporado ao filme mesmo sem a presença do peptídeo, fazendo necessárias mudanças experimentais para diminuir interações não específicas. A detecção eletroquímica da solução de anticorpos anti-Aβ 40 foi feita por VC, e foi observada uma mudança nas correntes obtidas em potenciais positivos, principalmente em 0,3V e também da área dos voltamogramas; em ambos os casos é verificada uma região linear entre 0 e 10 ng.mL-1 e essa resposta foi obtida apenas... / Silk fibroin (SF) and amyloid-β with 40 aminoacids (Aβ40) layer-by-layer (LbL) films for optical and electrochemical imunosensing applications were investigated. The growth of this films was confirmed by cyclic voltammetry (VC), observing changes in the voltammogram area and ultraviolet-visible region spectroscopy (UV-vis), observing increasing absorbance in 230 nm. The complete covering of an carbon electrode was verified using potassium ferrocyanide and ferricyanide in VC. There was distortion of the voltammograms with increasing adsorption time for the SF, and with 30 minutes was observed the maximum distortion, and therefore maximum electrode coverage. A conformation change of the peptide Aβ40 in the film was also observed using circular dichroism (CD). In the solution the peptide presented an characteristic spectrum of α-helix structure and in the film was observed the predominance of β-sheet structure. For the optical immunosensor an YVO4:Eu3+ nanoparticle suspension to monitor the europium emission. The LbL films had an excitation maximum centered in 270 nm and the europium emission in 619 nm, it was also observed an emission centered in 300 nm attributed to the SF and Aβ40. After the addition of antibodies, it was observed an increase in Eu3+ emission and a decrease of protein emission, associated with an energy transfer from SF/Aβ40 to the Eu3+. In the optical detection this effect was observer in the absence of peptide, therefore non-specific interactions between antibodies and the substrate. The electrochemical detection of the antibodies solution was performed with VC and were observed changes in voltammograms: an increase of current in positive potentials and an increase in voltammogram area. Both had a linear response in the 0 through 10 ng.mL-1 range and this response was observed only in the presence of the Aβ40.