In follicle sinus complex of sinus hairs, two blood vessels seem to have a prominent function. Up to date, their biological role is unknown, however, hypothesis suggest that they are used as hydraulical bearing for the hair which is used to change the stiffness and compliance of the fixation depending on the application. Because of the size of the structures of interest experiments at the living object to clarify the biological role are not possible so far. Therefore, mechatronic approaches can help to investigate advantages and possibilities of a bearing with tunable compliance. Thus, in the current thesis, it is develop a mathematical modeling, multi-body simulation and a mechatronic demonstrator of a swinging rod in a bearing with tunable compliance. The tunable compliance of the system was inspired of Jack Spring principle of work, which change the compliance by decreasing the number of active coils. / Tesis

El presente trabajo consiste en el diseño de un modelo teórico que explique el comportamiento de las señales de calcio en un microdominio (agrupación de canales iónicos y transportadores involucrados en la dinámica del calcio dentro de un cilio olfatorio), observadas experimentalmente. Los cilios olfatorios son de gran importancia en la biología ya que funcionan como estructuras receptoras de los odorantes en las neuronas olfatorias. El calcio es uno de los principales transductores de la señal eléctrica generada, por lo que entender su dinámica a cabalidad representa un gran aporte al tema en cuestión. Teniendo en cuenta que el factor más importante en el análisis de muy pocos canales es que la apertura de éstos es probabilística, y que las señales de calcio son muy puntuales en el cilio olfatorio con respecto al tiempo y al espacio, se realizó un modelo matemático estocástico resuelto numéricamente (utilizando el software MATLAB) en Ecuaciones Diferenciales Ordinarias. Se observó claramente que el principal modulador de las señales de calcio en el microdominio es el canal activado por nucleótidos cíclicos CNG, existiendo una dependencia directa entre la corriente a través del canal y la concentración intracelular de calcio. Modificando algunos parámetros de manera apropiada dentro de rangos con sentido desde el punto de vista biológico, fue posible llegar a valores cuantitativos que concuerdan con lo observado experimentalmente. De esta forma, se obtienen resultados numéricos de gran similitud con las mediciones experimentales, siendo la difusión en el cilio y la cinética del canal CNG los parámetros claves en la modulación de las señales de calcio. Finalmente, el modelo cumple con el objetivo de dar un respaldo teórico a la observación experimental de la existencia de microdominios en los cilios olfatorios de las neuronas del olfato.

El nivel de complejidad y organización de la materia en los seres vivos es sorprendente y a la vez fascinante. Aun cuando no se sepa por qué existe o cómo se genera, se cree firmemente en el paradigma que dicta que gran parte de la información para el surgimiento de tal complejidad está codificada, de alguna forma, en los genes. Al respecto las redes de regulación transcripcionales cumplen un rol fundamental, por cuanto son capaces de responder a estímulos externos y controlar de forma precisa los genes, y por ende, las proteínas que son expresadas en un momento particular. Debido a la incapacidad para directamente observar y comprender el funcionamiento de estos sistemas de regulación, surge la necesidad de utilizar métodos indirectos basados en el análisis de experimentos de expresión genética. Lamentablemente la mayor parte de estos procedimientos son de naturaleza estadística, por lo que ignoran el trasfondo netamente biológico del sistema analizado. Por ende los resultados carecen del sentido biológico necesario para hacerlos útiles e interpretables a dicho nivel. En el último tiempo nuevos enfoque de análisis basados en la naturaleza estructural del problema han sido introducidos. Al respecto, NCA (Network Component Analysis) ha demostrado un gran potencial y ventaja sobre otro tipo de aplicaciones, permitiendo al investigador reconstruir los parámetros desconocidos de redes de regulación transcripcionales. En el presente estudio se pretende reproducir las bases de dicha técnica, con el objetivo de comprender sus ventajas e identificar sus limitaciones. Luego se busca modificar y extender la técnica base, buscando incluir en el método nuevas funcionalidades, que en conjunto con reconstruir la red permitan la inclusión de información adicional con el fin de obtener resultados más precisos. El enfoque propuesto permite incluir la varianza de los datos de microarrays utilizado en el análisis, así como suposiciones en los parámetros a estimar del modelo, obteniendo así reconstrucciones que bajo ciertas condiciones se muestran más precisas que con el método original. Los métodos son probados y validados extensamente en redes sintéticas obteniendo resultados que ilustran la gran capacidad y robustez frente a errores de la técnica desarrollada. Por otra parte, un nuevo enfoque basado en la técnica heurística de recocido simulado es desarrollado. Con éste se espera encontrar redes alternativas a la propuesta, que expliquen de manera alternativa los resultados obtenidos y reduzcan así la gran cantidad de información respecto a la estructura de la red que NCA requiere para trabajar.

La presente memoria tiene por objetivo investigar el sistema sináptico y levantar nuevas hipótesis acerca de la relación entre la organización de la densidad postsinaptica y el gatillamiento de enfermedades cognitivas, tales como, esquizofrenia, Alzheimer y retardo mental. Ello con la motivación de iniciar el desarrollo de nuevas terapias que permitan un ataque al mecanismo de estas enfermedades y no sólo a las consecuencias de ellas. En particular este trabajo explora nuevas metodologías en la inferencia de interacciones interproteicas y aplicar aquellas relaciones putativas en el estudio de la estructura receptora de glutamato NRC/MASC (NMDA receptor complex/ MAGUK associated signalling complex), ya que en la última década se ha determinado el rol fundamental del neurotransmisor glutamato en los procesos cognitivos y, por lo tanto, de la importancia de la recepción de él. Para el desarrollo de los objetivos se propuso un protocolo nuevo, en donde se unen dos metodologías novedosas. En primer lugar, la aplicación del clasificador Naïve-Bayes para inferir interacciones interproteicas del ser humano, logrando de esa forma obtener una red de interacción más amplia y con un parámetro de confianza para cada uno de sus elementos. En segundo lugar, utilizando esta red inferida, en conjunto con otras redes disponibles en literatura, se llevó a cabo un estudio sistémico de la unidad NRC/MASC, y como ésta se ve afectada en sujetos con enfermedades cognitivas. Para ello se utilizó un algoritmo de clustering que permitió la definición de los módulos funcionales del complejo. El primer resultado obtenido fue una red de interacciones interproteicas para el ser humano, compuesta por un número de proteínas comparable a las reportadas con anterioridad. La información disponible en estas redes fue integrada en un modelo único. Se seleccionaron los nodos pertenecientes al complejo receptor NRC/MASC, los que fueron agrupados en 12 módulos altamente especializados mediante el algoritmo de clustering. El análisis de las características de cada modulo permitió identificar una nueva organización no reportada en literatura: un gran módulo receptor conforma la capa de entrada de la señal de glutamato, seguido de una capa de modulación, para finalizar con la capa de módulos efectores. Por otro lado se designó una capa híbrida, con clusters con una función dual, tanto moduladores como efectores. Estos resultados permiten definir un nuevo modelo funcional del receptor, en donde se presentan una gran cantidad de vías de señalización y un aumento de la complejidad de las relaciones intermodulares. Además, se encontró que los clusters con una alta correlación con las enfermedades cognitivas serían el módulo receptor y el cluster modulador compuesto por 3 proteínas G. Finalmente, esta memoria ha propuesto un modelo funcional para la unidad receptora NRC/MASC, cuya composición y características organizativas se diferencian de los reportados anteriormente. Estas características transforman este modelo en una herramienta novedosa para el estudio de los complejos mecanismos que hay detrás de enfermedades como esquizofrenia y retardo mental.

Arquitecto / El proyecto se planteó desde la necesidad de generar focos de transferencia tecnológica y valor agregado dentro de los productos exportados a través de la tecnología a nivel nacional. Entre los esfuerzos nacionales para alcanzar el desarrollo, la introducción de nuevas tecnologías y procesos sustentables, han sido líneas estratégicas a desarrollar. Es asi, como a partir de esta premisa, se desarrolló un proyecto arquitectónico en torno a la biotecnología ambiental denominado “Centro de Investigaciones Biotecnológicas”, enfocado en generar espacios de transferencia tecnológica entre el desarrollo investigativo, su aplicación dentro del mercado y enfocado a aumentar el capital humano en torno a esta ciencia. Ubicado en la ciudad de Valdivia, se recoge toda la trayectora de estudio ambiental que ha estado desarrollando la Universidad Austral, para lo cual la introducción de focos asociados a la biotecnología se traduce en un avance significativo dentro de esta área. De esta manera, el Centro de Investigaciones Biotecnológicas forma parte, en conjunto con diversas unidades académicas que se proyectan a futuro, de la consolidación de un Ecocentro Científico, destinado a complementar las investigaciones en torno al medio ambiente por parte de la Universidad Austral.

El objetivo de esta investigación fue seleccionar las condiciones que permitan la producción de enzimas pectinasas, a partir de cáscaras de naranja, empleando Actinomyces naeslundii. En la primera fase, se determinaron las condiciones de pH , temperatura, agitación y aireación, para un buen crecimiento del microorganismo. En la segunda, se empleó el diseño experimental Plackett-Burman, mediante la evaluación de ocho nutrientes, con dos niveles de variación. Los nutrientes fueron: cáscara de naranja, sulfato de amonio, úrea, sulfato ferroso, cloruro de calcio, cloruro de sodio, sulfato de magnesio y carbonato de sodio, utilizándose matraces Erlenmeyer con 150 mL de medio experimental pH 7.00 a 37 ºC y 300 rpm por 5 días. En la tercera fase, fue realizada la optimización del medio de cultivo experimental, siguiendo el diseño de Box-Benhken, en el que hubo evaluación de las concentraciones de cáscara de naranja, sulfato de amonio y sulfato ferroso en tres niveles. Con los resultados obtenidos, se realizó el análisis de regresión múltiple. Los cálculos y gráficos estadísticos fueron ejecutados con el software Statistical 2.1. obteniéndose la máxima producción de enzimas, con las siguientes concentraciones: cáscara de naranja 16.7 g / L, sulfato de amonio 5 g /L y sulfato ferroso 0.013 g / L, obteniéndose 0.65 U.I. / mL de actividad enzimática, en tres días de biotransformación. / The objective of this research was to choice the conditions that they permit to optimize the pectinasas enzymes production using orange skins and Actinomyces naeslundii; on first phase was used qualitative techniques for to determinate the conditions of pH, cultivation temperature, agitation and aeration for a good growth microorganism. On the second phase was used the Plackett- Burman design through the investigation of eight nutrients with two variation levels; The eight nutrients was: oranges skin, ammonium sulfate, urea, ferrous sulfate, calcium chloride, sodium chloride, magnesium sulfate y sodium carbonate. It was used Erlenmeyer flask with 150 mL of experimental medium pH 7, to 37 ºC, agitation to 300 rpm for 5 days. Third phase of optimization was developed through Box- Benhken design, oranges skin, ammonium sulfate and ferrous sulfate concentration were evaluated on three level. It was realized a multiple regression analyses with the three variables found previously . calculus and graphics were developed with Statistical 2.1 software. Optimum Parameters were: oranges skin 16.7 g / L, ammonium sulfate 5 g / L and ferrous sulfate 0.013 g / L. it was obtained 0.65 UI / mL of enzymatic activity in three days of biotransformation.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / The transcription process is initiated by the Core Promoter Elements (CPE), leading the formation of the Pre-Initiation Complex (PIC) which reclutes the transcription proteins (General Transcription Factors, GTFs) and RNA Polymerase II (RNA Pol II) that bind to the CPE. These GTFs are: TBP, TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF and TFIIH in the case of promoter recognized by the RNA Pol II that synthesizes the mRNA molecule using DNA sequence as template. Among the CPE are the TATA box, the TFIIB-recognition Element (BRE), the Initiator (Inr), the Motif Ten Element (MTE), Downstream Promoter Element (DPE) and the Downstream Core Element (DCE) (Thomas y Chiang, 2006) Data collected during the laboratory experimental work suggest that the DNA sequence named Homol D is a universal CPE in S. pombe and that the genes containing this element are transcribed by the RNA Pol II, which is also the target of a new factor or protein complex that determined the initiation site of transcription. We aim to determine which GTFs are required for Homol D box dependent gene transcription, through in vitro transcription assays, inmunodepletion and Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA). Here we show the analysis of the following specific antibodies for GTFs of interest (TBP, TAF1, TFIIB, TFIIE, TFIIH, TFIIF and the subunit of Srb4 mediator). xii Protein extract of S. pombe were used as GTFs source, while ribosomal K5 gene (that possess the Homol D box) were used as DNA template. To carry out transcription was used a purified RNA Pol II. The in vitro transcription and inmunodepletion experiments allowed us to observe that transcription does not occur when each transcription factor studied is depleted by using a specific antibody for each GTF. When using a promoter with an inverted Homol D as DNA template the same results were observed. When a rescue of the transcription reaction is performed by supplementing the depleted GTF after the inmunodepletion, the reaction occurred for both the normal and the inverted Homol D box. Therefore the studied GTFs, TBP, TFIIB, TFIIE, TFIIH and TFIIF are necessary for initiation of the transcription process in the K5 promoter which contains Homol D box. For the EMSA assays it was initially obtained a purified protein fraction with Homol D union and antibodies against each GTF to make an inmunodepletion of each GTFs and afterwards the reaction was incubated with P32γATP labeled probe. This assays allowed us to observe that the studied transcription factors are not the ones that recognize directly the Homol D box sequence. According with the work performed in this work, the GTFs TBP, TAF1, TFIIB, TFIIE, TFIIH, TFIIF and Srb4 are necessary for the formation of PIC but not for the recognition of the Homol D box in the K5 promoter, suggesting the existence of another factor/s o protein complex that recognizes the sequence of Homol D box. / El proceso de la transcripción es iniciado por los Elementos del Núcleo del Promotor (Core Promoter Element, CPE), que dirigen la formación del Complejo de Preiniciación (Pre-Initiation Complex, PIC), el cual está compuesto por los Factores de Transcripción Generales (General Transcription Factors, GTFs) y la RNA Polimerasa II (RNA Pol II). TBP, TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF y TFIIH corresponden a los GTFs que participan en la transcripción dirigida por promotores reconocidos por la RNA Pol II que sintetiza la molécula de mRNA a partir de una secuencia de DNA. Entre los CPE se encuentran la caja TATA, el elemento de reconocimiento de TFIIB (BRE), el Iniciador (Inr), el Motif Ten Element (MTE), el Downstream Promoter Element (DPE) y el Downstream Core Element (DCE) (Thomas y Chiang, 2006). Antecedentes recopilados durante el trabajo experimental de laboratorio sugieren que la secuencia de DNA denominada Homol D es un CPE universal en S. pombe y que los genes que poseen este elemento son transcritos por la RNA Pol II, la que además es blanco de un nuevo factor o complejo proteico que determina el sitio de inicio de la transcripción. Como objetivo de esta tesis se determinaron los requerimientos de GTFs necesarios para la transcripción de genes con promotores que poseen la caja Homol D, a través de ensayos de transcripción in vitro, inmunodepleción y geles de retardo (EMSA), en los cuales se utilizaron anticuerpos específicos para los distintos GTFs estudiados (TBP, TAF1, TFIIB, TFIIE, TFIIH, TFIIF y una subunidad del mediador Srb4). xiv Como fuente de GTFs se utilizaron extractos de proteínas del organismo S. pombe y como DNA molde fue utilizado el promotor del gen ribosomal K5 que posee la caja Homol D. Para llevar a cabo la transcripción se utilizó una RNA Pol II purificada. Los experimentos de transcripción in vitro e inmunodepleción, permitieron observar que la transcripción no ocurre al retirar cualquiera de los factores de transcripción por acción del anticuerpo específico para dicho GTFs. Además los ensayos usando como DNA molde un promotor con la caja Homol D invertida, permitieron observar los mismos resultados, es decir que la transcripción no ocurre al faltar alguno de los GTFs analizados en esta tesis. Al realizar un rescate de la reacción de transcripción, es decir, luego de hacer la inmunodepleción se suplementa el GTFs eliminado, se observó que la reacción ocurría, tanto para la caja Homol D normal como para la invertida, por lo tanto la presencia de todos los GTFs estudiados, TBP, TFIIB, TFIIE, TFIIH y TFIIF son necesarios para que se inicie el proceso de transcripción en el promotor K5 que posee la caja Homol D. Para los ensayos EMSA se utilizó extracto de proteínas totales que contenía la proteína con unión a Homol D y anticuerpos contra cada GTF, para realizar una inmunodepleción de ellos y luego se incubó con una sonda de DNA que contenía la caja Homol D marcada con P32γATP. Estos ensayos permitieron observar que los factores de transcripción estudiados no son los que reconocen de manera directa la secuencia de la caja Homol D, ya que a pesar de que ellos son retirados de la reacción se observa la aparición del complejo proteína/Homol D, reflejado como una banda en el film fotográfico. xv De acuerdo al trabajo realizado en este seminario de título, los GTFs TBP, TAF1, TFIIB, TFIIE, TFIIH, TFIIF y Srb4 son necesarios para la formación del PIC pero no para el reconocimiento de la caja Homol D en el promotor K5, sugiriendo que existiría otro factor o complejo proteico que reconoce la secuencia de la caja Homol D.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / En las últimas dos décadas, la especie bacteriana Klebsiella pneumoniae se ha convertido en uno de los principales focos de atención de las autoridades mundiales de salud, debido principalmente a la rápida aparición de cepas hipervirulentas y multiresistentes. La aparición de estas cepas estaría relacionada con el gran dinamismo del genoma de K. pneumoniae, promovido por una alta frecuencia de adquisición y pérdida de elementos genéticos móviles, entre los cuales las Islas Genómicas (GIs) jugarían un rol fundamental. Las GIs son segmentos de DNA que presentan un contenido GC distinto al del resto del cromosoma, y que pueden escindirse o integrarse en distintas posiciones de éste, normalmente en genes que codifican RNAs de transferencia (tDNAs). No obstante la importancia propuesta de las GIs en la evolución de K. pneumoniae, hasta ahora el número de GIs conocidas en esta especie es bajo, y poco se conoce respecto al uso de los tDNAs como sitios de integración de estos elementos en ésta y otras especies bacterianas. En este trabajo se caracterizó el set completo de tDNAs presentes en el cromosoma de 50 cepas de K. pneumoniae, identificando las GIs insertadas en dichos loci. Así, se identificaron y anotaron 97 clases de GIs, las que codifican sobre un 50% de proteínas con función desconocida. Además, se observó que solo un grupo reducido de tDNAs son ocupados como sitios de integración de GIs en esta especie, proponiendo y sometiendo a prueba posibles mecanismos o patrones que podrían explicar en parte este sesgo. Los resultados muestran que la dinámica de integración de GIs en K. pneumoniae es un área de investigación poco explorada, y que la evaluación del rol de las GIs en la hipervirulencia y resistencia a antibióticos de K. pneumoniae requerirá caracterizar una gran cantidad de proteínas codificadas en las mismas, cuya función se desconoce. / In the last two decades, the bacterial species Klebsiella pneumoniae has attracted the attention of global health authorities, mainly due to the dissemination of hypervirulent and multi-resistant strains, which are responsible for more severe infections and are more difficult to treat with the available antibiotics. The rapid development of these strains would be explained by the high dynamism of the K. pneumoniae genome, promoted by a high frequency of gain and loss of mobile genetic elements. Among them, genomic islands (GIs) were proposed to play a major role. GIs are DNA segments harboring a GC content that differs from the average for the host chromosome, and that can excise from and integrate into different locations, mainly into genes encoding transfer RNAs (tDNAs). In spite of the proposed role of GIs in K. pneumoniae evolution, a small number of these elements have been described in this species. Moreover, little is known regarding the usage of tDNAs as integration sites for these elements in bacteria. In this work we characterized the whole set of tDNAs typically present in the K. pneumoniae chromosome, searching for GIs integrated at each of them among 50 K. pneumoniae strains. This way, we identified a total of 97 classes of GIs, where more than 50% of the encoded genes have no predicted function. Additionally, we observed that only a small subset of tDNAs are used as integration sites for GIs in this species, and tested possible hypotheses explaining, at least partially, this bias in the selection of the integration site. Our results indicate that the dynamics of GIs integration in bacteria is an underexplored field, and that evaluating the impact of GIs over K. pneumoniae virulence and drug resistance will require efforts directed to address the functions of a high number of proteins encoded in their GIs.

Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / La biomasa lignocelulósica es una materia prima renovable prometedora para la producción de combustibles y productos químicos que está disponible a gran escala. Además, la disminución de las reservas de petróleo, junto con el aumento de las emisiones de gases de efecto invernadero, ha dado lugar a la producción y utilización de biocombustibles. En los últimos años, diversos estudios se han centrado en la investigación de diferentes tecnologías para la producción de bioetanol de segunda generación y productos químicos, siendo los bioprocesos basados en hidrólisis enzimática los que se muestran como la opción prometedora. Una etapa crítica del proceso es la conversión de los residuos lignocelulósicos a azúcares fermentables. La bioconversión de la celulosa es catalizada por un grupo de enzimas denominadas celulasas. En trabajos previos se identificó y clonó el gen codificante para una endoglucanasa desde Trametes versicolor (TvEG). El cDNA codificante para la proteína madura fue completamente secuenciado y clonado en el vector pPIC9K, y se expresó como una enzima extracelular activa en la levadura Pichia pastoris KM71. En el presente estudio, como principal objetivo, se purificó y caracterizó TvEG, y se evaluó su potencial hidrolítico en sustratos celulósicos. La cromatografía de intercambio iónico utilizando un FPLC permitió la purificación y concentración de esta enzima desde el sobrenadante del cultivo. Tras análisis mediante SDS-PAGE, se encontró un tamaño molecular mayor a los 42,3 kDa esperados. La hidrólisis catalizada por TvEG en carboximetilcelulosa (CMC) fue máxima a pH 5,6 y 55ºC. La enzima fue estable en un rango de pH de 3 a 9, y hasta los 55ºC; temperatura sobre la cual la estabilidad disminuyó rápidamente después de la incubación durante 15 min. TvEG tuvo la capacidad de liberar azúcares reductores desde papel filtro, Avicel, xilano y paja xiii de trigo. No obstante, las tasas de liberación en comparación a lo obtenido desde CMC fueron bajas, a excepción de lo obtenido desde Avicel (0,0461%) considerando la alta cristalinidad del sustrato. En conclusión, TvEG es una endoglucanasa mesófila. Esta enzima ha demostrado una alta capacidad para liberar azúcares reductores a partir de celulosa cristalina, por lo que podría tener potenciales aplicaciones en la hidrólisis de biomasa lignocelulósica. / Lignocellulosic biomass is a promising renewable feedstock for production of fuels and chemicals that is available at large scale. In addition, the declined oil reserves together with the increased greenhouse gas emissions, has led to the production and use of biofuels. In the last years, several studies have focused on the research of different technologies for the production of second generation bioethanol and chemicals, being enzymatic hydrolysis bioprocesses shown as the promising option. A critical stage in the process is the conversion of lignocellulosic residues into fermentable sugars. The bioconversion of cellulose is catalyzed by a group of enzymes called cellulases. At previous works the gene coding for an endoglucanase (TvEG) from Trametes versicolor was identified and cloned. The cDNA encoding for the mature protein was completely sequenced and cloned into the pPIC9K vector, and expressed as an active extracellular enzyme in the yeast Pichia pastoris KM71 (Salinas et al, 2011). In the present study, as main objective, TvEG was purified and characterized, and its hydrolytic potential in cellulosic substrates was evaluated. Ion exchange chromatography using FPLC allowed the enzyme purification and concentration from the culture supernatant. After SDS-PAGE analysis, a molecular size higher than the 42,3 kDa expected was found. The hydrolysis catalyzed by TvEG in carboxymethyl cellulose (CMC) was maximal at pH 5,6 and 55°C. The enzyme was stable in a pH range of 3 to 9, and up to 55ºC; above which stability decreased rapidly after incubation for 15 minutes. TvEG had the ability to release reducing sugars from filter paper, Avicel and wheat straw. However, the release rates compared to that obtained from CMC were lower, except for Avicel (0,0461%) considering the substrate high crystallinity. xv In conclusion, TvEG is a mesophilic endoglucanase. This enzyme had been shown a high capacity to release reducing sugars from crystalline cellulose, so could have potential applications in the hydrolysis of lignocellulosic biomass

Este trabajo abarca distintos aspectos de la metodología de la transferenciagénica en lubina, tanto in vitro como in vivo. Por una parte, se ha centrado en el estudioy evaluación de la transferencia génica somática como posible sustitución a latransgénesis estable en distintas aplicaciones. Por otra parte, se ha evaluado el sistemade regulación por tetraciclina para la regulación exógena de genes en peces. Por último,se ha probado que una línea celular de lubina puede utilizarse como sistema deexpresión de genes exógenos.Por primera vez se demuestra que la inyección de DNA plasmídico es eficientepara transferir genes exógenos a músculo de lubina. Los factores que favorecen laexpresión son, dosis altas de plásmido, el uso de un promotor adecuado, y un estadometabolicamente activo del músculo. La expresión que se obtiene es transitoria,alcanzándose el máximo cinco días después de la inyección. Una limitación de estatécnica es la incapacidad de reproducir en los distintos individuos inyectados, lamanera exacta en que la aguja de inyección entra en el paquete muscular, lo queorigina una gran variabilidad en cuanto a la toma de DNA por parte de las células, ypor tanto en el nivel de expresión del transgen. Esto se puede mejorar aumentando elnúmero de animales inyectados para disminuir así el error debido a la técnica, o usandouna segunda construcción para normalizar la transfección.La técnica de inyección de DNA en músculo se ha ensayado como método devacunación en peces. Sin embargo, ésta es la primera vez, que se prueba esta técnica enpeces para secretar una hormona en sangre. Como gen a inyectar se ha diseñado yconstruido un gen híbrido que codifica una hormona gonadotropa de cadena única delubina. Tras su inyección en músculo de lubina se pudo detectar la proteína en plasma.Para sistemas de origen piscícola, no se dispone hasta el momento de un métodoque permita controlar la expresión de genes exógenos de manera fiable. Por primeravez, hemos probado la utilidad del sistema de regulación por tetraciclina para estamisión. Tras valorar diferentes versiones del sistema en células de pez in vitro y enmúsculo in vivo, podemos concluir que la opción más eficiente es el uso deltransactivador tTA bajo el control de un promotor estable.Al igual que en células de mamíferos, hemos comprobado que las células de peztambién presentan dificultades para mantener el sistema de regulación por tetraciclinade una manera funcional; como resultado, encontrar clones con un grado de regulaciónóptimo y un nivel bajo de expresión basal es difícil. Sin embargo, el uso de unaestrategia basada en el uso del plásmido nuevo pTet-luc+-pur/GFP facilita esta tarea, ypermite obtener un alto porcentaje de clones regulables.A lo largo de este trabajo se han comparado los promotores CMV, de origenviral, y el promotor de la actina ß de carpa, para dirigir la expresión de distintos genestanto en las líneas celulares EPC y SBL, como en músculo de lubina in vivo. Losresultados nos permite concluir que el promotor de la actina ß de carpa, es más débil encuanto al nivel de expresión génica que logra promover, y menos estable a la hora demantenerse en una línea celular que el promotor CMV.Por último, los resultados obtenidos con la línea celular SBL permiten señalar aesta línea como un sistema de lubina apto para la expresión de genes exógenos. Estascélulas son capaces de secretar los productos de los genes introducidos, con lo quepodrían ser utilizadas para la producción de proteínas recombinantes. / This work focuses on different aspects of the gene transfer methodology in sea bass.On one hand, the use of the somatic gene transfer has been evaluated as an alternative to theuse of stable transgenesis in different applications. Somatic gene transfer has been used asmethod of delivery of a recombinant single-chain gonadotropin into the blood stream in seabass. On the other hand, we have evaluated the use of the tetracycline regulated system tocontrol exogenous gene expression in fish. The results showed that the best choice was the useof the rtTA transactivator under the control of a stable promoter. Finally, a sea bass cell linehas proven to be an efficient system for the expression of exogenous gene.