Los carotenoides son compuestos isoprenoides que en plantas participan durante la fotosíntesis como pigmentos accesorios, protegen contra el daño foto-oxidativo y son precursores del ácido abscísico. En mamíferos los carotenoides son la principal fuente para la síntesis de vitamina A, además de actuar como antioxidantes. Debido a esta vital importancia para plantas y humanos es que se ha enfocado el estudio en la ruta metabólica con el fin de aumentar la cantidad de carotenoides en los alimentos de consumo humano. Se ha descrito que, en la ruta de biosíntesis de carotenoides, la primera enzima de la ruta llamada fitoeno sintasa (PSY) es un punto clave y altamente regulado. En Daucus carota, nuestro modelo de estudio, se han descrito dos genes que codifican a PSY, DcPsy1 y DcPsy2. Estos genes se expresan diferencialmente en hojas y raíz durante el desarrollo de la planta, y además se ha determinado que la región promotora del gen DcPsy2 presenta elementos en cis regulados por luz, fitohormonas y estrés abiótico. Se ha evidenciado la funcionalidad de estos dos genes in vivo al sobreexpresarlos en Nicotiana tabacum, donde promueven un aumento de carotenoides. Sin embargo, no se ha determinado si en la propia D. carota, ambos genes realmente participan en la biosíntesis de carotenoides en hojas y/o raíz, ya que podrían estar cumpliendo una función órgano específica, como sucede en otras plantas. En este seminario de título, se transformaron explantes de D. carota con vectores que permiten la sobreexpresión del gen DcPsy1 y DcPsy2, con el fin de obtener plantas transgénicas que serán utilizadas en futuros análisis de expresión y acumulación de carotenoides. Se obtuvieron exitosamente 11 líneas transgénicas de plantas de D. carota transformadas con el vector que permite la sobreexpresión del gen DcPsy1 y 7 líneas transgénicas de plantas transformadas con el vector para la sobreexpresión del gen DcPsy2. Además, por medio de la expresión en hojas de tabaco de una proteína de fusión entre el producto del gen DcPsy1 y la proteína fluorescente YFP (PSY1:YFP), se determinó que la localización subcelular de la proteína PSY1 es en plastidio. De este modo se comprobó su correcta localización subcelular, lo que aporta un antecedente importante sobre su funcionalidad, dado que los carotenoides se producen en los plastidios de células vegetales. / Carotenoids are isoprenoid compounds that fulfill important functions in plants. They act as accessory pigments during photosynthesis, protect cells against photooxidative damage and are precursors of abscisic acid. In mammals, carotenoids are the main source for the synthesis of vitamin A and have very powerful antioxidant properties. Due to these characteristics, since several years the studies have focused on modifying the metabolic pathway in order to increase the amount of carotenoids in food for human consumption. It has been described that, phytoene synthase (PSY), the first enzyme in the pathway, is a key point of carotenoid synthesis regulation. In Daucus carota, our plant model, two genes coding for PSY have been described, DcPsy1 and DcPsy2. These genes are differentially expressed in leaves and root during plant development. Also, DcPsy2, and not DcPsy1, responds to ABA which correlates with the presence of cis elements that are regulated by light, phytohormones and abiotic stress that are present in the DcPsy2 promoter. The functionality of these two genes has been evidenced in vivo by heterologous expression in Nicotiana tabacum, where they promote an increase of carotenoids. However, it has not been determined in D. carota itself, if both genes actually participate in the biosynthesis of carotenoids in leaves and/or root, since they could be fulfilling different functions in the plant in a specific organ way, as has been reported for other plants. In this work, explants of D. carota were transformed with vectors for DcPsy1 and DcPsy2 overexpression, to obtain transgenic plants that will be used in future functional analysis. We successfully obtained 11 transgenic lines of D. carota plants transformed with the vector for DcPsy1 overexpression and 7 transgenic lines of plants transformed to overexpress DcPsy2 gene. In addition, we generated a construct for DcPsy1 subcellular localization. A fusion protein between the product of the DcPsy1 gene and the fluorescent protein YFP (PSY1:YFP), let us to conclude that DcPSY1 protein has a plastidial localization. This result provides arguments about its functionality because carotenogenic enzymes are located in plant plastids were carotenoids are produced.

Diseñador Industrial / El proyecto en sí consta de un sistema que permite al científico documentar proteínas en tres canales de emisión a partir sólo de una membrana. El proyecto, desde la visión macro, es resuelto por un equipo multidisciplinar formado por estudiantes de Bioquímica, Biotecnología y Diseño Industrial, dirigidos por un profesional de la ciencia para su tesis doctoral; teniendo cada uno de los integrantes una misión específica, lo que se describe como visión micro del proyecto (proyectos individuales), con el fin de hacer de las investigaciones y desarrollo realizados, un producto que se acomode a las necesidades de los científicos que trabajan día a día con proteínas, poniendo a su disposición un sistema que permite optimizar su trabajo en términos de tiempo, insumos a utilizar y calidad de resultados.

La actual problemática energética-medioambiental motiva la búsqueda de nuevas fuentes de energía con menor impacto, así como el diseño de procesos industriales más eficientes en el uso de los recursos. Las celdas de combustible microbiológicas (denominadas biopilas o biobaterías al ser operadas en forma discontinua) son una tecnología capaz de producir electricidad basada en fenómenos bioelectroquímicos, utilizan microorganismos vivos para catalizar reacciones de óxido-reducción logrando la generación de una fuerza electromotriz aprovechable. Mediante este elemento biológico amplían el concepto de combustible a una gran variedad de compuestos orgánicos e inorgánicos, incluyendo materias residuales del sistema productivo, que pueden llegar a ser usados como fuentes de energía. Las celdas de combustible microbiológicas diseñadas para producir electricidad oxidando materia orgánica residual son el principal sistema en estudio hasta hoy. No obstante, muchas alternativas restan por explorar, una de ellas y sobre la cual trata este trabajo, consiste en la generación de electricidad a partir de la energía libre de la oxidación de azufre elemental y sulfuros metálicos, con uso de bacterias oxidantes de azufre y hierro. Esta alternativa invita a pensar especialmente en el diseño de nuevos procesos para la minería, capaces de contribuir a la solución de su demanda energética, tales como biolixiviación anóxica de sulfuros metálicos electrogeneradora, o generación de bioelectricidad con material de botaderos o relaves ricos en compuestos inorgánicos reducidos de azufre. El diseño propuesto fue estudiado experimentalmente acotándolo a un sistema de azufre elemental como combustible y bacterias de la especie Acidithiobacillus ferrooxidans como elemento biocatalizador. Una celda a escala de laboratorio fue construida para dicho propósito, operada en forma discontinua (biopila), de doble cámara anóxica-aeróbica de 135 mL y 35 mL vol. vacío respectivamente, con discos de grafito de 1,6 cm de diámetro como electrodos, y una membrana de intercambio de cationes Nafion como separador, área transversal de 2 cm de diámetro. La celda se operó durante 526 h a 25 °C manteniéndose con una carga (resistencia externa) en circuito cerrado de 1 kΩ entre mediciones. Una serie de voltametrías cíclicas fueron realizadas para caracterizar la evolución en el tiempo de los procesos redox de los electrodos de cada compartimento. Asimismo, se investigó también por voltametría cíclica, la formación y electroactividad de biofilms de At. ferrooxidans en cultivos aeróbicos con azufre elemental sobre electrodos de grafito de 3 mm de diámetro. Los voltagramas arrojaron una serie característica de ondas redox ligadas a la formación de un biofilm, y sugieren propiedades catalizadores, probablemente de intermediarios de azufre solubles producidos por el metabolismo bacteriano en crecimiento con S0. Asimismo, un proceso de aparente adaptación anodofílica (uso de electrodo como aceptor terminal de electrones) se observa en el compartimento anóxico. La obtención de las curvas de polarización y potencia de la celda permiten estimar el potencial desempeño de bioelectrogeneración. Así, se halló un valor de máxima potencia de ~9 Wm-2 a una densidad de corriente de 12,5 mA∙cm-2, magnitudes más de 3 veces superiores a los valores máximos encontrados en sistemas de sustrato orgánico. Las curvas obtenidas presentan un acentuado fenómeno de histéresis que cuestionan la escalabilidad de este desempeño. La eficiencia energética, respecto del cambio de energía libre de Gibbs de la oxidación de S0 con O2, en la operación continua al punto de máxima potencia se estima <15 % con un rendimiento del combustible < 0,64 kWh/kgS0, siendo el máximo teórico 4,31 kWh/kgS0. Dado un valor referencial de 10 USD/tonS0, este tipo de energía resulta de relativo bajo costo alcanzando 15,6 ¢USD/kWh para el desempeño registrado.

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El plan de negocio desarrollado es viable y se enmarca dentro de la biotecnología agraria, una industria que en los últimos veinte años se ha desarrollado fuertemente en el mundo, aunque en nuestro país todavía es incipiente. El objetivo del presente plan es buscar oportunidades de negocio fuera del océano rojo, ya que los autores de la investigación están convencidos que la biotecnología es la oportunidad para el país. La industria de la piña actualmente genera 22.000 empleos directos y en el mediano plazo podría verse muy afectada si se sigue sembrando con semillas viejas e infectadas. Según el trabajo de campo realizado con la piña, el mercado de semillas es enorme; solo en Satipo, la demanda potencial es de 166 millones de semillas anuales. Los agricultores entrevistados manifestaron que tienen problemas de degeneración con la semilla y presencia de hongos. Por otro lado, el agricultor emplea 19 meses para obtener su semilla lo que genera un alto costo de oportunidad. Son estos los factores clave para el éxito del negocio. Conociendo esta problemática planteamos como alternativa de solución, la semilla obtenida por medio de la técnica de cultivo in vitro que tiene grandes ventajas frente a la semilla convencional haciéndola atractiva para los agricultores. El negocio se desarrollaría estratégicamente en tres etapas: la primera, implementando parcelas demostrativas en campos del agricultor para el convencimiento de los mismos; la segunda, iniciando la producción de semillas para la venta tercerizando el laboratorio e implementando un invernadero y vivero; en la tercera etapa, completaremos el proceso productivo con la implementación del laboratorio buscando ampliar la capacidad productiva. Es importante considerar para el inicio de la producción la firma previa del contrato con el agricultor y la importancia de los servicios de capacitación y asesoramiento antes y después de la venta.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / Los fotorreceptores se encuentran ampliamente distribuidos en todos los dominios de la vida, y se caracterizan por experimentar cambios de conformación inducidos por la presencia o ausencia de luz. Estas moléculas, junto con distintas herramientas ópticas, han permitido la aparición de la optogenética, que consiste en el uso de luz para permitir el comando de distintos procesos biológicos con un fino control espacio-temporal. El uso de luz como tratamiento inductor se destaca debido a que es una señal fácil de regular y con gran resolución espacial, popularizando su uso en sistemas mamíferos. Recientemente, el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae ha sido también adoptado como una plataforma para este tipo de aproximaciones, ya que no presenta fotorreceptores descritos, y por lo tanto, no es capaz de sensar la luz. Recientemente, se ha descrito un sistema optogenético llamado Fungal Light- Oxygen-Voltage (FUN-LOV). Este se basa en la interacción de los dominios LOV de las proteínas WHITE COLLAR 1 (WC-1) y VIVID (VVD) del hongo Neurospora crassa, y en la arquitectura clásica de los sistemas de doble híbrido. FUN-LOV presentó notables niveles de inducción en la transcripción de un gen reportero luciferasa, y bajo ruido en condiciones de oscuridad, por lo que se presenta como uno de los sistemas optogenéticos más robustos reportados hasta la fecha. Sin embargo, poco se sabe sobre el papel que cumplen los distintos dominios de las proteínas que participan en este tipo de arquitectura para la funcionalidad y robustez del sistema optogenético. Es por esto que este seminario de título se presenta como una revisión de la modularidad y robustez del sistema FUN-LOV. Para esto se intercambiaron los dominios de unión a DNA (DBD) y de activación (AD) del sistema original por el de diferentes factores de transcripción (TF), ampliamente descritos en S. cerevisiae, tales como el DBD de las proteínas LexA y Cup2p, y el AD de VP16. Con el objetivo de realizar esta evaluación se generaron las correspondientes construcciones genéticas in silico, para luego ensamblarlas in vivo usando clonamiento por recombinación en levaduras. La evaluación de los sistemas se realizó de forma indirecta a través de la cuantificación de la actividad del gen reportero luciferasa (LUC) en respuesta a luz azul (BL) y al estímulo particular de cada dominio intercambiado (cobre, luz roja). Como resultado se obtuvo que ambos sistemas en los que se hizo un cambio a nivel de DBD/promotor, presentaron una pérdida en su funcionalidad y robustez, lo que sugiere fuertemente que dichos módulos son de vital importancia para este tipo de sistemas optogenéticos. Por su parte, el sistema FUN-LOV VP16 mantuvo su funcionalidad como interruptor-optogenético, pero presentó un menor nivel de inducción de actividad luciferasa, además de una cinética más lenta comparado con el sistema ya reportado. Finalmente, se concluye que el sistema FUN-LOV no es modular a nivel de DBD/promotor, ya que al remplazar estos módulos el sistema pierde su funcionalidad y robustez. Por otro lado, el sistema es modular a nivel de AD, ya que mantiene su funcionalidad, mientras que la robustez varía dependiendo de la naturaleza del AD a utilizar. / Photoreceptors are widely distributed in all the domains of life and are characterized by undergoing conformational changes induced by the presence or absence of light. These molecules, together with different optical tools, have allowed the appearance of optogenetics, which involves the use of light to allow the command of different biological processes with a fine spatio-temporal control. Light as an inducer treatment is remarkable since it is easy to regulate and provides great spatial resolution, which has boosted its use in mammalian systems. Recently, the model organism Saccharomyces cerevisiae has been adopted as an ideal platform for this kind of systems, due to the absence of described photoreceptors, and therefore, it is not capable to sense the light. Recently, an optogenetic system called FUN-LOV has been described. FUN-LOV is based on the interaction of Neurospora crassa photoreceptors WC-1 and VVD, and on the classical architecture of the double hybrid systems. FUN-LOV showed remarkable levels of luciferase gene expression, and low noise in dark conditions, so it is presented as one of the most robust optogenetic systems reported so far. Nonetheless, little is known about the role played by the different protein domains for the functionality and robustness of the optogenetic system. Therefore, this title seminar is presented as a revision of modularity and robustness of the FUN-LOV system. For this, the DBD and AD of the original system were exchanged for different TF domains widely described in S. cerevisiae, such as the DBD of the LexA and Cup2 proteins, and the AD of VP16. The evaluation was carried out generating the genetic constructions in silico, to then assemble them in vivo using yeast recombinational cloning. The evaluation of the systems was performed indirectly through the activity quantification of LUC reporter gene in response to BL and the particular stimulus for each domain exchanged (copper, red light). As results, a loss of functionality and robustness was observed when the domains where exchanged at the DBD/promoter level, strongly suggesting that these modules are crucial for this type of optogenetic systems. On other side, the FUN-LOV VP16 system keep its functionality as an opto-switch, but showed a lower induction of luciferase activity, and slower kinetics in relation with the already reported system. Finally, we concluded that FUN-LOV is not a modular system at the DBD/promoter level, because functionality and robustness of the system are lost when these modules were replaced. Nonetheless, the system is modular at the AD level, since it maintained its functionality, meanwhile the robustness varies depending on the nature of the AD used. / FONDECYT-Regular 1171151 y el Instituto Milenio de Biología Integrativa (iBio).

Ingeniería en Biotecnología Molecular / Actualmente, el uso de enzimas corresponde a un área de la biotecnología de gran crecimiento y desarrollo, la cual ha buscado dar solución a problemas de tipo industriales, biomédicos y domésticos; representando una solución específica, sustentable y ecológicamente amigable. En el ámbito de la innovación, como parte de una mejora tecnológica se ha buscado obtener enzimas estables y que puedan ser utilizadas en condiciones extremas de pH, temperatura, salinidad etc. Los microorganismos provenientes de ambientes extremos representan una buena fuente de este tipo de enzimas, ya que generalmente estos microorganismos precisan de este tipo de enzimas para la sobrevida en las condiciones hostiles de su hábitat. Un ambiente extremo que ha sido poco explorado en este sentido es el Desierto de Atacama. Conocido por ser el desierto más antiguo y árido del planeta, presenta condiciones ambientales que hacen que sea considerado como un ambiente extremo único en el mundo. Pese a estas condiciones adversas, diversos microorganismos han podido ser aislados desde este ambiente tan particular. Entre ellos esta Streptomyces leeuwenhoekii C34 que presenta varios grados de tolerancia a condiciones extremas. En este trabajo se realizó la búsqueda bioinformática de enzimas de interés comercial en el genoma de S. leeuwenhoekii C34. Teniendo en cuenta el gran potencial biotecnológico y diversidad de aplicaciones de las enzimas lipasas, se seleccionó el gen sle_62990 que codifica para una lipasa putativa GDSL- SGNH. Con el fin de estudiar este gen se generó la cepa LIP de S. leeuwenhoekkii C34 que sobre expresa el gen sle_62990. Con esta cepa se pudo comprobar que el gen sle_62990 codifica para una lipasa extracelular funcional y que presenta actividad contra p-nitrofenil palmitato. También se intentó la expresión heteróloga de la enzima en el medio intracelular de E. coli. Sin embargo, no se obtuvieron los resultados esperados, ya que se encontró en cuerpos de inclusión. / Currently, the use of enzymes corresponds to a growing area in the biotechnology field which has sought to solve industrial, biomedical, and domestic problems. These represent a specific, sustainable and ecologically friendly solution. Stable enzymes that can be used under extreme conditions such as high pH, temperature and salinity are of particular interest for biotechnological improvement. Microorganisms from extreme environments require these types of enzymes in order to survive under the harsh conditions of their habitat. Therefore, they represent a good source of interesting enzymes. An extreme environment that has been little explored is the Atacama Desert. The Atacama Desert is known as the oldest and driest desert on Earth. It presents extreme a environmental conditions. Despite these harsh conditions, various microorganisms have been isolated from this particular environment. Among them Streptomyces leeuwenhoekii C34, that shows several degrees of tolerance to extreme conditions. In this work, possible commercial enzymes were searched in the genome of S. leeuwenhoekii C34. Considering the great biotechnological potential and the diversity of applications of the lipases enzymes the gene sle_62990 that encoded for a putative lipase was selected. In order to study this gene, the LIP strain of S. leeuwenhoekii C34 that over-expressed the sle_62990 was generated. The over-expression allowed to confirm that the sle_62990 gene encodes for a functional extracellular lipase and it has activity against p-nitrophenyl palmitate. Attempts to heterologously express this gene in E. coli were unsuccessful.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniería en Biotecnología. / El cáncer de vesícula biliar (CVB) es una enfermedad poco frecuente a nivel mundial, no obstante, países como India, Japón y Chile poseen una elevada tasa de incidencia. En nuestro país, el CVB representa una de las principales causas de muerte por cáncer en mujeres, particularmente en la etnia Mapuche. Los principales factores de riesgo se asocian con la colelitiasis, el género y factores genéticos. Debido a que sus síntomas son inespecíficos en estadios tempranos, esta enfermedad posee un mal pronóstico al momento del diagnóstico. Los tratamientos actuales son la cirugía y la quimioterapia, ambos ineficaces en estadios avanzados. Debido a lo anterior, se hace necesario profundizar el conocimiento acerca de las características del cáncer de vesícula biliar con el fin de desarrollar terapias más eficaces. Una estrategia reportada en varias publicaciones ha sido la búsqueda e identificación de marcadores moleculares que han sido descritos como antígenos asociados a tumor (AAT) en otros cánceres, debido principalmente a que se ha demostrado su presencia en la tumorigénesis y progresión tumoral, por lo que pueden ser utilizados como blancos para dirigir inmunoterapias antitumorales. De esta forma, en esta tesis planteamos que la expresión de los marcadores moleculares; erbB2, Survivina, MAGE1, MUC1, CEA, WT1 y CA19-9 se correlaciona positivamente con el progreso de la enfermedad en los distintos estadios de pacientes chilenos con CVB y podrían constituir candidatos como blancos terapéuticos en el CVB. Para ello se determinó mediante inmunohistoquímica la expresión de cada uno de estos AAT mencionados en biopsias de tumores de 16 pacientes con diversos estadios de CVB. Nuestros resultados mostraron que un alto porcentaje de las biopsias de pacientes con CVB expresan los diferentes AAT: erbB2 (14/16), Survivina (14/16), MAGE1 (14/16), MUC1 (12/16), CEA (11/16), CA19-9 (11/16) y WT1 (14/16). Además, observamos que la expresión de los AAT evaluados es independiente del estadio en que se encontraban los pacientes. Por último, se observó que la expresión de CA19-9 en tumores se asociaría una mayor sobrevida post-diagnosis en pacientes con CVB, aunque este hallazgo debe ser confirmado estadísticamente. Esta tesis constituye un aporte en el estudio de la expresión de AAT en CVB en pacientes. Por otro lado, los resultados obtenidos, si se confirman en un número mayor de pacientes, nos permitirían proponer a los AAT estudiados como posibles blancos terapéuticos contra CVB, ya sea utilizándolos como fuentes de antígenos en inmunoterapias celulares o a través de su inhibición mediante la utilización de anticuerpos monoclonales. / Gallbladder cancer (CVB) is a rare disease worldwide, however, countries such as India, Japan and Chile have a high incidence rate. In our country, the CVB represents one of the main causes of cancer death in women, particularly in the Mapuche ethnic group. The main risk factors are associated with cholelithiasis, gender and genetic factors. Because its symptoms are nonspecific in early stages, this disease has a poor prognosis at the time of diagnosis. The current treatments are surgery and chemotherapy, both ineffective in advanced stages. Due to the above, it is necessary to deepen the knowledge about the characteristics of gallbladder cancer in order to develop more effective therapies. A strategy reported in several publications has been the search and identification of molecular markers that have been described as tumor-associated antigens (AAT) in other cancers, mainly because their presence in tumorigenesis and tumor progression has been previously demonstrated. For this reason, they can be used as targets to direct anti-tumor immunotherapies. In this way, we propose that the expression of molecular markers; erbB2, Survivina, MAGE1, MUC1, CEA, WT1 and CA19-9 correlate positively with the progress of the disease in the different stages of Chilean patients with CVB and could constitute candidates for ATT also for the CVB. To do this, the expression of each of these mentioned AATs was determined in tumor biopsies of 16 patients with different stages of CVB using immunohistochemistry. Our results showed that a high percentage of biopsies from patients with CVB express the different AATs: erbB2 (14/16), Survivin (14/16), MAGE1 (14/16), MUC1 (12/16), CEA (11 / 16), CA19-9 (11/16) and WT1 (14/16). In addition, we observed that the expression of evaluated TAA is independent of the stage in which the patients were. Finally, it was observed that the expression of CA19-9 in tumors would be associated with greater post-diagnosis survival in patients with CVB, although this finding must be confirmed statistically. This thesis constitutes a contribution in the study of the expression of AAT in CVB in patients. On the other hand, obtained results, if confirmed in a larger number of patients, would allow us to propose the TAA studied as possible therapeutic targets against CVB, either using them as antigen sources in cellular immunotherapies or through their inhibition by using of monoclonal antibodies.

Los glucosinolatos son compuestos cianogénicos naturales que se degradan por la acción de tioglucosidasas endógenas (mirosinasas) para dar lugar a isotiocianatos, tiocianatos y nitrilos; muchos de ellos han captado la atención por sus diversas propiedades biológicas, entre otras, como agentes preventores del cáncer, biopesticidas, antiafrodisiacos. Luego del secuenciamiento del genoma de Arabidopsis, se ha elucidado mejor la ruta de biosíntesis de los glucosinolatos, identificandose los primeros reguladores de la ruta, estudios de su función, así como relaciones evolutivas entre rutas parecidas. / Glucosinolates are natural cyanogenic compounds that are broken down by the action of endogenous tioglucosidases (mirosinases) to produce isothiocyanates, thiocyanate, and nitriles; many of them call the attention to researchers by diverse biological properties, such as cancer preventing, biopesticides, anti-aphrodisiacs. After the sequencing of Arabidopsis genome was completed, the glucosinolates biosynthetic process has been better elucidated, identifying the first regulators of the pathway, function research, and also the evolution relationship between similar pathways. / Tesis

Memoria para optar al título Profesional de Médico Veterinario / En este trabajo se investigó mediante fecundación in vitro, la capacidad de espermatozoides caninos refrigerados a 4 °C y frescos (controles), de atravesar la ZP, y penetrar el citoplasma ovular, de ovocitos de perra en estado inmaduro y madurados in vitro, a través de diferentes tiempos de coincubación gamética. Se trabajó con eyaculados de 5 perros adultos, el semen se obtuvo por estimulación digital, utilizando la segunda fracción espermática. Luego de la evaluación del semen, se retiró el plasma seminal por centrifugación, los espermatozoides utilizados como controles (frescos) fueron resuspendidos en medio Fert TALP y los espermatozoides que se sometieron a refrigeración se resuspendieron en extensor o diluyente en base a TRIS-yema de huevo-ácido cítrico y fueron posteriormente refrigerados a 4 °C, por 24 horas. Posterior a ese tiempo, se retiró el diluyente por centrifugación y el pellet espermático fue resuspendido en medio Fert TALP. Ambos tipos de espermatozoides -frescos y refrigerados- fueron coincubados con ovocitos de perra tanto inmaduros como madurados in vitro, en forma separada. Los ovocitos utilizados provinieron de ovarios macerados, obtenidos previamente por ovariectomía. Los ovocitos fueron seleccionados bajo la lupa estereoscópica y lavados en PBS. Posteriormente, los utilizados en estado inmaduro se ambientaron en medio de coincubación Fert TALP y luego se coincubaron con espermatozoides frescos o refrigerados. Los ovocitos que se sometieron a maduración in vitro fueron incubados en medio TCM 199 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 10 UI/mL de hCG, 2.5 μl/mL de solución piruvato y 5 μl/mL de solución antibiótica por 72 y 96 horas. Posteriormente fueron coincubados separadamente con ambos tipos de espermatozoides. La coincubación gamética se realizó por períodos de 1 a 10 horas en medio Fert TALP. Cada hora de incubación se retiraron ovocitos, se fijaron en una solución en base a ácido acético, metanol y cloroformo (3:6:2) por tres minutos, y posteriormente en ácido acético y metanol (1:3) por 72 horas a 4 °C y teñidas con 0,1% de Yoduro de Propidio para la 4 posterior evaluación de la penetración espermática y fecundación en microscopia de epifluorecencia. Un ovocito penetrado se determinó cuando se encontró espermatozoides en zona pelúcida (ZP), en espacio perivitelino (PV) o en el citoplasma ovular (C). Se utilizó análisis de varianza y de regresión para determinar diferencias en los diferentes parámetros estudiados. Se evaluaron un total de 3391 ovocitos inmaduros (n= 1765) y madurados in vitro (n= 1626). La penetración espermática fue directamente proporcional al tiempo de coincubación. El aumento del porcentaje de penetración total con espermatozoides frescos fue significativo a partir de las 3 horas en ovocitos inmaduros y 2 horas en ovocitos madurados in vitro (p< 0,05). Con espermatozoides refrigerados, los ovocitos inmaduros muestran diferencias en la penetración total a partir de las 5 horas de coincubación, en ovocitos madurados in vitro es posible observar diferencias a partir de las 2 horas. Los mayores porcentajes de penetración total se obtuvieron a partir de las 6 y 7 horas de coincubación y hacia finales del cultivo. Los espermatozoides refrigerados tuvieron un menor porcentaje de penetración que los frescos, durante todo el periodo de cultivo, excepto a la primera hora de coincubación con ovocitos madurados in vitro y espermatozoides refrigerados (p<0,05). Los ovocitos madurados in vitro fueron penetrados en mayor proporción que los inmaduros (p< 0,05), considerando todo el periodo de cultivo. Se concluye que al aumentar el tiempo de cultivo, un mayor número espermatozoides logró atravesar las cubiertas ovocitarias. Los ovocitos inmaduros y madurados in vitro son penetrados en mayor porcentaje por espermatozoides frescos respecto a aquellos refrigerados, sin embargo, los espermatozoides sometidos a refrigeración serían capaces de penetrar antes los ovocitos madurados in vitro. No obstante los ovocitos de perra inmaduros y madurados in vitro pueden ser penetrados por espermatozoides caninos frescos y refrigerados, la utilización de ovocitos madurados sería más apropiado para evaluar la capacidad fecundante de los espermatozoides frescos y criopreservados. / Proyecto FONDECYT 1030380