Made available in DSpace on 2015-10-10T02:04:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000475655-Texto+Completo-0.pdf: 1136903 bytes, checksum: 1a2ad879662fb2a0203c2418ab7dc36f (MD5) Previous issue date: 2015 / Liver fibrosis is a complex disease that is caused by inappropriate tissue repair due to the deposition of connective tissue. When a chronic lesion affects the liver, regenerative response fails and hepatocytes are replaced with abundant extracellular matrix (ECM). The imbalance between production and degradation of ECM will result in the accumulation of proteins that change normal liver architecture, and thus its functionality. The main source of ECM is the activated hepatic stellate cell (HSC). In order, to clarify possible therapeutic approaches to the disease, the this work aimed to evaluate the possible antifibrotic action of Pluchea sagitallis (Lam. ) Cabrera on an activated HSC immortalized lineage (GRX). Our results demonstrated that the P. sagittalis aqueous extract at 0. 039 and 0. 078 mg/mL concentrations was able to reduce cell growth and proliferation. Regarding to oxidative stress evaluation, there was no statistically significant difference between the treated group and the control. Staining with OilRed-O (ORO) showed a statistically significant increase in intracellular lipid content after 5 days of treatment, exerting in vitro effect on the GRX phenotypic change of activated towards the quiescent state. These results were confirmed by colorimetric quantification of lipid content. Regarding the TGF-β1 and collagen production, there were no statistically significant differences observed between the groups. In conclusion, the P. sagittalis aqueous extract reduces the growth and proliferation of GRX cells and induces the reversal of activated towards a quiescent phenotype. There was no decrease in cell proliferation either by necrosis or by apoptosis via activation of the senescence. Thus, our data suggest that the extract showed an antifibrotic effect, possibly by activating phenotype reversal. / A fibrose hepática apresenta uma patogênese complexa causada por reparo tecidual inadequado devido à deposição de tecido conectivo. Quando um dano crônico acomete o fígado, a resposta regenerativa falha e os hepatócitos são substituídos por matriz extracelular (ECM) excedente. Assim, o desequilíbrio entre a degradação e a produção de ECM acarretará no acúmulo dessas proteínas que alteram a arquitetura normal do fígado e, consequentemente, sua funcionalidade. A principal fonte de ECM é a célula estrelada hepática (HSC) ativada. Sendo assim, na tentativa de elucidar possíveis abordagens terapêuticas para a doença, o objetivo desse trabalho foi avaliar a possível ação antifibrótica do extrato aquoso de Pluchea sagitallis (Lam. ) Cabrera sobre uma linhagem imortalizada de HSC ativadas (GRX). Nossos resultados demonstraram que as concentrações de 0,039 e 0,078 mg/mL do extrato aquoso de P. sagitallis foram capazes de diminuir o crescimento e a proliferação celular. Quanto à avaliação do estresse oxidativo, não foi observada diferença estatisticamente significativa entre o grupo tratado e controle. A coloração com oil red (ORO) mostrou aumento significativo do conteúdo lipídico intracelular após 5 dias de tratamento, indicando efeito in vitro sobre a mudança fenotípica em linhagem GRX, do estado ativado para o estado quiescente. Esses resultados foram confirmados pela quantificação colorimétrica de lipídios. Em relação à produção de TGF-β1 e colágeno total, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos. Concluindo, o extrato aquoso da P. sagittalis diminuiu o crescimento e a proliferação das células GRX e induziu a reversão do fenótipo ativado para quiescente.A diminuição na proliferação celular não ocorreu nem por necrose nem por ativação da apoptose e senescência. Sendo assim, nossos resultados sugerem que o extrato apresenta um efeito antifibrótico, possivelmente pela via que ativa a reversão do fenótipo.

Orientador: Denise Bevilaqua / Banca: Fabiana Alexandrino / Banca: Versiane Albis Leão / Resumo: A recuperação de cobre a partir de calcopirita usando bactérias é o grande desafio da indústria mineradora atualmente. A biohidrometalurgia é um processo de exploração mineral bem estabelecido para a recuperação de cobre, no entanto não existe ainda um processo sendo aplicado comercialmente no mundo para a extração de cobre a partir de mineral calcopirítico. São inúmeras as alternativas que vem sendo estudada para o aumento da recuperação de cobre neste processo, a adição de cloreto é uma destas alternativas. No entanto, uma das limitações é a reconhecida inibição dos organismos acidofilicos em meio contendo cloreto. A principal bactéria envolvida neste processo é o Acidithiobacillus ferrooxidans. Esta espécie é acidofilica, mesofilica e obtém energia a partir da oxidação de íons ferrosos e compostos reduzidos de enxofre, incluindo os sulfetos metálicos, como por exemplo, calcopirita. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi estudar as linhagens da coleção do laboratório de Biohidrometalurgia na presença de íons cloreto. Para tanto as linhagens foram avaliadas quanto à capacidade de oxidarem Fe2+, enxofre elementar e calcopirita na presença de íons cloreto. Foi observada uma variação grande quanto à cinética de oxidação de íons ferrosos na presença de diferentes concentrações de cloreto. Uma ordem crescente de halotolerância foi proposta: S < SSP < V3 < LR < PCE < ATCC < SJ22 < CMV < PCEL < AMF. Quando enxofre foi utilizado como fonte de energia, todas as linhagens foram inibidas quando a produção de ácido, com exceção da linhagem PCEL. A capacidade de oxidação de calcopirita pelas linhagens também foi verificada através de ensaios respirométricos na presença de íons cloreto. Foi possível estabelecer uma ordem crescente de porcentagem de inibição das linhagens na... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nowadays, the biggest challenge for mineral companies is recover copper from chalcopyrite. Biohydrometallurgy is a well-established mineral process for copper recovery, however there is no commercial process been applied for copper recovery from chalcopyrite ore. A number of alternatives have been studied; the addition of chloride is one of them. Nevertheless, one of the restrictions is the recognized chloride inhibition of acidophilic organisms. The main bacterium involved in this process is Acidithiobacillus ferrooxidans. This specie is acidophilic, mesophilic and obtains energy from oxidation of ferrous ions and reduced sulphur compounds, including metal sulphides, like chalcopyrite. This work studied the strains of Biohydrometallurgy laboratory's collection in the presence of chloride ions. The strains were evaluated for their ability to oxidize ferrous ions, elemental sulphur and chalcopyrite in the presence of chloride ions. It was observed a wide discrepancy in the kinetics of ferrous ions oxidation in the presence of different chloride concentrations. A crescent order of halotolerance was proposed: S < SSP < V3 < LR < PCE < ATCC < SJ22 < CMV < PCEL < AMF. When sulphur was utilized as energy source, all strains were inhibiting regarding acid production, with exception for PCEL strain. The capacity of chalcopyrite oxidation was evaluated in respirometric assays in the presence of chloride ions. It was possible to establish a crescent order of percentage of inhibition in the presence of 50 mmol L-1 of chloride and chalcopyrite: (AMF ≈ LR ≈ V3) < ATCC < PCEL < SJ22 < S < SSP < CMV < PCE. The exception were the strains AMF, LR and V3, the others one presented some degree of inhibition. Copper recovery, pH, Eh, Fe2+ and Fe3+ were monitored in shake flasks experiments in two different sets: in the presence of 50 mmol L-1 and with successive... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Maria Lucia Gonsales da Costa Araujo / Banca: Sandra Regina Pombeiro Sponchiado / Banca: Carlos Osamu Hokka / Resumo: O ácido clavulânico (AC) é um composto β-lactâmico que, apesar de não ter atividade antibiótica significativa, é um potente inibidor de β-lactamases produzidas por bactérias resistentes a antibióticos β-lactâmicos. O efeito sinérgico do AC com penicilinas e cefalosporinas resulta no bloqueio do sítio ativo de β-lactamases e, assim, protege aqueles antibióticos conferindo-lhes um maior espectro de ação. O AC é produzido industrialmente por linhagens de Streptomyces clavuligerus em meios contendo fontes de N provenientes de matérias primas vegetais de baixo custo que rendem altas concentrações de produto. Porém, estes complexos protéicos, assim como estimulam o crescimento e a produção, também podem conter componentes desconhecidos que afetam negativamente o processo. Neste contexto, a utilização de meios sintéticos contendo aminoácidos (AA) pode ser uma boa alternativa. A maioria dos AA é bem assimilada por S. clavuligerus mas apenas alguns favorecem a produção de AC. Asn e Pro, por exemplo, favorecem o crescimento celular, enquanto Orn e Arg são precursores do AC e estimulam sua síntese. Desta forma, meios contendo aminoácidos como fontes de N podem apresentar vantagens significativas, pois, além de direcionar o processo de produção de AC, resultam em caldos mais homogêneos e menos viscosos que promovem melhorias na transferência de massa e calor, nas condições de monitoramento e controle, bem como nos processos de separação, recuperação e purificação do produto. No presente trabalho, utilizou-se a metodologia de planejamento fatorial de experimentos 22, com replicatas do ponto central, para otimizar empiricamente a proporção molar entre glicerol e Orn do meio suplementar sintético de processo contínuo intermitente em frascos agitados agitados (250 rpm, 28ºC). A etapa contínua era iniciada após 48 h de batelada...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The clavulanic acid (CA) is a β - lactam compound that despite not having significant bioactivity, is a potent inhibitor of β - lactamases produced by bacteria resistant to β - lactam antibiotics. The synergistic effect of CA with penicillins and cephalosporins results in blockade of the active site of β - lactamases and protects those antibiotics by giving them a greater spectrum of action. The CA is industrially produced by strains of Streptomyces clavuligerus in media containing N source of low-cost vegetable raw materials that yield high concentrations of the product. However these complex media, as well as stimulates growth and the production, may also contain unknown components that affect negatively the process. Then the use of synthetic media containing amino acid (AA) may be a good alternative. Most of AA is well metabolized by S. clavuligerus but only some of them induce the production of CA. Asn and Pro, for example, promote cell growth, while Orn and Arg are precursors of CA and stimulate its synthesis. Thus media containing amino acids may be significantly advantageous because, in addition to provide a direction for the process, result in more homogeneous and less viscous broths that promote improvements in heat and mass transfer, monitoring and controlling of the process, as well as in the processes of separation, recovery and purification of the product. In this work, the factorial design 22 of experiments methodology was used to optimize empirically the molar ratio between glycerol and Orn of the synthetic supplementary medium of an intermittent continuous process in shaken flasks (250rpm, 28ºC). The continuous process started after 48 h of batch process in a medium containing glycerol as limiting substrate, proteic extract from soybean (Soytone) as the main source of N and salts (pH 6,8 ± 0,2). Sampling and medium supplementation were accomplished every 24 h,...(Complete abstract, click electronic access below) / Mestre

Resumo: Devido ao esgotamento progressivo das jazidas de minérios de cobre com teores elevados (>2%), a aplicação de processos convencionais para a extração de cobre desses minérios, como a pirometalurgia, torna-se inviável devido ao alto custo dos gastos de energia envolvidos. Em função desse esgotamento, bem como do acúmulo de rejeitos de baixos teores (< 0,5%), a busca de processos alternativos para atender a demanda crescente desse metal em todo mundo tornou-se uma necessidade. Uma das alternativas mais viáveis envolve o uso de microrganismos capazes de solubilizar sulfetos metálicos de cobre, em decorrência de seus processos metabólicos oxidativos. O processo que utiliza esses microrganismos na recuperação do cobre de minérios de baixo teor ou de rejeitos é conhecido como biolixiviação e tem sido aplicado em escala industrial em vários países, em especial EUA e Chile, onde estão as maiores reservas mundiais de minério de cobre. Biolixiviação ou lixiviação bacteriana é o processo pelo qual bactérias, sobretudo as do gênero Acidithiobacillus e, principalmente, a espécie Acidithiobacillus ferrooxidans, oxidam sulfetos metálicos (CuFeS2, CuS, CuS2, PbS, ZnS entre outros) como fonte de energia, levando à solubilização desses metais. O A. ferrooxidans é uma espécie mesofílica, quimiolitotrófica e acidofílica que, além de sulfetos metálicos, oxida também íons ferrosos e compostos reduzidos de enxofre. Esse processo é uma alternativa viável para a extração de cobre, pois requer poucos gastos com insumos (ácidos e agentes oxidantes), apresenta reduzido gasto energético, baixo investimento de capital, baixo custo operacional e reduzida mão de obra especializada na operação. Dentre os minerais de cobre, o mais abundante e também o mais refratário ao ataque químico ou bacteriano é a calcopirita. Assim, muitos estudos foram desenvolvidos...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: High-grade copper ores deposits (>2%) have been depleted for centuries. So, conventional processes to recover copper from low-grade ores such as pirometallurgy have become prohibitive due the elevated costs, since large amount of energy is spent in this process. As a result of this depletion, a huge amount of low-grade ores (<0.5%) as well waste materials from conventional process have been accumulated for years, waiting for an economic alternative method. In order to match up a constant increase in the copper world demand, the search for new methodologies has become an obligation. Among these alternatives, the use of microorganisms capable to copper sulfides dissolution is the most feasible one. This process, known as bioleaching or bacterial leaching, has been applied in industrial scale in several countries, such as USA and Chile, where the highest copper deposits are located. Bacterial leaching is developed by certain bacteria belong to the Acidithiobacillus genus, among others, mainly by species Acidithiobacillus ferrooxidans, which oxidize metal sulfides (CuFeS2, CuS, CuS2, PbS, ZnS, etc) as its energy source, solubilizing the corresponding metal. It is a mesophilic, chemolithotrophic and acidophilic bacterium that besides metal sulfides oxidize also ferrous iron and other reduced sulphur compounds as energy source. The viability of the process is related with the low costs operation: low capital investments, reduced needs for specialized works, low reagents and materials consumption, etc. Chalcopyrite is most abundant copper mineral and, at same time, the most refractory to chemical or bacterial attack. In this way, several studies have been devoted to understand the mechanisms involved in the mineral dissolution, as well to developed new methodologies to improve chalcopyrite dissolution. It was investigated in this study the effect of some chemical agents...(Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Oswaldo Garcia Junior / Coorientador: Denise Bevilaqua / Banca: Assis Vicente Benedetti / Banca: Wilson Cervi da Costa / Mestre

Orientador: Sandro Roberto Valentini / Banca: Maria Célia Bertolini / Banca: João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa / Banca: Francisco Javier Medrano Martin / Banca: Beatriz Amaral de Castilho / Resumo: Em um rastreamento por duplo-híbrido, dois parceiros físicos de eIF5A foram identificados: Dys1 e Lia1 (Ligante de eIF5A). Lia1 foi identificada mais tarde como desoxihipusina hidroxilase. As interações físicas evidenciadas por duplo-híbrido foram confirmadas por copurificação. Mapeamento do sítios de ligação de eIF5A revelou que ambos os domínios N- e C-terminal podem ligar-se a Dys1, enquanto que o domínio Cterminal é suficiente para a ligação com Lia1. Pela primeira vez foi demonstrado in vivo que a estrutura secundária em -hélice, presente na extremidade N-terminal da proteína Dys1, pode modular a atividade da enzima através do impedimento estérico da entrada do substrato eIF5A no sítio ativo. Experimentos de inativação gênica mostraram que, em contraste com eIF5A e Dys1, Lia1 não é essencial para a viabilidade celular. Superexpressão do gene LIA1 não suprime o fenótipo temperatura-sensível de mutantes condicionais de eIF5A. Além disso, os alelos de TIF51A não são sinteticamente letais com a deleção de LIA1. Assim como previamente demonstrado para a enzima humana DOHH, o ferro também é essencial para a atividade hidroxilásica de Lia1. O sítio ativo de Lia1 é compreendido pelos resíduos de aminoácidos H79, E80, H112, E113, E116, H237, E238, H270 e E271. A proteína recombinante é uma mistura de formas ligada e não ligada ao metal, as quais foram separadas por gel nativo ou gel filtração, sugerindo um raio hidrodinâmico maior para a apoenzima. A forma mais alongada adotada por Lia1 na ausência do metal foi confirmada por ensaios de "quenching" da fluorescência do triptofano por acrilamida e SAXS. Além da alteração conformacional e inativação da enzima, a perda do metal levou à maior instabilidade de Lia1 na desnaturação térmica ou química. Os resultados obtidos em conjunto mostram que, além de manter a estabilidade da proteína...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In a two-hybrid screen, two eIF5A binding partners were identified: Dys1 and Lia1 (Ligand of eIF5A). Lia1 was further identified as deoxyhypusine hydroxylase. The two-hybrid interactions were confirmed by GST pulldown. Mapping binding sites for these proteins revealed that both eIF5A domains can bind to Dys1, whereas the C-terminal domain is sufficient to bind Lia1. We demonstrate for the first time in vivo that the N-terminal α-helix of Dys1 can modulate enzyme activity by impairing eIF5A interaction. Gene disruption studies showed that, in contrast to the essential nature of eIF5A and Dys1, Lia1 is not essential for cell viability. Overexpression of LIA1 gene does not suppress temperature-sensitivity of eIF5A mutants. Moreover, these TIF51A alleles are not synthetically lethal with a knockout strain of LIA1. Recently, It was shown that LIA1 encodes the enzyme responsible for the final step of hypusine formation, the metalloenzyme deoxyhypusine hydroxylase. As the hydroxylation step in hypusine synthesis is not required for eIF5A activity, lack of genetic interactions between these two genes is expected. As previously demonstrated for the human enzyme DOHH, iron is also essential for Lia1 hydroxylase activity. Lia1 active site is formed by aminoa cid residues H79, E80, H112, E113, E116, H237, E238, H270 and E271. The recombinat protein is a mixture of iron-bound and iron-free forms, which were separated by native gel or gel filtration, suggesting a bigger hydrodynamic radius for the apoenzyme. The elongated shape adopted by Lia1 in the absence of the metal was confirmed by acrylamide quenching of tryptophan intrinsic fluorescence and SAXS. In addition to the conformational change and enzyme inactivation, loss of iron led to higher instability of Lia1 during thermal or chemical unfolding. Taken together, the results show that, besides the ability of iron to keep the stability of the protein...(Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Resumo: Uma possibilidade para a recuperação de metais a partir de minerais com baixos teores ou de rejeitos industriais é a utilização da lixiviação com micro-organismos. A biolixiviação é o processo de oxidação bacteriana de sulfetos metálicos contendo metais de valor (por exemplo, níquel, cobre ou zinco), os quais são liberados para a solução, seguida da recuperação por técnicas metalúrgicas convencionais. Estudos de biolixiviação de concentrados de sulfetos minerais em tanques agitados e, sobretudo em pilhas, têm sido desenvolvidos em escala piloto e comercial. Entretanto, poucos trabalhos têm sido realizados sobre o aproveitamento de rejeitos minerais de processos convencionais, tais como flotação ou fusão em forno "flash", por rotas biotecnológicas. O objetivo deste trabalho foi recuperar níquel e cobre de rejeitos industriais, provenientes de processo de flotação e de fusão, utilizando bactérias, especialmente da espécie Acidithiobacillus ferrooxidans ou pelo uso de soluções ácidas, em escala de laboratório. Também foram realizados experimentos de biolixiviação de um sulfeto de níquel (pentlandita) para avaliar o processo de solubilização do metal. Conjuntamente, outros experimentos foram realizados com a finalidade de se obter novas linhagens isoladas a partir destes rejeitos minerais. Suas diferenças fisiológicas foram avaliadas. A partir dos experimentos com os rejeitos encontrou-se que com a escória foi possível obter 13% de níquel e 8 % de cobre em solução após 14 dias de lixiviação biológica. Com soluções ácidas, em pH 0,5 e 1,0, as recuperações foram de 56% de níquel e 24% de cobre em pH 0,5 enquanto que em pH 1,0 as concentrações foram de 21% e 12% de niquele e cobre, respectivamente. Para a recuperação de níquel e cobre deste rejeito sugere-se a lixiviação ácida e não bacteriana. Com a lama as porcentagens... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bacterial leaching is a feasible to recover metals from minerals with low grade or from mine wastes using microorganisms. The bioleaching process is the bacterial oxidation of valuables metals bearing sulphide minerals (e.g. nickel, copper or zinc), which are released to the solution, followed by conventional recovered by metallurgical techniques. Studies on bioleaching of sulphide minerals concentrates in stirred tanks and, particularly, in heaps, have been developed on pilot and commercial scales. However, few studies have been undertaken on using of mineral wastes from conventional processes such as flotation or flashing smelting through biotechnological routes. This work aims at recovering nickel and copper from industrial wastes such as flotation tailings and slag using bacteria, especially Acidithiobacillus ferrooxidans species, or using acid solutions at laboratory scale. Experiments were also accomplished for nickel sulfide bioleaching to evaluate the metal dissolution process, for comparison purpose. Other experiments were also carried out to obtain new strains isolated from mineral waste to study the physiological differences between them. After 14 days of bioleaching of slag it was possible to extract 13% of nickel and 8% of copper in solution while with acid solutions the extractions were 56% of nickel and 24% of copper at pH 0.5 and 21% and 12% at pH 1.0, respectively. For the metals solubilization from the slag it is suggested the acid leaching instead of bioleaching. With the flotation tailings the recoveries of nickel and copper were 23% e 16% at pH 0.5 or 1.0 while after 14 days with bioleaching the concentrations in solution were 46 % and 17% for nickel and copper. These results show that the flotation tailings can be treated with biological leaching for a higher recovery of metals. The studies of nickel sulfide bioleaching with different bacterial species reached only... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Oswaldo Garcia Júnior / Coorientador: Denise Bevilaqua / Banca: Maria Lucia Gosales da Costa Araújo / Banca: Ana Teresa Lombardi / Banca: Wilson Cervi da Costa / Banca: Luis Gonzaga Santos Sobral / Doutor

Orientador: Edwil Aparecida de Lucca Gattás / Banca: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Banca: Maristela de Freitas Sanches Peres / Banca: Rubens Monti / Banca: Eleonora Cano Carmona / Resumo: No presente trabalho, inicialmente foi feito um estudo da Metodologia de Superfície de Resposta (RSM) que tem sido adotada com muita freqüência na otimização com várias aplicações na biotecnologia. Foi feita uma revisão na literatura científica dos conhecimentos existente, onde se priorizou as bases teóricas da RSM que consiste em: trabalho preliminar, onde são determinados as variáveis independentes e seus níveis; seleção do projeto experimental com a previsão e verificação da validade da equação do modelo e, representação gráfica da equação do modelo e determinação das condições ótimas de operação. Em seguida a RSM foi aplicada na otimização de biomassa pela levedura recombinante Pichia pastoris. Pichia pastoris que é uma levedura metilotrófica, geneticamente manipulada para expressar proteínas heterólogas que são de grande valor biotecnologico na pesquisa básica e em usos industriais na produção de grande variedade de proteínas heterólogas. Glicerol quinase (GK; EC 2.7.1.30) é uma enzima chave no metabolismo do glicerol e catalisa glicerol para glicerol-3- fosfato na biossíntese de fosfolípidos. Nessa etapa foi conduzido um estudo para determinar um meio otimizado para a produção de biomassa máxima pela recombinante Pichia pastoris com cultivo em frascos agitados usando 2,31% (p/v) de glicerol como fonte de carbono. A otimização foi realizada por metodologia de superfície de resposta (RSM). Em experimentos preliminares, realizados seguindo um planejamento Plackett-Burman, o conteúdo de glicerol (Gli) e tempo de crescimento (t) foram selecionados como os fatores mais importantes na produção de biomassa. Assim, os ensaios subsequentes foram realizados para a otimização da produção de biomassa, seguindo um delineamento composto central rotacionado... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this study, was initially used to study the response surface methodology (RSM) has been adopted frequently in optimization with many applications in biotechnology. A review of scientific literature on existing knowledge, which prioritized the theoretical foundations of RSM consisting of: preliminary work, where they are certain independent variables and their levels; project selection with the prediction and experimental verification of the validity of equation model and graphical representation of the model equation and determination of optimal operating conditions. RSM was then applied to the optimization of biomass by recombinant yeast Pichia pastoris in GK4 clone obtained from a previous selection of four clones from a cloning process of genetically modified yeast. Pichia pastoris is a methylotrophic yeast that has been genetically engineered to express heterologous proteins that are prized for basic research and industrial biotechnology purposes in the production of wide variety of heterologous proteins. Glycerol kinase (GK; EC 2.7.1.30) is a key enzyme in glycerol metabolism and catalyzes glycerol to glycerol-3-phosphate in the biosynthesis of phospholipids. The present study was undertaken to determine an optimized medium for the maximal biomass production of recombinant Pichia pastoris in shaker cultures using 2.31% (w/v) glycerol as the carbon source. Optimization was carried out by response surface methodology (RSM). In preliminary experiments, performed following a Plackett-Burman design, glycerol content (Gly) and growth time (t) were selected as the most important factors on biomass production. Therefore, subsequent experiments were carried out for optimization biomass production, following a central composite rotatable design as a function of Gly and time. Gly showed to have a significant... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Resumo: A bactéria acidofílica Acidithiobacillus ferrooxidans é encontrada em ambientes inorgânicos e ácidos tais como depósitos minerais e drenagem ácida de minas, sendo a principal bactéria envolvida na biolixiviação, um processo pelo qual o metabolismo microbiano causa a solubilização do metal contido em minérios que possuam sulfetos metálicos. A adesão da bactéria à superfície do mineral com a subseqüente formação de biofilme é um pré-requisito para a dissolução do sulfeto metálico. Apesar de existirem pesquisas sobre a biogênese, a bioquímica e a regulação da formação de biofilme, o processo primário de adesão e os genes que participam destes processos têm sido pouco estudados nessa espécie bacteriana. O objetivo do presente trabalho foi analisar a adesão e o reconhecimento de grupos tióis na linhagem A. ferrooxidans LR em presença do sulfeto de cobre calcopirita (CuFeS2). Para este fim, foram selecionados onze genes descritos no genoma de A. ferrooxidans ATCC 23270, disponibilizado pela TIGR. Os genes selecionados para este trabalho são: cluster tad (tadA, tadB e tadC) envolvidos na formação de pilus e fimbrias; genes que codificam pilinas do tipo IV; genes pertencentes ao cluster Fe-S e o gene msrA que codifica uma metionina -Ssulfóxido redutase. A análise da expressão destes genes foi realizada por PCR em tempo real. Foi feita uma análise de bioinformática com o objetivo de conhecer o grau de conservação das seqüências das proteínas codificadas pelos genes e a busca de domínios conservados nessas proteínas. Além disso, foi clonada, purificada e caracterizada por métodos biofísicos uma proteína ligante de cluster Fe-S, com o objetivo de avaliá-la futuramente no processo global de biolixiviação. Os resultados de expressão a partir de PCR em tempo real de células livres e aderidas incubadas em presença de calcopirita mostraram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The acidophilic bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans is capable of causing dissolution of metals have been identified in acid mine water and mineral processing plants. Usually this microorganism is found in those places and they have been widely studied in bacterial oxidation and lixiviation in which use inorganic electron donors and fixed carbon dioxide. For this reason has been utilized for enhancing the extraction rates of metals in the ores. The mineralassociated bacteria, adhesion and biofilm formation are critical steps for colonization and subsequent mineral solubilization. Despite research of biogenesis, biochemistry and regulation of biofilm formation has been reported, adhesion process through pilus assembly mechanisms is not studied in this bacterium in spite of related genes involved in the formation of a type IV pilus and tight adherence were identified in thus genome. The objective of this work was to analysis tight adherence, type IV pilus and possibly thiol recognition cluster Fe-S genes expression for time real PCR in planktonic and adhered cells of A. ferrooxidans strain LR incubated in the presence of chalcopyrite. As well, In Silico analysis was realized for genes selected to conservation and conserved domains research. Finally, the Fe-S cluster-binding protein codified by locus Afe_0551 was cloned and expresses to characterize for spectroscopic methods. The results of gene expression revealed to level expression differences in planktonic and adhered cells incubated with chalcopyrite. The genes were unaltered or repressed after 24 h of incubation, however, the expression changed to induction after 20 dyes. Probably, the process of adhesion in first hours of incubation is favored. In the other hand, the Fe-S cluster-binding protein codified by locus Afe_0551 showed high thermal resistance and stability in widen pH range. Far-UV CD measurements showed a high structure... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Oswaldo Garcia Júnior / Coorientador: Denise Bevilaqua / Banca: Maria Célia Bertolini / Banca: Lucio Fábio Caldas Ferraz / Banca: Fabiana Alexandrino / Banca: Roberto Ruller / Doutor

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Ana Paula Ulian de Araújo / Banca: Fábio Marcio Squina / Banca: Rolf Alexander Prade / Resumo: Este trabalho descreve a caracterização funcional de alguns fatores de transcrição possivelmente envolvidos na regulação do metabolismo do glicogênio no fungo filamentoso Neurospora crassa. Em uma análise sistemática realizada com 69 linhagens mutantes em genes codificadores para fatores de transcrição, foram identificadas e selecionadas sete linhagens que apresentaram perfis diferentes de acúmulo de glicogênio, em relação à linhagem selvagem, tanto durante o crescimento vegetativo (30°C) como no estresse térmico (45°C). Com o objetivo de verificar o envolvimento dos fatores de transcrição selecionados na expressão dos genes gsn (glicogênio sintase) e gpn (glicogênio fosforilase), experimentos de Northern blot foram realizados e revelaram variações ao nível transcricional em algumas linhagens. A análise por Blast revelou que alguns fatores de transcrição haviam sido previamente estudados em N. crassa (CSP-1, RCO-1, NIT2) ou em outros organismos (PacC, FlbC, Fkh1) e participam na regulação de diferentes processos biológicos. O fator de transcrição PACC e a influência do pH externo sobre a regulação do metabolismo do glicogênio foram investigados mais detalhadamente neste trabalho. Os resultados mostraram que na linhagem selvagem o acúmulo de glicogênio e a expressão do gene gsn foram reprimidos em condições de pH alcalino, enquanto que o gene pacC foi superexpresso nesta condição. A linhagem mutante pacCKO mostrou perder a regulação sobre o acúmulo de glicogênio e expressão do gene gsn, tanto durante o crescimento em pH fisiológico (5,8) como alcalino (7,8). A análise de ligação DNA-proteína mostrou que a proteína PACC de N. crassa recombinante produzida em E. coli foi capaz de se ligar ao motif de DNA para a proteína PACC, presente na região promotora do gene gsn... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This work describes the functional characterization of transcription factors likely involved in glycogen metabolism regulation in the filamentous fungus Neurospora crassa. In a systematic analysis performed with 69 strains knocked-out in genes encoding transcription factors, seven strains were identified and selected by presenting profiles of glycogen accumulation different from that existent in the wild-type strain during vegetative growth (30°C) and under heat stress (45°C). In order to verify the involvement of the selected transcription factors in regulation of gsn (codes for glycogen synthase) and gpn (codes for glycogen phosphorylase) genes, Northern blot assays were performed. Differences in gene expression were observed in some strains compared to the wild-type strain. Blast analysis showed that transcription factors have been previously studied either in N. crassa (CSP-1, RCO-1, NIT2) or in other organisms (PacC, FlbC, Fkh1) participating in the regulation of different biological processes. The transcription factor PACC and the influence of the external pH under the regulation of the glycogen metabolism were further investigated. The results showed that in the wild-type strain the glycogen content and the gsn gene expression were repressed under alkaline conditions, while the pacC gene was overexpressed in this condition. The pacCKO strain showed impairments in the glycogen accumulation and gsn gene expression under normal pH (5.8) and alkaline (7.8) conditions. Protein-DNA binding analysis showed that N. crassa PACC recombinant protein produced in E. coli cells was able to bind to the pacC motif present in the gsn promoter. Binding specificity was confirmed by competition assays using an oligonucleotide containing the DNA motif and by binding to a DNA fragment containing the motif mutated by site-directed mutagenesis... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Reinaldo Marchetto / Banca: Eduardo Maffud Cilli / Banca: Wilton Rogério Lustri / Banca: Vani Xavier de Oliveira Junior / Banca: Herida Regina Nunes Salgado / Resumo: O sistema ParE-ParD é um sistema toxina-antitoxina bacteriano, sendo ParE a toxina e ParD a antitoxina. ParD é capaz de neutralizar a ação de ParE formando um complexo com o mesmo, o qual é eficaz na autorregulação do operon parDE. Estudos têm mostrado que a atividade tóxica de ParE ocorre inibindo a atividade da DNA girase, mas nenhum efeito desta proteína sobre a atividade da topoisomerase IV foi observado até hoje. Baseando-se na estrutura primária da toxina ParE de Escherichia coli, bem como nos escassos dados em relação a esta toxina, a meta deste trabalho foi a obtenção de peptídeos sintéticos baseados nesta proteína a fim de avaliar as sequências de aminoácidos responsáveis pela interação com as diferentes topoisomerases bacterianas, além de tentar isolar uma sequência polipeptídica com potencial atividade inibitória sobre essas enzimas. Utilizando modelagem molecular por homologia, um modelo tridimensional para toxina ParE de E. coli foi obtido e validado. Com base nos dados estruturais inferidos a partir do modelo da estrutura tridimensional de ParE, 12 peptídeos foram racionalmente desenhados e sintetizados pela metodologia da fase sólida. Ensaios de inibição in vitro da atividade de superenovelamento de DNA pela girase e de relaxamento de DNA pela topoisomerase IV foram realizados e indicaram que os peptídeos ParE3 (ParE 80-100), ParE8 (ParE 61-105), ParE10 (ParE 61-87) e ParE12 (ParE 61-79) atuam como bons inibidores de ambas enzimas. Ensaios de fluorescência intrínseca e anisotropia de fluorescência, empregando peptídeos sintéticos derivados de ParE, evidenciaram que o processo de inibição da atividade da DNA girase pela toxina ParE deve ocorrer por interação com a proteína GyrA da enzima. Foi iniciado neste trabalho os primeiros testes usando lipossomas como veículos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The operon parDE encode a toxin-antitoxin system formed by ParE toxin and its antitoxin ParD. ParD is able to neutralize ParE action and is effective in autoregulation of the operon. Studies have shown that the toxic activity of the ParE occurs by inhibiting the activity of DNA gyrase, but no effect of this protein on the activity of topoisomerase IV has been observed yet. Based on the primary structure of the Escherichia coli ParE toxin, as well as the scarce data of this toxin, the aim of this work was to obtain synthetic peptides based on this protein in order to assess the amino acid sequences responsible for interaction with the bacterial topoisomerases, besides trying to isolate a polypeptide sequence with potential inhibitory activity against these enzymes. Using molecular homology modeling, a three-dimensional model for E. coli ParE toxin was obtained and validated. Based on structural data inferred from ParE threedimensional model, 12 peptides were rationally designed and synthesized by solid-phase method. Tests of inhibition of the supercoiling reaction of the DNA gyrase and inhibition of DNA relaxation by topoisomerase IV were performed and indicated that the peptides ParE3 (ParE 80-100), ParE8 (ParE 61-105), ParE10 (ParE 61 -87) and ParE12 (ParE 61-79) act as good inhibitors of both enzymes. Intrinsic fluorescence and fluorescence anisotropy assays, using synthetic peptides derived from ParE showed that inhibition process of activity of the DNA gyrase by ParE toxin must occur by interaction with the GyrA protein. In this work was started the first tests using liposomes as carrier vehicles for bioactive peptides derived from ParE. The peptides were efficiently encapsulated in soybean phosphatidyl choline liposomes. It was observed, although reduced, inhibition of bacterial growth when peptides encapsulated in liposomes were... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor