Orientador: Sandro Roberto Valentini / Coorientador: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Alexandra Ivo de Medeiros / Banca: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Banca: Érico Tosoni Costa / Banca: Dirce Maria Carraro / Resumo: Ácido retinóico (AR) regula a transcrição de uma série de genes envolvidos em proliferação celular, diferenciação celular e apoptose através de sua ligação com o receptor de ácido retinóico (RAR) ligado com o receptor de retinóide X (RXR) na forma de heterodímero. A proteína ligante de ácido retinóico celular (CRABP2) é envolvida no transporte do AR do citoplasma para o núcleo, atuando assim como uma proteína coativadora dos receptores retinóides nucleares. Com o objetivo de melhor entender o mecanismo de sinalização celular por ácido retinóico envolvendo CRABP2, foi utilizado o sistema de duplo-híbrido em levedura como uma ferramenta para identificação de interações físicas proteína-proteína. Um total de 20 proteínas candidatas ligantes de CRABP2 foram identificadas no rastreamento de duplo-híbrido, das quais cinco são relacionadas com regulação da transcrição, mais especificamente com o processo de remodelagem da cromatina: polipeptídeo do complexo T (TCP1), histona H3/família 3A (H3F3A), histona H3/família 3B (H3F3B), tubulina beta (TUBB) e fator associado ao CTD relacionado com SR (SCAF1). Esses resultados sugerem um papel mais direto de CRABP2 na remodelagem de cromatina e poderá revelar novos aspectos da regulação da transcrição mediada por receptores de ácido retinóico. Além disso, também foi abordado neste trabalho um estudo dos níveis de expressão dos receptores de ácido retinóico em resposta a agentes desmetilantes / Abstract: Retinoic acid (RA) regulates the transcription of a series of genes involved in cell proliferation, differentiation and apoptosis by binding to RA Receptor (RAR) and Retinoid X Receptor (RXR) heterodimers. The cellular retinoic acid-binding protein 2 (CRABP2) is involved in the transport of RA from the cytosol to specific RA receptors in the nucleus, acting as a coactivator of nuclear retinoid receptors. In order to have a better understanding of the mechanism of cellular signaling by retinoic acid involving CRABP2, we used the yeast two-hybrid system as a tool for the identification of physical protein-protein interactions. A total of twenty putative CRABP2-interacting proteins were identified in the two-hybrid screen, out of which five are related to transcription regulation, more specifically to the process of chromatin remodeling: t-complex 1 (TCP1); H3 histone, family 3A (H3F3A); H3 histone, family 3B (H3F3B); tubulin beta (TUBB) and SR-related CTD-associated factor 1 (SCAF1). These results suggest a more direct role for CRABP2 in chromatin remodeling and may reveal new aspects of the control of transcription by RA receptors. Furthermore, we have also investigated the expression levels of the retinoic acid receptors, in mammalian cells in response to demethylating agents / Doutor

Orientador:Maria Lucia Gonsales da Costa Araujo / Banca: José Roberto Ernandes / Banca: Ruy de Souza Junior / Banca: Alberto Colli Badino Junior / Banca: José Gregório Cabrera Gomez / Resumo: Cefamicina C é um antibiótico produzido por Streptomyces clavuligerus de grande interesse, em virtude de seu maior grau de resistência a enzimas do tipo β-lactamases comparativamente a outros antibióticos beta-lactâmicos. Cefamcina C é produzida em pequenas concentrações na natureza assim como acontece com todos os metabólitos secundários. Assim, investimentos em programas de melhoria de linhagens e de otimização de meios de cultura e operação de biorreatores são aspectos-chave para o aumento da produção industrial. Porém, a eficácia de tais estratégias pode ser limitada, o que requer o uso de novas abordagens. Neste sentido, a engenharia metabólica é uma área importante que alia ferramentas de quantificação de fluxos metabólicos e de técnicas de biologia molecular para melhoria de linhagens. O estudo dos fluxos metabólicos permite, por meio de análise criteriosa do metabolismo do micro-organismo, identificar gargalos metabólicos na rota biossintética de um produto de interesse para, posteriormente, propor possíveis soluções para o aumento da produção. No presente projeto realizou-se o estudo dos fluxos metabólicos de S. clavuligerus com vistas a encontrar formas de operação do metabolismo que conduzam a aumentos da produção de cefamicina C. Para isto, primeiramente foi desenvolvido um meio de cultivo quimicamente definido contendo maltose como fonte de carbono e lisina como fonte de nitrogênio, para que análises do caldo fermentado não tivessem interferência de componentes desconhecidos. Tal meio possibilitou a obtenção de biomassa em torno de 9 g.L-1 e cefamicina C ao redor de 200 mg.L-1 em processo contínuo. Este modo de operação foi possível somente em biorreator devido ao controle de pH, pois em shaker as variações deste parâmetro inviabilizaram o processo. Paralelamente, foi construído um modelo metabólico com 78 reações e 81 metabólitos, sendo 10 externos e 71 internos, que ... / Abstract: Cephamycin C is an antibiotic produced by Streptomyces clavuligerus of great interest due to its higher degree of resistance to β-lactamases as compared to other beta- lactam antibiotics. Cephamycin C is produced in small concentrations in nature as with all secondary metabolites. Therefore, investments in improvement of strains and optimization, of culture media and operation of bioreactors are key aspects to increase the production. However, the effectiveness of such strategies may be limited, requiring the use of new approaches. In this aspect, the metabolic engineering is an important field that combines quantification of metabolic fluxes and molecular techniques for improving strains. The study of metabolic fluxes enables one to identify metabolic bottlenecks through careful analysis of metabolism of the microorganism, and to suggest ways to increase production. In this project we carried out the study of metabolic fluxes in S. clavuligerus aiming to find ways to increase the production of cephamycin C. For this, first we developed a chemically defined culture medium because this kind of media does not cause interference in the analyses. The developed medium contained maltose as carbon source and lysine as nitrogen source and resulted in 9 g.L-1 of biomass and 200 mg.L-1 of cephamycin C in the continuous process. This mode of operation was only possible in the bioreactor due to its pH control. Due to variations in the pH, the continuous process in shaken-flasks became unviable. The metabolic model was constructed with 78 reactions and 81 metabolites (10 external and 71 internal) which suitably described the metabolism of S. clavuligerus. This model was simulated with the aid of Optflux, a multi-task software developed for this purpose. The profiles of maltose, lysine, biomass, cephamycin C, clavulanic acid, external protein and CO2 evolution were monitored. These data were used for the model simulations. The results allowed... / Doutor

Orientador: Rubens Monti / Banca: Sandra Regina Pombeiro Sponchiado / Banca: Eleonora Cano Carmona / Resumo: Neste trabalho foi utilizada a metodologia de superfície de resposta, por meio de delineamento composto central rotacional para investigar as melhores condições de produção de xilanase pelo fungo filamentoso Aspergillus niger. Este micro-organismo é considerado um bom produtor de enzimas xilanases, sendo que estas enzimas têm a capacidade de hidrolisar xilana em xilooligossacarídeos e xilose. Produtos assim obtidos estão sendo cada vez mais utilizados em rações animais para melhoria da flora intestinal; para a produção de xilitol e também para a produção de álcool de segunda geração. A análise estatística dos resultados obtidos neste trabalho mostrou que as melhores condições de produção da enzima extracelular foram: pH 5,0, temperatura de 37 ºC, agitação de 80 rpm, e concentração de fonte de carbono de 2 % (p/v). Após a determinação das condições ideais, o extrato foi clarificado por filtração em caulim, e as proteínas assim obtidas foram precipitadas com acetona ocorrendo uma melhora sensível na atividade específica. Após filtração em Sephadex G-75 foi mostrada a presença de atividade xilanolítica em dois picos, e as frações referentes ao segundo pico foram reunidas e submetidas à coluna de troca iônica DEAE-Trisacryl, na qual se constatou uma fração sendo eluída com 0,06 mol/L de NaCl, contendo atividade de xilanase. A SDS-PAGE da fração majoritária revelou uma única banda protéica com massa molar aparente de 34 kDa. A cromatografia em sílica gel P60 revelou que os produtos de hidrólise foram constituídos de xilooligossacarídeos, após 120 min de hidrólise / Abstract: In the present work, response surface methodology was utilized, through appliance of rotational central composite design to investigate the best conditions of production of xylanase by the filamentous fungus Aspergillus niger. This microorganism is considered a good producer of xylanase enzyme, which has the ability to hydrolyze hemicelluloses in xylooligosaccharides and xylose. Products obtained this way are being increasingly utilized in animal feeding to improve the intestinal flora, to produce xylitol and also to produce second generation ethanol. The statistical analysis of the obtained results showed that the best conditions for the extracellular enzyme production were: pH 5.0, 37 ºC, 80 rpm shaking, and 2 % (w/v) carbon source concentration. After the determination of the ideal production conditions, the enzyme extract was clarified through filtration in kaolin, and the protein obtained were precipitated with acetone, with a sensitive increase in the specific activity. After molecular exclusion chromatography in Sephadex G-75 the presence of xylanolitic activity was shown in two peaks, and the fractions related to the second peak were collected and submitted to DEAE-Trisacryl ion exchange column, in which were observed fractions showing xylanase activity that was eluted with 0.06 mol/L NaCl. SDS-PAGE of the majority fraction revealed only one proteic band with apparent molar mass of 34 kDa. P60 silica gel chromatography revealed that the product of hydrolysis was constituted of small xylooligosaccharides released after 120 min of hydrolysis / Mestre

Orientador: Rubens Monti / Banca: Daniela Alonso Bocchini Martins / Banca: Maristela de Freitas Sanches Perez / Banca: Eleonora Cano Carmona / Banca: Marcos Filice / Resumo: As xilanases são glicosidases que catalisam a hidrólise das ligações 1,4-β-xilosídicas da xilana e que possuem potencial biotecnológico em vários processos industriais, como na clarificação de sucos e vinhos, na fabricação de pães, na filtração da cerveja e no tratamento das polpas celulósicas. Recentemente, recebem atenção pela produção dos xilooligossacarídeos como ingredientes prebióticos. Embora possuam diversas vantagens sobre os métodos químicos, as enzimas são, geralmente, limitadas para uso industrial. A imobilização em suportes sólidos melhora a estabilidade dos biocatalisadores e o controle operacional, promovendo a recuperação do produto sem a contaminação pela enzima. Assim, os objetivos deste trabalho foram: produzir e caracterizar a xilanase de Aspergillus niger; imobilizar covalentemente, em suportes sólidos, a xilanase de A. niger e quatro outras, provenientes de diferentes fontes (Aspergillus versicolor, Trichoderma longibrachiatum, Thermomyces lanuginosus e Streptomyces halstedii); caracterizar os derivados obtidos; analisar o produto de hidrólise da xilana pelos derivados. A xilanase de A. niger mostrou ótima estabilidade até 55°C, com meia-vida de 15 minutos a 60°C, e sua produção foi induzida por pequenas concentrações de xilose. O fungo secretou pelo menos duas isoformas com atividade xilanolítica. A xilanase I foi purificada em uma única etapa, por adsorção em suporte ativado com quelatos, assim como a enzima de S. halstedii, contendo cauda de histidina. A xilanase de T. longibrachiatum (comercial) foi parcialmente purificada com suportes iônicos, e as de T. lanuginosus (comercial) e A. versicolor já apresentavam alto grau de pureza. As enzimas foram imobilizadas em agarose ativada com diferentes grupos reativos, com fatores de estabilização entre 12 (T. lanuginosus) e 600... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Xylanases are glycosidases that catalyze the hydrolytic cleavage of β-1,4-linked polymers of D-xylose and they have biotechnological potential in various industrial processes such as in the clarification of juices and wines, in the manufacturing of breads, in beer filtration and in the treatment of cellulose pulps. Recently, attention is given to the production of xylo-oligosaccharides as prebiotic ingredients. While enzymes have several advantages over chemical methods, they are generally limited for industrial use. Immobilization on solid supports improves the stability of the biocatalyst and the operational control, and promotes the easy recovery of the product without contamination by the enzyme. The objectives of this study were: to produce and characterize xylanases from Aspergillus niger; to immobilize the xylanase of Aspergillus niger and four others from different sources (Aspergillus versicolor, Trichoderma longibrachiatum, Thermomyces lanuginosus and Streptomyces halstedii) covalently on solid supports; to characterize the derivatives obtained; to analyze the products profile of xylan hydrolysis by the derivatives. The xylanase of A. niger showed excellent stability up to 55°C, with a half-life of 15 minutes at 60°C, and its production was induced by low concentrations of xylose. The fungus produced at least two isoforms with xylanolytic activity. Xylanase I was purified in one step by adsorption on support activated with chelates, as well as the histidine-tagged enzyme of S. halstedii. The xylanase of T. longibrachiatum (commercial) was partially purified with ionic supports, and those from T. lanuginosus (commercial) and A. versicolor already showed high degree of purity. The xylanases were then immobilized on agarose activated with different reactive groups, and presented stabilization factors between 12 (T. lanuginosus)... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:08:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000400848-Texto+Completo-0.pdf: 845159 bytes, checksum: 8c58174c9e78cd5ecdd6aca7c1bd46db (MD5) Previous issue date: 2008 / This thesis is about the central role biotechnology has played in the constitution and understanding of subjectivity in contemporary society. Initially, using conceptual ideas by Latour and Foucault, this study analyses political, ethical and institutional issues involved in the PhD research process. Then, looking at every day life elements, the research analyses the proliferation of biotechnology and the intensification of its discourses. Through combining methodologies from Science Studies and Foucauldian archaeology and genealogy, the range of discourses about biotechnology in scientific and media communications is explored. Scientific journals, newspapers, magazines, TV and internet resources were collected and analysed. Based on this research, we observe that biotechnologies are ‘transmuting’ the ways we conceive the realms of biology, life, body and “self”. Subsequently, it is argued that in contemporary society biotechnology has established itself as a new dispositive, in the Foucauldian sense. It is suggested that biotechnologies are making possible the constitution of a new kind of human being – a hybrid human non-human subject constituted by organic and nonorganic matters and whose subjectivity will be presently called ‘biotechnological’. The relations between different notions of subjectivity are analysed pointing to the historical emergence of these concepts linked with fields of knowledge and power as well as rationalities of government. Finally, critical insights are provided regarding psychology’s participation in the contemporary network, where biotechnologies become more significant to the understanding of the world and what we are becoming. Some of the new and traditional psychological interventions are problematized based on the analysis of the alliances with biotechnologies.In all, this thesis concludes by considering the contribution of Bruno Latour and Michel Foucault towards policies of research and production of knowledge in psychology in relation to the changes of contemporary society. / Este estudo versa sobre a centralidade que as biotecnologias vêm assumindo na constituição e compreensão da subjetividade na contemporaneidade a partir de uma pesquisa que analisa a proliferação das biotecnologias e a intensificação de enunciados sobre as mesmas na vida cotidiana. Tomando as ferramentas conceituais oferecidas pelos trabalhos de Bruno Latour e Michel Foucault, iniciase esta tese pela análise da constituição da mesma, que é permeada por questões políticas, éticas, institucionais e teóricas. Em seguida, aponta-se para transmutações que as biotecnologias vêm provocando nos modos de conceber o biológico, a vida, o corpo e o ‘eu’, sustenta-se que, na contemporaneidade, a biotecnologia tem se constituído em um novo dispositivo político, no sentido utilizado por Foucault. Compondo uma abordagem metodológica com base nos estudos científicos e na arquegenealogia foucaultiana, explora-se a dispersão de enunciados sobre biotecnologias em comunicações científicas e midiáticas (retiradas de periódicos científicos, jornais, revistas, televisão e internet). Sugerese a constituição de um modo de ser biotecnológico, ou seja, sujeitos híbridos de humanos e não-humanos compostos por substâncias orgânicas e não-orgânicas. A partir disso são analisadas as relações entre diferentes noções de subjetividade, que emergem historicamente vinculadas a campos de saber e poder, bem como racionalidades de governo. Por fim, discute-se como a psicologia participa dessa rede contemporânea em que as biotecnologias tornam-se cada vez mais importantes para a compreensão do mundo e daquilo que estamos nos tornando. Considerando as novas alianças do campo psi com as biotecnologias, são problematizadas algumas intervenções tradicionais e recentes da psicologia.Além disso, pontua-se nesta tese a contribuição de Bruno Latour e Michel Foucault para os modos de fazer pesquisa e produzir conhecimento na psicologia, frente às mudanças e desafios da sociedade contemporânea.

O cádmio (Cd) é considerado um metal extremamente tóxico à maioria dos organismos. As plantas constituem a principal forma de entrada deste metal na cadeia alimentar. O tomate, uma espécie amplamente utilizada para consumo humano, foi recentemente identificado como hiperacumulador de Cd. Diante disso, o presente trabalho objetivou quantificar o teor de Cd nas folhas e frutos de seis cultivares de tomate, bem como caracterizar os genes possivelmente envolvidos na tolerância e na hiperacumulação de Cd nesta espécie. Para tanto, as cultivares de tomate foram cultivadas na presença da dose de Cd de 90 mg Kg-1 ou na ausência deste metal. Simultaneamente, foi procedida uma busca de genes ortólogos aos HMAs (HMA1 – HMA4) de Arabidopsis thaliana, os quais formam um grupo de transportadores de metais, incluindo o Cd. Através desta busca, foi identificado em tomate um ortólogo ao HMA1 de A. thaliana. A expressão do HMA1 e também do LeNRAMP3, LeFER, LeIRT1 e LeNRAMP1, os quais são genes envolvidos no transporte de metais em tomate, foi comparada entre as plantas cultivadas com e sem Cd. Na maioria das cultivares de tomate, todos os genes avaliados foram responsivos ao Cd, sendo verificado um aumento nas expressões em resposta a presença do metal no substrato. Todas as cultivares de tomate utilizadas foram caracterizadas como hiperacumuladoras de Cd e foram capazes de acumular o metal nos frutos. No intuito de caracterizar o papel do HMA1 durante o processo de hiperacumulação de Cd em tomate, este gene foi empregado nas etapas que compõem o silenciamento gênico induzido por vírus (VIGS). O silenciamento do HMA1 não teve efeito na acumulação de Cd na parte aérea de tomate. Por outro lado, o silenciamento deste gene resultou na redução do peso seco das raízes e no aumento da intensidade dos sintomas de clorose nas plantas cultivadas com Cd a 0,7 mM. Em conjunto, os resultados indicam que o tomate representa um organismo modelo atrativo para a elucidação dos mecanismos envolvidos na tolerância e na hiperacumulação de Cd. / Cadmium (Cd) is considered an extremely toxic metal to most organisms. Plants are the main pathways for Cd entry into the food chain. Tomato, a species widely used for human consumption, was recently identified as a Cd hyperaccumulator. Therefore, this study aimed to quantify Cd content in leaves and fruits of six tomato cultivars, as well as characterize the genes possibly involved in Cd tolerance and hyperaccumulation in this species. To this end, the tomato cultivars were grown in the presence of Cd at 90 mg kg-1 or in the absence of the metal. Simultaneously, a search for orthologous genes to HMAs (HMA1 - HMA4) from Arabidopsis thaliana was performed, these genes are a group of metal transporters, including Cd. By this search, was identified an ortholog of HMA1 from A. thaliana in tomato. The expression of HMA1 and also of the genes LeNRAMP3, LeFER, LeIRT1 LeNRAMP1, which are involved in transport of metals in tomato, was compared between plants grown with and without Cd. In most tomato cultivars, all genes were responsive to Cd, and it was verified an increase in expression in response to the metal presence. All the tomato cultivars used were characterized as Cd hyperaccumulators and were able to accumulate the metal in the fruits. In order to characterize the role of the HMA1 during the process of Cd hyperaccumulation in tomato, this gene was used in the steps that comprise the virus induced gene silencing (VIGS). The silencing of HMA1 had no effect on Cd accumulation in tomato shoot. On the other hand, this gene silencing resulted in a reduction of the roots dry weight and in an increased severity of the symptoms of chlorosis in plants grown with 0.7 mM of Cd. Taken together, these results indicate that tomato represents an attractive model organism for elucidation of the mechanisms involved in Cd tolerance and hyperaccumulation.

Marismas são ecossistemas entremarés altamente produtivos que suportam grandes variações de salinidade e são cobertos por vegetação herbácea adaptada que abriga diversos microrganismos. Os objetivos do presente trabalho foram isolar e avaliar a diversidade e o potencial biotecnológico de leveduras associadas ao filoplano de macrófitas aquáticas de uma marisma da Ilha da Pólvora – RS. Foram realizadas cinco coletas de hastes e folhas de três espécies de macrófitas Scirpus maritimus, Spartina alterniflora e Spatirna densiflora entre junho de 2012 e janeiro de 2013. As amostras foram colocadas em solução de Tween 20 a 0,5% e incubadas a 200 rpm por 30 minutos. Em seguida foram realizadas diluições decimais seriadas (10-1, 10-2 e 10-3) e um volume de 0,1mL foi inoculado em ágar malte levedura acidificado ao pH 4.0 e suplementado com 0.04% de cloranfenicol e 0.01% de bifenila. As placas foram incubadas por 7 dias a 20 – 25 oC e as colônias isoladas e purificadas em meio Glucose Yeast Peptone. Isolados de leveduras e fungos leveduriformes foram agrupados de acordo com a morfologia de colônia e testados quanto a afinidade ascomicética ou basidiomicética em meio uréia/DBB. O potencial biotecnológico dos isolados foi avaliado por meio de testes enzimáticos para a produção das enzimas de interesse industrial amilase, esterase, caseinase, celulase, gelatinase e lipase. As leveduras que obtiveram maior produção também foram testadas quanto à capacidade de degradar o corante azóico Acid Red 357. Foram obtidos 102 isolados, 37 leveduras de afinidade basidiomicética, 27 leveduras de afinidade ascomicética e 38 fungos leveduriformes. Cinco linhagens tiveram as regiões D1/D2 e/ou região ITS do DNA sequenciadas, sendo duas delas pertencentes à espécie Hortaea werneckii, de importância clínica. Dos 102 isolados, todos produziram lipase, 63,7% esterase, 50% gelatinase, 47% amilase, 45% caseinase e 45% celulase. As linhagens testadas no meio com o corante azóico obtiveram crescimento muito rápido e foram capazes de clarear a cor do meio, porém devem ser futuramente testadas em outras concentrações de corante para uma melhor visualização do resultado. Os resultados do trabalho demonstram o grande potencial biotecnológico de leveduras e fungos leveduriformes associados ao filoplano de plantas de marismas e, portanto, sua capacidade de contribuir para o avanço da biotecnologia. / Salt marshes are highly productive intertidal ecosystems that support large variations in salinity and are covered by herbaceous vegetation that home many microorganisms. The objectives of this study were to isolate and evaluate the diversity and the biotechnological potential of yeasts associated with phylloplane of aquatic weeds in a salt marsh on the island of Pólvora - RS. Five surveys were carried, between June 2012 and January 2013, and stems and leaves of three species of macrophytes, Scirpus maritimus, Spartina alterniflora and Spartina densiflora, were collected. The samples were placed in 0.5% Tween 20 solution and incubated at 200 rpm for 30 minutes. Decimal serial dilutions (10-1, 10-2 and 10-3) were performed, and a volume of 0.1 mL was inoculated onto YM acidified to pH 4.0 and supplemented with 0.04% chloramphenicol and 0.01% biphenyl. Plates were incubated for 7 days at 20 - 25 ° C, and colonies were isolated and purified in GYP medium. Isolates of yeasts and yeast-like fungi were grouped according to colony morphology, and tested for ascomycetous or basidiomycetous affinity in urease / DBB medium. The biotechnological potential of the isolates was assessed by enzymatic assays for the production of enzymes of industrial interest amylase, esterase, caseinase, cellulase, lipase and gelatinase. Yeasts with the greatest production were also tested for their ability to degrade azo dye Acid Red 357. 102 yeast isolates were obtained, 37 with basidiomycetous affinity, 27 with ascomycetic affinity and 38 yeast-like fungi. Five strains had the D1 / D2 regions and / or the ITS region of rDNA sequenced, two of which is Hortaea werneckii, a species of clinical importance. Of the 102 isolates, all produced lipase, 63.7% esterase, 50% gelatinase, 47% amylase, 45% caseinase and 45% cellulase. The strains tested in the medium with the azo dye grew very rapidly, and were able to lighten the color of the medium, but they must be further tested in other dye concentrations for a better evaluation of the result. Our results demonstrate the great biotechnological potential of yeasts and yeast-like fungi associated with the phylloplane of macrophytes, and therefore their ability to contribute to the advancement of biotechnology.

A indústria coureira tem se deparado com novos desafios e a necessidade de melhorar e otimizar processos, a fim de atingir a qualidade exigida em seus artigos finais bem como atender a legislação ambiental. A utilização de enzimas na produção de couros é uma alternativa para a redução do impacto ambiental desta atividade. As enzimas comerciais existentes, ainda não possuem especificidade suficiente, tampouco suas características são conhecidas em detalhes. Além disso, sua atividade é determinada utilizando caseína como substrato, sendo que as peles bovinas não possuem esta proteína. Desta forma, é importante que características tais como atividade sobre colágeno e queratina sejam conhecidas, bem como que sejam buscadas novas enzimas para aplicação na indústria do couro e avaliada detalhadamente sua ação nos processos de ribeira. Neste trabalho, foram caracterizadas cinco enzimas comerciais, normalmente, aplicadas às etapas de remolho, caleiro e purga. Para tanto, foram testadas diferentes temperaturas, valores de pH, a estabilidade térmica das mesmas, bem como a ação de inibidores e produtos químicos comumente utilizados em conjunto com as enzimas. A temperatura ótima de ação das enzimas ficou em torno de 55°C, em valores de pH que variaram de 9 a 12, as enzimas se mostraram estáveis a 37°C e perderam totalmente sua atividade quando expostas durante 120 min. a 55°C. Com base nestes dados, foram isoladas e selecionadas, a partir de lodo da estação de tratamento de efluentes de um curtume, 10 bactérias produtoras de enzimas com possibilidade de aplicação na produção mais limpa de couros, isto é, como substituintes de produtos químicos no processo. Dentre estas 10, duas bactérias com morfologias distintas foram escolhidas para estudos mais detalhados, porém, as duas colônias foram identificadas como Bacillus subtilis e serão chamadas neste trabalho de BLBc 11 e BLBc 17. O meio de cultivo, o pH e a temperatura foram otimizados através do planejamento experimental. Para a seleção das variáveis significativas para a produção de proteases, uma variedade de fontes de carbono (glicose, maltose, glicerol), fontes de nitrogênio (extrato de levedura, peptona, farelo de soja), sais inorgânicos (sulfato de magnésio, cloreto de cálcio, sulfato de ferro heptahidratado) foram testados e identificados através do planejamento experimental Plackett-Burmann. Para a bactéria BLBc 11, os fatores que apresentaram efeito significativo para o meio de cultivo foram extrato de levedura, peptona e farelo de soja, os quais foram otimizados através de um planejamento composto central rotacional (CCR). O pH e a temperatura foram otimizados através da utilização de um planejamento fatorial, ambos apresentaram efeito significativo sobre a produção de proteases. Para a bactéria BLBc 17 o pH e a temperatura foram otimizados através de um planejamento CCR. Após estas etapas, as enzimas produzidas pelas bactérias BLBc 11 e 17 foram caracterizadas e aplicadas na etapa de depilação de peles bovinas. A ação enzimática foi avaliada com base na quantificação de proteínas interfibrilares e hidroxiprolina liberados para o banho residual, além da avaliação das amostras obtidas em microscópio óptico e de varredura. Análises comparativas (DQO, BDO e nitrogênio total) entre o processo convencional e o processo usando enzimas foram realizadas e demonstraram que o processo proposto neste trabalho tem grandes perspectivas de sucesso. / Leather industry has been facing with new challenges and the need to improve and optimize processes in order to achieve required quality in their final articles as well as meet the environmental legislation. The enzymatic treatment of leather is a promising technology. However, the reaction kinetics of commercial enzymes available to the leather industry are not fully understood and their activities have been mainly determined over model proteins such as casein as substrate, which is absent in cattle hides. Therefore, it is important to determine their activities on collagen and keratin, the main proteins of skin; and also the screening and isolation of new enzymes in order to use these enzymes in leather processing. In this work, were tested five commercial proteases, normally applied during soaking, liming and bating operations. Thus, were tested different temperatures, pH values, the thermal stability of the enzymes and the action of inhibitors and chemicals commonly used together with them. Kinetics of temperature and pH of enzymes were very similar for all five enzymes, with maximal activities around 55°C and 9 to 12, respectively. The enzymes were stable at 37 °C and lost completely its activity when exposed for 120 min. at 55 °C. Based on these data, were isolated and selected from a tannery treatment effluent, 10 bacteria producing enzymes with potential application in cleaner leather production. Among these 10, two bacteria with different morphologies were chosen for detailed study; however, the two colonies were identified as Bacillus subtilis and will be called in this work BLBc 11 and BLBc 17. The culture medium, pH and temperature of cultivation were optimized through experimental design. For the selection of significant variables for protease production, a variety of carbon sources (glucose, maltose, glycerol), nitrogen sources (yeast extract, peptone, soybean meal), inorganic salts (magnesium sulfate, calcium chloride, heptahydrate ferrous sulfate) were tested and identified via Plackett-Burmann design experiments. For bacterium BLBc 11, the factors that presented significant effect for protease culture medium were yeast extract, peptone and soybean meal, these were optimized using a central composite design (CCD). The pH and the temperature were optimized using factorial design, both presented significant effect. For bacterium BLBc 17 pH and temperature were optimized using a CCD. After these steps, the enzymes produced by bacteria BLBc 11 and 17 were characterized and applied in cattle hide unhairing. This step was evaluated measuring inter-fibrillary proteins and hydroxyproline released into the bath, and also using optical and scanning electronic microscopy. Comparative analysis (COD, BOD and total nitrogen) between conventional and enzymatic process were made and show that the proposed process have excellent prospects of success.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Educação, Programa de Pós-graduação em Educação, 2012. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2012-06-20T23:30:24Z No. of bitstreams: 1 2012_NuritRachelBensusan.pdf: 1212804 bytes, checksum: 9ac83f04b91371f44d145a15799da871 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-21T11:50:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_NuritRachelBensusan.pdf: 1212804 bytes, checksum: 9ac83f04b91371f44d145a15799da871 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-21T11:50:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_NuritRachelBensusan.pdf: 1212804 bytes, checksum: 9ac83f04b91371f44d145a15799da871 (MD5) / Com o crescente papel da ciência e da tecnologia em nossa vida, surge cada vez mais um questionamento sobre como se dão e quem são os atores envolvidos nos processos de tomada de decisão sobre essa agenda. Diversas iniciativas no sentido de democratizar esses processos vem sendo desenvolvidas, incluindo, muitas vezes, propostas de formar o público para que ele possa se engajar. Para entender a importância do tema, foi realizada um exame do desenvolvimento de questões como a conservação da biodiversidade e a biotecnologia, mostrando seu potencial de reconfigurar nosso futuro. Analisou-se também as tendências da popularização da ciência e particularmente as iniciativas de formação e de engajamento do público em questões de ciência e tecnologia. Os museus de ciência emergem como instituições fundamentais para desempenhar esse papel e capitanear esse tipo de iniciativas. Um conjunto de entrevistas com gestores de museus de ciência brasileiros analisou as tendências no país no que concerne o papel dessas instituições e discutiu as possibilidades de realizar atividades com a finalidade de ajudar a formar o público para a participação nos processos de tomada de decisão em ciência e tecnologia no Brasil. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / With the increasing role of science and technology in our lives, questions about how and who are the ones involved in the decision making processes related to this agenda are arising. Many initiatives connected to the democratizing of these processes have being developed, including frequently, proposals of forming the public aiming at his engagement. An analysis of the development of issues as biodiversity conservation and biotechnology was held to highlight their potential in reshaping our future. Science popularization trends were also examined, particularly the public engagement initiatives in science and technology issues. Science museums emerged as fundamental institutions to play this role. A set of interviews with Brazilian science museums managers provided an analysis of the tendencies in the country concerning the role of these institutions and a discussion on the possibilities of promoting activities with the goal of helping to form the public to foster his participation in decision making processes related to science and technology.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Molecular, 2010. / Submitted by Fernanda Weschenfelder (nandaweschenfelder@gmail.com) on 2010-11-10T19:47:58Z No. of bitstreams: 1 2010_EvelineQueirozdePinhoTavares.pdf: 10549437 bytes, checksum: 9aa3d943af10dc802ad268d781829074 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-12-08T22:54:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_EvelineQueirozdePinhoTavares.pdf: 10549437 bytes, checksum: 9aa3d943af10dc802ad268d781829074 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-12-08T22:54:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_EvelineQueirozdePinhoTavares.pdf: 10549437 bytes, checksum: 9aa3d943af10dc802ad268d781829074 (MD5) / O Bioetanol é um combustível alternativo particularmente interessante, pois paralelamente às técnicas já estabelecidas pela indústria sucroalcooleira no Brasil, são geradas imensas quantidades de bagaço-de-cana, um resíduo bastante sub-aproveitado. Este pode apresentar de 40 a 50% de celulose, polímero resultante da repetição de unidades de Dglicose unidas por ligações ß-1,4. Estas podem ser alvo de enzimas celulolíticas produzidas principalmente por fungos filamentosos. O emprego de estratégias envolvendo sistemas heterólogos para produção destas enzimas pode favorecer o alcance dos níveis máximos de produção em prazos inferiores aos observados em sistemas nativos, além de facilitar a purificação da proteína recombinante. Neste trabalho, foi realizada a caracterização parcial da endoglicanase A (EG A) de Aspergillus nidulans, enzima de interesse biotecnológico incluída no projeto da rede Bioetanol (MCT/FINEP), onde nosso grupo desenvolve a meta de “Produção de celulases recombinantes em sistema heterólogo de Pichia pastoris”. As construções para clonagem envolveram promotores induzíveis por metanol, sendo o vetor de expressão obtido dirigido para integração no genoma de P. pastoris. Assim, após clonagem e transformação desta levedura metilotrófica, foi realizada a expressão heteróloga desta enzima seguida de sua purificação parcial. Empregando o sobrenadante dos clones recombinantes, foi obtido um produto heterólogo com atividade máxima em carboximetilcelulose (CMC) a partir de 24 h de indução. Após purificação empregando ultrafiltração e filtração em gel, a enzima recombinante foi caracterizada, atuando preferencialmente em pH ácido (de 4,5 a 5,0) e temperatura próxima a 50oC, em torno da qual esta enzima apresentou-se termoestável a 45 e 55oC por cerca de 48 h. Foi observado um incremento de 30 a 80% nos valores de atividade diante da incubação com Co2+, DTT e ß-mercaptoetanol. A degradação de substratos alternativos mostrou-se significativa somente na incubação com CMC e, em menor extensão, em papel de filtro. Além disso, a análise de atividade em gel e o perfil eletroforético das amostras das etapas da purificação confirmaram a massa molecular de 34 kDa, conforme esperado. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Bioethanol is an alternative fuel of particular interest because in Brasil, the techniques used in fuel industry generate an enormous amount of a by-product, which could be further degraded: the sugarcane bagasse. It can presents 40-50% of cellulose content, which is a polymer composed by repeated units of D-glucose, linked by ß-1,4 bonds. These bonds can be cleaved by cellulolytic enzymes produced specially by filamentous fungi. The use of heterologous expression strategies to produce these enzymes can be advantageous in order to higher levels of production in shorter periods compared as those observed with wild type enzymes, besides the feasibility of recombinant protein purification methods. In this work, we describe the partial characterization of endoglucanase A (EG A), produced by Aspergillus nidulans. On account of the biotechnological interest, this enzyme was included in the project of the Bioethanol net (MCT/FINEP), and our group was responsible for developing the “Recombinant cellulases production employing Pichia pastoris as a heterologous expression system. The cloning vector was constructed using methanol-induced promoters, with the foreign DNA being directed to be integrated in the Pichia pastoris genome. Finally the enzyme was partially purified and characterized. To examine whether higher levels of activity towards CMC would occur, we used the supernatant of the recombinant clones. We observed the highest level of activity after 24h of induction. After ultrafiltration and gel filtration purification procedures, we characterized an enzyme that acts preferentially at pH 4, which is thermostable at a temperature of approximately 50ºC. It was observed an increased enzyme activity when the enzyme was incubated in the presence of Co2+, DTT and ß-mercaptoethanol. The hydrolysis of lignocellulosic substrates was significant only with CMC and, at a lesser extent, with filter paper. Also, the analysis of activity in gel and the electrophoretic profile of the purified samples confirmed the molecular mass of 34 kDa, as predicted.