Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2013-07-15T23:42:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 225093.pdf: 325315 bytes, checksum: d212dc9ded12ee738948d769206717c9 (MD5) / Fungos como os basidiomicetes podem crescer e frutificar em substratos lignocelulósicos em função de sua capacidade de produzir enzimas hidrolíticas e oxidativas e as liberar para o meio extracelular. Resultado disso é a degradação da lignocelulose e correspondente produção de biomassa vegetativa. O monitoramento da degradação pode fornecer importantes informações sobre a eficiência na conversão da lignocelulose. No presente trabalho definiu-se o perfil enzimático de Agaricus brasiliensis em cultivo tradicional (Substrato compostado) e axênico (Substrato não compostado), assim como monitorou-se a produção de massa miceliana e a degradação da lignocelulose através de análises da lignina Klason, espectroscopia de infravermelho (FTIR), pH e relação C/N. A. brasiliensis produziu enzimas como lacase, manganês peroxidase, ß-glicosidase e xilanase em ambos substratos. A atividade de lacase foi elevada quando comparada a Mn peroxidase, principalmente em cultivo axênico. A xilanase apresentou níveis mais elevados de atividade enzimática em cultivo tradicional. Houve a formação de maior massa miceliana em cultivo tradicional. A atividade de lacase e a biossíntese de proteínas apresentaram correlação significativa com a biomassa vegetativa produzida em cultivo tradicional. No cultivo tradicional houve aumento na concentração relativa de lignina, em cultivo axênico houve redução. Os espectros de infravermelho evidenciaram consumo mais acentuado dos polissacarídeos (1110cm-1) no cultivo tradicional. As variações de pH evidenciaram uma tendência para acidificação em ambos substratos. A relação C/N reduziu-se no tradicional e elevou-se no axênico. Os resultados obtidos indicam que o fungo tem maior facilidade de crescimento em substratos degradados, no entanto, pode crescer nos dois tipos de substratos, utilizando os componentes lignocelulósicos de forma diferenciada.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2013-07-16T01:08:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 221599.pdf: 325315 bytes, checksum: d212dc9ded12ee738948d769206717c9 (MD5) / Fungos como os basidiomicetes podem crescer e frutificar em substratos lignocelulósicos em função de sua capacidade de produzir enzimas hidrolíticas e oxidativas e as liberar para o meio extracelular. Resultado disso é a degradação da lignocelulose e correspondente produção de biomassa vegetativa. O monitoramento da degradação pode fornecer importantes informações sobre a eficiência na conversão da lignocelulose. No presente trabalho definiu-se o perfil enzimático de Agaricus brasiliensis em cultivo tradicional (Substrato compostado) e axênico (Substrato não compostado), assim como monitorou-se a produção de massa miceliana e a degradação da lignocelulose através de análises da lignina Klason, espectroscopia de infravermelho (FTIR), pH e relação C/N. A. brasiliensis produziu enzimas como lacase, manganês peroxidase, ß-glicosidase e xilanase em ambos substratos. A atividade de lacase foi elevada quando comparada a Mn peroxidase, principalmente em cultivo axênico. A xilanase apresentou níveis mais elevados de atividade enzimática em cultivo tradicional. Houve a formação de maior massa miceliana em cultivo tradicional. A atividade de lacase e a biossíntese de proteínas apresentaram correlação significativa com a biomassa vegetativa produzida em cultivo tradicional. No cultivo tradicional houve aumento na concentração relativa de lignina, em cultivo axênico houve redução. Os espectros de infravermelho evidenciaram consumo mais acentuado dos polissacarídeos (1110cm-1) no cultivo tradicional. As variações de pH evidenciaram uma tendência para acidificação em ambos substratos. A relação C/N reduziu-se no tradicional e elevou-se no axênico. Os resultados obtidos indicam que o fungo tem maior facilidade de crescimento em substratos degradados, no entanto, pode crescer nos dois tipos de substratos, utilizando os componentes lignocelulósicos de forma diferenciada.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:22:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 319058.pdf: 1195939 bytes, checksum: 7a16d693bd3b53a8e32368cbf4998a3e (MD5) Previous issue date: 2013 / A quitosana é um polímero de larga aplicação, destacando-se por ser estável, atóxico, filmogênico e apresentar potencial elétrico natural. Apresenta também biodegradabilidade, biocompatibilidade e mucoadesividade, além de ação antioxidante e antimicrobiana. Em geral, a quitosana é um produto derivado da quitina de crustáceos oriundos da indústria pesqueira. Seu fornecimento é afetado por instabilidades climáticas, carecendo de controle de qualidade e padronização da matéria-prima. Adicionalmente, os processos de extração são demorados e com considerável impacto ambiental. Estudos têm evidenciado o potencial de produção de quitosana prontamente extraível de microrganismos. Esse processo tem a vantagem do total acompanhamento do processo, do baixo custo e a possibilidade de controle de qualidade da matéria-prima. Além do mais, os processos de extração e purificação são mais rápidos e menos poluentes. Nesse contexto, a possibilidade de uma produção padronizada, aliada à extração facilitada e menor probabilidade de efeitos toxicológicos dos extratos de origem marinha, são diferenciais que motivaram este trabalho. O Laboratório de Bioprocessos da UFSC vem trabalhando no desenvolvimento de processos para o cultivo de microrganismos em biorreatores para produção de biomassa e obtenção de substâncias bioativas, sendo este trabalho parte de suas pesquisas. Além de avaliar biomassa residual da extração de betaglucanas e glucomananas de um fungo basidiomiceto para a obtenção de quitosana, também se isolou e estudou o processo de produção e extração de aminopolissacarídeos de cultivo submerso em biorreator airlift e biorreator de tanque agitado. Optou-se por metodologias de extração heterogênea (termoquímica) e os resultados obtidos apontam consideráveis diferenças entre os dois fungos. As diferenças são relacionadas tanto aos cultivos, quanto aos processos necessários para a extração dos materiais de interesse, além do rendimento, produtividade e qualidade dos mesmos. Os resultados reafirmam que fungos da ordem Mucorales destacam-se como alternativa para a produção de amino polissacarídeos, sobretudo quitosana. Assim, a busca por novos isolados, o aprimoramento das condições de cultivo e de extração dos compostos são os indicativos importantes a serem seguidos .<br>

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:10:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 318382.pdf: 1686846 bytes, checksum: 51ac5e51f122726f40392a9cb814daf3 (MD5) Previous issue date: 2013 / No presente trabalho transfectamos uma cepa de Leishmania amazonensis com um plasmídeo contendo o gene da ?-galactosidase, visando estabelecer um ensaio colorimétrico para triagem de compostos ativos contra amastigotas intracelulares de leishmania. A transfecção não alterou o crescimento de promastigotas em cultura, a infectividade de células THP-1 e de camundongos Balb/c. A atividade da enzima foi diretamente proporcional ao número de parasitos. A inibição do crescimento dos parasitos intracelulares pelo fármaco de referência Anfotericina B, determinada tanto pelo método colorimétrico quanto por contagem microscópica dos parasitos, produziu resultados semelhantes, validando o ensaio. O teste colorimétrico também foi aplicado com sucesso para avaliar a atividade de uma classe de moléculas análogas e derivadas do ácido gálico. O estudo da correlação estrutura atividade mostrou que estas moléculas possuem uma atividade leishmanicida pouco seletiva. Algumas melhorias como a transfecção integrativa e estável, bem como padronização deste método com outras espécies de Leishmania ainda são desejáveis. Contudo, o ensaio com L. amazonensis expressando ?-galactosidase foi robusto, sensível, reprodutível e rápido na avaliação da atividade leishmanicida de compostos <br>

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:20:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 318765.pdf: 2373273 bytes, checksum: e329a10e5147d84d16e405ecda427b9c (MD5) Previous issue date: 2013 / A maior parte do plantio nacional de maçãs é feita nos estados da região sul. Devido a eventos que comprometem a qualidade dos frutos, observam-se perdas anuais significativas na produção. A perspectiva dessas perdas pressiona o setor agroindustrial na busca por alternativas que agreguem mais valor aos frutos não destinados ao consumo in natura. Além da utilização destes na produção de suco, a obtenção de produtos diferenciados como a sidra mostra-se como uma das alternativas. A sidra é uma bebida alcoólica feita a partir do suco fermentado de maçãs, por um processo semelhante ao da produção de espumantes a partir de uvas, mas resultando num produto com menores teores de álcool. Vários fatores podem interferir na qualidade das sidras, sendo que as leveduras utilizadas e as condições de fermentação têm sido apontadas como os fatores que mais influenciam as características finais dessa bebida. Nesse contexto, este trabalho trata do isolamento de leveduras e de estudos visando agrupar e caracterizar isolados para essa finalidade. Os estudos foram de caráter preliminar, visando a criação de recursos para estabelecimento dessa linha de pesquisa. Embora tenha sido isolado mais de 200 leveduras, principalmente oriundas de atividades de maleicultura, neste trabalho apresentam-se os resultados obtidos de um grupo de 81 leveduras. A busca e caracterização de linhagens de leveduras iniciadoras para diferentes resultados enológicos e que predominem durante a fase fermentativa poderão permitir melhor controle do processo produtivo, além de estabelecer padrões elevados e duradouros, resultando em sidras de alta qualidade. <br> / Abstract: Most of the Brazilian national crop of apples is made in the southern states. Due to events that compromise the quality of the fruits, there are significant annual losses in production. The prospect of such losses presses the agribusiness sector to seek alternatives to add greater value to the fruit not destined for fresh consumption. Besides the use in the production of juice, differentiated products such as cider is shown as an alternative. Cider is an alcoholic beverage made from fermented apple juice, through a process similar to the production of sparkling wine from grapes, but resulting in a product with lower alcohol levels. Several factors can interfere with the quality of ciders, and the yeasts and fermentation conditions have been identified as the factors that most influence the final characteristics of this drink. In this context, this work had the objective of isolating yeasts and developing studies to determine and characterize the best candidates for the production of cider. The studies were preliminary in nature in order to create resources for the establishment of this line of research. While we have isolated over 200 yeasts, primarily from apple orchards and processing facilities, in this work we present the results obtained for only 81 of them. The search and characterization of potential yeast strains for different starting and oenological properties that prevail during the fermentation phase, may allow better control of the production process, and establish high standards for the obtainment of high quality ciders.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T12:47:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338219.pdf: 1806932 bytes, checksum: cb4e68c860e46d1c5b4be98ef954ceed (MD5) Previous issue date: 2015 / Na levedura S. cerevisiae os carboidratos sacarose, maltose e maltotriose são fermentados por vias metabólicas diferentes: a sacarose é hidrolisada pela invertase extracelular (codificada pelos genes SUC), enquanto maltose e maltotriose são ativamente transportadas para dentro da célula e hidrolisadas pelas a-glicosidases presentes no citoplasma (ambas proteínas codificadas pelos genes MAL). Os genes SUC também permitem a síntese de uma forma intracelular da invertase, uma enzima com nenhuma função óbvia em leveduras. No entanto, a sacarose pode também ser metabolizada por células de levedura através dos transportadores e a-glicosidases codificados pelos genes MAL. Nossos resultados mostram que a maltotriose pode ser também eficientemente fermentada pelas células de S. cerevisiae através de seu transporte ativo mediado pela permease AGT1, um transportador MAL necessário para utilização de maltotriose, e sua hidrólise intracelular mediada pela invertase intracelular. A cepa brasileira industrial utilizada na produção de etanol combustível CAT-1 não pode fermentar maltotriose eficientemente devido ao promotor do AGT1 ser defeituoso. Para aumentar a fermentação de maltotriose por esta levedura, colocamos um promotor constitutivo (PGPD) à frente do gene AGT1 presente na cepa CAT-1, gerando a linhagem GMY05. No entanto, esta linhagem não foi capaz de fermentar eficientemente a maltotriose. Por outro lado, quando esta linhagem foi modificada para sobre-expressar a forma intracelular da invertase, por substituição da sequência sinal do gene SUC2 com o promotor constitutivo PADH1, a cepa iSUC2 obtida (GMY08) fermentou maltotriose eficientemente. Utilizando condições em que os genes MAL não são expressos, foi possível mostrar que a forma intracelular da invertase é capaz de hidrolisar a maltotriose (mas não maltose ou p-nitrofenil-a-glicosídico). Assim, os nossos resultados indicam uma sobreposição inesperada no metabolismo de sacarose e maltotriose por células de levedura, indicando que a invertase intracelular pode hidrolisar da maltotriose, e oferece novas abordagens a ser aplicadas para otimizar várias fermentações industriais que utilizam hidrolisados de amido, incluindo a panificação, produção de bebidas destiladas e cerveja, ou inclusive bioetanol.<br> / Abstract : It is well known that in the yeast S. cerevisiae the sugars sucrose, maltose and maltotriose are metabolized by different pathways: sucrose is hydrolyzed by the extracellular invertase (encoded by SUC genes), while maltose and maltotriose are actively transported into the cell and hydrolyzed by intracellular a-glucosidases (both proteins encoded by MAL genes). Furthermore, the SUC genes also allow the synthesis of an intracellular form of invertase, an enzyme with no obvious function in yeasts. We have already shown that sucrose can be metabolized by yeast cells through MAL-encoded transporters and a glucosidases. Now, our results will show that maltotriose can be efficiently fermented by S. cerevisiae cells through its active transport mediated by the AGT1 permease, a MAL transporter required for maltotriose utilization, and its intracellular hydrolysis mediated by the cytoplasmic invertase. The Brazilian industrial fuel-ethanol strain CAT-1 cannot ferment maltotriose efficiently due to a defective promoter of the AGT1 gene. To increase maltotriose fermentation by this strain, we placed a strong promoter (PGPD) in the AGT1 gene of strain CAT-1, generating strain GMY05. While the AGT1 gene was indeed over-expressed in this strain (measured by real-time PCR), maltotriose was still not fermented efficiently. However, when we over-expressed the intracellular form of invertase, by replacing the signal sequence of the SUC2 gene with the strong PPGK promoter, the resulting iSUC2 strain GMY08 fermented maltotriose efficiently. Using conditions were the MAL-encoded a glucosidases could not be expressed, we showed that the intracellular form of invertase could hydrolyze maltotriose (but not maltose or p-nitrophenyl-a-glucoside). Thus, our results indicate an unexpected overlap in sucrose-maltotriose metabolism by yeast cells, showing that the intracellular invertase allows efficient maltotriose hydrolysis, and offers new approaches that can be applied to optimize several industrial fermentation processes that use starch hydrolysates, including production of bread, distilled beverages and beer, or even bioethanol.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-01-17T03:12:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 343183.pdf: 1791663 bytes, checksum: ffcd0e0328ec869dd2ed5761aec6b98b (MD5) Previous issue date: 2016 / A entomologia forense tem se mostrado muito importante no Brasil e no mundo. Cada vez mais academia e institutos de perícia têm visto a importância dessa ciência na resolução de casos judiciais. Em medicina legal, a maior parte dos estudos é focado na família Calliphoridae, no entanto, temos observado que a família Sarcophagidae é tão frequente em cadáveres humanos quanto os califorídeos. Entre os motivos dos sarcofagídeos não estarem entre as espécies mais estudadas, acreditamos que a dificuldade de identificação morfológica seja o principal deles, isso porque as chaves dicotômicas são em sua maioria voltadas apenas aos machos, sendo necessária a exposição do aparelho genital dessas moscas. Dessa forma, esse trabalho teve como objetivo traçar o perfil molecular de machos da família Sarcophagidae, a fim de possibilitar futuras identificações por métodos moleculares das principais espécies de Sarcophagidae encontradas na Grande Florianópolis. Para isso os machos coletados foram identificados pelos métodos taxonômicos convencionais. Posteriormente foi feita a padronização das técnicas de extração de DNA e PCR. O gene utilizado para as análises foi COI, por ser o padrão em estudos de Barcode. Por fim, foram estabelecidos os padrões de caracterização molecular das espécies por RFLP-PCR e sequenciamento. Os métodos apresentados se mostraram eficientes para a identificação molecular de 8 das 10 espécies coletadas.<br> / Abstract : Forensic entomology has been very important in Brazil and worldwide. Increasingly universities and crime scene labs have seen the importance of this science in solving court cases. In forensic medicine, most studies are focused on the Calliphoridae family, however, we have observed that the Sarcophagidae family is so often in human bodies as the blowflies. Among the reasons of sarcofagídeos are not among the most studied species, we believe that the morphological identification of difficulty is the main one, because this dichotomous keys are mostly directed only to males, requiring exposure of the genital tract of these flies. Thus, this study aimed to trace the molecular male profile of Sarcophagidae family in order to enable future identification by molecular methods of the main species found Sarcophagidae on great Florianópolis. For this the collected males were identified by conventional taxonomic methods. After, the standardization of DNA extraction and PCR techniques. The gene used for the analyzes was COI, to be the standard in studies with Barcode. Finally, patterns of molecular characterization of the species RFLP-PCR and sequencing were established. The methods presented were effective for molecular identification to 8 of the 10 species collected.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-02-07T03:12:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 343942.pdf: 1729219 bytes, checksum: 19fb9d251379c101884db85376fb7d60 (MD5) Previous issue date: 2016 / Os oceanos consistem no maior habitat para a vida microbiana. Para sobreviver a estes diferentes ambientes, as bactérias sofreram adaptações em suas estruturas químicas, físicas e biológicas. As enzimas derivadas de organismos marinhos, especialmente aqueles de águas profundas, têm se tornado interessante para a indústria biotecnológica devido à sua superior adaptação a condições extremas (tais como a resistência a stress osmótico, pressão e temperatura). Atualmente, o sequenciamento do genoma é uma das abordagens que permite conhecer o potencial genético do microrganismo com baixo custo. Erythrobacter citreus LAMA 915, uma Alphaproteobacteria oligotrófica facultativa foi isolada de amostras de água do mar, coletadas a 3600 metros de profundidade, na Elevação de Rio Grande, a uma temperatura de 2,5°C. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo e sequenciar o genoma de E. citreus LAMA 915 e identificar os genes envolvidos na resposta ao stress ambiental e quanto ao potencial biotecnológico. Uma vez sequenciado o genoma e montado, obteve-se um genoma com de 3,09 Mbp em 28 contigs, 2959 ORF e 52 RNA. Foram encontrados quais os genes envolvidos na resposta a stress osmótico, térmico, pressão hidrostática bem como na de privação de nutrientes. Além disso, genes de relevância industrial foram prospectados na E. citreus LAMA 915. Os genes envolvidos no metabolismo de alcanos descritos classificam a E. citreus LAMA 915 como potencial agente de biorremediação de áreas contaminadas por petróleo. Foram encontradas duas rotas metabólicas de produção de polihidroxialcanoatos (PHA), uma sendo clássica, que envolve os genes phaA e phaB; e uma segunda rota, está ß-oxidação devido à proximidade do gene phaC com o gene tesb 1. Além disso, este microrganismo também apresentou um grupo genes envolvidos na produção de lipases (fosfolipase A2, fosfolipase B, fosfolipase C e fosfolipase D), as quais podem ser usadas na indústria (produção de biodiesel). Em resumo, foram encontrados os genes que conferem a E. citreus LAMA 915 a valiosa habilidade de colonizar habitats extremos. Além disso, este microrganismo apresente um repertório genético de relevância para indústria biotecnológica.<br> / Abstract : The deep sea environments shelter in the largest volume of life on Earth. To survive in such different environments, bacteria need to adapt its chemical, physical and biological structures. Enzymes derived from marine organisms, particularly from deep sea environments, have drawn the interest of the biotechnological industry due to their intrinsic features such as osmotic resistance. Nowadays, genome sequencing is one of the approaches used for bioprospection analysis. Erythrobacter citreus LAMA 915, a facultative oligotrophic Alphaproteobacteria, was isolated from sea water collected at 3600 meters depth at 2.5°C at Rio Grande Raise. In this context, the present study aimed at sequencing of the genome of E. citreus LAMA 915 and identification of genes involved in the environmental stress response and potential bio-technology process. Its genome was sequenced and the assembly produced a genome with 3.09 Mbp, 28 contigs, 2959 ORF and 52 RNA. Genes involved in environmental response to osmotic stress, thermal stress, hydrostatic pressure and also starvation was found. Further, E. citreus LAMA 915 presented genes related to potential biotechnology process, including genes of interest to industry. As example, we can mention genes involved in metabolism of alkanes, which have impact on oil spill and classify E. citreus as a potential bioremediation agent for petroleum contaminated areas. Regarding to polyhydroxyalkanoates (PHA), a biopolymer, we found two possible routes: the classical route, which involves the phaA and phaB genes; and a second one, that can be ß-oxidation due to proximity of the phaC gene with the tesb 1 gene. E. citreus LAMA 915 also presented a set of lipase (phospholipase A2, phospholipase B, and phospholipase C and phospholipase D), which can be used in biodiesel yield. In summary, we found a set of genes that confers to E. citreus LAMA 915 the ability to colonize habitats with different available nutrients. In addition, its genetic repertoire indicates their potential to be used in different biotechnology areas.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-03-28T04:10:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 344604.pdf: 1015682 bytes, checksum: 335d990113d5b4c936026c9464b3f875 (MD5) Previous issue date: 2016 / O Cryptococcus neoformans, agente etiológico da criptococose é uma levedura encapsulada de distribuição mundial. A doença é oportunista para pacientes imunocomprometidos, mas também pode acometer indivíduos imunocompetentes. A infecção pelo fungo resulta de inalação de basidiósporos presentes no ambiente e pode causar infecção pulmonar sintomática ou assintomática autolimitada ou permanecer latente dentro de um granuloma. O fungo está classificado em três variedades: C. neoformans var grubii (sorotipo A) de distribuição mundial, C. neoformans var neoformans (sorotipo D) e C. neoformans var gattii (sorotipos B e C) e o híbrido sorotipo AD encontrados nas regiões tropicais e subtropicais. No Brasil, as três variedades são reportadas como agentes etiológicos da criptococose em humanos. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrência do fungo Cryptococcus neoformans em amostras ambientais na Serra Catarinense e avaliar a variabilidade genética dos isolados. Excretas de pombos (720 amostras) e folhas de eucalipto (240 amostras), foram coletas no período de Abril de 2014 a Março de 2016 em intervalo de 3 meses em 18 municípios da Serra Catarinense e processadas para isolamento do fungo em meio de cultura Níger cloranfenicol a 37oC. Foram isoladas 17 amostras, todas do município de Lages e a caracterização morfológica, produção de urease, produção de melanina e quimiotipagem em meio CGB permitiram identificar presuntivamente os isolados como pertencentes ao gênero Cryptococcus. A amplificação do gene CAP59 e a restrição do fragmento amplificado com as enzimas de restrição AvaII e HaeIII permitiu identificar todos os isolados com C. neoformans var. grubii tipo A e a tipagem molecular através de PCR-fingerprinting utilizando o iniciador M13 revelou que todas as amostras pertencem ao padrão molecular VNI. Os resultados mostram que apenas C. neoformans var. grubii tipo A, padrão molecular VNI foi identificado nas amostras ambientais na Serra Catarinense.<br> / Abstract : Cryptococcus neoformans, the causative agent of cryptococcosis is an encapsulated yeast-like fungus of worldwide distribution causing a common opportunistic infection on immunocompromised patients, but also affecting immunocompetent individuals. The infection occurs via inhalation of environmental basidiospores and may lead to symptomatic or asymptomatic pulmonary disease that can be often self-limited or remain latent within a granuloma in the lung. The fungus has three varieties as follows: C. neoformans var. grubii (serotype A) worldwide distributed, C. neoformans var. neoformans (serotype D) and C. neoformans var. gattii (serotypes B and C), as well as the hybrid serotype AD are found in tropical and subtropical regions. Since human cryptococcosis in Brazil is caused by all three varieties, we have addressed in this study the occurrence and typing of C. neoformans obtained from environmental samples from the Serra Catarinense. Pigeon excreta (720 samples) and eucalyptus leaves (240 samples) were collected between April 2014 and March 2016 in a 3 months interval at the municipalities of the Serra Catarinense and processed for fungus isolation in Niger chloranphenicol medium at 37oC. A total of 17 samples were isolated from the municipality of Lages. Morphological characterization, urease and melanin production and chemotyping in CGB medium, led us to presumptively identify the isolates belonging to the genus Cryptococcus. The PCR/RFLP analysis of the CAP59 gene using HaeIII and AvaII allowed identification of the isolates as C. neoformans var. grubii type A. Molecular typing using PCR-fingerprinting with M13 primer revealed that all samples belong to NIV molecular pattern. Our results indicate the exclusive presence of C. neoformans var. grubii type A VNI in environmental samples from the Serra Catarinense.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-20T17:57:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 191341.pdf: 1032344 bytes, checksum: 181147078a68df06b4226956b74fa506 (MD5) / O presente trabalho apresenta os resultados referentes à otimização de um protocolo para a extração de DNA a partir de acículas de plantas adultas de Araucaria angustifolia e critérios para o armazenamento e conservação do material vegetal, além da otimização e adaptação de protocolos para as técnicas RAPD e AFLP, bem como o teste de transferibilidade de iniciadores para marcadores microssatélites de Pinus sp para A. angustifolia. A capacidade informativa destes marcadores para análise da diversidade genética de A. angustifolia foi testada em uma população natural do Parque Ecológico Municipal de Lages/SC, a qual já havia sido estudada com marcadores isoenzimáticos e RFLP-PCR. Observou-se que o acondicionamento e armazenamento das acículas é um fator crucial para a qualidade do DNA extraído. A quantidade de DNA obtido nas extrações variou entre 66 a 400 mg por grama de tecido, com um valor médio de 147,3 mg para os materiais acondicionados em sílica gel. Materiais acondicionados em caixas térmicas com gelo resultaram em DNA com qualidade inferior, com uma média de 137,3 mg. Materiais armazenados por até três meses a -20°C resultaram em menor quantidade de DNA, com qualidade inferior. O protocolo otimizado resultou em DNA com baixa contaminação por proteínas, com razão OD260/OD280 entre 1,7 e 2,0 em 80% das amostras analisadas. Com o protocolo otimizado para a técnica RAPD, 10% dos iniciadores utilizados revelaram polimorfismo quando testados em indivíduos de duas populações, todavia, apenas 7,5% revelaram polimorfismo quando somente a população de Lages foi analisada. Os seis iniciadores utilizados revelaram 18 bandas polimórficas. O protocolo adaptado para a técnica AFLP possibilitou um número variável de bandas polimórficas, entre nenhuma e 29 bandas, dependendo da combinação de iniciadores utilizada. Dentre 29 iniciadores para marcadores microssatélites testados, somente dois geraram produtos amplificados em A. angustifolia, sem, no entanto serem utilizados para a análise da diversidade genética da população, devido à característica das bandas. A análise da diversidade genética da população foi realizada a partir de 18 marcadores RAPD, 62 marcadores AFLP e com os 80 marcadores agrupados. A diversidade genética estimada pelo índice de Shannon foi de 0,53, 0,54 e 0,54, respectivamente. Os dendogramas de similaridade genética gerados também apresentaram grande coerência entre as três situações testadas. O nível de diversidade genética estimado com esses marcadores foi superior àquele obtido com marcadores isoenzimáticos e RFLP-PCR utilizados anteriormente por outros pesquisadores. Os resultados obtidos neste trabalho levam à conclusão que o armazenamento das folhas e o processo de extração do DNA são cruciais para o sucesso de estudos utilizando marcadores baseados na análise direta do DNA e confirmam a hipótese de que marcadores RAPD e AFLP são poderosas ferramentas para estudos genéticos em A. angustifolia, devido à sua capacidade de acessar aleatoriamente, amplas regiões genômicas. Já o baixo nível de transferibilidade de iniciadores microssatélites deve-se, provavelmente, à grande distância taxonômica entre as espécies utilizadas no estudo, caracterizando a necessidade do desenvolvimento de iniciadores para regiões microssatélites específicos para A. angustifolia.