Tese de mestrado integrado. Engenharia Electrotécnica e de Computadores - Major em Telecomunicações. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2008

Tese de mestrado. Métodos Computacionais em Ciências e Engenharia. Faculdade de Engenharia, Faculdade de Ciências. Universidade do Porto. 2005

Aunque en España los aislados más comunes de CTV son poco agresivos, en otros países suelen predominar aislados más virulentos que producen los síndromes de amarilleo (seedling yellows, SY) y acanaladuras en la madera (stem pitting, SP) en pomelo o naranjo dulce que conllevan a una disminución en la producción y calidad de los frutos. Por ello, el objetivo general de esta tesis ha sido el desarrollo de herramientas para controlar los aislados más virulentos de CTV. Para poner a punto un sistema genético eficaz que permitiera identificar los determinantes de patogenicidad de los síntomas de SY y SP se utilizó como base el aislado agresivo de origen español T318A (inductor de SY y SP), que ha sido caracterizado biológica y molecularmente. Una peculiaridad de este aislado es la presencia en su población de RNAs defectivos de gran tamaño que poseen capacidad de replicación autónoma que podrían servir como minireplicones naturales para el desarrollo de un sistema genético. Para poder evaluar la eficacia replicativa de los futuros clones de cDNA se desarrolló un protocolo de RT-PCR cuantitativa a tiempo real con SYBR Green que permite la detección y cuantificación de forma fiable de CTV en distintos tejidos y especies huésped y ha permitido identificar correctamente el 91% de los aislados como virulentos (inductores de SY, SP o ambos) o no virulentos por el valor de la temperatura de fusión (Tm) de sus productos de amplificación. A su vez, para identificar aislados potencialmente peligrosos en campo (inductores de SP en pomelo o naranjo dulce) se desarrolló un nuevo protocolo de RT-PCR a tiempo real con tres sondas Taqman tipo LNA, que permiten la detección y cuantificación de variantes de secuencia características de aislados no virulentos, virulentos inductores de SP y virulentos tipo T36 (inducen SY pero no SP). Este nuevo protocolo se aplicó al análisis de la población viral de plantas co-inoculadas con un aislado no virulento y otro inductor de SP para estudiar la capacidad invasiva y de acumulación de cada aislado. Por último, en el desarrollo de un sistema genético basado en T318A se ensayó en primer lugar su capacidad para replicarse en protoplastos de Nicotiana benthamiana. La construcción de un cDNA infeccioso del genoma completo de T318A se inició construyendo minireplicones basados en algunos de sus RNAs defectivos de gran tamaño, colocados bajo la acción del promotor 35S en un vector binario y con la pauta de la ORF 1a interrumpida por un intrón para reducir su toxicidad en bacterias. La agroinfiltración de estos clones dio lugar a una replicación eficiente en hojas de N. benthamiana y a partir de los minireplicones que más se acumulaban se obtuvieron clones de longitud completa insertándoles la región central del genoma que les faltaba. Aunque todos los clones de longitud completa se replicaron en hojas agroinfiltradas de N. benthamiana la pauta de acumulación del RNA genómico de T318A sugiere que este aislado no se mueve a células vecinas ni produce una infección sistémica. / The common CTV isolates in Spain are not very aggressive and they only produce decline of varieties grafted on sour orange, while in other countries more virulent isolates that produce the seedling yellows (SY) and stem pitting syndromes (SP) in grapefruit or sweet orange prevail with independence of the rootstock used. The general objective of this thesis was the development of tools to control the most virulent isolates of CTV. To accomplish this, the development of an effective genetic system that allow the characterization of the genetic determinants of the symptoms of SY and SP has begun. To set up an effective genetic system that permit the identification of the pathogenicity determinants of the symptoms of SY and SP the aggressive Spanish isolate T318A (inductor of SY and SP) was used, that was characterized biological and molecularly. A peculiarity of this isolate is the presence in its population of defective RNAs of high size that possess capacity of autonomous replication. To evaluate the replicative ability of the cDNA clones it was developed a real-time RT-PCR assay using SYBR Green for specific and reliable quantitative detection of CTV in different citrus species and tissues infected with pathogenically distinct CTV isolates sampled from plants growing in the greenhouse or in the field. Also, to identify isolates potentially dangerous in the field (able to induce SP in grapefruit or sweet orange trees) a new protocol of real time RT-PCR was developed with three Taqman LNA probes that allow the detection and quantification of characteristic sequence variants of each of the three main CTV groups observed, that include mild, severe SP, and T36-like isolates, respectively (SY but non SP). Finally, in the development of a genetic system based on T318A, the agroinfiltration of these clones provided an efficient replication in leaves of Nicotiana benthamiana although the accumulation of genomic RNA of T318A suggests that this isolate does not move to neighbouring cells neither it produces a systemic infection.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-09-16Bitstream added on 2014-08-13T18:01:31Z : No. of bitstreams: 1 000746985_20150927.pdf: 1074107 bytes, checksum: 736b109d2ccde3c59ca3e85ff6da7aea (MD5) Bitstreams deleted on 2015-09-28T16:42:56Z: 000746985_20150927.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-28T16:43:44Z : No. of bitstreams: 1 000746985.pdf: 3182272 bytes, checksum: 2f1f8eea88932fcd1181df434e0bea11 (MD5) / O vírus da dengue afeta milhões de pessoas a cada ano no mundo todo. O processo de infecção viral pela via endossomal é intermediada pela sequência 98 a 112 (DRGWGNGCGLFGKGG), conhecido como peptídeo de fusão, este segmento faz parte da glicoproteína E, localizado no envelope do vírus. Todos os flavivirus, incluindo os quatro sorotipos da dengue, apresentam esta sequência em regiões próximas, além de apresentarem alta identidade. Apesar de intensas pesquisas e o aumento da incidência de casos da dengue, não existem drogas antivirais específicas, até este momento, para o combate desta doença. Deste modo, a compreensão da interação do vírus com as células hospedeiras é importante na busca de novos fármacos. Neste sentido, este trabalho visou entender melhor o modo de ação do peptídeo de fusão da dengue e a importância de suas regiões laterais. O objetivo deste projeto teve por finalidade avaliar as contribuições das regiões laterais ao peptídeo de fusão, isto é, 88-97 e 113-123, em sua atividade, para os quatro sorotipos da dengue. A obtenção dos peptídeos foi realizada por meio da síntese em fase sólida. Os modelos de membrana utilizados foram micelas zwitteriônicas (LPC) e vesículas (PC ovo e POPG). Sabendo-se que a exposição desta sequência e, consequente, fusão da membrana é dependente do pH do meio, os estudos foram realizados em pHs 5,5 e 7,1. Nestes estudos, foram utilizadas as técnicas de Transferência de Energia de Ressonância de Föster (FRET), Dicroísmo Circular, Fluorescência, Monocamadas de Langmuir e BAM. O aminoácido triptofano foi usado como sonda para analisar a profundidade da inserção em miméticos de membrana. Os resultados mostraram que a SPFS foi útil, obtendo os materiais desejados. Avaliando a habilidade fusogênica dos 14 peptídeos estudados, observamos que cada sorotipo apresenta atividade diferente um do outro, sendo que os peptídeos do sorotipo 2 foram os que... / Dengue virus affects millions of people worldwide every year. The process of viral infection via endosomal is mediated by the sequence 98-112 (DRGWGNGCGLFGKGG), known as the fusion peptide. This segment is part of the glycoprotein envelope of the virus. All flavivirus, including all four dengue serotypes, contain this fusion sequence and all serotypes present high sequence identity. Although intense researches, the dengue cases have increased and, up to date, there are no specific antiviral drugs to combat this disease. Thus, understanding the virus interaction with host cells is essential for the search and development of new drugs against the dengue virus. Therefore, this study craved a better understanding of the mode of action of the dengue fusion peptide sequence and the importance of its lateral regions. This project aimed to assess the contributions of the lateral regions of the fusion peptide (88-97 and 113-123 sequences) on its activity, for the four dengue serotypes. The synthesis of peptides was performed by solid phase peptide synthesis (SPPS). The membrane models used were zwitterionic micelles (LPC) and vesicles (egg PC and POPG). Since the exposure of this sequence and the resulting membrane fusion is dependent on pH, studies were performed in pH 5.5 and 7.1. In these studies, the techniques of Resonance Energy Transfer Föster (FRET), circular dichroism, fluorescence, Langmuir monolayers and BAM (Brewster angle microscopy) were used. The amino acid and natural fluorophore tryptophan was used as a probe to analyze the insertion depth of the fusion peptide in the membrane mimetic by fluorescence. The results showed that the SPPS was feasible, obtaining the desired materials. Assessing the fusogenic ability of 14 peptides studied, the data indicated that each serotype has different activity and the serotype 2 peptides presented the major interaction. The studies of interaction peptide/membrane mimetic indicated...

Orientador: Maria Célia Bertolini / Coorientador: Fernanda Zanolli Freitas / Banca: Dulce Helena Ferreira de Souza / Banca: Iran Malavazi / Resumo: Os organismos pertencentes ao reino dos fungos têm exercido um papel fundamental no avanço da compreensão dos mecanismos moleculares de organismos eucariotos devido as suas facilidades de manipulação e o conhecimento das características genéticas e bioquímicas envolvidas em seu ciclo de vida. Neurospora crassa é um fungo cujos mecanismos genéticos e bioquímicos básicos são bem definidos, e por isso tem sido muito usado como um sistema modelo em pesquisas que visam à elucidação de processos celulares complexos. Em trabalhos anteriores desenvolvidos em nosso laboratório foram identificadas algumas proteínas que se ligam à região promotora do gene gsn que codifica a enzima glicogênio sintase, regulatória no processo de síntese de glicogênio. O presente trabalho teve como objetivo estudar algumas dessas proteínas, anotadas como hipotéticas, numa tentativa de entender melhor as suas participações no mecanismo de regulação. Para isto linhagens mutantes nos genes que codificam as referidas proteínas foram adquiridas junto ao Fungal Genetics Stock Center. Análises de determinação do conteúdo de glicogênio nas linhagens mutantes foram realizadas tanto em condições normais de crescimento (30º C) como em situações de choque térmico (45º C). Todas as linhagens mutantes avaliadas apresentaram um perfil de acúmulo de glicogênio semelhante ao da linhagem selvagem, isto é, todas apresentaram uma queda nas quantidades de glicogênio após o choque térmico. Entretanto a linhagem mutante na ORF NCU06679 apresentou o conteúdo de glicogênio mais reduzido, em ambas as situações ambientais (antes e depois do choque térmico). Com o objetivo de verificar o envolvimento das proteínas estudadas na expressão do gene gsn, experimentos de Northern blot foram realizados e revelaram que na situação de estresse térmico, os níveis do transcrito gsn diminuem semelhantemente... (Resumo completo clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The organisms belonging to the kingdom of fungi have played a key role in advancing the understanding of the molecular mechanisms of eukaryotic organisms due to their easy handling and the genetic and biochemical mechanisms involved in their life cycle. Neurospora crassa is a fungus whose basic biochemical and genetic mechanisms are well defined, and therefore has been widely used as a model system in studies aimed to elucidate complex cellular processes. In a previous work developed in our laboratory we identified some proteins that bind to the promoter region of the gsn gene that encodes glycogen synthase, the regulatory enzyme in the glycogen synthesis. This work aimed to start studying these proteins, annotated as hypothetical proteins, in an attempt to better understand their roles in the regulation of glycogen metabolism. For this, mutant strains in genes encoding the proteins were purchased from the Fungal Genetics Stock Center. Analysis of glycogen determination were performed in the mutant strains both under normal growth (30º C) and under heat shock condition (45º C). All mutant strains showed a glycogen content profile similar to the wild type strain, that is, all showed a decrease in the amounts of glycogen after heat shock. However the mutant strain in the ORF NCU06679 presented lower glycogen content compared to the wild type strain, in both environmental condition (before and after heat shock). To verify the participation of the proteins in the gsn gene expression, Northern blot experiments were performed and showed that under heat stress the gsn transcript levels decreased similarly to that observed in the wild type strain. However the reduction in the gene expression was higher in the mutant strain containing the ORF NCUO6679 knocked out / Mestre

Orientador: Eduardo Maffud Cilli / Banca: Reinaldo Marchetto / Banca: Saulo Santesso Garrido / Banca: Pietro Ciancaglini / Banca: Luciana Malavolta Quaglio / Resumo: O vírus da dengue afeta milhões de pessoas a cada ano no mundo todo. O processo de infecção viral pela via endossomal é intermediada pela sequência 98 a 112 (DRGWGNGCGLFGKGG), conhecido como peptídeo de fusão, este segmento faz parte da glicoproteína E, localizado no envelope do vírus. Todos os flavivirus, incluindo os quatro sorotipos da dengue, apresentam esta sequência em regiões próximas, além de apresentarem alta identidade. Apesar de intensas pesquisas e o aumento da incidência de casos da dengue, não existem drogas antivirais específicas, até este momento, para o combate desta doença. Deste modo, a compreensão da interação do vírus com as células hospedeiras é importante na busca de novos fármacos. Neste sentido, este trabalho visou entender melhor o modo de ação do peptídeo de fusão da dengue e a importância de suas regiões laterais. O objetivo deste projeto teve por finalidade avaliar as contribuições das regiões laterais ao peptídeo de fusão, isto é, 88-97 e 113-123, em sua atividade, para os quatro sorotipos da dengue. A obtenção dos peptídeos foi realizada por meio da síntese em fase sólida. Os modelos de membrana utilizados foram micelas zwitteriônicas (LPC) e vesículas (PC ovo e POPG). Sabendo-se que a exposição desta sequência e, consequente, fusão da membrana é dependente do pH do meio, os estudos foram realizados em pHs 5,5 e 7,1. Nestes estudos, foram utilizadas as técnicas de Transferência de Energia de Ressonância de Föster (FRET), Dicroísmo Circular, Fluorescência, Monocamadas de Langmuir e BAM. O aminoácido triptofano foi usado como sonda para analisar a profundidade da inserção em miméticos de membrana. Os resultados mostraram que a SPFS foi útil, obtendo os materiais desejados. Avaliando a habilidade fusogênica dos 14 peptídeos estudados, observamos que cada sorotipo apresenta atividade diferente um do outro, sendo que os peptídeos do sorotipo 2 foram os que... / Abstract: Dengue virus affects millions of people worldwide every year. The process of viral infection via endosomal is mediated by the sequence 98-112 (DRGWGNGCGLFGKGG), known as the fusion peptide. This segment is part of the glycoprotein envelope of the virus. All flavivirus, including all four dengue serotypes, contain this fusion sequence and all serotypes present high sequence identity. Although intense researches, the dengue cases have increased and, up to date, there are no specific antiviral drugs to combat this disease. Thus, understanding the virus interaction with host cells is essential for the search and development of new drugs against the dengue virus. Therefore, this study craved a better understanding of the mode of action of the dengue fusion peptide sequence and the importance of its lateral regions. This project aimed to assess the contributions of the lateral regions of the fusion peptide (88-97 and 113-123 sequences) on its activity, for the four dengue serotypes. The synthesis of peptides was performed by solid phase peptide synthesis (SPPS). The membrane models used were zwitterionic micelles (LPC) and vesicles (egg PC and POPG). Since the exposure of this sequence and the resulting membrane fusion is dependent on pH, studies were performed in pH 5.5 and 7.1. In these studies, the techniques of Resonance Energy Transfer Föster (FRET), circular dichroism, fluorescence, Langmuir monolayers and BAM (Brewster angle microscopy) were used. The amino acid and natural fluorophore tryptophan was used as a probe to analyze the insertion depth of the fusion peptide in the membrane mimetic by fluorescence. The results showed that the SPPS was feasible, obtaining the desired materials. Assessing the fusogenic ability of 14 peptides studied, the data indicated that each serotype has different activity and the serotype 2 peptides presented the major interaction. The studies of interaction peptide/membrane mimetic indicated... / Doutor

O filoplano do Hibiscus rosa-sinensis abriga uma enorme biodiversidade de leveduras e fungos semelhantes a leveduras cujo potencial biotecnológico ainda é desconhecido. Foram isoladas 84 cepas de leveduras de filoplano desta planta, sendo identificadas pela metodologia clássica. Do total de isolados 37% são de afinidade ascomicética, 36% de afinidade basidiomicética e 27% de fungos semelhantes a leveduras.

A família das serino proteases inclui diversas proteínas envolvidas em uma variedade de processos fisiológicos, como digestão protéica, regulação da pressão arterial e da coagulação sanguínea, entre outros. Quando disfuncionais, relacionam-se à condições patológicas graves como trombose vascular, embolismo pulmonar, infarto agudo do miocárdio, isquemia cerebral, bem como com o quadro da hemofilia B, ocasionada pela deficiência de fator IX. A investigação dos mecanismos de ação e a compreensão do funcionamento de serino proteases e de seus inibidores, as serpinas, é essencial para desvendar mecanismos de doenças e para a modelagem de fármacos mais específicos e eficientes. A pesquisa de fármacos anti-trombóticos busca desenvolver produtos capazes de interferir no processo hemostático que pode resultar no grave quadro trombo-embólico. A nitroforina-2 (NP-2), produzida na secreção salivar do inseto barbeiro Rhodnius prolixus, é uma proteína dotada de potente ação anti-hemostática, atuando como um inibidor específico do complexo tenase intrínseco (TF/FVIIa/FIX). Em trabalho anterior, nosso grupo identificou que o fragmento correspondente ao segmento 90-110 de NP-2 possui atividade anticoagulante. Um modelo do complexo fator IXa (fIXa)-NP-2 foi gerado a partir do “docking” do peptídeo de NP-2 na provável região de ligação com fIXa. Este complexo foi usado como ponto de partida para a simulação por dinâmica molecular e refinamento da estrutura. Novos peptídeos foram propostos como o objetivo de gerar estruturas com maior afinidade por fIXa. Identificamos o hexapeptídeo LKEADE como apresentando melhor afinidade por fIXa, o qual sugerimos como “template” para o planejamento racional de fármacos com ação anticoagulante e anti-trombótica. Numa outra vertente de nosso trabalho, estudamos a superfamília de proteínas denominada serpinas (serpins, ou “SERine Protease INhibitors”) que engloba um grande conjunto de proteínas dotadas de estruturas similares e provenientes de vários e distintos organismos. A função inicialmente identificada para as serpinas foi de inibição de serino proteases da coagulação sangüínea; entretanto, muitas serpinas perderam esta função.Nestes estudos foram usados modelos ocultos de Markov para criar modelos e descrições possibilitando classificar as serpinas em relação à sua função biológica. Foram criadas assinaturas para cada grupo: seqüências consenso e padrões de aminoácidos distintos para cada modelo/função correspondente. Um modelo específico para serpinas da coagulação sangüínea foi criado. Para este modelo, foi gerada a expressão regular [IVTLM]-[FLVA]- F-S-P-[VLWYF]-[SG]-[IV] que descreve tal função. Além disso, ela codifica a seqüência de uma importante região envolvida na mudança conformacional e no funcionamento da serpina. Tanto esta seqüência quanto a estrutura secundária correspondente podem ser melhor investigadas, por sugerirem um alvo para inibição ou ativação. / The protein family of serine proteases comprises molecules involved in a wide range of physiological processes, such as regulation of blood pressure and coagulation. Dysfunctional serine proteases are related to pathological conditions such as embolism, heart failure, cerebral ischemia and also hemophilia B (the latter being a consequence of factor IX deficiency). The understanding of serine proteases mechanism of action, as well as of their inhibitors is a key step to the discover and develop new drugs. In the study of homeostasis, the search for anti-thrombotic drugs seek to avoid thrombosis and related conditions. The protein nitrophorin-2 (NP-2), found in the salivary glands of the hematophagous insect Rodnius prolixus, is a specific inhibitor of the intrinsic tenase complex (TF/fVIIa/fIX). In previous studies, we identified the NP-2 fragment (amino acid sequence 90-110) showing anticoagulant activity. Models of the complex factor IXa (fIXa) – NP-2 were created. This complex was used as a starting point for the molecular dynamic simulations and structure refinement. New NP-2 peptides were suggested, in order to achieve higher affinity complexes. We identified the hexapeptide LKEADE as showing higher affinity for fIXa, which we suggest to be used on rational drug design studies for anticoagulant drugs. The superfamily of proteins known as serpins (“Serine Protease Inhibitors”) involve a number of similar structures, found in a wide variety of organisms. Its function was initially identified as an inhibitor of blood clotting serine proteases. However, many serpins have lost that function in the course of natural evolution. Hidden Markov models were then used to create profiles classifying those proteins due to their biological function. We created signatures for each group of functional serpins in the form of consensus sequences and distinct amino acid patterns. A blood clotting-specific model was generated, which has yielded the regular expression [IVTLM]-[FLVA]-F-S-P-[VLWYF]-[SG]-[IV]. Such pattern also codes for a region of the structure involved in an extensive conformational change. The change is related to the activation of the serpin, and, therefore, both pattern and sequence should be investigated. Combined, these information suggest a powerful target for blood clotting inhibition.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2009 / Made available in DSpace on 2012-10-24T18:01:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 264151.pdf: 1074569 bytes, checksum: a39136c47f0285802f4595d73c2cca85 (MD5) / Câncer é um termo genérico utilizado para um grupo de doenças que pode afetar várias partes do corpo e caracteriza-se pela proliferação celular anormal que tende a ser agressiva determinando a formação de tumores. O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais freqüente no mundo e o mais comum entre as mulheres. A cada ano, 22% dos novos casos de câncer em mulheres são de mama, apresentando altas taxas de mortalidade. Alguns processos biológicos, como o controle do ciclo celular, a apoptose, os processos de reparo de DNA lesado, vias metabólicas hormonais e de xenobióticos, estão intimamente ligados ao desenvolvimento de vários tipos de câncer, incluindo o câncer de mama. Genes que codificam proteínas e enzimas importantes para essas rotas podem conter mutações ou polimorfismos que podem contribuir para o desenvolvimento do câncer de mama. Esse trabalho procurou identificar possíveis marcadores genéticos de susceptibilidade ao câncer de mama através da análise de polimorfismos em genes de reparo de DNA e detoxificação em 162 mulheres diagnosticadas com câncer de mama e em 148 mulheres não afetadas pela doença e sem histórico familial da mesma, provenientes do Estado de Santa Catarina, Brasil, em um estudo caso-controle. Os polimorfismos tipo SNP (single nucleotide polymorphism) Arg194Trp e Arg399Gln do gene XRCC1, Val-9Ala do gene MnSOD e Val158Met do gene COMT foram identificados pela técnica de PCR-RFLP com eletroforese em gel de agarose e poliacrilamida. As freqüências alélicas e genotípicas foram calculadas e submetidas ao teste ?2 para verificar se estavam de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW). A associação de determinados alelos, genótipos e dados clínicos e epidemiológicos (idade da menarca, idade da menopausa, nuliparidade, idade da primeira gestação, amamentação, utilização de anticoncepcional, índice de massa corpórea e tabagismo) com a susceptibilidade ao câncer de mama foi verificada através do teste odds ratio (OR), com Intervalo de Confiança (IC) de 95% e p=0,05 como o limite de significância. Através de regressão logística multivariada foram propostas combinações de dados genéticos, epidemiológicos e clínicos além de modelos de interação entre essas variáveis e o câncer de mama. Com exceção da freqüência genotípica de MnSOD Val-9Ala para casos, todas as freqüências genotípicas se encontram em EHW. As freqüências dos alelos polimórficos encontradas em casos e controles respectivamente foram: 0,378 e 0,328 (A) para Arg194Trp; 0,079 e 0,089 (T) para Arg399Gln; 0,521 e 0,463 (A) para Val158Met; 0,474 e 0,451 (C) para Val-9Ala. Não foi constatada qualquer associação estatisticamente significativa entre os SNPs analisados de forma individual e o câncer de mama. Foram encontradas associações positivas (risco) estatisticamente significativa para a combinação dos SNPs XRCC1 Arg399Gln e COMT Val158Met (OR=3,909; IC95% 1,078-14,176; Wald=4,302; p=0,038) e também de MnSOD Val-9Ala e COMT Val158Met (OR=2,129; IC95% 1,049-4,323; Wald=4,375; p=0,036) com o câncer de mama. Foi observada ausência de associação dos fatores epidemiológicos e clínicos analisados isoladamente bem como da combinação destes com os SNPs e o câncer de mama. Apesar de ter-se identificado um modelo de interação que melhor representou a interação entre as características genéticas, clínicas e epidemiológicas e o câncer de mama, não há como afirmar com absoluta segurança que este modelo possa ser associado ao aumento do risco de câncer de mama.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T11:26:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 276691.pdf: 1483324 bytes, checksum: b4f538164d553239d6fa75c6a1ac46f6 (MD5) / As lipases são enzimas altamente versáteis que catalisam reações químicas com diversos substratos em diferentes condições e possuem características tanto bioquímicas quanto estruturais que lhes conferem resistência e termotolerância, além de serem empregadas em vários bioprocessos industriais como na produção de alimentos e biocombustíveis. A lipase de S. xylosus (AF208229) foi recentemente isolada e inicialmente caracterizada por nosso grupo de pesquisa e colaboradores. Essa proteína possui uma alta homologia e identidade estrutural com diversas outras lipases da família I.5, e apresenta atividade enzimática sobre p-nitrofenil-ésteres. Apesar de ser considerada uma enzima moderadamente termoestável e ter atividade enzimática sobre diferentes ésteres, o mecanismo de ação catalítica ainda permanece desconhecido, e principalmente, os mecanismos estruturais envolvidos em sua estabilização térmica nunca foram descritos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar bioquimicamente a lipase recombinante AF208229 de S. xylosus recentemente clonada e expressa heterologamente, e investigar os possíveis mecanismos envolvidos em sua termotolerância por meio de análises de espectroscopia de dicroísmo circular (DC). Nesse trabalho a lipase de S. xylosus (AF208229) foi expressa e purificada, submetida a ensaios enzimáticos em três temperaturas (25°C, 37°C e 42°C), e três pH (7,0 8,0 e 9,0), sua especificidade catalítica foi analisada utilizando-se diferentes p-nitrofenil-ésteres como substratos (de 2 a 18 carbonos) e sua termoestabilidade foi acompanhada durante 10, 20 e 30 minutos em 95°C. Para as análises espectroscópicas, a enzima foi submetida a um tratamento de remoção de íons (produzindo-se a apo enzima) e sua atividade enzimática e sua termotolerância foram reavaliadas. Por fim o espectro de dicroísmo circular (DC) da apo e da holo_enzima foram analisados em diferentes condições. Os resultados obtidos apresentam pela primeira vez o perfil estrutural e os mecanismos de estabilidade 8 térmica dessa lipase. O perfil de DC da holo_enzima foi avaliado nas mesmas temperaturas descritas para os ensaios enzimáticos, bem como sua capacidade de re-enovelamento. O perfil de DC e a capacidade de re-enovelamento também foram observados para a apo_enzima. O efeito dos cofatores metálicos Zn2+ e Ca2+ foram avaliados nos ensaios enzimáticos da apo_enzima, na sua termotolerância, no seu perfil de DC e na sua capacidade de re-enovelamento. Observou-se que a holo_enzima apresenta sua maior atividade em pH 9,0 e 42°C, que tem preferência por substratos de cadeias curtas (pNP-acetato, 2 carbonos) e que retem 77% de sua atividade enzimática após 10 minutos de tratamento térmico (95°C). A holo_enzima é capaz de se re-enovelar, readquirindo sua conformação estruturalmente estável e ativa. A apo_enzima também é capaz de se re-enovelar após o tratamento térmico, porém perde quase totalmente sua atividade. Observou-se que na presença do íon Zn2+ a apo_enzima se re-enovelou e reteve sua atividade enzimática. Com base nesses resultados poderia afirmar-se que a lipase de S. xylosus (AF208229) é uma metaloenzima dependente de zinco e que esse íon possivelmente localizado em um motivo estrutural rico em -hélices próximo ao ativo site. / Lipases are highly versatile enzymes, which catalyze many chemical reactions with different substrates in different conditions. These enzymes have particular biochemical and structural characteristiscs which promote stability and thermal resistance. Besides, they are used by industries, i.e: food technology, detergents and biofuels. S. xylosus lipase (AF208229) was recently isolated and characterized by our group. This enzyme shares a high homology with other lipases among I.5 lipases family and has activity on p-nitrophenyl esters. Although considered a moderated thermostable lipase, its catalytic function remains unclear and its structural mechanisms for thermal stabilization have never been described. This work assessed the enzymatic activity of the recombinant lipase from S. xylosus in three different temperatures (25°C, 37°C and 42°C) and pH (7.0, 8.0 and 9.0), and the thermostability (incubation at 95°C for 10, 20 and 30 minutes). In order to investigate the mechanism involved in enzymatic activation, the enzyme was submitted to an ion removal treatment (to obtain an apo_- enzyme) and its activity and themotolerance were evaluated in the presence and absence of Zn2+ and Ca2+. The structural profile of apo-_enzyme and holo_enzyme were assessed by circular dichroism (CD) at different conditions in the presence an in the absence of metal cofactors as: Zn2+ and Ca2+. These results represent the first insights on S. xylosus lipases secondary structure and its mechanism for thermal stabilization. S. xylosus lipase (AF208229) was more active in pH 9.0, 42°C with specificity for short-chain substrates (pNP-acetate C2). In addition, this enzyme was able to maintain 77% of its activity after a thermal treatment (95°C for 10 min) and to refold to its stable conformation. apo_enzyme showed the same ability to refold as seen to holo_enzyme, but was not able to keep its activity after thermal treatment, which indicate the need of metal for its activity stabilization. Interesting, in the presence of Zn2+ the apo_enzyme was able to acquire a more stable conformation after thermal treatment and still keep residual activity. 10 These results propose that S. xylosus lipase (AF208229) is a metalloenzyme which uses Zn2+ as its metal coordinating, and the Zn2+ is possibly located in a-helical rich motif close to the active site.