Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T21:18:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 329166.pdf: 2158652 bytes, checksum: 524a7e709a3f914c4365813e3d0a13e1 (MD5) Previous issue date: 2014 / A infecção por Mycobacterium tuberculosis (Mtb) pode levar a um estado latente no qual o hospedeiro é capaz de controlar o crescimento do patógeno. Embora uma resposta imune celular seja fundamental para o controle de Mtb dentro de macrófagos, foi demonstrado que fatores associados à micobactéria apresentam um papel importante no desenlace da infecção. Levando em consideração o alto impacto na saúde mundial causado pela tuberculose (TB), a ineficiência de vacinas e o surgimento de cepas de Mtb resistentes, há uma necessidade do desenvolvimento de novas estratégias para diagnósticos, tratamentos e vacinas contra TB. O nosso grupo descreveu previamente uma nova lectina de 13 kDa secretada pelo M. tuberculosis (sMTL-13) e embora tenha sido sugerida a importância desta proteína em pacientes com tuberculose, ainda restam questões fundamentais da biologia desta lectina que precisam ser elucidadas. Para investigar o possível papel da sMTL-13 durante a infecção, um nocaute (?Rv1419) foi gerado. Um aumento significativo na morte celular foi observado em macrófagos infectados com ?Rv1419, assim como o crescimento intracelular exacerbado em comparação com a infecção pela bactéria selvagem. Análises in silico da proteína, assim como a sua detecção na superfície do Mtb, sugerem que a sMTL-13 pode atuar na entrada da bactéria durante interação inicial patógeno-hospedeiro. Isto foi confirmado através de experimentos de adesão, onde foi observado que a capacidade do bacilo em se ligar à membrana do macrófago é afetada pela ausência da sMTL-13. Além disto, níveis mais baixos de TNF foram detectados em macrófagos infectados com ?Rv1419, sugerindo que esta lectina pode ser importante para o reconhecimento do bacilo. Ademais, foi observado que a proteína purificada pode levar à morte celular via necrose em condições onde a função de caspase está bloqueada. Portanto, nós especulamos que a sMTL-13 regula a morte celular e produção de citocina pró-inflamatória como uma estratégia de sobrevivência, permitindo o crescimento do patógeno sem levar as células hospedeiras à morte prematura.<br> / Abstract : Infection by Mycobacterium tuberculosis (Mtb) can lead to a latent state in which the host is able to control pathogen growth. While effective cellular immune responses are critical to control Mtb growth inside macrophages, it has been demonstrated that mycobacteria-associated factors play an important role in the outcome of infection. Given the high impact in public heath caused by tuberculosis (TB), inefficient vaccine and emergence of Mtb resistant strains, there is a need for novel diagnosis, treatment and vaccine strategies against TB. We have previously described a novel secreted 13-kDa lectin in pathogenic Mtb (sMTL-13) and although a possible importance for this protein as a major mycobacterial antigen was shown in TB patients, fundamental questions on the biology of this lectin remain to be answered. In order to investigate the possible role of sMTL-13 during infection, a knock out mutant (?Rv1419) was generated. Significant cell death was observed in ?Rv1419-infected macrophages as well as increased knockout intracellular growth compared to infection with wild type bacteria. In silico analysis of the protein as well as its detection on the surface of Mtb suggests sMTL-13 may act during bacteria entry in the cell in the initial pathogen-host interactions. This was confirmed by binding experiments where it was observed that the adhesion of bacilli is affected in the absence of sMTL-13. Furthermore, lower levels of TNF were detected in ?Rv1419-infected macrophages, suggesting that this lectin may be important for cell recognition. In addition, it was shown that this purified protein can lead to cell death in a necrotic pathway in conditions where the function of caspases is impaired. Therefore, we speculate that sMTL-13 regulates cell death and pro-inflammatory cytokine production as a survival strategy, allowing pathogen growth without leading host cells to a premature death.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2015 / Made available in DSpace on 2015-06-02T04:08:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 333884.pdf: 2929048 bytes, checksum: 0d0c1e8dd241198b20d2515f906d45f5 (MD5) Previous issue date: 2015 / Produzidos a partir de fontes renováveis e utilizados para o transporte automotivo, os biocombustíveis tornam-se cada dia mais importantes no balanço energético mundial devido à necessidade de reduzir a dependência da utilização de petróleo, de origem fóssil. No Brasil, a maior parte da produção de bioetanol é obtida diretamente a partir da cana-de-açúcar, porém, na pouco aproveitada biomassa lignocelulósica residual (como bagaço e palha) encontra-se a xilose, o segundo açúcar mais abundante na natureza. A conversão bem sucedida da hemicelulose em etanol combustível com alto rendimento é o fator decisivo para a viabilidade econômica do processo. Saccharomyces cerevisiae é um microrganismo altamente efetivo na produção de etanol a partir de hexoses, com elevada produtividade de etanol, alta tolerância a esse produto, e tolerância às condições industriais de produção de álcool combustível, mas incapaz de utilizar açúcares como a xilose. Linhagens recombinantes de S. cerevisiae podem constituir uma alternativa interessante para a fermentação da xilose. Assim, no presente trabalho, foram usadas linhagens de S. cerevisiae recombinantes capazes de metabolizar xilose, transformadas com o plasmídeo integrativo pAUR-XKXDHXR, o qual permite a sobre-expressão dos genes das enzimas xilose redutase, xilitol desidrogenase e xilulose cinase. Em primeira abordagem, foi realizado um experimento de engenharia evolutiva com uma linhagem contendo apenas o gene do transportador de glicose HXT2 sobre-expresso, permitindo a obtenção de uma linhagem mutante no gene STB5, que codifica um regulador da via das pentoses-fosfato. Esta linhagem mutante foi capaz de crescer em xilose tão bem quanto em glicose. Em segunda abordagem, usando engenharia genômica, foi deletada uma cópia do gene FPS1, o qual codifica um facilitador de glicerol, em uma linhagem industrial selecionada para eficiente fermentação de caldo de cana-de-açúcar, obtendo-se uma linhagem que fermenta a xilose mais eficientemente. Nossos resultados revelam que as estratégias empregadas são promissórias para incrementar consideravelmente a produção de etanol a partir de linhagens de S. cerevisiae recombinantes.<br> / Abstract: Biofuels produced from renewable sources and used for automotive transport are becoming increasingly more important in the global energy mix, looks for decrease world's oil dependency comes from fossil sources use. Most of the Brazilian ethanol production is obtained directly from sugar cane, however, it don't take advantage of the residual lignocellulosic biomass coming from this process (such as bagasse and straw) which is rich in xylose, the second most abundant sugar in nature. The successful conversion of hemicellulose (compound of lignocellulose) into ethanol fuel with high yields is the decisive factor for economic feasibility of its use. Saccharomyces cerevisiae is a highly effective microorganism for ethanol production from hexoses, which poses high ethanol productivity and high tolerance to it, and tolerance to industrial conditions in alcohol fuel production, but is not able to use sugars such as xylose. Recombinant strains of S. cerevisiae may constitute an interesting alternative to xylose fermentation. In this research work was used two strains of recombinant S. cerevisiae, capables of metabolize xylose, transformed with the integrative plasmid pAUR-XKXDHXR which permits overexpression of enzyme genes xylose reductase, xylitol dehydrogenase and xylulose kinase. In first approach, an evolutive engineering experiment was carried out with a strain that only had a transporter gene of glucose HXT2 overexpressed, turned out to be in a mutant strain in the STB5 gene that encodes for a regulator pentose-phosphate pathway, mutant lineage capable of grow in xylose efficiently as in glucose. In second approach, using genetic engineering, was deleted a copy of FPS1 gene which encodes a glycerol facilitator in a selected industrial strain for efficient fermentation of sugar cane broth, coming out a strain that ferments xylose more efficiently. Our results reveal as promissory the strategies used for important increase of ethanol production from recombinant lineages of S. cerevisiae.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-10-06T04:06:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334675.pdf: 2103795 bytes, checksum: ccd250eef9810ed9db2bf44c58134fb1 (MD5) Previous issue date: 2015 / Com a criação do Programa de Controle Higiênico Sanitário de Moluscos Bivalves pelo governo brasileiro em 2012, o processo de purificação de moluscos pelo método da depuração passou a ser exigido quando há a detecção de patógenos bacterianos nos animais. Entretanto, não é fornecida a forma ou eficácia desse método. Mais estáveis e prevalentes em amostras ambientais que bactérias, os vírus entéricos são comumente associados a surtos de gastroenterites relacionados ao consumo de moluscos contaminados. Porém, sua detecção em geral é baseada em métodos de detecção de genoma, sem relação com a infecciosidade viral. Dessa forma, esse trabalho teve como objetivo avaliar a aquisição de patógenos virais por ostras Crassostrea gigas artificialmente contaminadas, a estabilidade desses patógenos frente a condições controladas de temperaturas e a eficácia do processo de depuração na inativação desses micro-organismos. Foram utilizados como modelos virais o adenovírus humano tipo 2 (AdVH-2) e o norovírus murino tipo 1 (NVM-1) e metodologias de detecção de vírus infecciosos. O comportamento entre os dois modelos virais foi diferente no processo de bioacumulação artificial pelas ostras, com o AdVH-2 atingindo o ápice de concentração viral no tecido digestivo após 8h, e o NVM-1 após 24h. Os dois modelos virais se mostraram estáveis por até 96h em ostras resfriadas a 4°C, porém foram inativados em amostras de ostras cozidas "ao bafo" na temperatura de 100°C por até 6 min. A depuração se mostrou eficiente para a inativação do AdVH-2 utilizando a metodologia de placa de lise de detecção de vírus infecciosos, e o uso da lâmpada U.V. acelerou o processo. Após 24h de depuração com luz U.V., 2,92 log de redução foram encontrados (correspondendo a mais de 99% de inativação viral), não sendo mais detectado nenhum virus infeccioso após esse período. E com 48h de depuração no tanque controle, 2,65 log de redução foram detectados. O uso de métodos de desinfecção (como a luz U.V.) em sistemas de depuração fechados é exigido pelas agências reguladoras internacionais, uma vez que a permanência de patógenos na água do tanque pode re-contaminar os animais, e o descarte irregular dessa água pode levar à contaminação ambiental. As análises da depuração do NVM não puderam ser concluídas, pois as amostras de ostras foram coletadas durante o período reprodutivo dos animais, e o estresse causado pela coleta e contaminação artificial levou os animais a desovarem e morrerem. Dessa forma, novos experimentos serão conduzidos no inverno para complementar os dados do atual trabalho.<br> / Abstract : The process of shellfish purification through depuration started to be required by the Brazilian government with the establishment of the Hygienic Control Program of Bivalve mollusks in 2012, but recommendation on how it should be performed or on its efficiency has not been suggested. More stable and prevalent in environmental samples than bacteria, enteric viruses are generally related to gastroenteritis outbreaks associated with the consumption of contaminated oysters. However, virus detection methods are usually based on genome detection rather than infectious virus. Therefore, this work aimed at evaluating the accumulation of viral pathogens on oysters Crassostrea gigas artificially contaminated; the stability of these pathogens maintained in controlled conditions of temperature and the depuration efficiency in inactivating these microorganisms. Human adenovirus type 2 (ADVH-2) and the murine norovirus type 1 (NVM-1) were used, as well as detection methodologies of infectious viruses. The behavior of the two viruses were different in the oyster?s artificial bioaccumulation process, with the AdVH-2 reaching its peak of viral concentration after 8h, and the NVM-1 in 24h. The two viruses were stable for 96 hours in oysters maintained under 4°C, but they were completely inactivated in steamed oyster samples cooked for up to 6 minutes in 100°C. The depuration process was efficient in inactivating the AdVH-2, evaluated by the plaque assay for infectious virus detection, and the U.V. light accelerated the process. After 24h of depuration with U.V. light, a reduction of 2,92 log was found (which represents an inactivation of more than 99% of the viruses), with no infectious virus being detected after this period. After 48h in the tank without U.V. light, a reduction of 2,65 log was found. The use of disinfection methodologies in closed depuration systems is required by international regulation agencies, once these pathogens can re-contaminate other animals, and the irregular discharge of the tank water can lead to environmental contamination. The NVM-1 depuration assays could not be concluded because the oysters samples were collected during the reproductive period of the animals, and the stress caused by the collection and artificial contamination lead the animals to spawn and die. Thereby, new experiments will be conducted in the winter to complete this work data.

ALMEIDA, Francisca Diva Lima. Emprego de tecnologias emergentes no processamento de suco de laranja adicionado de fruto-oligossacarídeos e suco de laranja produzido via síntese enzimática. 2015. 109 f. Tese(doutorado em biotecnologia)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-04-05T18:47:19Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_fdlalmeida.pdf: 2133554 bytes, checksum: d01535d6cd346c20c6b84dd80a5d29e5 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-05-23T17:44:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_fdlalmeida.pdf: 2133554 bytes, checksum: d01535d6cd346c20c6b84dd80a5d29e5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-23T17:44:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_fdlalmeida.pdf: 2133554 bytes, checksum: d01535d6cd346c20c6b84dd80a5d29e5 (MD5) Previous issue date: 2015 / The aim of this research was to use emerging technologies on the processing of the prebiotic orange juice added of fructo-oligosaccharides (FOS) and in prebiotic orange juice produced by enzymatic synthesis. The first stage of the study was evaluated the effect of atmospheric pressure cold plasma (ACP) and high pressure processing (HPP) on the prebiotic orange juice added 7% commercial FOS. The orange juice was directly and indirectly exposed to plasma discharge at 70 kV with processing times of 15, 30, 45 and 60 seconds. For high pressure processing, the juice containing the same concentration of FOS was treated at 450 bars for 5 minutes. After the treatments, the fructo-oligosaccharides were qualified and quantified by Thin Layer Chromatography (TLC), using densitometer. The organic acids, color analysis and pH values were also evaluated. Both processes did not degrade the FOS. The organic acids and the color of the treated samples were also preserved. On the second stage of the study, the effect of plasma and ozone treatments on prebiotic orange juice produced by enzymatic synthesis were evaluated. The orange juice was directly and indirectly exposed to plasma discharge at 70 kV with processing times of 15, 30, 45 and 60 seconds. For ozone processing, different loads (0.057, 0.128 and 0.230 mg/ O3.mL of juice) were evaluated. After the treatments, the oligosaccharides were quantified by HPLC. The juice pH, color, total phenolic content and total antioxidant activity were also determined. Both processes promoted a partial degradation of the oligosaccharides in the juice. However, the juice maintained an enough amount of oligosaccharides to be classified as a prebiotic food. The other parameters analyzed were preserved. Thus, atmospheric cold plasma and ozone are suitable non-thermal alternatives for prebiotic orange juice treatment. / O objetivo desta pesquisa foi empregar tecnologias emergentes no processamento de suco prebiótico de laranja adicionado de fruto-oligossacarídeos (FOS) e em suco prebiótico de laranja produzido via síntese enzimática. A primeira etapa da pesquisa consistiu em avaliar o efeito da aplicação das tecnologias de plasma e de alta pressão, como métodos de conservação, em suco de laranja adicionado de 7% de FOS comercial. O suco foi exposto direta e indiretamente ao processamento por plasma em diferentes tempos: 15 30, 45 e 60 s. Para o processamento com alta pressão, o suco foi tratado a uma pressão de 450 bars por 5 minutos. Após os tratamentos, a concentração de fruto-oligossacarídeos foi quantificada pela técnica de cromatografia em camada delgada (CCD), utilizando o equipamento densitômetro. Determinações de cor, pH e concentração de ácidos orgânicos foram também realizadas. Ambos os processos não degradaram os FOS presentes no suco. Ácidos orgânicos e a cor das amostras tratadas também foram preservados. Na segunda etapa da pesquisa, foi avaliado o efeito da aplicação dos tratamentos de plasma e ozônio em suco prebiótico de laranja produzido via síntese enzimática. O suco foi exposto direta e indiretamente ao processamento por plasma, a 70 kV, em diferentes tempos: 15 30, 45 e 60 s. Para o processamento com ozônio, diferentes cargas (0,057, 0,128 e 0,230 mg/ O3.mL de suco) foram avaliadas. Após os tratamentos, a concentração de oligossacarídeos foi determinada pela técnica de HPLC. Os valores de pH, cor, conteúdo de fenólicos totais e atividade antioxidante total também foram determinados. Ambos os processos promoveram uma degradação parcial dos oligossacarídeos no suco. Contudo, o suco manteve uma quantidade suficiente de oligossacarídeos para ser classificado como um alimento prebiótico. Os demais parâmetros analisados foram preservados. Diante disso, sugere-se que os tratamentos de plasma, alta pressão e ozônio são alternativas não térmicas adequadas para o tratamento de suco de laranja prebiótico.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-09-05T04:11:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 348078.pdf: 1068588 bytes, checksum: db47e704a25f47d27aa2871de405437f (MD5) Previous issue date: 2017 / Uma das principais aplicações da entomologia forense médico-legal é a estimativa do intervalo pós-morte (IPM). Entretanto, certas substâncias químicas presentes em um cadáver podem interferir no desenvolvimento dos insetos que se alimentam dele, sendo importante conhecer estes efeitos para uma estimativa mais precisa do IPM. Entomotoxicologia é o ramo da entomologia forense que estuda o uso de insetos necrófagos na detecção e análise de drogas e outras substâncias em tecidos em decomposição, além de investigar seus possíveis efeitos no desenvolvimento destes artrópodes. Sendo assim, o objetivo principal deste trabalho foi investigar o impacto dos quimioterápicos ciclofosfamida (CF) e metotrexato (MTX) no desenvolvimento pós-embrionário de Chrysomya megacephala. Para isso, foram feitos experimentos in vitro com diferentes concentrações destas drogas incorporadas em carne bovina moída, simulando as dosagens injetadas em humanos que passam por quimioterapia. Foram feitos cinco tratamentos para a alimentação das larvas em cada experimento, sendo um controle negativo (água destilada). Para a CF foram utilizadas ½ Dose inicial intravenosa - DIIv (25 mg/kg), 1 DIIv (50 mg/kg), 2 DIIv (100 mg/kg) e 4 DIIv (200 mg/kg); e para o MTX foram utilizadas ½ Dose Inicial Intraperitoneal - DIIp (5 mg/kg), 1 DIIp (10 mg/kg), 2 DIIp (20 mg/kg) e 4 DIIp (40 mg/kg). Todos os tratamentos foram realizados em triplicata e mantidos a 25°C em estufa BOD. A cada 12 horas eram retiradas três larvas de cada tratamento, sacrificadas e o comprimento total de cada uma era medido com auxílio de um paquímetro digital, até o abandono da dieta para pupariação. Foi também realizado um experimento a parte sem manipulação das larvas para calcular as taxas de sobrevivência larval e total para cada tratamento, além da proporção sexual das moscas emergidas. ANOVA e teste Tukey foram realizados para comparar o efeito das drogas sobre o desenvolvimento de C. megacephala. Os resultados indicaram claramente que ambos os medicamentos afetaram o desenvolvimento e sobrevivência de C. megacephala, porém de forma heterogênea. Além disso, houve um desvio da razão sexual esperada nas larvas expostas ao MTX, emergindo uma quantidade significativamente maior de fêmeas do que machos. Estes fatores de interferência negativa devem ser considerados em casos de morte suspeita de pessoas que faziam uso destes medicamentos para que não haja uma subestimativa de IPM.<br> / Abstract : One of the main applications of medico-legal forensic entomology is the estimation of the postmortem interval (PMI). However, certain chemical substances present in a cadaver can interfere in the development of the insects that feed on it, thus it is important to know these effects for a more accurate estimation of PMI. Entomotoxicology is the branch of forensic entomology that studies the use of scavenger insects in the detection and analysis of drugs and other substances in decomposing tissues, in addition to investigating their possible effects on the development of these arthropods. Therefore, the main purpose of this work was to investigate the impact of the chemotherapeutic drugs cyclophosphamide (CF) and methotrexate (MTX) on the post-embryonic development of Chrysomya megacephala. For this, in vitro experiments were performed with different concentrations of these drugs incorporated in minced beef, simulating the dosages injected in humans that undergo chemotherapy. Five treatments were done to feed the larvae in each experiment, with one as a negative control (distilled water). For CF, ½ initial intravenous dose - DIIv (25 mg/kg), 1 DIIv (50 mg/kg), 2 DIIv (100 mg/kg) and 4 DIIv (200 mg/kg) were used; and for MTX ½ Initial Intraperitoneal Dose - DIIp (5 mg/kg), 1 DIIp (10 mg/kg), 2 DIIp (20 mg/kg) and 4 DIIp (40 mg/kg) were used. All treatments were performed in triplicate and maintained at 25°C in a BOD chamber. At every 12 hours three larvae of each treatment were removed, sacrificed and the total length of each one was measured with the aid of a digital caliper until the abandonment of the diet for pupariation. A separate experiment without manipulation of the larvae was also performed to calculate the larval and total survival rates for each treatment, in addition to the sex ratio of the emerged flies. ANOVA and Tukey test were performed to compare the effect of drugs on the development of C. megacephala. The results clearly indicated that both drugs affected the development and survival of C. megacephala, but in a heterogeneous manner. In addition, there was a deviation in the expected sex ratio in MTX-exposed larvae, with significantly more females than males emerging. These negative interference factors should be considered in cases of suspected death of people using these drugs so that there is no underestimation of PMI.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-11-14T03:24:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 348746.pdf: 2398591 bytes, checksum: ee1248fe883b7567941bdb7d90ef2176 (MD5) Previous issue date: 2017 / A produção de etanol de segunda geração depende muito da fermentação da xilose, o segundo açúcar mais abundante nos hidrolisados lignocelulósicos, pela levedura Saccharomyces cerevisiae. Mas essa levedura é incapaz de fermentar essa pentose, uma vez que não dispõe de enzimas e transportadores eficientes para a sua metabolização. Assim, é importante identificar enzimas e transportadores de xilose de diferentes organismos para a expressão em células de S. cerevisiae. Contudo, pesquisadores têm demonstrado que essa levedura requer modificações genéticas adicionais para uma efetiva fermentação de xilose; entre elas, a sobre-expressão do gene XKS1 (que codifica a xilulocinase) e a deleção do gene PHO13 (que codifica uma fosfatase alcalina) melhoram a fermentação de xilose em linhagens recombinantes. Assim sendo, o presente trabalho se propôs a desenvolver linhagens de S. cerevisiae recombinantes por meio da sobre-expressão do gene XKS1 e/ou deleção do gene PHO13, com o intuito de que essas linhagens possam ser utilizadas como plataformas para a análise de enzimas e transportadores heterólogos envolvidos no metabolismo da xilose. Primeiramente, foi construída a linhagem ASY-1, com a finalidade de servir como plataforma para testes de enzimas heterólogas, já que esta linhagem foi obtida a partir da sobre-expressão do gene XKS1 na linhagem wild-type CEN.PK2-1C. A seguir, foi construida a linhagem ASY-2, a partir da deleção do gene PHO13 na linhagem ASY-1. As linhagens CEN.PK2-1C, ASY-1 e ASY-2 foram transformadas com plasmídeos contendo genes que codificam as enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase provenientes das leveduras Spathaspora arborariae e Spathaspora passalidarum, respectivamente, e a performance fermentativa das linhagens transformantes foi avaliada. Nossos resultados mostram que a sobre-expressão do gene XKS1 foi necessária para haver consumo de xilose em crescimentos aeróbios e para a produção de etanol a partir dessa pentose em fermentações microaeróbias, indicando que essa sobre-expressão é crucial para o metabolismo da xilose em S. cerevisiae. A deleção do gene PHO13 permitiu um consumo mais rápido e maior da xilose, tanto em crescimentos aeróbios quanto em fermentações microaeróbias, além de ter aumentado a produção de xilitol e alterado a produção de glicerol em todos os ensaios. Ainda, os efeitos vantajosos causados pela deleção do gene PHO13 no consumo de xilose e na produção de etanol se mostraram mais evidentes em meios contendo alta concentração (100 g.L-1) de xilose. Paralelamente, contruímos também a linhagem ASY-3, com a finalidade de servir como plataforma para testes de transportadores heterólogos, sendo que esta linhagem foi construída a partir da deleção do gene PHO13 na linhagem DLG-K1, uma linhagem hxt-null (hxt1-hxt7 e gal2) que possui os genes necessários à metabolização de xilose sobre-expressos mas incapaz de transportar monossacarídeos. As linhagens DLG-K1 e ASY-3 foram transformadas com plasmídeos contendo genes que codificam os transportadores Sut4 e Xut1 provenientes das leveduras Spathaspora arborariae e Scheffersomyces stipitis, respectivamente, e a performance fermentativa das linhagens transformantes foi avaliada. Em ensaios de crescimento aeróbios, nossos resultados mostraram que a deleção do gene PHO13 permitiu consumo mais rápido e maior da xilose, além de maior produção de etanol. No entanto, em fermentações microaeróbias, não houve diferença no consumo de xilose entre as linhagens contendo ou não o gene PHO13 e expressando os transportadores heterólogos. A deleção do gene PHO13 também alterou a produção de glicerol pelas cepas em todos os ensaios fermentativos realizados utilizando transportadores heterólogos. Portanto, as linhagens recombinantes desenvolvidas constituem importantes ferramentas para a clonagem e identificação de novos genes envolvidos no transporte e fermentação de xilose por S. cerevisiae. / Abstract : Second-generation ethanol production depends greatly on the xylose fermentation, the second most abundant sugar in the lignocellulosic hydrolysates, by the yeast Saccharomyces cerevisiae. But this yeast is incapable of fermenting this pentose, since it does not have efficient enzymes and transporters for its metabolization. Therefore, it is important to identify xylose enzymes and transporters of different organisms for the expression in S. cerevisiae cells. However, researchers have shown that this yeast requires additional genetic modifications for an effective xylose fermentation; among them, XKS1 gene (which encodes xylulokinase) overexpression and PHO13 gene (encoding alkaline phosphatase) deletion to improve xylose fermentation in recombinant strains. Thus, the present work aimed to develop recombinant S. cerevisiae strains by XKS1 gene overexpression and/or PHO13 gene deletion, so that these strains could be used as platforms for the analysis of enzymes and transporters involved in xylose metabolism. Firstly, the ASY-1 lineage was constructed to serve as a platform for heterologous enzyme tests, since this lineage was obtained from the XKS1 gene overexpression in the wild-type strain CEN.PK2-1C. The ASY-2 yeast was then constructed by PHO13 gene deletion in the ASY-1 strain. The CEN.PK2-1C, ASY-1 and ASY-2 strains were transformed with plasmids containing genes for xylose reductase and xylitol dehydrogenase from Spathaspora arborariae and Spathaspora passalidarum yeasts, respectively, and the fermentative performance of transformants was evaluated. Our results show that XKS1 gene overexpression was required for xylose consumption in aerobic growths and for ethanol production from this pentose in microaerobic fermentations, indicating that this overexpression is crucial for xylose metabolism in S. cerevisiae. PHO13 gene deletion allowed a faster and greater xylose consumption, both in aerobic growth and microaerobic fermentations, in addition to increasing the production of xylitol and altering the production of glycerol in all the assays. Furthermore, the advantageous effects caused by PHO13 gene deletion on xylose consumption and ethanol production were more evident in media containing high xylose concentrations (100 g.L-1). At the same time, we also built the ASY-3 lineage, in order to serve as a platform for heterologous transporter tests. This strain was constructed by the PHO13 gene deletion in the DLG-K1 strain, a hxt-null yeast (hxt1-hxt7 and gal2) which has the genes necessary for xylose metabolization overexpressed, but incapable of transporting monosaccharides. The DLG-K1 and ASY-3 yeast were transformed with plasmids containing genes encoding the Sut4 and Xut1 transporters from Spathaspora arborariae and Scheffersomyces stipitis yeasts, respectively, and the fermentative performance of the transformants was evaluated. In aerobic growth assays, our results showed that PHO13 gene deletion allowed for faster and greater xylose consumption, in addition to higher ethanol production. However, in microaerobic fermentations, there was no difference in xylose consumption between strains containing or not the PHO13 gene and expressing the heterologous transporters. PHO13 gene deletion also altered glycerol production by the strains in all fermentative assays performed using heterologous transporters. Thus, the developed recombinant strains are an important tool for cloning and identification of new genes involved in xylose transport and fermentation by S. cerevisiae.

O cádmio (Cd) é considerado um metal extremamente tóxico à maioria dos organismos. As plantas constituem a principal forma de entrada deste metal na cadeia alimentar. O tomate, uma espécie amplamente utilizada para consumo humano, foi recentemente identificado como hiperacumulador de Cd. Diante disso, o presente trabalho objetivou quantificar o teor de Cd nas folhas e frutos de seis cultivares de tomate, bem como caracterizar os genes possivelmente envolvidos na tolerância e na hiperacumulação de Cd nesta espécie. Para tanto, as cultivares de tomate foram cultivadas na presença da dose de Cd de 90 mg Kg-1 ou na ausência deste metal. Simultaneamente, foi procedida uma busca de genes ortólogos aos HMAs (HMA1 – HMA4) de Arabidopsis thaliana, os quais formam um grupo de transportadores de metais, incluindo o Cd. Através desta busca, foi identificado em tomate um ortólogo ao HMA1 de A. thaliana. A expressão do HMA1 e também do LeNRAMP3, LeFER, LeIRT1 e LeNRAMP1, os quais são genes envolvidos no transporte de metais em tomate, foi comparada entre as plantas cultivadas com e sem Cd. Na maioria das cultivares de tomate, todos os genes avaliados foram responsivos ao Cd, sendo verificado um aumento nas expressões em resposta a presença do metal no substrato. Todas as cultivares de tomate utilizadas foram caracterizadas como hiperacumuladoras de Cd e foram capazes de acumular o metal nos frutos. No intuito de caracterizar o papel do HMA1 durante o processo de hiperacumulação de Cd em tomate, este gene foi empregado nas etapas que compõem o silenciamento gênico induzido por vírus (VIGS). O silenciamento do HMA1 não teve efeito na acumulação de Cd na parte aérea de tomate. Por outro lado, o silenciamento deste gene resultou na redução do peso seco das raízes e no aumento da intensidade dos sintomas de clorose nas plantas cultivadas com Cd a 0,7 mM. Em conjunto, os resultados indicam que o tomate representa um organismo modelo atrativo para a elucidação dos mecanismos envolvidos na tolerância e na hiperacumulação de Cd. / Cadmium (Cd) is considered an extremely toxic metal to most organisms. Plants are the main pathways for Cd entry into the food chain. Tomato, a species widely used for human consumption, was recently identified as a Cd hyperaccumulator. Therefore, this study aimed to quantify Cd content in leaves and fruits of six tomato cultivars, as well as characterize the genes possibly involved in Cd tolerance and hyperaccumulation in this species. To this end, the tomato cultivars were grown in the presence of Cd at 90 mg kg-1 or in the absence of the metal. Simultaneously, a search for orthologous genes to HMAs (HMA1 - HMA4) from Arabidopsis thaliana was performed, these genes are a group of metal transporters, including Cd. By this search, was identified an ortholog of HMA1 from A. thaliana in tomato. The expression of HMA1 and also of the genes LeNRAMP3, LeFER, LeIRT1 LeNRAMP1, which are involved in transport of metals in tomato, was compared between plants grown with and without Cd. In most tomato cultivars, all genes were responsive to Cd, and it was verified an increase in expression in response to the metal presence. All the tomato cultivars used were characterized as Cd hyperaccumulators and were able to accumulate the metal in the fruits. In order to characterize the role of the HMA1 during the process of Cd hyperaccumulation in tomato, this gene was used in the steps that comprise the virus induced gene silencing (VIGS). The silencing of HMA1 had no effect on Cd accumulation in tomato shoot. On the other hand, this gene silencing resulted in a reduction of the roots dry weight and in an increased severity of the symptoms of chlorosis in plants grown with 0.7 mM of Cd. Taken together, these results indicate that tomato represents an attractive model organism for elucidation of the mechanisms involved in Cd tolerance and hyperaccumulation.

Submitted by Maykon Nascimento (maykon.albani@hotmail.com) on 2015-04-14T18:48:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação Berthil Borges Longo.pdf: 1938483 bytes, checksum: 3ca514e950f7320a724e099f66c34f97 (MD5) / Approved for entry into archive by Elizabete Silva (elizabete.silva@ufes.br) on 2015-04-29T19:20:30Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação Berthil Borges Longo.pdf: 1938483 bytes, checksum: 3ca514e950f7320a724e099f66c34f97 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-29T19:20:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação Berthil Borges Longo.pdf: 1938483 bytes, checksum: 3ca514e950f7320a724e099f66c34f97 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / CAPES / Novas ferramentas de Tecnologias Assistivas (TAs) têm aparecido ultimamente. Um exemplo são os Ambientes Virtuais (AVs), os quais são importantes para o desenvolvimento de novas TAs, que podem ser direcionadas para promoverem uma melhor qualidade de vida de pessoas com mobilidade reduzida permanente ou promover a reabilitação de pessoas com deficiência motora temporária. Outras ferramentas, que surgiram há algumas décadas com o desenvolvimento dos computadores, também ajudam no tratamento de pessoas com deficiência motora, que são as Interfaces Humano-Máquina (IHM). Utilizando em conjunto com equipamentos que capturam sinais biológicos, como equipamentos de Eletromiografia (EMG) e Eletroencefalografia (EEG), essas ferramentas se configuram como canais de comunicações entre o ser humano e os computadores, diferentemente das comumente utilizadas. Isso abre uma gama de possibilidades para sua utilização no tratamento e na assistência de pessoas com deficiência motora, onde sinais EMG podem ser utilizados para controlar próteses robóticas; e sinais EEG, quando capturados da região do córtex motor, podem ser utilizados em neuroreabilitação. Por outro lado, quando capturados na região occipital, os sinais de EEG podem ser utilizados para gerar comandos e outras finalidades. Este trabalho apresenta o desenvolvimento de novas ferramentas para auxiliar em pesquisas de TAs envolvendo sinais biológicos. Três diferentes AVs foram desenvolvidos para auxiliar nesse tipo de pesquisa. Além deles, um equipamento EEG comercial foi adaptado para ser utilizado com uma IHM, o qual utiliza dois desses três AVs desenvolvidos. Como resultados, temos a utilização bem sucedida do equipamento EEG obtido com sua utilização com SSVEP e Imaginação motora, além da implementação com sucesso dos três AVs desenvolvidos, que estão disponíveis para download gratuito, e que podem ser utilizados em demais pesquisas envolvendo TAs. / New Assistive Technology (AT) tool has appeared lately. An example are the Virtual Environments (VE) which are important to new ATs development, that can aim to improve the life quality of people with permanent reduced mobility or to promote rehabilitation to people with temporary motor disability. Other tool that appeared some decades ago with computer development can also help in the treatment of motor disability persons, which are called Human Machine-Interface (HMI). Using it together with equipment that can acquire biological signals like Electromyography (EMG) and Electroencephalography (EEG), these tools behave as communication channels between humans and computers, different from the ones usually used. This opens a wide range of possibilities for its usage in the treatment and assistance of motor disability people, which EMG signals can be used to control robotic prosthesis, and EEG signal, when acquired from the motor cortex, can be used in neurorehabilitation. On the other hand, when these signals are captured from the occipital region, the EEG signals can be used to generate commands or used in other purposes. This work presents the development of new tools to be used in AT which uses biological signals. Three different VE where built to assist this kind of research. Furthermore, a commercial EEG equipment was adapted to be used with a HMI, which uses two of the built VE. As results, we have the successful use of the adapted EEG equipment with with SSVEP and motor imagery. Furthermore, the three developed AVs were successfully implemented, which are available for free download to be used in other TA projects.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-03-15T04:02:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334747.pdf: 9033118 bytes, checksum: 027254caae7a74df7d45fa337ad31361 (MD5) Previous issue date: 2015 / O mercado de cogumelos comestíveis se expande rapidamente, demandando um aumento na sua produção. Para isso, é fundamental o fornecimento de inoculantes de qualidade, que na falta representa um gargalo importante na produção. Os grãos de cereais utilizados tradicionalmente na produção de inoculantes, fornecem nutrientes para o crescimento miceliano do fungo e o prepara para a rápida colonização do substrato. Esses são produzidos usando-se resíduos agrícolas, reciclando-se assim o material lignocelulósico. Alguns fungos comestíveis estão entre os únicos organismos capazes de degradar lignina, transformando-a em biomassa de valor nutricional. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma alternativa biotecnológica para o processo de fermentação em estado sólido, tradicionalmente utilizado na produção dos inoculantes. Um inoculante em alginato de cálcio foi desenvolvido utilizando o processo de fermentação submersa com aditivos nutrientes a fim de simular as condições do inoculante em grãos, induzindo a produção de enzimas lignocelulolíticas (peroxidases e ß-glicosidases). Foi possível cultivar Lentinula edodes e Pleurotus ostreatus var. florida em condições submersas com aeração em frascos estáticos utilizando farinha de trigo integral e serragem de eucalipto como aditivos e a biomassa obtida foi encapsulada em alginato de cálcio. Os inoculantes em alginato aditivados de L. edodes colonizaram o substrato mais rapidamente do que o inoculante em alginato não aditivado, mas não foram observadas diferenças de colonização entre os inoculantes em alginato de P. ostreatus var. florida. A viabilidade dos inoculantes em alginato foi mantida em 100 % por pelo menos seis meses, ultrapassando em quatro meses a viabilidade dos inoculantes tradicionais. Um biorreator airlift foi utilizado com sucesso no cultivo de P. ostreatus var. florida utilizando farelo de trigo como aditivo. Uma grande quantidade de biomassa foi obtida, assim como uma pequena produção de exopolissacarídeos. Atividade para as duas enzimas estudadas foi detectada. Este trabalho possibilitou a produção de um inoculante em alginato de cálcio de qualidade em menor tempo que o inoculante tradicional, com alta viabilidade, utilizando aditivos para preparar o metabolismo fúngico e com grande potencial para produção e uso comercial. O uso de um biorreator airlift se mostrou eficiente na produção de quantidades desejáveis de biomassa para a produção de inoculante.<br> / Abstract : The edible mushroom market is expanding rapidly, demanding an increased production. Ergo, it is necessary a regular supply of high quality grain spawn, making it the bottleneck of the process. The cereal grains used in spawn making provide nutrients for mycelium growth and prepare the fungus for the rapid colonization of the substrate. Mushrooms are grown on agro industrial residues, thus recycling the lignocellulosic materials. Some edible mushrooms are amongst the only organisms capable of degrading lignin, transforming this recalcitrant material in a valuable biomass. The aim of this work was to develop a biotechnological alternative to the solid-state fermentation, traditionally used to produce spawn. An alginate-based inoculant was developed using submerged fermentation using additives so to mimic the conditions in the grain spawn, inducing the fungi to produce lignocellulolytic enzymes, namely peroxidases and ß-glucosidases. It was possible to grow both Lentinula edodes and Pleurotus ostreatus var. florida in submerged conditions provided with aeration in static flasks using whole-wheat flour and eucalypt sawdust as additives. The biomass obtained was encapsulated in calcium alginate. The alginate-based inoculants were capable of colonizing the substrate for mushroom production. L. edodes additivated alginate inoculants colonized the substrate faster than the non-additivated alginate inoculant, but no differences in colonization were observed between P. ostreatus var. florida alginate inoculants. The inoculants maintained a 100 % viability for at least six months, surpassing in four months that for the traditional grain spawn. An airlift bioreactor was used to successfully cultivate P. ostreatus var. florida using wheat bran as additive. A high yield of biomass was obtained as well as a small production of exopolysaccharides. Activity for both enzymes studied was detected. This work made possible to produce an alginate inoculant of quality in less time than the grain spawn, with high viability, using additives to prepare the fungus metabolism with great potential for production and commercial use. The use of an airlift bioreactor proved to be efficient in producing desirable amounts of biomass for inoculant production.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-06-26T01:11:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 316504.pdf: 1547020 bytes, checksum: b34d09659e361589831135b8d5198ea5 (MD5) / A pesquisa por novos compostos biologicamente ativos obtidos a partir de produtos naturais, nos últimos anos, tem sido incentivada em todo o mundo, pois são considerados muito importantes na descoberta de novos fármacos para varias doenças. Diversas estratégias, baseadas em diferentes tipos de observações, juntamente com triagens randomizadas, têm sido usadas na investigação da biodiversidade com o intuito de contribuir para o aumento do arsenal terapêutico anti-herpético. As infecções causadas pelos vírus herpéticos são um grave problema de saúde pública, devido à capacidade dos mesmos de causarem infecções agudas e recorrentes, além do aparecimento de cepas resistentes ao aciclovir, fármaco de primeira escolha disponível. Diante deste quadro, o Laboratório de Virologia Aplicada da UFSC avalia, há vários anos, a atividade antiviral de produtos naturais e sintéticos, tendo encontrado resultados promissores para muitas das amostras testadas. Inicialmente, a citotoxicidade (CC50) e a atividade anti-HSV (CI50) foram avaliadas através do ensaio colorimétrico do MTT e do ensaio de redução do número de placas de lise, respectivamente. De acordo com os resultados obtidos através da triagem dos representantes oriundos da biodiversidade terrestre e marinha, três amostras (a fração rica em trissulfato de halistanol: TSH e os compostos TSH-A e TSH-C) foram selecionadas devido aos seus promissores índices de seletividade (IS= CC50/CI50) de 15,33; 2,46 e 1,95 frente ao HSV-1 (cepa KOS). O mecanismo de ação foi avaliado através de uma sequência de ensaios, que visou avaliar a possível interferência destas amostras nas diversas etapas do ciclo de replicação viral. Na avaliação do tempo de adição, estas amostras inibiram significativamente a replicação viral, quando foram adicionadas simultaneamente ou até 3h pós-infecção. As amostras avaliadas apresentaram atividade virucida e inibiram a entrada dos vírus nas células Vero (adsorção e penetração). A análise da expressão proteica viral por Western blotting mostrou que as amostras TSH-A e TSH-C inibiram a expressão das proteínas ? (ICP27) e ? (gB), em diferentes intensidades e a TSH foi a única amostra que inibiu a expressão de todas as proteínas virais. Ao serem combinadas com o aciclovir, elas também demostraram efeito sinérgico, em concentrações equivalentes a 2x seus valores de CI50. O conjunto destes resultados indica a potencialidade destas amostras como compostos antivirais, mas ainda são necessários estudos mais aprofundados.<br> / Asbtract : The search for new biological active compounds derived from natural products in recent years has been stimulated throughout the world, because they are still considered a very important source to find new medicines against some diseases. Several strategies based in different types of observations and randomized screenings have been used to evaluate the biodiversity in order to increase the number of available anti-herpes drugs. The infections caused by herpesvirus are a serious worldwide public health problem, because these viruses are able to cause acute and persistent infections, besides the emergence of strains resistant to acyclovir, the available drug of choice. In this context, the Laboratory of Applied Virology from UFSC has been evaluating, for several years, the antiviral activity of natural and synthetic products, and found promising results for many of the samples tested. Initially, the cytotoxicity (CC50) and anti-HSV activity (IC50) were assessed by MTT and viral plaque number reduction assays, respectively. According to the results obtained through the anti-HSV screening of different taxons from the terrestrial and marine biodiversity, three samples (fraction rich in halistanol trisulphate: TSH and the compounds TSH-A and TSH-C) were selected due to their promising selectivity indices (SI=CC50/IC50) of 15.33, 2.46 and 1.95 against HSV-1 replication (KOS strain). The mechanism of action was evaluated through different methodological strategies, which aimed to detect the possible interference of these samples at various stages of the viral replication cycle. The evaluation of these samples in the addition time assay showed a significant viral replication inhibition when they were added simultaneously or up to 3h post-infection. These samples were virucidal and also inhibited viral entry into Vero cells (adsorption and penetration). In addition, the analysis of viral protein expression by Western blotting showed that the samples TSH-A and TSH-C inhibited the expression of á (ICP27) and ã (gB) proteins, at different levels of intensity and a TSH was the unique sample who inhibited all virus protein expression. When combined with acyclovir, they also demonstrated synergistic effects at concentrations equivalent to 2x their IC50 values. Taken together, these results indicate the potential of these samples as antiviral compounds, but further studies are needed.