Die beständige Autoantikörperproduktion in Patienten mit Systemischem Lupus Erythematodes (SLE) suggeriert die Existenz eines autoreaktiven humoralen Gedächtnisses; die Häufigkeit selbstreaktiver Gedächtnis-B-Zellen in SLE wurde jedoch noch nicht ermittelt. Unter normalen Umständen exprimieren neu gebildete B-Zellen im Knochenmark Autoantikörper mit hoher Frequenz, darunter auch antinukleäre Antikörper. Diese autoreaktiven B Zellen unterliegen einer strengen Überwachung an zwei Kontrollpunkten für Selbsttoleranz, einer im Knochenmark und einer in der Peripherie. Im Gegensatz dazu steht SLE mit einem Defekt in Zusammenhang, der die Etablierung von B-Zell-Toleranz an diesen beiden Kontrollpunkten verhindert und somit einer hohe Anzahl selbstreaktiver naiver B-Zellen in der Peripherie. Das Ziel dieser Studie war die Bestimmung der molekularen Eigenschaften und Reaktivitäten von IgG Gedächtnis-B-Zell-Antikörpern in SLE. Mittels einer Einzelzell-PCR basierten Methode wurden 200 monoklonale Antikörper von einzelnen IgG+ Gedächtnis-B-Zellen vier unbehandelter SLE Patienten kloniert. Die generelle Häufigkeit an polyreaktiven und HEp-2 selbstreaktiven Antikörpern in dieser Population war vergleichbar mit der in gesunden Vergleichspersonen. 15% der Antikörper aus IgG+ Gedächtnis-B-Zellen eines Patienten mit Serum-Autoantikörpertitern derselben Spezifität waren hochreaktiv und spezifisch gegen die SLE-assoziierten löslichen Kernantigene Ro52 und La; nicht jedoch in den übrigen drei Patienten oder gesunden Vergleichspersonen. Die Keimbahnkonfigurationen dieser Antikörper gegen Kernantigen waren nicht-selbstreaktiv oder polyreaktiv mit schwacher Ro52-Bindung und untermauern die Theorie, dass somatische Mutationen zur Reaktivität und Spezifität von Autoantikörpern beitragen. Die Häufigkeitsvarianz, mit der Gedächtnis-B-Zellen SLE-assoziierte Antikörper exprimieren, legt nahe, dass dies eine wichtig Variable für den Erfolg von Therapien sein kann, die diese Population beseitigen. / Persistent autoantibody production in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) suggests the existence of autoreactive humoral immunological memory, but the frequency of self-reactive memory B cells in SLE has not been determined. Under normal circumstances, autoantibodies including antinuclear antibodies (ANAs) are frequently expressed by newly generated B cells in the bone marrow, but these autoreactive B cells are tightly regulated at two checkpoints for self-tolerance, in the bone marrow and the periphery, before maturation into naïve immunocompetent B cells. In contrast, SLE is associated with a failure to establish B cell tolerance at the two checkpoints leading to high numbers of autoreactive naïve B cells in the periphery. The aim of this study was to determine the molecular features and reactivities of IgG memory B cell antibodies expressed in SLE. A single-cell PCR based strategy was applied that allowed the cloning of the Ig heavy and Ig light chain genes of a single purified B cell and the in vitro expression of 200 recombinant monoclonal antibod-ies from single IgG+ memory B cells of four untreated SLE patients. The overall frequency of polyreactive and HEp-2 self-reactive antibodies in this compartment was similar to healthy controls (HC). 15% of IgG memory B cell antibodies were highly reactive and specific for SLE-associated extractable nuclear antigens (ENAs) Ro52 and La in one patient with serum autoantibody titers of the same specificity but not in the other three patients or healthy individuals. The germline forms of the ENA antibodies were non-self-reactive or polyreactive with low binding to Ro52 supporting the idea that somatic mutations contribute to autoantibody specificity and reactivity. Heterogeneity in the frequency of memory B cells expressing SLE-associated autoantibodies suggests that this variable may be important in the outcome of therapies that ablate this compartment.

Das Leben und Überleben einer Zelle wird auf verschiedenen Ebenen streng reguliert. Diese Ebenen sind eng miteinander verknüpft: (i) Signalwege leiten extrazelluläre Signale in den Zellkern, wo (ii) Genregulation sie zu Proteinen übersetzt, und (iii) Proteine kontrollieren metabolische Funktionen, die Nährstoffe zu Energie und zellulären Bausteinen konvertieren. Diese Systeme sind hochkomplex und werden oft nur einzeln betrachtet. Systembiologie ist ein interdisziplinäres Forschungsgebiet, das Methoden anbietet, um Informationen aus heutigen Hochdurchsatz-Experimenttechnologien zu extrahieren. Diese Methoden können effektiv sein, um die vorgenannten Systeme einzeln oder im Ganzen zu untersuchen. In dieser Doktorarbeit wende ich Methoden an, um Signalwege und Zellmetabolismus zu erforschen, und ich präsentiere neue Arbeitsabläufe für das Modellieren und Analysieren dieser Systeme. Beide Methoden sind auf großskalige Netzwerkrekonstruktionen fokussiert. Da die Erhältlichkeit von xperimentellen Daten eines der größten Probleme der Systembiologie darstellt, befassen sich die Methoden explizit mit dem Umgang mit Wissenslücken. Sie werden auf den Snf1 Signalweg und den Metabolismus von Hefezellen angewendet und vermitteln neue Erkenntnisse über diesen Modellorganismus. Des Weiteren präsentiert diese Arbeit eine eingehende Analyse vom metabolischen Reprogrammieren in Darmkrebszellen, welche bisher unbekannte Zusammenhänge von metabolischer Funktionalität und Onkogenen beinhaltet. Zum Abschluss stelle ich unseren Vorschlag für ein standardisiertes Datenaustauschformat vor, welches seinen Schwerpunkt auf Datentabellen der Systembiologie legt. Zusammenfassend behandelt diese Doktorarbeit die Signalwege und den Metabolismus von Zellen, inklusive neuer Modellierabläufe und biologischer Erkenntnisse. Diese Erkenntnisse werden in den Kontext unseres aktuellen Wissensstandes gesetzt und darauf aufbauend werden neue potentielle Ansatzpunkte für Experimente vorgeschlagen. / Cellular life is governed on different layers of regulation, which are tightly interconnected: (i) Signalling pathways transmit extracellular signals to the cells’ nucleus, where (ii) gene regulation translates these signals into proteins, and (iii) proteins control metabolic functions, which convert nutrients to energy and cell building blocks. Due to the complexity of each of these systems, they are often analysed individually or only partially. Systems Biology is an interdisciplinary field of research that offers techniques to harvest the information of todays high-throughput experiments. These techniques can be powerful approaches to investigate the aforementioned regulatory layers of a cell either individually or as a whole. In this thesis, I am employing means of Systems Biology to explore signalling pathways and metabolism, and I provide novel workflows for modelling and exploring these systems. Both workflows are focussed on accurate large-scale network reconstructions of the target system. Since one of the major problems in Systems Biology is the availability of experimental data, the workflows put emphasis on the handling of knowledge gaps. They are applied on the Snf1 pathway and metabolism in yeast and provide new findings about this model organism. Furthermore, this thesis presents an in-depth analysis of metabolic reprogramming in colorectal cancer cells, which yields previously unknown coherences of metabolic function and oncogenes. Finally, I am presenting a proposal for a standardised data format in Systems Biology, which is based on data tables. In summary, this thesis comprises works on signalling pathways and cell metabolism, which includes novel modelling workflows and new biological findings, analyses their impact on the scientific state of the art, and proposes directions for new experimental targets.

Die Schwangerschaft ist ein komplexes Phänomen, bei dem es zu einer Interaktion zwischen dem mütterlichen Immunsystem und dem Fetus kommt. An der feto-maternalen Grenze kommt es zur Auslösung einer inflammatorischen Reaktion, die für eine normale Implantation und Schwangerschaft notwendig ist. Allerdings kann eine exzessive Entzündungsreaktion zu Schwangerschaftskomplikationen wie dem immunologisch vermittelten Sponatanabort füh-ren. Das zytoprotektive Enzym Hämoxygenase-1 (HO-1) spielt eine sehr wichtige Rolle bei der Kontrolle inflammatorischer Reaktionen. Inwiefern HO-1 für das Gelingen und Bestehen einer Schwangerschaft unabdingbar ist, wurde bisher nicht untersucht. Unsere Hypothese ist, dass HO-1 eine bedeutsame Rolle während der Schwangerschaft spielt. Die Beantwortung dieser wichtigen Frage ist deshalb Hauptziel dieser Dissertation. Es konnte gezeigt werden, dass eine spezifische Hochregulation des HO-1 Moleküls mittels Gentherapie in einem Mausmodell für Spontanabort zur signifikanten Reduktion der Abortra-te führte. Dieser protektive Effekt war mit einer erhöhten Th2/Th1 Zytokinen-Ratio und mit verminderter Apoptose assoziiert. Ein weiteres Teilziel dieser Arbeit bestand darin, die Rolle des HO-1 Moleküls während der Plazentation zu untersuchen. Dafür wurde eine Trophoblastenstammzelllinie benutzt, die in der Lage ist, zu Riesenzellen zu differenzieren. Die mittels Zinkprotoporphyrin (ZnPPIX) induzierte Expressionssuppression von HO-1 führte zur Verminderung der Überlebensrate von Trophoblastenstammzellen und zur Hemmung von deren Ausdifferenzierung in Trophoblastenriesenzellen. Um die Rolle des HO-1 Moleküls in anderen Schwangerschaftsprozessen zu untersuchen, wurden Hämoxygenase-1 defiziente (Hmox1-/-) Mäuse benutzt. Da die Verpaarung von Hmox1-/- Mäuse zu keinem erfolgreichen Abkömmling führt, war ein weiteres Teilziel dieser Arbeit gewesen, den zu Grunde liegenden Mechanismus aufzuklären. Es zeigte sich, dass Hmox1-/- Weibchen im Vergleich zu den Hmox1+/+ Weibchen weniger Oozyten produzieren. Auch konnten die Hmox1-/- Oozyten weniger erfolgreich als die Hmox1+/+ Oozyten fertili-ziert werden. Verschiedene Verpaarungsexperimente mit Hmox1+/+, Hmox1+/- und Hmox1-/- Mäusen ergaben einen indirekt proportionalen Zusammenhang zwischen HO-1 Expression und Aborthäufigkeit. Die hier gewonnenen Daten deuten daraufhin, dass HO-1 eine entscheidene Rolle in der Schwangerschaft spielt. Die gewonnenen Erkenntnisse tragen zum Verständnis der Pathologie des immunologisch vermittelten Spontaborts bei und können darüber hinaus helfen neue Be-handlungsstrategien gegen diese gefürchtete Schwangerschaftskomplikation zu entwickeln. / Mammalian pregnancy is a parabiotic union of two genetically different individuals, the fetus and the mother. At the feto-maternal interface, inflammatory processes can occur due to an immune reaction against alloantigens. It is known that some degree of systemic or uterine inflammation is necessary for both normal implantation and pregnancy. However, if this in-flammation becomes too excessive it can cause pregnancy complications such as abortion. Heme oxygenase-1 (HO-1), the enzyme responsible for the degradation of free heme, plays a key role in inflammatory processes. Viewing pregnancy mainly as an inflammatory process had led us to the idea that HO-1 may play an important role in pregnancy. Therefore, the main aim of this work was to analyze the role of HO-1 in the different processes related to preg-nancy by means of functional studies employing in vivo as well as in vitro models. First, we could show that a specific up-regulation of HO-1 in abortion-prone animals by means of an adenoviral vector is able to reduce the abortion rate. This HO-1 up-regulation improved pregnancy outcome by up-regulating the Th2/Th1 cytokines ratio and protecting tissues from apoptosis, suggesting an important role of HO-1 in pregnancy. In a second part of the work, we aimed to analyze the role of HO-1 in placentation. For that, a trophoblast stem cell line capable of differentiate into trophoblast giant cells was used. Inter-estingly, a down-regulation of HO-1 by means of ZnPPIX led to diminished survival of the trophoblast stem cells. Furthermore, these cells were unable to differentiate into trophoblast giant cells in the absence of HO-1, strongly suggesting a crucial role of HO-1 in placentation. Finally, a closer look into the role of HO-1 in pregnancy was performed by using heme oxy-genase-1 deficient mice (Hmox1-/- mice). Interestingly, Hmox1-/- females produce much less oocytes than wild type females. Analyses of the ovaries of both types of females showed dif-ferences in follicle development. Furthermore, when fertilized in vitro, a significant diminu-tion in the fertilization rate of Hmox1-/- oocytes when compared to Hmox1+/+ oocytes was found. Since the mating of Hmox1-/- mice does not yield progeny, we also aimed to clarify whether this is due to problems in the female, in the male or in both. For this, different mating combinations of mice partially or totally deficient in Hmox1 were performed. The analysis of the pregnancy outcome showed that, the less HO-1 in the combination, the higher the fetal rejection. In summary, a central role of HO-1 in different processes of reproduction could be demon-strated in this work which helps understanding the mechanisms behind pregnancy success.

Channelrhodopsin-2 ist ein lichtaktivierter Kationenkanal, der zur nichtinvasiven Steuerung neuronaler Aktivität verwendet wird. Einige grundlegende Eigenschaften dieses Proteins sind bereits bekannt, aber die molekularen Mechanismen des Ionentransports und der Aktivierung liegen noch weitgehend im Dunkeln. Ziel dieser Studie war es, anhand von Mutationsstudien die Funktion einzelner Aminosäuren zu bestimmen. Dazu habe ich gezielt potentiell wichtige Reste substituiert und die Channelrhodopsin-2-Varianten elektrophysiologisch untersucht. Um die aufgetretenen Änderungen beim Ionentransport und den Kanalkinetiken zu erklären, habe ich verschiedene mathematische Modelle an die experimentellen Daten angepasst. Dabei stellte sich heraus, dass die Reste H134 und E90 Schlüsselpositionen für den Protonentransport sind. Außerdem haben auch die Reste E235 und D253 einen großen Einfluss auf den Ladungstransport. Dagegen wird die Kanalöffnung von C128 und D156 kontrolliert. Des Weiteren kontrolliert E123 die Übergänge zwischen leitenden und nichtleitenden Zuständen von Channelrhodopsin-2. Aus der zielgerichteten Mutation von Aminosäuren resultierten Varianten, die langsamere oder schnellere Kinetiken hatten oder eine bessere Expression zeigten als der Wildtyp. Das Anwendungspotential der modifizierten Kanäle wurde in Kooperationen mit neurophysiologischen Arbeitsgruppen untersucht. Dadurch konnten drei neue Typen von Channelrhodopsinen in die Neurophysiologie eingeführt werden. Die step-functions opsins führen zu einer anhaltenden Membrandepolarisation, die die Erregbarkeit von Neuronen gegenüber synaptischen Inputs erhöht. ChETA erlaubt das zeitlich präzise Auslösen von Aktionspotentialen auch bei sehr hohen Anregungsfrequenzen. T159C und E123T/T159C ermöglichen durch ihre großen Photoströme und optimierten Kinetiken eine hohe Zuverlässigkeit bei der optischen Steuerung neuronaler Aktivität. Dadurch wird das Anwendungsspektrum von Channelrhodopsin-2 erheblich erweitert. / Channelrhodopsin-2 is a light-activated cation channel which has become a very useful tool in neurophysiology, since it allows the noninvasive control of neural activity. Some of the basic features of this channel are known from previous studies, but the molecular mechanisms of ion translocation and activation are largely unknown. The aim of my thesis is to elucidate the function of single amino acids by mutational studies. I replaced potentially important residues and probed the constructs by electrophysiological measurements under various conditions. Additionally, I fitted the experimental data to several mathematical models in order to explain changes in ion permeabilities and channel kinetics and I assigned particular functions to the mutated residues. Apparently, H134 and E90 are key positions for the proton transportation. Mutations at E235 and D253 also strongly influence ion translocation, whereas C128 and D156 obviously control the channel opening. Moreover, I found that E123 is a key element for the channel activation which controls the transitions between conducting and non-conducting states of Channelrhodopsin-2. The genetically modified Channelrhodopsin-2-variants provide several favorable features, such as, a slower or faster channel opening and closing or an optimized expression. Therefore, we tested the potential of promising constructs for applications in collaboration with neurophysiology laboratories. Finally, we introduced three new tools. First, step-function opsins induce a sustained membrane depolarization which sensitizes neurons to native synaptic inputs. Second, the ChETA variant allows the temporally precise generation of action potentials even at high stimulation frequencies. Third, T159C and E123T/T159C provide large photocurrents and optimized kinetics resulting in an improved performance in the noninvasive control of neural activity. In summary, this significantly broadens the range of application for channelrhodopsin-2.

Die Veraenderungen des Immunsystems mit zunehmendem Alter, Immunseneszenz genannt, resultieren in erhoehter Infektanfaelligkeit. Infolge dessen leiden aeltere Menschen unter haeufigeren und schwerer verlaufenden Infekten, Autoimmunerkrankungen und vermindertem Impfschutz. Immunseneszenz entsteht nicht nur aufgrund chronologischen Alterns, sondern wird auch durch andere teils ungeklaerte Faktoren verursacht. Cytomegalievirus (CMV) ist ein Herpesvirus, dass in immunkompetenten Menschen lebenslang persistiert. Infolge chronischer Immunaktivierung traegt CMV zur beschleunigten Immunseneszenz bei. In dieser Arbeit wurden die Alters- und CMV-induzierten Veraenderungen in humanen T-Zellen analysiert. Dafuer wurden PBMC von 50 gesunden Spendern in drei verschiedenen Altersgruppen antigenspezifisch (CMV-Proteine pp65 und IE1 und protein purified derivate von Mycobacterium tuberculosis (PPD)) und polyklonal (OKT3) in vitro stimuliert. Ein 11-Farben-Panel wurde etabliert, um die simultane Expression der Differenzierungsmarker CD45RA und CD27 und der Aktivierungsmarker CD40L, IFNg, IL2 und TNF auf T-Zellen durchflusszytometrisch zu untersuchen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass die antigenabhaengige Differenzierung der Gedaechtnis-T-Zellen mit zunehmendem Alter und CMV-Infektion zunahm. Die Differenzierung der Gedaechtnis-T-Zellen in CMV-positiven Spendern war ausserdem mit der Antwortgroesse gegen pp65 korreliert. Die pp65-spezifische, aber nicht die IE1-spezifische polyfunktionale T-Zell-Antwort nahm mit zunehmendem Alter der Probanden zu. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass CMV einen grossen Einfluss auf das Immunsystem gesunder Individuen hat. Die Differenzierung der Gedaechtnis-T-Zellen ist nicht nur abhaengig von der Infektion mit CMV, sondern auch davon, wie das Immunsytem auf CMV reagiert. Polyfunktionale CMV-spezifische T-Zellen, die wahrscheinlich CMV kontrollieren, sind vorhanden und werden nicht von dysfunktionalen T-Zellen im Alter verdraengt. / Ageing of the immune system, also called immunosenescence, is a phenomenon that leads to increased susceptibility to infections in elderly people. Persistent cytomegalovirus (CMV) infection induces strong T cell responses in humans and is thought to be one of the driving forces of immunosenescence. In this work CMV-induced alterations in the T cell compartment of human individuals were analysed in terms of frequencies and absolute numbers per ml blood. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 50 donors in three different age groups were stimulated in vitro and examined for the phenotypic markers CD45RA and CD27 and the effector molecules CD40L, IFNg, IL2 and TNF by polychromatic flow cytometry. The frequency of responding polyfunctional T cells to stimulation with OKT3 or CMV peptide pools phosphoprotein 65 (pp65) or immediate-early protein1 (IE1) increased with the age of the donor. The memory subset distribution differed between CMV-seronegative and CMV-seropositive donors and was correlated with the response size in the CMV-seropositive group. Polyfunctional T cells expressed quantitatively and qualitatively more activation marker on a per cell level than monofunctional cells and therefore appeared to be more effective. Furthermore, polyfunctional T cells expressed reduced amounts of surface CD3, CD4 and CD8 compared to monofunctional or non-responding T cells. In summary, the results indicate that CMV has a significant influence on the immune system of healthy people. The memory subset composition of the entire T cell compartment depends on how the immune system responds to CMV (large or small responses) rather than the presence or absence of infection. Irrespectively of response size or age a robust population of polyfunctional CMV-specific T cells is present and may be in control of CMV.

Flavinmononukleotid (FMN) und Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) gehören zu den wichtigsten Redox-Coenzymen und sind an zentralen Stoffwechselprozessen aller Organismen beteiligt. Sie entstehen aus Riboflavin (Vitamin B2). Das bifunktionale RIBA Enzym, das Peptiddomänen für die GTP Cyclohydrolase II (GCHII) und 3,4-Dihydroxy-2-Butanon-4-Phosphat-Synthase (DHBPS) Aktivität umfasst, führt die beiden ersten Schritte der Riboflavin Biosynthese in Pflanzen durch. Die RIBA Proteine werden durch drei Gene in Arabidopsis thaliana und anderen Blütenpflanzen kodiert. Eines der Ziele war es, die physiologischen Rollen der drei RIBA Isoformen aufzuklären. Detaillierte enzymatische Untersuchungen wurden mit rekombinanten RIBA Proteinen IN VITRO durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass RIBA2 und RIBA3 jeweils die GCHII oder die DHBPS Aktivität verloren haben. Des Weiteren konnte die Phosphorylierung von RIBA1, sowie die Hemmung von dessen GCHII Aktivität durch FMN nachgewiesen werden. Ein Knockout von RIBA1 führte zu Embryoletalität. Die schrittweise Reduzierung des RIBA1 Proteingehaltes in Arabidopsis, welches zu einem verringerten Flavingehalt führte, ergab einen schwerwiegenden Bleichungsphänotyp. Die konstitutive Antisense-Mutante, sowie das Verfahren des Virus-induzierten Gen-„Silencing“ wurden verwendet, um den durch RIBA1-Mangel hervorgerufenen Flavin-Defizienz-Effekt zu beschreiben. Eine Metabolomics Analyse ergab, dass die Abnahme des Flavingehaltes zu einer Deregulierung verschiedener Zitronensäurezyklus assoziierten Flavoenzyme und zu einer starken Reduktion der katabolischen Kapazität diverser Aminosäuren führt, während flavinabhängige Stickstoffassimilationsprozesse eher priorisiert wurden. Diese Arbeit leistet einen Beitrag zur Erweiterung des Kenntnisstands über den pflanzlichen Riboflavin Biosyntheseweg, sowie zum Verständnis über die Folgen von Flavinmangel in Pflanzen. Darüber hinaus wird hier der erste Versuch zu Erhöhung des Vitamin B2-Gehalt in Pflanzen beschrieben. / Flavin mononucleotide (FMN) and Flavin adenine dinucleotide (FAD) belong to the main redox coenzymes and are involved in central metabolic processes. They derive from riboflavin also referred to as vitamin B2. The bifunctional RIBA enzyme, which comprises peptide domains for GTP cyclohydrolase II (GCHII) and 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase (DHBPS) activity, performs the two initial steps of riboflavin biosynthesis in plants. Three genes encode RIBA proteins in Arabidopsis thaliana and many other flowering plants. One of the main aims of this study was to elucidate the physiological roles of the three RIBA isoforms. Detailed enzymatic studies were performed with recombinant RIBA proteins IN VITRO. It revealed for RIBA2 and RIBA3 the loss of either GCHII or DHBPS activity, respectively. The phosphorylation of RIBA1 as well as the inhibition of its GCHII activity by FMN could be demonstrated. A knockout of RIBA1, encoding the dominant RIBA isoform, led to embryo lethality. The gradual reduction of the RIBA1 protein content in Arabidopsis was associated with reduced flavin amounts and a severe bleaching phenotype that was caused by the gradual loss of pigments during leaf development. Flavin deficiency effects caused by RIBA1 depletion were characterised with a constitutive antisense mutant and the virus induced gene silencing method. A comprehensive metabolite profiling, revealed that the loss of almost one third of total flavin content led to a deregulation of several citric acid cycle-associated flavoenzymes. Moreover, a severe reduction of the catabolic capacity of numerous amino acids is seen, while seemingly flavin-dependent processes of the nitrogen assimilation are prioritised. In summary, this thesis contributes to the extended knowledge about the riboflavin biosynthesis pathway as well as to the understanding about consequences of flavin deficiency in plants. Moreover, the first attempt to increase the vitamin B2 content in plants is presented.

In h?heren Pflanzen vermittelt der Blaulicht-sensitive Photorezeptor Phototropin verschiedene Reaktionen wie Phototropismus, Chloroplastendrehung und die ?ffnung von Schlie?zellen. Alle Reaktionen haben mit der Optimierung der pflanzlichen Lichtaufnahme und damit einer angepa?ten Photosynthese sowie der Vermeidung von Lichtsch?digung zu tun. In C.reinhardtii haben alle Phototropinreaktionen mit dem Sexualleben dieser Alge zu tun, d.h. Gametogenese, sexueller Kompetenz sowie der Keimung von Zygoten. Diese Doktorarbeit wurde Ende 2001 begonnen und verlief parallel zu den Arbeiten von Huang. Im Unterschied zu den Ergebnissen von Huang war das Chlamydomonas Phototropin in meinen H?nden unl?slich. Das Protein war nicht komplett membranassoziiert, sondern ein Teil des Proteins blieb immer l?slich. Die Phototropinmenge sowie die Verteilung waren in vegetativen Zellen, die unter Stark- oder Schwachlicht gewachsen waren, unterschiedlich. Deshalb wurde fš¹r diesen Unterschied Licht als wesentlicher Faktor verantwortlich gemacht. Jedoch zeigen verschiedene St?mme bei vegetativem Wachstum unter identischen Lichtbedingungen unterschiedliche Phototropinmengen. Das deutet auf weitere Faktoren hin, die Konzentration und Verteilung von Phototropin beeinflussen. In Chlamydomonas wurde neben dem Volll?ngenprodukt noch eine c-terminal verkš¹rzte Phototropinvariante gefunden. Licht wurde als Verursacher der Verkš¹rzung identifiziert. Aber nur lange Belichtungen von ca. 48 h fš¹hrten je nach Intensit?t zu klaren Abbaumustern. Fš¹r das Studium der Beteiligung des Phototropins am Sexualleben von Chlamydomonas, sollte ein Phot- Stamm generiert werden. Dazu wurde ein RNAi-Konstrukt hergestellt, mit dem es m?glich war, im Stamm cw15 arg- A das Phototropin bis auf 10% des Originalniveaus zu reduzieren. Leider funktionierte das Konstrukt in anderen St?mmen nicht zuverl?ssig. Im Stamm CC32pab1mt(+) konnte nur ein Klon mit einer Reduktion auf 15% des Originalniveaus erreicht werden. Au?erdem war die Silencing-Effizienz stark von den Wachstumsbedingungen abh?ngig. Die beste Reduktion wurde bei niedrigen Lichtintensit?ten gefunden. Es wurde ein weiterer Kreuzungstest etabliert, der fš¹r die Analyse der Zygotenkeimung verschiedene Vorteile gegenš¹ber bekannten Tests liefert. Aus den durchgefš¹hrten Tests konnte geschlossen werden, dass Licht auch ein wesentlicher Faktor fš¹r die Zygotenkeimung ist. Bei mittleren Lichtintensit?ten keimen Zygoten mit wenig Phototropin sp?ter. Starklicht kann diesen Mangel weitgehend kompensieren. Zur biochemischen Analyse des Phototropins in vitro war die Expression eines markierten Phototropins notwendig. Zur Analyse des Phototropinabbaus und fš¹r die sp?tere Reinigung wurde auch versucht, Phototropin in verschiedenen Gastorganismen zu exprimieren. In dieser Arbeit wurde Phototropin in Xenopus Oocyten und Diatom?en exprimiert. Diese Versuche haben best?tigt, dass das Phototropinabbauprodukt vom selben Gen wie das Volll?ngenprotein resultiert. Durch Expression der Phot-Mutante S57S/C250S konnte auch gezeigt werden, dass die Aktivierung des Phototropins keine Voraussetzung fš¹r den Abbau ist. Erstmalig konnte auch Phototropin als Fusionsprotein in Chlamydomonas exprimiert werden. Das Fusionsprotein wurde gereinigt und die Identit?t massenspektrometrisch verifiziert. Es wurde ein Stamm gefunden, der nur eine verkš¹rzte Variante des Phototropins exprimiert. Das Produkt war besser l?slich als die Volll?ngenversion. Eine Gro?produktion sollte fš¹r die Reinigung und nachfo! lgende Kristallisation angesetzt werden. Tandem Affinit?tsreinigungen sollten fš¹r die Identifizierung von Reaktionspartnern durchgefš¹hrt werden. / Abstract In higher plants, phototropin is in charge of phototropism (Liscum, 2002), chloroplast relocation (Wada et al., 2003) and stomatal opening (Schroeder et al., 2001). All its functions are connected with plants' modulation to the surrounding light conditions so that plants can make the best use of light for photosynthesis and dodge harmful strong light. In C.reinhardtii, all its reported functions are connected to the sexual life of this green alga, i.e. gametogenesis, maintenance of gamete competence and zygote germination. This PhD work started at the end of 2001 and went on in parallel with Huang's work. Different from Huang's observation that phototropin was insoluble (Huang et al., 2002), it was found that phototropin existed not only as a membrane associated protein, a portion of phototropin always remained soluble. Phototropin levels and distributions were different between vegetative cells grown in strong light or in darkness. Light was thought to be the essential factor that caused this difference. But, different strains grown vegetatively under same light conditions showed that the levels of phototropin and its distributions varied. This suggested the existence of other factors in the determination of its level and distribution. A C-terminus degradation product of phototropin was found as a stable component in C. reinhardtii. Light was found as a reason that caused the degradation. However, short time of illumination with strong light (up to 2 h) did not evoke the degradation machinery. In light gradient experiment, long time illumination (~48h) with different light intensity showed a clear degradation pattern. To study phototropin involvement in Chlamydomonas sexual life, a Phot1- strain was needed. An RNAi phototropin construct was made. It managed to reduce the level of phototropin in strain cw15 arg- A down to 10% of its original level. However, the construct did not work properly in other strains. Only one transformant of strain CC32pab1mt(+) with a reduction of the phototropin level to around 15% of the original level was found. Under different growth conditions, the silencing efficiency varied. The best silencing result appeared when cells were grown under low light conditions. A new mating assay was established in this work, which has many benefits over the traditional way of studying zygote germination. The conclusion was drawn from this assay that light was the primary factor that determines zygote germination; under moderate light conditions, zygotes with higher phototropin level would germinate earlier; strong illumination could compensate the difference caused by the low phototropin level in zygote germination. For phototropin function analysis in vitro, a Chlamydomonas strain that over-expressed phototropin was in need. To prove that the suspected degradation product originated from the phototropin gene and to purify phototropin for crystallization, trials to express C.r. phototropin cDNA in different organisms were also made. Phototropin was expressed in Xenopus oocytes and diatom in this work. The expression pattern confirmed that both the full-length and the suspected degradation product did originate from the same phototropin gene. It was also found that the degradation was independent on phototropin activation state by expressing C.r. Phot1 (C57S, C250S) in oocytes. For the first time, recombinant phototropin got expressed in Chlamydomonas by fusion expression strategy. The fusion product was purified and the identity was confirmed by Mass Spectrometry analysis. One strain which expressed only a C-terminus truncation version of the fusion product was found. Compared with the full length product, this mutant had better solubility and was easier to be purified. Large scale of purification should be performed to obtain enough material for crystallographic studies. Tandem affinity purification (TAP) tag should also be performed in Chlamydomonas proteomic studies about phototropin.

Lipoxygenasen sind nichthämeisenhaltige Dioxygenasen, die die Bildung von Hydroperoxiden aus molekularem Sauerstoff und mehrfach ungesättigten Fettsäuren katalysieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Lipoxygenase-Ligand-Wechselwirkungen untersucht: a) Durch gezielte Substratveränderungen und ortsgerichtete Mutagenese konnte gezeigt werden, dass Fettsäuren normalerweise mit dem Methylende in der Bindungstasche tierischer Lipoxygenasen gebunden werden. Unterschiedliche Positionsspezifitäten basieren demzufolge auf dem Volumen der Substratbindungstasche (Volumenhypothese). Darüber hinaus konnte bei der 15-Lipoxygenase eine inverse Substratbindung (Carboxylgruppe im aktiven Zentrum) durch Modifikation beider Enden der Fettsäure erzwungen werden, wodurch ausschließlich 5-Lipoxygenierung katalysiert wurde. b) Untersuchungen mit dem Hemmstoff Ebselen ergaben unterschiedliche Hemmmechanismen für verschiedene Enzymzustände. Die Hemmung der Lipoxygenase im Grundzustand (Fe[II]) erfolgt durch kovalente Bindung und Veränderung der Eisenligandensphäre irreversibel nach einem nicht-kompetitiven Mechanismus. Dagegen wird die aktive Lipoxygenase (Fe[III]) nur noch kompetitiv durch Ebselen gehemmt. c) Die Membranbindung der tierischen 15-Lipoxygenase erfolgt über hydrophobe Wechselwirkungen, vermittelt durch oberflächenexponierte, hydrophobe Aminosäuren aus beiden Enzymdomänen. Die Expression einer enzymatisch aktiven Trunkationsmutante, der die N-terminale Domäne fehlt, zeigte, dass diese nicht essentiell ist für die Membranbindung. / Lipoxygenases are nonheme iron-containig dioxygenases that catalyze the oxygenation of polyunsaturated fatty acids to hydroperoxy derivatives. Here, the interaction of lipoxygenases with various ligands was investigated: a) From substrate modifications and site directed mutagenesis it was concluded that fatty acids are bound with their methyl end in the substrate binding pocket of mammalian lipoxygenases. The positional specificity is therefore related to different volumes of this binding pocket (space-based hypothesis). For the 15-lipoxygenase an inverse substrate binding (carboxy terminus in the pocket) could be forced by simultaneous modification of both ends of the fatty acid. This lead to an exclusive 5-lipoxygenation by the 15-lipoxygenase. b) The mechanism of lipoxygenase inhibition by ebselen depends on the enzyme's state. The groundstate lipoxygenase (containing Fe[II]) is irreversibly inhibited in a non-competetive manner due to covalent modification and alteration of the iron ligand sphere. The active enzyme (containing Fe[III]) on the other hand is only competetively inhibited. c) The membrane binding of the mammalian 15-lipoxygenase is based on hydrophobic interactions mediated by solvent exposed, hydrophobic amino acid residues of both enzyme domains. The expression of an enzymatically active truncation mutant, which lacks the entire N-terminal domain, showed that this domain is not essential for membrane binding.

Diese Arbeit basiert auf der grundlegenden Annahme, dass Signaltransduktionsnetzwerke in lebenden Organismen als das Ergebnis eines evolutionären Prozesses betrachtet werden können, der sich durch Mutations- und Selektionsprinzipien auszeichnet. Basierend auf dieser Hypothese werden zwei Ansätze vorgestellt, um Design und Kontrollmechanismen von Netzwerken zu untersuchen. In Kapitel 2 wird ein Modell entwickelt, welches die Struktur analysiert. Ein vereinfachtes Modell wird benutzt, um Systeme, bestehend aus Rezeptoren, Kinasen und Phosphatasen, zu beschreiben. Zwei dynamische Eigenschaften sollten für die Überlebensfähigkeit der Organismen eine wichtige Rolle spielen: (i) Um eine Autoaktivierung zu verhindern, z.B. gegenüber stochastischen Schwankungen von Rezeptorliganden, muss der Signal-Aus Zustand dynamisch stabil sein. (ii) Das Ausgangssignal sollte verstärkt werden. Um Netzwerke zu charakterisieren, die beide Kriterien gleichzeitig erfüllen, wird eine systematische Analyse von kleinen Netzwerken durchgeführt. Die Untersuchungen machen deutlich, dass für solche Netzwerke die folgenden zwei Design-Eigenschaften gelten: (i) Mit steigender Netzwerkgröße verringert sich die Konnektivität, was einer steigenden Spezifität der Kinasen gleichkommt. (ii) Die Anzahl der "Feedback"-Zyklen nimmt mit zunehmender Netzwerkgröße ab, was eine abnehmende Tendenz anzeigt, dass "nachgeschaltete" Kinasen "vorgelagerte" Kinasen aktivieren. Die allgemeine Gültigkeit dieser Eigenschaften wird durch die Untersuchung eines großen Kinase-Netzwerks aus der Datenbank TRANSPATH gestützt, welches hinsichtlich verschiedener Strukturmerkmale weitergehend untersucht. Das Netzwerk-Design unterscheidet sich aussagekräftig von Zufallsnetzen. In Kapitel 3 werden Kontrollmechanismen unterschiedlicher Signalnetzwerke analysiert, indem die Metabolische Kontroll Theorie auf transiente Aktivierungsprofile angewendet wird, indem Kontrollkoeffizienten für Amplitude, Signaldauer berechnet werden. / This work is based on the hypothesis that signal transduction networks in living cells are the result of an evolutionary development which is governed by mutations and natural selection principles. Based on this working hypothesis, two approaches are presented to investigate design and control mechanisms of signal transduction networks. In the first approach, covered in chapter 2, a model is developed to analyse the structural design of signaling networks. A simplified model is used to describe systems consisting of receptors, kinases and phosphatases. Two dynamic features of signaling systems are assumed to be crucial for the organism''s surviving capacity: (i) To avoid autoactivation, e.g. due to stochastic fluctuations of receptor ligand, the signal off-state must be dynamically stable. (ii) The signal output should be amplified. To characterise networks fulfilling both criteria simultaneously, a systematic analysis is performed for small networks. The investigations reveal that for such networks the following two design principles hold true: (i) With increasing network size the connectivity decreases connoting an increasing specificity of kinase activities. (ii) The number of feedback cycles decrease with increasing network size indicating a decreasing tendency of downstream kinases to activate upstream kinases. The general validity of these design principles is supported by the analysis of a large kinase network retrieved from the TRANSPATH database. This signaling network is further investigated regarding several design properties. When comparing the design and dynamic features of the TRANSPATH network to random networks, significant differences are observed. In the second approach, described in chapter 3, control mechanisms of different signaling networks are analysed by applying Metabolic Control Analysis to transient activation profiles. Control coefficients on the signal amplitude, signal duration and integrated response are calculated.

Innerhalb der Decapoda stellt das Taxon Brachyura eines der artenreichsten Taxa mit bis zu 10000 Arten dar. Die Phylogenie der Brachyura wird aufgrund morphologischer und molekularer Untersuchungen seit mehr als ein Jahrhundert kontrovers diskutiert. Zur Klärung phylogenetischer Fragestellungen wurde mit den vergleichenden Untersuchungen der Magenossikel und der Magenzähne von 66 Taxa der Brachyura ein neuer phylogenetischer Ansatz gewählt. Mit Anwendung eines spezifischen Färbepigmentes, Alizarin-Rot S, konnten sechs neue Magenossikel einer bereits existierenden Nomenklatur hinzugefügt werden, so dass jetzt 41 Magenossikel für das Grundmuster der Brachyura angenommen werden können. Im Ergebnis der phylogenetischen Analyse wird ein monophyletisches Taxon Brachyura einschließlich der Taxa Dromiidae und Raninidae unterstützt. Die von Guinot (1977, 1978) als Monophyla postulierten Teiltaxa Podotremata und Heterotremata finden hier keine Unterstützung. Taxa wie Raninidae und Cymonomidae, welche aufgrund der coxalen Position ihrer Genitalporen dem Taxon Podotremata sensu Guinot zugeschrieben werden, weisen nach vorliegenden Daten eine nähere Verwandtschaft zu den "höheren" Krabben auf. Eine Monophylie eines Taxons Thoracotremata sensu Guinot kann dagegen basierend auf den analysierten Magenstrukturen, aber auch auf der Grundlage molekularer Studien (Schubart et al. 2000a, 2000b) und dem vorliegenden Daten zum Fossilbericht angenommen werden. Eine basale Stellung der Dynomenidae und Dromiidae im Ergebnis der kladistischen Analyse lässt sich mit den Fossilfunden aus dem mittleren Jura in Übereinstimmung bringen. Des weiteren kann für die meisten Taxa der "höheren" Krabben ein gemeinsamer Vorfahre für die obere Kreide bzw. bis zum Beginn des Tertiärs postuliert werden. / Within the Decapoda the taxon Brachyura is the species-richest taxon with up to 10000 species. The phylogeny of the Brachyura has been discussed based on morphological and molecular investigations since more than a century. The investigation of the foregut-ossicles and gastric-teeth of 66 brachyuran species, is a new approach to answer important phylogenetic questions. Using a specific staining pigment Alizarin Red S, six new described foregut-ossicles are added to an existing nomenclature. As a result of this method the presence of 41 foregut-ossicles is proposed for the ground pattern of the Brachyura. The cladistic analysis supports a monophyletic origin of the Brachyura including the Dromiidae and the Raninidae. The taxa Podotremata and Heterotremata, postulated as monophyletic by Guinot (1977, 1978), are not supported in the present study. The Dromiidae and Raninidae, which are placed within the Podotremata sensu Guinot, are closer related to the "higher crabs". Based on the analysed foregut-characters, several molecular studies (Schubart et al. 2000a, 2000b), and the data of the fossil record, a monophyletic origin of the Thoracotremata sensu Guinot is suggested. The analysed basal position of the Dynomenidae and Dromiidae is in agreement with the brachyuran fossil record. A common ancestor for most of the "higher" brachyuran crabs is suggested for the period between the upper Cretaceous and the beginning of the Tertiary.