Der Transkriptionsfaktor CCAAT/Enhancer-Binding Protein alpha (C/EBPa) koordiniert Proliferationshemmung und Differenzierung von myeloiden VorlŠuferzellen und Adipozyten. C/EBPa ist ein transkriptioneller Aktivator von abstammungspezifischen Genen und blockiert den Zellzyklus durch Repression von proliferationsfšrdernden E2F Zielgenen. Die hier gezeigten Daten zeigen, dass auch umgekehrt E2F die transkriptionelle und differenzierungsfšrdernde AktivitŠt von C/EBPa entgegenwirkt. Somit besitzen E2F-C/EBPa eine zentrale Schalterfunktion zwischen Proliferation und Differenzierung. Der Repressionsmechanismus durch E2F ist in mehreren Aspekten neuartig: Zum erstenmal wurde gezeigt, dass E2F einen anderen Transkriptionsfaktor reprimieren kann. E2F reprimiert die transkriptionelle AktivitŠt von C/EBPa ohne Bindung an cis-regulatorischen Elemente, sondern durch direkte Protein-Protein Interaktionen, die die Bindung von C/EBPa an DNA verhindern. Diese Form der transkriptionellen Repression geschieht unabhŠngig von "Pocket-Proteinen''". Patienten mit Akuter Myeloiden LeukŠmie (AML) weisen hŠufig eine gestšrte DNA Bindung von C/EBPa auf, welche ursachlich fŸr granulozitŠren Funktionsstšrungen sein kšnnte. Daher wŠre es wichtig zu analysieren ob E2F die DNA Bindung von C/EBPa in AML Patienten beeintrŠchtigt und ob auf E2F gerichtete Therapien granulozitŠre Reifung wiederherstellen. C/EBPa blockiert Zellproliferation durch vielseitigen Mechanismen. Hier wurde gezeigt, dass C/EBPa mit UBF1, dem Co-Aktivator der RNA Polymerase I, an chromosomalen Foci positioniert wird. Eine €hnlichkeit zu anderen fokalen Strukturen suggeriert, dass C/EBPa die Transkription von Polymerase I regulierten rRNA Gene reprimieren und somit ribosomale Biogenese beeintrŠchtigen kšnnte. Die Assoziation zwischen C/EBPa und UBF1 wird durch die Histon-Methyltransferase SUV39H1 stimuliert. Demnach kšnnte die antiproliferative Funktion von C/EBPa nicht nur auf der Regulierung von RNA Pol II-abhŠngiger Transkription, sondern auch auf der Repression von RNA Pol I regulierter rRNA Synthese basieren. / The transcription factor CCAAT/Enhancer-Binding Protein alpha (C/EBPa) coordinates proliferation arrest and differentiation of myeloid progenitors and adipocytes. C/EBPa acts as a transcriptional activator of lineage specific genes and blocks the cell cycle by repressing transcription of E2F-regulated genes. Data presented here suggest that also inversely E2F interferes with the transcriptional activity of C/EBPa, counteracting C/EBPa-mediated differentiation processes. Thus, E2F-C/EBPa are part of a switch mechanism between proliferation and differentiation. The mechanism by which E2F suppresses C/EBPa-mediated transactivation is novel in several aspects. E2F acts as a co-repressor of another transcription factor, C/EBPa, without binding to cis-regulatory elements, but by direct protein-protein interactions that abolish the binding of C/EBPa to DNA. This mechanism of transcriptional repression occurs independent of pocket proteins. Disturbed DNA binding of C/EBPa is often observed in AML patients suggesting a causative role in granulocytic disorders. Thus, it would be of main interest to analyze whether E2F mediates disruption of C/EBPa''s DNA-binding in AML patients and whether therapies directed against E2F could restore granulocytic maturation. Despite the extensive knowledge of mechanisms involved in the inhibitory function of C/EBPa, it has not been addressed whether C/EBPa may impinge on cell proliferation by affecting the ribosomal biogenesis of a cell. This work demonstrates an association of C/EBPa to the RNA Pol I transcription factor UBF1, both proteins retained in large chromosomal foci. Similarities to other focal structures associated to UBF1, suggest that C/EBPa may repress transcription of Pol I-transcribed rRNA genes, and thus affect ribosomal biogenesis. The enrichment of C/EBPa at sites of UBF1 is induced by the histone methyltransferase SUV39H1. Thus, C/EBPa may not only control lineage commitment and cell proliferation by regulating genes transcribed by RNA Pol II, but also may act as a repressor of RNA Pol I mediated rRNA synthesis.

Alternatives Spleißen ist von großer Bedeutung für die Steuerung der Genexpression und Proteindiversität. Die Cdc2-like Kinasen (Clk) und DNA Topoisomerase I (DNA topo I) steuern alternatives Spleißen über die Phosphorylierung von Serine/Arginin-reichen (SR) Proteinen. Tissue Factor (TF) und die endotheliale Stickstoffmonoxidsynthase (eNOS) beeinflussen maßgeblich die Endothelfunktion. Alternatives Spleißen führt zur Bildung von Isoformen von TF („full length“ (fl)TF, alternativ gespleißter humaner (asH)TF) und eNOS (eNOS, eNOS 13A, B und C). Wie das alternative Spleißen von TF und eNOS gesteuert wird und welchen Einfluss dies auf die Endothelfunktion hat ist unbekannt und wurde in dieser Arbeit untersucht. Die TNF-a-Stimulation der HUVEC erhöhte die Expression beider TF-Isoformen. Die Clk-Inhibition reduzierte die mRNA-Expression von flTF und asHTF. Die DNA topo I-Inhibition erhöhte die asHTF-Expression und verringerte flTF. Die Inhibition der DNA topo I reduzierte ebenfalls die Expression des flTF-Proteins aber nicht von asHTF, verbunden mit einer reduzierten TF-Aktivität. Die Clk-Inhibition reduzierte das flTF-Protein und die TF-Aktivität nur leicht aber asHTF vollständig. Die Inhibition der Kinasen beeinflusste das SR Protein-Phosphorylierungsmuster. Die Inhibition von SF2/ASF und SRp75 mittels siRNAs veränderte die Expression und die Aktivität von TF in HUVEC. Die TNF-a-Stimulation von HUVEC induzierte ferner die mRNA-Expression von eNOS 13A, B und C, nicht aber von eNOS. Dies führte zu einer Reduktion der eNOS-Aktivität. Die Inhibition der DNA topo I, nicht aber der Clks hob diese Effekte auf. Diese Daten zeigen, dass die DNA topo I sowie die Clks an der Regulation der endothelialen TF-Expression und Aktivität beteiligt sind, während die eNOS-Isoformexpression und Aktivität nur durch die DNA topo I beeinflusst wurde.Diese Ergebnisse eröffnen neue Einblicke in die Regulation des alternativen Spleißens von TF und eNOS sowie dessen Einfluss auf die Endothelfunktion. / Alternative splicing is an important mechanism to control gene expression and protein diversity. The Cdc2-like kinases (Clk) and DNA topoisomerase I (DNA topo I) control alternative splicing by regulating the phosphorylation state of serine/arginine-rich (SR) proteins. Tissue Factor (TF) and the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) are crucial for the endothelial function. Alternative splicing lead to the formation of different isoforms of TF („full length“ (fl)TF, alternatively spliced human (asH)TF) and eNOS (eNOS, eNOS 13A, B and C). How alternative splicing of TF and eNOS is regulated as well as the impact on endothelial function is still unknown and was investigated in this study. The stimulation of HUVEC with TNF-a induced the expression of both TF isoforms. The inhibition of Clks reduced the mRNA expression of flTF and asHTF. DNA topo I inhibition increased asHTF and reduced flTF mRNA expression. Inhibition of DNA topo I also reduced flTF but not asHTF on protein level in stimulated cells leading to a reduced TF activity. Clk-inhibition slightly reduced flTF protein and TF activity, whereas asHTF was completely blocked. The inhibition of both kinases altered the phosphorylation pattern of SR proteins. The siRNA-mediated inhibition of SF2/ASF and SRp75 modified the TF isoform expression and TF activity in TNF-a-induced HUVEC. Moreover, stimulation of HUVEC with TNF-a induced the mRNA expression of eNOS 13A, B and C, but not of eNOS. This led to a reduction of eNOS activity. The inhibition of DNA topo I but not of Clks abolished these TNF-a-mediated effects in HUVEC. These data indicate DNA topo I and the Clks to be involved in the regulation of endothelial TF expression and activity, whereas, eNOS isoform expression and activity was influenced by DNA topo I, but not Clks in TNF-a-stimulated HUVEC. In conclusion, this study reveals new insights into the regulation of alternative splicing of TF and eNOS and the impact of these processes on endothelial function.

Toxoplasma gondii weist eine weltweite Verbreitung auf und kann fast alle Wirbeltiere, vor allem Vögel und Menschen infizieren. Felide sind Endwirte von T. gondii, welche das infektiöse und umweltresistente Oozysten-Stadium ausscheiden können. T. gondii kann auch ohne sexuelle Vermehrung unterschiedlichste Zwischenwirte und Zwischenwirtspezies infizieren. Obwohl eine sexuelle Phase ein Teil des Lebenszyklus ist, werden rekombinierte Genotypen nur selten beobachtet. Dies ist ein Grund dafür, warum T. gondii eine klonale Populationsstruktur erkennen lässt. Während in Nordamerika und Europa drei klonale Genotypen (Typ I, II und III) dominieren, werden in Südamerika und Asien, neben den drei bekannten auch atypische und andere Genotypen beobachtet. Auch innerhalb der atypischen Genotypen lässt sich eine klonale Populationsstruktur erkennen. Die Linien I, II und III weisen Unterschiede in ihrer Virulenz für Mäuse auf. Typ-I-Stämme sind hochvirulent. Die Infektion mit nur einem Organismus führt bereits zum Tod. Klonale Typ-II- und Typ-III-Stämme sind avirulent für Mäuse. Nur Infektionen mit mehr als 103 Organismen führen zum Tod. In dieser Studie zeige ich, dass die Mehrzahl isolierter T. gondii-Oozysten dem Typ II zuzuordnen ist. Es wurde keine Typ-I-, dafür aber eine Typ-III-Infektion und vereinzelte Hinweise auf Mischinfektionen und nicht-kanonische T. gondii Genotypen beobachtet. Erstmalig kann gezeigt werden, dass aus einer Rekombination zwischen den Typen II und III genetisch unterschiedliche T. gondii in einer natürlich infizierten Katze entstanden sind. Die identifizierten nicht-kanonischen T. gondii Klone weisen unterschiedliche, meist hohe Virulenz im Mausmodell auf. Eine geringe Anzahl von T. gondii-DNA Proben von humanen Toxoplasmose-Fällen deutet auf eine Infektion mit T. gondii des Typs II hin. Ich zeige mit dieser Studie, dass sexuelle Rekombination von T. gondii in Deutschland möglich ist, und diese zur Entstehung von hochvirulenten T. gondii führen kann. / Toxoplasma gondii is a protozoan parasite that can infect almost all warm-blooded animals, including birds and humans. The definitive host is the cat which excretes the highly infectious and environmental resistant oocyst stage. Equally important for the spread of T. gondii is the transmission of T. gondii by ingestion of contaminated food (prey) between host species. Sexual recombination is a rare event observed in T. gondii. This is one of the reasons why a clonal population structure of T. gondii is observed. In Europe and North America the majority of genotypes (types) of T. gondii are members of only three clonal types, designated type I, type II and type III. In South America and Asia, T. gondii is shown to have an increased genetic diversity with a high prevalence of atypical genotypes. However, even within those atypical genotypes, a clonal population structure can be observed. More importantly, mouse virulence of types I, II and III differ markedly. While infection with T. gondii type I is always lethal in mice, infections with 104–106 parasites of type II or type III are needed to have the same effect in mice. This study shows that the majority of cats in Germany excrete T. gondii oocysts of type II. We have not observed any type I T. gondii, but show that type III and, importantly, mixed type infection as well as non-canonical T. gondii are present in Germany. For the first time we demonstrate that a sexual cross between T. gondii type II and type III in a single, naturally infected cat occurred in Germany resulting in excretion of many genetically different non-canonical T. gondii. Most of the identified non-canonical T. gondii show a high virulence in mice. The RFLP-typing analysis of a limited number of T. gondii-DNA isolated from human samples revealed only alleles of T. gondii type II. I show that genetic recombination of different T. gondii types in Germany can lead to a higher genetic diversity and generation of highly mouse-virulent T. gondii.

Diese Dissertation analysiert zum ersten Mal STARD13, ein Protein mit einer RhoGAP-Domäne, und dessen Rolle als essentiellen Regulator der Pankreasarchitektur im Mausembryo. Es wird gezeigt, dass Stard13 anfangs im pankreatischen Endoderm exprimiert wird und später in den “Epithelspitzen” angereichert ist. Konditionelle Ablation von Stard13 im Mauspankreas beeinflusst die normale Epithelmorphogenese und die Organisation der “Epithelspitzen”. Das beeinträchtigt die Proliferation der Pankreasvorläuferzellen und führt zu Organhypoplasie. Dabei reguliert STARD13 örtlich und zeitlich Rho-Signale, die für die Morphogenese essentiell sind. Desweiteren werden die Mechanismen, die für die Entwicklung des Pankreasepithels in ein funktionierendes Organ notwendig sind, neu beleuchtet. Es wird zum Beispiel eine funktionelle Verbindung zwischen Rho-vermittelter Kontrolle der Epithelumgestaltung und der Determinierung der Organgröße hergestellt. Dabei spielt die reziproke Interaktion von actin-MAL-SRF and MAPK Signalen eine wichtige Rolle. / The development of functional organ architecture relies on coordinated morphogenesis and growth. In the developing pancreas, the branching epithelium is organized in discrete domains that delineate one specific domain of progenitor cells at the tip of the branches. Very little is known about branching morphogenesis in the pancreas and how it is coordinated with proliferation. This thesis presents the first analysis of the RhoGAP-domain-containing protein STARD13 and its role as an essential regulator of pancreas tissue architecture in the mammalian embryo. It is shown that Stard13 is expressed in the pancreatic endoderm and enriched at the distal tip of the branching epithelium. Conditional ablation of Stard13 expression in the mouse pancreas disrupts epithelial morphogenesis and tip domain organization, resulting in hampered proliferation of pancreatic progenitors and subsequent organ hypoplasia. Stard13 acts by regulating Rho signaling spatially and temporally during pancreas development. This thesis provides new insights into the mechanisms that shape pancreatic epithelium to create a mature organ and establishes a functional link between Rho-mediated control of epithelial remodeling and organ size determination, involving reciprocal interaction of actin-MAL-SRF and MAPK signaling.

Ziel dieser Arbeit war es, den zentralen Kohlenstoffwechsel mit besonderem Fokus auf Regulation zu untersuchen, insbesondere durch die Auftrennung von zwei Regulationsebenen: metabolische Regulation, assoziiert mit direkten Wech- selwirkungen zwischen Metaboliten und Enzymen, sowie hierarchische Regulation, assoziiert mit Änderungen in Enzymmengenänderungen durch die Regulation von de novo Enzymproduktion. Unsere Untersuchungen basieren größtenteils auf drei Datensätzen aus glukoselimitierten Chemostatkulturen von S. cerevisiae. Im Kap. 2 wurden Extrazelluläre Bedingungen im Makroskopischen unter- sucht. Das wichtigsten Ergebnis dieser the- oretischen Analyse ist die Charakterisierung des Selektionsdruckes in einem Chemostatkultur. Im Kap. 4 wurde eine Analyse auf Systemebene des zentralen Kohlenstoffwech- sels durchgeführt. Unter Verwendung der Metaboliten- und der Flußdaten wurde ein kinetisches Modell konstruiert, welches wesentliche Teile des zentralen Kohlen- stoffwechsels umfaßt. Die meisten kinetischen Ausdrücke und Parameterwerte wurden aus einem bestehenden kinetischen Modells (Teusink-Modell) übernom- men. / In this work, we aimed to elucidate central carbon metabolism focusing on the aspect of regulation, especially by separating two regulatory levels: metabolic regulation, associated with direct interactions of metabolites and enzymes, and hierarchic regulation, associated with enzyme level change via regulation of de novo enzyme production. Our investigations were largely based on the analysis of three datasets from glucose limited continuous cultures of S. cerevisiae. Extracellular conditions on the macroscopic scale were investigated in Chapter 2. This was inspired by the perceived lack of clarity regarding an important aspect: concentration of glucose, the limiting nutrient and main carbon source in these cultures. The main outcome of this theoretical analysis was characterisation of the selection pressure in a chemostat culture, as selecting for cells which produce the growth rate, defined by the pre-set dilution rate, with lower external concentration of the limiting nutrient. Flux regulation on the scale of individual enzymes was investigated for selected reactions in Chapter 3. This analysis was based on the attempt to reproduce flux changes through these reactions, using enzyme kinetic expressions with inputs from the three aforementioned datasets. The notion of hierarchic and metabolic regulation was introduced and modified. System-level analysis of central carbon metabolism was undertaken in Chap- ter 4. Using the information on metabolite levels and flux, a kinetic model representing significant parts of central carbon metabolism was constructed. To get feasible flux distributions, constrained metabolic flux balance analysis was performed, using a stoichiometric network, constructed to be consistent with the model’s stoichiometry. Fitting the model resulted in two sets of parameters corresponding to steady states reproducing, the nominal data values of the anaerobic and the fully aerobic conditions.

Da limnische Gastropoden eng an ihre isolierten aquatischen Habitate gebunden sind, bewahren sie Verbreitungsmuster über lange Perioden und stellen geeignete Modelle zur Rekonstruktion geographisch und klimatisch bedingter Veränderungen des Lebensraumes dar. Das Ziel dieser Arbeit besteht in der Rekonstruktion der Besiedlungsgeschichte des australischen Kontinents durch eine Familie Süßwassergastropoden (Thiaridae) unter Verwendung molekularer Marker (mitochondrialer und im Kerngenom basierter Genfragmente inklusive der AFLP-Technik). Viele der heute in Australien vorkommenden biotischen Elemente wurden als junge Einwanderer aus dem indo-malayischen Archipel eingestuft. Es werden jedoch immer mehr Fälle bekannt, die von diesem Standardszenario abweichen. Um zu testen, ob es sich bei Thiariden tatsächlich um Einwanderer aus dem Norden handelt, oder ob ihr Ursprung auf dem australischen Kontinent liegt, wurden die evolutionären Verwandtschaftsverhältnisse innerhalb der Familie, sowie ihre Position im phylogenetischen Stammbaum der Superfamilie Cerithioidea analysiert. Mit der Aufdeckung der stammesgeschichtlichen Beziehungen zu nicht-australischen Verwandten, durch Altersbestimmung der phylogenetischen Verzweigungen mittels „molekularer Uhr“ sowie der detaillierten Analyse der aktuellen Vorkommnisse und möglichen historischen Areale, konnte ein asiatischer Ursprung der Thiariden widerlegt werden. Ein Abriss hinsichtlich Dispersion und/oder Vikarianz ist hier vor dem Hintergrund der Rekonstruktion plattentektonischer Ereignisse dargestellt. Demnach hat die Besiedlung Asiens ihren Ausgang ursprünglich im australischen Raum genommen und der Kontinent wurde nicht wie bislang angenommen von Asien aus besiedelt. Mit der Aufdeckung eines gondwanischen Ursprungs repräsentieren Thiariden ein vielversprechendes Modellsystem in der Speziationsforschung, welches Einblicke in die Dynamik der Mechanismen der Artbildung unter dem Einfluss von klimatischen Veränderungen ermöglicht. / Due to their limited potential of dispersal and habitat fidelity, limnic gastropods tend to preserve distribution patterns over long periods of time and are suitable organisms in biogeographical research. In this thesis intensive investigations into the phylogeography of Australian freshwater snails are provided, presenting the first molecular study of the Thiaridae (Caenogastropoda: Cerithioidea) based on DNA sequence markers and amplified fragment length polymorphisms. The aim of this study is to determine the historical events that may have influenced their presence on the Australian continent. In general, the origin of Australian freshwater faunal elements and the directionality and timing of colonizations are still controversial. Conventionally, many biotic elements found in Australia today are considered to be recent invaders from the Indo-Malay archipelago but more and more cases have become known that deviate from this standard scenario. In order to test whether the thiarids represent recent invaders or if they originated on the Australian continent, the evolutionary relationships within the family as well as its phylogenetic position in the superfamily Cerithioidea is analysed. A molecular clock approach is applied so that the dispersal events can be related to historical tectonical changes. By comparison of the molecular phylogenies, as well as the distributional data, the fossil record and divergence date estimates in conjunction with the excellent record of Earth history the long-held view that the thiarid fauna is an appendage to the southeast Asian biota can be rejected. Instead, an Australian continental, i.e. East-Gondwanian origin is found to be the most parsimonious explanation of the present distribution. With their now assumed long history on the continent, thiarids represent an important model system in speciation research which provides details of the dynamics of the underlying mechanisms of speciation under the influence of climate change.

Angiogenese ist entscheidend für die meisten physiologische Prozesse und viele pathologische Umstände. Dabei wird Angiogenese durch die Interaktion zwischen der extrazellulären Matrix (ECM) und endothelialen Zellen reguliert. Während der kardiovaskulären Entwicklung im Zebrafisch fördert Klf2, ein blutstrom-sensitiver Transkriptionsfaktor, die VEGF-abhängige Angiogenese. Der Mechanismus, bei dem biophysikalische Reize die Klf2 Expression regulieren und Angiogenese kontrollieren, ist größtenteils unbekannt. In meiner Studie zeige ich, dass erhöhte klf2 mRNA Expression den molekularen und morphogenetischen kardiovaskulären Defekten in Zebrafisch ccm Mutanten zugrundeliegen. Desweiteren zeige ich, dass diese Defekte durch verstärkte egfl7-Expression und Angiogenese vermittelt werden. Meine Studie zeigt ausserdem, dass die Klf2-Expression unabhängig vom Blutstrom durch den Extrazellularmatrix-bindenden Rezeptor beta1 Integrin reguliert wird. Der CCM-Protein-Komplex, zusammen mit dem ihm verbundenden Integrin-regulierenden Protein ICAP-1 verhindert ein verstärktes Angiogenese-Signal in endothelialen Zellen, indem es die beta1 Integrin-abhängige Klf2 Expression begrenzt. Zusammenfassend zeigt meine Arbeit einen neuen beta1 Integrin-Klf2-Egfl7 Signalweg, der durch zerebrale kavernöse malformations (CCM) Proteine reguliert wird / Angiogenesis is critical to most physiological processes and many pathological conditions. This process is controlled by physical interactions between the extracellular matrix (ECM) and endothelial cells. Klf2, a blood flow–sensitive transcription factor, promotes VEGF-dependent angiogenesis during zebrafish cardiovascular development. However, the mechanism by which biophysical stimuli regulate Klf2 expression and control angiogenesis remains largely unknown. In my study, I show that elevated klf2 mRNA levels underlie the molecular and morphogenetic cardiovascular defects in zebrafish ccm mutants. Furthermore, I demonstrate that these defects are mediated by enhanced egfl7 expression and angiogenesis signaling. My study also revealed that Klf2 expression is regulated by the extracellular matrix-binding receptor beta1 integrin in the absence of blood flow. The CCM protein complex and its associated beta1 integrin-regulatory protein ICAP-1 prevents increased angiogenesis signaling in endothelial cells by limiting beta1 integrin-mediated expression of Klf2. ln sum, my work uncovered a novel beta1 integrin-Klf2-Egfl7 signaling pathway, which is regulated by the cerebral cavernous malformations (CCM) proteins.

Die lichtgetriebene Protononenpumpe Bacteriorhodopsin (BR) aus Halobacterium salinarum stellt den Prototyp lichtgetriebener Protonenpumpen dar und wurde durch strukturelle und spektroskopische Untersuchungen als einfaches Modellsystem für Protonentransferschritte in Proteinen etabliert. Aufgrund der schlechten heterologen Expression von BR in Wirtszellen konnten elektrophysiologische Untersuchungen unter kontrollierter Membranspannung jedoch nur vereinzelt durchgeführt werden und erlaubten kaum Rückschlüsse zum Einfluss einzelner Aminosäuren auf die Pumpkraft des Proteins. Das dem BR nahverwandte Coccomyxa subellipsoidea Rhodopsin (CsR) hingegen zeigte gegenüber BR etwa 8-fach größere Photoströme in elektrophysiologischen Messungen in Xenopus laevis Oozyten und ermöglichte so eine umfangreiche elektrophysiologische Charakterisierung. Dabei konnten Unterschiede zu BR, wie etwa die erhöhte Spannungsabhängigkeit oder die erhöhte Toleranz der Pumpkraft gegenüber dem extrazellulären pH, auf Grundlage des Sequenzvergleiches nicht geklärt werden. Entsprechend wurden, um weitere mechanistische Details zu klären, im Rahmen dieser Arbeit spektroskopische und röntgenkristallographische Untersuchungen an CsR vorgenommen. Dabei konnte eine hochauflösende Kristallstruktur von CsR gelöst werden, die es erlaubt, mechanistische Unterschiede zu anderen lichtgetriebenen Protonenpumpen auf strukturelle Unterschiede zurück zu führen. So konnte die erhöhte Spannungsabhängigkeit mit der besonderen Komposition des zytoplasmatischen Halbkanals und die erhöhte Toleranz gegenüber dem äußeren pH mit der einzigartigen Konfiguration des Protonenfreisetzungskomplexes in CsR assoziiert werden. Letztlich konnte auf Grundlage der Struktur CsR, durch rationales Design, in einen licht-induzierten Protonenkanal transformiert werden, der bereits bei physiologischen Bedingungen quasisymmetrische bidirektionale Ströme zeigt. / The light-driven proton pump bacteriorhodopsin (BR) from Halobacterium salinarum represents the prototype of light-driven proton pumps and was established by structural and spectroscopic investigations as a simple model system for proton transfer steps in proteins. However, due to the poor heterologous expression of BR in host cells, electrophysiological investigations under controlled membrane potential could only be carried out in some cases and hardly allowed conclusions to be drawn about the influence of individual amino acids on the pumping force of the protein. Coccomyxa subellipsoidea rhodopsin (CsR), which is closely related to BR, showed about 8 times larger photocurrents in electrophysiological measurements in Xenopus laevis oocytes than BR and thus enabled an extensive electrophysiological characterization. Observed differences to BR, such as the increased voltage dependence or the increased tolerance of the pumping force to the extracellular pH, could not be clarified solely on the basis of the sequence comparison. Accordingly, in order to clarify further mechanistic details, spectroscopic and X-ray crystallographic investigations on CsR were carried out within the scope of this work. A high-resolution crystal structure of CsR was solved, which allows to link mechanistic differences to other light-driven proton pumps to structural differences. Thus, the increased voltage dependence could be addressed by the special composition of the cytoplasmic half channel and the increased tolerance to the external pH could be associated with the unique configuration of the proton release complex in CsR. Finally, by a structure-based rational design approach, CsR was transformed into a light-induced, which shows almost symmetrical bidirectional currents already under physiological conditions.

Die antillanische Flora ist eine der artenreichsten der Erde. Trotz jahrhundertelanger floristischer Forschung zeigen jüngere Studien, daß der Archipel noch immer weiße Flecken beherbergt. Das trifft besonders auf die Familie der Orchideen zu, deren letzte Bearbeitung für Cuba mehr als ein halbes Jahrhundert zurückliegt. Die vorliegende Arbeit basiert auf der lang ausstehenden Revision der Orchideengattung Pleurothallis R. Br. für die Flora de Cuba. Mittels weiterer morphologischer, palynologischer, molekulargenetischer, phytogeographischer und ökologischer Untersuchungen auch eines Florenteils der anderen Großen Antillen wird die Genese der großantillanischen Pleurothallis-Flora rekonstruiert. Der Archipel umfaßt mehr als 70 Arten dieser Gattung, wobei die Zahlen auf den einzelnen Inseln sehr verschieden sind: Cuba besitzt 39, Jamaica 23, Hispaniola 40 und Puerto Rico 11 Spezies. Das Zentrum der Diversität liegt im montanen Dreieck Ost-Cuba - Jamaica - Hispaniola, einer Region, die 95 % der groß-antillanischen Arten beherbergt, wovon 75% endemisch auf einer der Inseln sind. Da die meisten Arten entweder endemisch oder pankaribisch verbreitet sind, bleiben die floristischen Bezüge zwischen den Inseln und zu den kontinentalen Nachbargebieten nur schwach ausgeprägt. Immerhin lassen sich einige Verbindungen unter den Inseln der Großen Antillen und besonders zu Mittelamerika erkennen. Diese Affinitäten steigen von Ost nach West. Molekulargenetische und (mikro-)morphologische Daten zeigen ein deutliches Muster der historischen Biogeographie. Danach lassen sich die antillanischen Arten hinsichtlich ihrer Genese in drei Gruppen einteilen. 25% der Arten sind pankaribisch verbreitet, wobei der Großteil der Inselpopulationen vom mittelamerikanischen Festland stammt. Ebenfalls aus dieser Region stammen weitere 25%, die jedoch auf den Inseln neue Arten gebildet haben. Die verbleibenden 50% der groß-antillanischen Sippen sind autochthon und das Ergebnis adaptiver Radiation auf den Inseln. Diese intensive Kladogenese beschränkt sich auf drei Verwandtschaftskreise innerhalb der Gattung Pleurothallis in den Untergattungen Antilla Luer und Specklinia Lindl. (2 Linien). Es stellte sich heraus, daß der überwiegende Anteil der Artbildungsprozesse allopatrischer Natur ist. Sympatrie konnte nur in einem einzigen Fall direkt belegt werden. Das Ergebnis der allopatrischen Speziation sind zwei Typen von Vikarianz, räumlich geographischer und geologischer. In Cuba sind überraschenderweise fast 80% der endemischen Arten an einen Gesteinstyp gebunden, überwiegend an Serpentin. West-Hispaniola, wo viele Schwesternarten cubanischer Sippen beheimatet sind, besteht fast ausschließlich aus Kalkstein. Geographische Vikarianz ist daher oft geologisch unterlegt, eine Bindung die für Epiphyten kaum vermutet wurde. Hinter der Geologie verbergen sich jedoch eher Bestäuberareale und weniger physiologische Anpassung als limitierender Faktor. Eine Verfrachtung in Vegetation auf anderem petrologischen Untergrund scheint damit der Hauptauslöser für Artbildungen gewesen zu sein. Ausgangspunkt waren höchstwahrscheinlich individuenarme Gründerpopulationen die den Bedingungen eines founder events ausgesetzt waren. Neben den reichen geologischen Verhältnissen im Dreieck Ost-Cuba - Jamaica - Hispaniola wird die intensive Artbildung durch weitere spezifisch lokale Bedingungen unterstützt. Karibische Wirbelstürme dürften entlang der Hauptrouten für eine häufige Verfrachtung von Samen oder Pflanzen von Mittelamerika auf die Großen Antillen sowie zwischen den Inseln selber verantwortlich sein. Ein zweiter günstiger Umstand für erfolgreiche Migration innerhalb des Dreiecks besteht in der räumlichen Nähe der Inselgebirge und deren optimalen klimatischen Bedingungen für die Besiedlung durch mikrophytische Epiphyten. Molekulargenetische Daten lieferten weiterhin wertvolle Informationen in Bezug auf die beiden aktuell diskutierten Systeme der Pleurothallidinae, einer streng morphologischen (Luer) und einer fast ausschließlich auf DNA-Sequenzen (Pridgeon & Chase) basierenden Klassifikation. DNA-Sequenzen der cubanischen Arten stützen das neue System von Pridgeon & Chase weitestgehend, zeigen aber Widersprüche bezüglich der Monophylie in einigen der neuen oder wieder errichteten Taxa. Angesicht dessen, daß die karibische Florenregion leider nicht nur durch ihre Biodiversität zu den zehn globalen hot spots zählt, sondern auch durch die großflächige Zerstörung von Primärvegetation, war es auch ein Anliegen der vorliegenden Arbeit, ein erstes detailliertes Bild von Genese und Verbreitung antillanischer Orchideen zu vermitteln. Diese Daten können direkt für die Gestaltung und das Management von karibischen Schutzgebieten eingesetzt werden, da Orchideen in der Naturschutzpolitik einen hohen Argumentationswert besitzen. / The Antillean Flora is one of the most diverse on our globe. However, despite floristic work for centuries recent studies show that there are still blank areas. This is especially the case in the family Orchidaceae, which, in the case of the Cuban Flora, has been reviewed more than half a century ago for the last time. The work presented here is based on the long pending revision of the genus Pleurothallis R. Br. for the Flora de Cuba. Adding further morphological, palynological, molecular, and ecological data this study is aimed at the reconstruction of the Greater Antillean Pleurothallis flora. The archipelago comprises more than 70 species of this genus, with a differing diversity on the particular islands; Cuba accommodates 39 taxa, Jamaica 23, Hispaniola 40 and Puerto Rico 11. The centre of diversity lies within the triangle E Cuba - Jamaica - W Hispaniola, a region that accommodates about 95% of the Greater Antillean species. 75% of the taxa are confined to just one island. Since most of the plants are either endemic or are of pan-Caribbean distribution floristic relationships among the islands and with regard to neighbouring continental areas remain rather indistinct. The strongest affinities are with Central America. Floristic relationships with that area increase from E towards W. Molecular and (micro-)morphological data show a clear pattern of historical phytogeography. Concerning their origin there are 3 groups of species. 25% of the Greater Antillean taxa are widespread in the Pan-Caribbean area, with the majority of the island populations having their origin presumably on the Central American continent. Another 25% are derived from Central American ancestors too, however, they have evolved into new species on the islands in the course of migration. The remaining 50% of the Greater Antillean taxa are autochthonous. They are the result of adaptive radiation on the archipelago. Intense cladogenesis is confined to 3 lineages within Pleurothallis. They belong to the subgenera Antilla Luer and Specklinia Lindl. (2 lineages). The majority of speciation events shows an allopatric pattern. Sympatry during speciation could be detected in a single case only. Allopatric speciation has resulted into 2 types of vicariance, spatial geographic and geological. Indeed, 80% of the Cuban endemics are associated with a single type of rock, serpentine in most cases. In contrast, W Hispanola where many sister taxa of Cuban pleurothallids live, is formed almost exclusively by limestone. In many cases, geographic vicariance is therefore geologically defined, a surprising association in epiphytic orchids. Geological vicariance, in turn, may have been brought about by pollinator distribution rather than by physiological adaptation to the geological environment. Migration to petrologically different localities seems to be the main trigger for speciation in Cuban Pleurothallis. This process was most probably started with a small number of individuals that met conditions of a founder event. Apart from the geologically rich background in the triangle E Cuba - Jamaica - Hispaniola there are other specific local conditions that are responsible for the rich diversity. Caribbean hurricanes provide a powerful means of transport along their main routes. They should be responsible for frequent migrations from the Central American mainland to the archipelago and between the islands. Moreover, the mountains within the triangle are in close spatial neighbourhood and meet favourable climatic conditions for the colonisation of small epiphytes. Molecular data from the Cuban species of Pleurothallis yielded valuable information for the current discussion concerning the morphological (Luer) and molecular classifications (Pridgeon & Chase) of the subtribe. These data support the new molecular based system to a great extent, however, they show new inconsistencies with respect to monophyly in some of the new or resurrected taxa. Considering that the Caribbean Flora belongs to the ten global hot spots, due to its diversity on the one and the loss of primal vegetation on the other side, it was a goal of the present thesis to impart a detailed picture of the genesis and distribution of Antillean orchids. Bearing in mind the political value of orchids in conservation these data can be used directly for the organisation and management of Caribbean nature reserves.

LRP2/Megalin ist ein Rezeptor der LDL-Rezeptor Genfamilie mit essentieller Funktion in der Entwicklung des Zentralnervensystems. Der Rezeptor wird im Neuroepithel des Embryos exprimiert und steuert die Ausbildung der Vorderhirnstrukturen. In weiteren Untersuchungen an LRP2-defizienten Mäusen konnte ich zeigen, dass der Verlust der Expression des Rezeptors in adulten Tieren zu einer Beeinträchtigung der Proliferation neuronaler Vorläuferzellen in der subventrikulären Zone (SVZ) des lateralen Ventrikels führt. Infolgedessen war die Anzahl der Neuroblasten reduziert, die zum olfaktorischen Bulbus wandern und dort zu Interneuronen differenzieren. Anhand immunhistologischer Untersuchungen konnte ich nachweisen, dass der Verlust von LRP2 zu einer verminderten Anzahl GFAP-positiver Zellen, die auch die neuronalen Stammzellen (Typ B Zellen) umfassen, führt. Weiterhin wiesen LRP2 Mutanten eine Reduktion in den Signalen für Nestin, DLX2, PSA-NCAM und DCX. Meine derzeitige Hypothese besagt daher, dass LRP2 ebenso wie im embryonalen Neuroepithel auch in der adulten neuronalen Stammzellnische eine Rolle bei der Regulation der BMP4 Signalwege spielt. Dies wird möglicherweise durch Endozytose-vermittelte Aufnahme mit anschließendem Abbau des Morphogens durch LRP2 vermittelt, wie es bereits in vitro gezeigt werden konnte. BMP4 hat im Wesentlichen eine anti-proliferative Wirkung. Eine exakt gesteuerte Regulation der Konzentration dieses Morphogens ist daher eine Vorraussetzung für ein Neurogenese-permissives Milieu in der adulten neurogenen Stammzellnische. Die Ergebnisse meiner Arbeit entschlüsseln eine neue Rolle von LRP2 in der adulten Neurogenese. Die Expression des Rezeptors im Ependym des lateralen Ventrikels ist essentiell für die Regulation der BMP Signalwege in der neurogenen Stammzellnische. / LRP2 (also know as megalin) is a member of the low-density lipoprotein receptor gene family that plays an important role in regulation of neurogenesis in the embryonic neural tube. During early forebrain development, LRP2 deficiency leads to an increase in bone morphogenetic protein 4 (Bmp4) expression and signalling in the dorsal neuroepithelium, and a loss of sonic hedgehog (Shh) expression in the ventral forebrain. In this thesis I demonstrate that LRP2 is expressed in ependymal cells of the lateral ventricles in the adult brain. Intriguingly, expression is restricted to the ependyma that faces the stem cell niche. Expression is not seen in ependyma elsewhere in the lateral ventricles or in the dentate gyrus, the second neurogenic zone of the adult mouse brain. I further show that lack of LRP2 expression in adult mice results in impaired proliferation of neural precursor cells in the SVZ resulting in a decreased number of neuroblasts reaching the olfactory bulb. Using immunohistological detection of marker proteins, absence of LRP2 was shown mainly to affect the GFAP-positive neuronal precursor cell population in the SVZ (B cells). Furthermore, Lrp2 mutant mice also showed a decrease in the signals for nestin, DLX2, PSA-NCAM and DCX. Reduced neurogenesis in the SVZ in LRP2-deficient mice coincides with a significant increase in BMP2/4 expression and enhanced activation of downstream mediators Phospho-SMAD1/5/8 and ID3 in the stem cell niche. My findings revealed a novel regulatory pathway whereby LRP2 down-regulates BMP signaling to modulate the instructive microenvironment of the SVZ and to enable adult neurogenesis to proceed. Thus, LRP2 plays a crucial role in regulating BMP-signaling levels in the adult SVZ, highlighting the unique role of ependymal cells in this stem cell niche. The underlying mechanism of LRP2 action in control of neurogenesis may thus be conserved between the embryonic and adult brain.