Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den physiologischen Veränderungen porciner Spermatozoen, die durch einen metabolischen Einbau von Fettsäuren in Spermatozoenlipide hervorgerufen werden. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der metabolischen Aufnahme von Fettsäuren in die Spermatozoenlipide und die Bewertung des physiologischen Zustandes porciner Spermatozoen mit Hinblick auf die Niedrigtemperaturlagerung. Alle in den porcinen Spermatozoen vorkommenden Lipide wurden mittels GC und MALDI-TOF-MS analysiert. Hauptvertreter der polaren Lipidklassen sind Glycerophospholipide (GPC, GPE). Der Hauptvertreter der neutralen Lipidklassen ist Diacylglycerol (DAG). Die metabolische Aufnahme von Fettsäuren in die Lipide wurde durch die Supplementierung des Flüssigkonservierungsmediums mit [14C]-Octadecadiensäure radiochemisch untersucht. Anhand dieser Experimente wurde gezeigt, dass die Temperatur und die Inkubationsdauer wichtige Faktoren für die metabolische Aufnahme dieser Radiochemikalie in die Spermatozoenlipide sind. Die zugesetzten Fettsäuren werden sowohl in die neutralen (DAG) als auch in die polaren Lipide (diacyl-GPC) der Spermatozoen eingebaut. Nach Supplementierung mit 13C-markierter Octadecadiensäure wurden die Lipide mittels MALDI- und Q-TOF-MS als DAG (18:2/18:2), GPC (16:0/18:2) und GPC (18:2/18:2) charakterisiert. Die gleichen Ergebnisse wurden auch für die in den Spermatozoenlipiden vorkommenden Hexadecen-, Octadecen-, und Octadecatriensäure erhalten. Bei der Untersuchung des physiologischen Zustandes von Spermatozoen wurde gezeigt, dass insbesondere Supplementierungsvarianten mit endogen vorkommenden Fettsäuren zu einer besseren Spermatozoenvitalität und Motilität bei Niedrigtemperaturlagerung führten. Gleichzeitig wurde eine Verminderung des Auftretens von akrosomalen Schäden festgestellt. Damit stellt eine Supplementierung der Spermatozoen mit ausgewählten Fettsäuren eine effektive Maßnahme zur Lagerung von Spermatozoen bei 4 bis 6°C dar. / This study examines the metabolic incorporation of selected fatty acids into the lipids of porcine spermatozoa and evaluates the physiological state of spermatozoa subsequent to low temperature storage supplementation with selected free fatty acids. The aim was to understand the role of fatty acids in relation to the (cryo-)preservation of spermatozoa and successful reproduction in more detail. All lipids present in porcine spermatozoa were analysed using gas chromatography (GC) and mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). The main representatives of the polar lipid classes are glycerophospholipids (in particular GPC and GPE). The main representatives of the neutral lipid classes are diacylglycerols (DAG). Metabolic incorporation of fatty acids into lipids was radiochemically monitored using [14C]-octadecadienoic acid in the supplied spermatozoa-preservation medium. Temperature and incubation time were shown to be particularly important determinants. The added fatty acids were incorporated into both the spermatozoas’ neutral (DAG) and polar lipids (diacyl-GPC). The affected lipids were characterised by means of MALDI- and Q-TOF-MS subsequent to the supplementation of uniformly 13C-labelled octadecadienoic acid. DAG (18:2/18:2), GPC (16:0/18:2) and GPC (18:2/18:2) could be identified and a de-novo biosynthesis of DAG (18:2/18:2) could be proven. The same results were obtained when spermatozoa were supplemented with hexadecenoic, octadecenoic and octadecatrienoic acids. Finally, it was shown that the physiological state of the spermatozoa, especially those supplemented with endogeneously present fatty acids, led to an enhanced vitality and motility in spermatozoa subsequent to low temperature storage. It was also observed that acrosomal damage was reduced and that hexadecenoic acid significantly stabilised all the vitality parameters. In conclusion, supplementing spermatozoa with selected fatty acids is an effective solution for the storage of spermatozoa at 4 to 6°C.

Das Wissenschaftsverständnis als Verständnis über die charakteristischen Grundzüge der Erkenntnisgewinnung und die Eigenschaften naturwissenschaftlichen Wissens ist in einem durch Naturwissenschaften und Technik geprägten Alltag unverzichtbar (z. B. NGSS Achieve Inc., 2013). Viele Autoren gehen davon aus, dass Schüler durch das Konstruieren, Testen und Ändern von Modellen ein Modellverständnis als Bestandteil von Wissenschaftsverständnis erlangen (z. B. Lehrer & Schauble, 2006). Doch bisher konnte keine Studie gefunden werden, die diesen Zusammenhang empirisch belegt. Daher wurde auf der theoretischen Basis des Modells der Modellbildung nach Justi und Gilbert (2002) eine standardisierte Hands-On-Aufgabenstruktur entwickelt und evaluiert. Sie regt Schülerinnen und Schüler dazu an, Tätigkeiten der Modellbildung auszuführen, um eigene Hypothesen zu untersuchen. Dabei aktivierte Schülervorstellungen wurden mit einer Methodenkombination aus Lautem Denken, Interview und Videoaufzeichnung erfasst. Zur Beurteilung der Qualität aktivierter Vorstellungen in unterschiedlich elaborierten Ausprägungen wurde das Kompetenzmodell der Modellkompetenz von Upmeier zu Belzen und Krüger (2010) herangezogen. Als grundlegendes Ergebnis zeigt sich, dass die meisten Probanden der zehnten Jahrgangsstufe trotz unterstützender und strukturierender Maßnahmen keine Vorstellungen über Modelle als Erkenntnismethoden äußerten. Doch in der Arbeit werden andere erfolgreiche Lernangebote zur Aktivierung epistemologischer Schülervorstellungen beschrieben. Eine weitere Erkenntnis der Studie ist, dass die durch Justi und Gilbert (2002) beschriebenen Schritte zur Modellbildung mit Blick auf zukünftige Interventionen um drei Aspekte erweitert werden können. Außerdem werden mit Blick auf die Anbindung in den Schulkontext Unterschiede zwischen grafischen, gegenständlichen und verbalen Modellbildungsprozessen reflektiert, die mithilfe eines qualitativen, experimentellen Untersuchungsdesigns erfasst wurden. / Various authors claim that students achieve a better understanding of the nature of science and scientific inquiry through modeling (e.g. Lehrer & Schauble, 2006). In this process, students develop models of a phenomenon, test their ideas with the model, change the models and discuss the results. Whether students do indeed achieve a better understanding of the nature of science and scientific inquiry through the process of modeling cannot be answered sufficiently by current research. That’s why, in this study the model of modeling by Justi and Gilbert (2002) was transferred into a standardized hands-on tasks. The task forces students to analyze their own questions about a biological phenomenon by building, testing and changing models. In this process, students’ conceptions were captured with a combination of interviews, thinking aloud and videography. The theoretical structure of model competence by Upmeier zu Belzen and Krüger (2010) served to assess the quality of the student statements. A fundamental result of this study is that the participants at the age of sixteen expressed mainly ideas about models as a product of science despite supportive measures. The thesis describes other offers of the hands-on tasks which enable ideas about models as inquiry methods. Another finding of the study is that the modeling steps of Justi and Gilbert (2002) can be extended to three aspects. In addition, and overlooking the school context, differences between graphic, material and verbal modeling processes are described. These were analyzed using a qualitative, experimental study design.

Bacillus amyloliquefaciens FZB42 ist ein im Boden weit verbreitetes Bakterium. Es kolonisiert Pflanzenwurzeln und werde als Biodünger verwendet, da sie in der Lage sind, Pflanzenwachstum zu fördern. Der domestizierte Stamm B. subtilis 168 ist eng verwand mit B. amyloliquefaciens FZB42, fördert jedoch kein Pflanzenwachstum. Als ein erster Ansatz zur Ermittlung von Gendifferenzen zwischen FZB42 und B. subtilis 168 - wobei zum damaligen Zeitpunkt nur die Genomsequenz letzteren Organismus bekannt war - wurde die Supression Subtractive Hybridisation (SSH) angewandt. Hierdurch wurden mehrere einzigartige Gene in B. amyloliquefaziens identifiziert. Unterdessen beteiligte sich unser Labor in Kollaboration mit dem GenoMik Network in Göttingen an einem Projekt, dessen Ziel die komplette Sequenzierung des Genoms von B. amyloliquefaciens war. Der Hauptanteil der Arbeit, sowie die Koordination des gesamten Projekts wurden von Xiao-Hua Chen und mir selbst durchgeführt. B. amyloliquefaciens FZB42 besitzt die srf, fen, pks1 (bae), bac und dhb Operons, welche für die Synthese von Surfactin, Fengycin, Bacillaene, Bacilysin und Bacillibactin verantwortlich sind und die ebenfalls im Genom von B. subtilis 168 enthalten sind. Das Genom von B. amyloliquefaciens FZB42, beinhaltet die bmy Gencluster, die die Synthese von Bacillomycin D kontrolliert. Ein weiteres in dieser Arbeit verfolgtes Ziel war die Identifizierung der regulatorischen Wege, die die Expression von Bacillomycin D steuern. Es wurde gezeigt, dass globale Regulatoren, wie beispielsweise DegU, DegQ und ComA, die alternativen Sigmafaktoren sigB und sigH und ein neuartiges Rap-Protein die transkriptionale Aktivität des in dieser Arbeit identifizierten Hauptpromotors des bmy-Operons beeinflussen. Es wurde gezeigt, dass DegU seine Effekte nach direkter Bindung an zwei unterschiedliche Regionen im bmy-Promotor ausübt. Es wurde außerdem gezeigt, dass DegU abgesehen von der Aktivierung des Hauptpromoters des bmy-Operons eine zusätzliche, vermutlich eine post-transkriptionale Rolle spielt. Auf ähnliche Weise erwies sich YczE, ein Membranprotein unbekannter Funktion, das neben sfp kodiert liegt, als essentiell für die Bacillomycin D-Produktion. Der Effekt wurde auf einem post-transkriptionalen Level ausgeübt und war unabhängig von DegU. / Bacillus amyloliquefaciens FZB42 is widely distributed in the soil. It colonizes the plant roots and is used as bio-fertilizer, since they can promote plant growth.The domesticated strain of B. subtilis 168 is closely related to B. amyloliquefaciens FZB42, but does not promote plant growth. As a first approach to detect gene differentiation between FZB42 and B. subtilis 168, and since only the genome sequence of the latter was known at that point, Suppression Subtractive Hybridization (SSH) was employed. Thereby, several unique genes of B. amyloliquefaciens FZB42 could be identified. Meanwhile, our laboratory became engaged in a project aiming to define the complete genome sequence of B. amyloliquefaciens FZB42, in collaboration with the GenoMik Network in Göttingen. The major part of the work and the co-ordination of the whole process were performed by Xiao-Hua Chen and myself. B. amyloliquefaciens FZB42 possesses the srf, fen, pks1 (bae), bac and dhb operons, which are also shared by B. subtilis 168. In addition, the genome of B. amyloliquefaciens FZB42 contains the bmy gene clusters, which controls the synthesis of bacillomycin D. A further issue pursued in this work was to identify the regulatory pathways that govern the expression of bacillomycin D. Global regulators, such as DegU, DegQ and ComA, the alternative sigma factors, sigB and sigH, and a novel Rap protein were found to affect the transcriptional activation of the main promoter of the bmy operon identified in this work. In particular, DegU was shown to mediate its effects, after binding directly to two sites at the bmy promoter region. DegU was shown to play an additional role on bacillomycin D production, presumably a post-transcriptional one. Similarly, YczE, a membrane protein of unknown function, encoded adjacently to sfp proved to be essential for bacillomycin D production, but dispensable for the production of the rest peptide antibiotics produced by B. amyloliquefaciens FZB42. The effect was mediated at a post-transcriptional level and was independent of DegU.

Die RNA-abhängige Proteinkinase (PKR) ist eine Interferon-induzierte Proteinkinase mit einer zentralen Rolle in der antiviralen Immunantwort. Die Aktivierung von PKR wird durch Bindung viraler RNA oder spezifischer Protein-Regulatoren ausgelöst und resultiert in der Inhibierung der Translation und Induktion von Transkriptionsfaktoren für die Produktion proinflammatorischer Zytokine. Trotz intensiver Forschung ist es bisher nicht gelungen, das gesamte Spektrum von PKR-Regulatoren und Adaptorproteinen aufzudecken. In der vorliegenden Arbeit wurde mithilfe von quantitativer Massenspektrometrie eine systematische Analyse von PKR Bindungspartnern im Kontext einer Influenzavirusinfektion durchgeführt. Dabei wurden 47 Proteine identifiziert, die nach Infektion mit einem Influenza A Virus spezifisch an PKR gebunden waren. Die Interaktion von PKR und einem Teil der Proteine wurde validiert und es konnte gezeigt werden, dass einige der gefundenen Proteine die PKR-Phosphorylierung verstärkten. Hierbei wurde das KH-Typ Splicing regulatorische Protein (KSRP) als neuer Regulator von PKR identifiziert.Die Aktivierung von PKR durch KSRP wurde dabei durch direkte Interaktion der Proteine über die N-terminale Domäne von PKR vermittelt, war jedoch unabhängig von der RNA-Bindungsfunktion. Immunfluoreszenzversuche zeigten, dass die Infektion mit einer Virusmutante zur Umlagerung beider Proteine in Stress-Granula führte. Verringerte KSRP-Level beeinträchtigten die PKR-Aktivierung, was zu einer 10-fachen Verbesserung der Replikation von mutierten Influenzaviren in Zellen mit verringerter IFN-beta-Expression führte. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass KSRP die antivirale Abwehr durch direkte Bindung an PKR und die damit verbundene Steigerung der PKR-Aktivität unterstützt. Zusammenfassend unterstreichen die Ergebnisse das Vermögen quantitativer Massenspektrometrie antivirale Mechanismen systematisch aufzuklären, um potenzielle Ziele für antivirale Therapien zu finden. / The RNA-dependent protein kinase (PKR) is an interferon induced protein kinase that plays a significant role in innate antiviral immunity. Activation of PKR can be triggered by binding of viral RNA or distinct protein regulators and results in inhibition of translation and the induction of transcription factors that lead to production of proinflammatory cytokines. Over the last decades, extensive research was conducted to identify the whole network of PKR regulators and adaptor proteins, but it is most likely that still some pieces are missing to complete our understanding of PKR functions. This thesis provides a systematic analysis of PKR binding partners in the context of influenza A virus infection by using quantitative mass spectrometry. In total, 47 proteins that bound specifically to PKR after influenza A virus infection were identified. The interaction between PKR and a subset of candidates was validated and it was shown that some of the identified proteins upon overexpression induced PKR phosphorylation. Hereby, the KH-type-splicing regulatory protein (KSRP) was identified as a novel protein regulator of PKR. Activation of PKR by KSRP was mediated by direct interaction of KSRP with the N-terminal domain of PKR, but was found to be independent from dsRNA binding. Immunofluorescence experiments showed that upon infection with an influenza A mutant virus, both proteins were redistributed to cytoplasmic stress granules. Knockdown of KSRP impaired PKR activation and consequently rescued viral replication of influenza A mutant viruses by one order of magnitude in cells with reduced IFN-beta levels. It was shown for the first time that KSRP is able to support antiviral signalling by enhancing PKR activation in a process that involves direct protein-protein-interaction. Taken together, this study demonstrates the aptitude of quantitative mass spectrometry for elucidation of cellular antiviral response pathways to reveal potential new targets for antiviral therapy.

Polytäne Chromosomen von Drosophila sind in eine Abfolge von Banden und Interbanden unterschiedlichen Kompaktionsgrades gegliedert. Das Protein Z4 ist notwendig, um dieses Muster aufrecht zu erhalten (Eggert et al., 2004). Durch Koimmunpräzipitation mit Z4 wurde in unserer Arbeitsgruppe ein Chromodomänen Protein identifiziert, das von uns als Chriz bezeichnet wurde (Gortchakov et al., 2005). In meiner Arbeit testete ich die Interaktion zwischen den vollständigen Proteinen Chriz und Z4. Ich konnte dabei zeigen, dass beide Proteine in vivo direkt miteinander interagieren. Die kartierten Interaktionsdomänen am N-Terminus von Z4 und am C-Terminus von Chriz sind hinreichend für die wechselseitige Interaktion beider Proteine. Chriz ist wie Z4 in vielen Interbanden polytäner Interphasechromosomen gebunden. Die überexpression verschiedener Domänen von Chriz zeigte, dass sowohl der N- als auch der C-Terminus von Chriz für die Interbandenbindung von Chriz ausreichend sind. Der Chriz C-Terminus ist dar Über hinaus notwendig, um das überleben von Tieren mit einer Chriz Null Mutation bis in das larvale Stadium zu gewährleisten. Tiere mit induziertem Chriz RNAi knock down zeigten eine verringerte DNA Kondensation polytäner Chromosomen. Die Ähnlichkeit des chromosomalen Phänotyps von Z4 und Chriz Mutationen legt nahe, dass beide Proteine in einem gemeinsamen Komplex in Interbanden vorkommen. Unter Ausnutzung von Chriz RNAi bzw. Z4 RNAi konnte ich zeigen, dass die chromosomale Bindung von Z4 von Chriz abhängt. Weiterhin sind die Proteinkinase Jil-1 und an Serin 10 phosphoryliertes H3 (H3pS10), beides Marker für dekondensiertes Chromatin, in Chriz RNAi Tieren verringert. Aus meinen Daten schliesse ich, dass Chriz/Z4/Jil-1 in einem gemeinsamen Komplex an Interbanden gebunden sind. Chriz ist dabei fundamental wichtig für die zielgerichtete Bindung und Stabilität des Komplexes. Der Komplex selbst ist erforderlich, um die lokale Chromatinstruktur aufrecht zu erthalten. / Drosophila polytene chromosomes are compacted into a series of bands and interbands. Z4 is a protein to keep this pattern, since Z4 mutant larvae show a decompaction of chromosomes and a loss of banding pattern (Eggert et al., 2004). By coimmuno-precipitation, we identified a chromodomain protein, which we named Chriz, for chromodomain protein interacting with Z4 (Gortchakov et al., 2005). In my PhD thesis, I tested the interactions between the full length proteins and different fragments of Chriz and Z4 which showed that Chriz could directly interact with Z4 in vivo. The interaction domains were mapped and it was determined that the N terminus of Z4 and the C terminus of Chriz are sufficient for mutual interaction. GST pull down confirmed these data and more precisely localized the interaction domains. Chriz, like Z4, is present in many interbands of interphase polytene chromosomes. The overexpression of different domains of Chriz demonstrated that both the N and C terminus are sufficient for targeting of Chriz to interbands. The C terminus was shown to be sufficient for rescue of Chriz null mutations into larva stage. Chriz full length proteins, with site directed mutations within the chromodomain, could still partially rescue the null mutant. Chriz RNAi knock down resulted in a loss of structure of polytene chromosome. The similar chromosomal phenotype of Z4 and Chriz indicate that they cooperate in the formation of chromosomal structure. Using the Chriz RNAi, I showed that Z4 chromosomal binding is dependent on Chriz. However, by a similar assay I showed that Chriz binding did not depend on Z4. Finally, the decondensed interphase chromatin marker Jil-1, a H3S10 histone kinase, and H3pS10 are decreased in Chriz RNAi line. From these data, I conclude that Chriz/Z4/Jil-1 form an interband binding complex. Chriz is the fundamental factor for the chromosomal targeting and stabilitation of the complex that is required to maintain locally chromatin structure.

YB-1, ein Y-Box-Protein in Säugerzellen, konnte sowohl im Zytoplasma als auch in den Zellkernen von HeLa-Zellen nachgewiesen werden. Es wurde eine Abhängigkeit der intrazellulären Lokalisation von YB-1 vom Verlauf des Zellzyklus beobachtet. In jeder Phase des Zellzyklus war YB-1 im Zytoplasma zu finden. Eine Kernlokalisation von YB- 1 konnte nur in den HeLa-Zellen festgestellt werden, die sich im Übergang von der G1- in die S-Phase oder in der frühen S-Phase des Zellzyklus befanden. Die Abhängigkeit der Lokalisation von YB-1 vom Verlauf des Zellzyklus unterstützt die These, daß YB-1 und andere Y-Box-Proteine an der Regulation der Zellproliferation beteiligt sind. Es wurden verschiedene Proteine identifiziert, die im Zytoplasma von HeLa-Zellen mit YB-1 assoziiert vorkommen. Alle identifizierten Proteine erfüllen Aufgaben im RNA-Metabolismus, was auf eine Beteiligung dieser Proteinkomplexe an der Regulation der mRNA hinweist. Die Interaktion von P32/SF2 (P35) mit YB-1 erwies sich als abhängig vom Zellzyklus, wobei eine maximale Assoziation dieser beiden Proteine beim Übergang der HeLa-Zellen von der G1- in die S-Phase zu beobachten war. In Multidrug-resistenten MCF7/ADR-Zellen konnte eine deutlich verstärkte Interaktion von P32/SF2 mit YB-1 im Vergleich zu den sensitiven MCF7-Zellen festgestellt werden. Im Zytoplasma von HeLa-Zellen konnte YB-1 in Verbindung mit membrangebundenen Polysomen nachgewiesen werden. Eine Assoziation von YB-1 mit freien oder zytoskelettgebundenen Polysomen konnte nicht festgestellt werden. Damit wurde erstmalig gezeigt, daß YB-1 eine Spezifität für eine bestimmte Gruppe von Polysomen besitzt. Die Assoziation mit membrangebundenen Polysomen legte die Vermutung nahe, daß YB-1 an der Translationskontrolle von Polypeptiden beteiligt ist, die am rauhen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert werden. Es konnte gezeigt werden, daß YB-1 die Translation von P-Glykoprotein, einem integralen Membranprotein, positiv reguliert. Ein Einfluß auf die Translation der untersuchten sekretorischen Proteine (a-Faktor und Präprolactin) konnte nicht beobachtet werden. Diese Ergebnisse belegen, daß YB-1 ein spezifischer Regulator der Translation bestimmter Membranproteine ist. Am Hand von P-Glykoprotein konnte des weiteren demonstriert werden, daß YB-1 sowohl die Transkription als auch die Translation dieses Proteins positiv reguliert. Die in den Zellkulturen beobachtete Korrelation von YB-1 mit der Expression von P-Glykoprotein konnte auch in primären Mammakarzinomen nachgewiesen werden. Somit ist YB-1 ein entscheidender Faktor bei der Ausbildung einer intrinsischen multiplen Resistenz von Mammakarzinomen gegen die Behandlung mit Chemotherapeutika. Aus diesem Grunde könnte YB-1 einen Ansatzpunkt für die künftige Diagnose und Therapie von Mammakarzinomen und eventuell auch von anderen Tumoren bieten. / YB-1, a mammalian Y-box protein was detected in the cytoplasm as well as in the nuclei of HeLa cells. The intracellular localisation of YB-1 depends on the cell cycle. In every part of the cell cycle, YB-1 was found in the cytoplasm. A nuclear localisation of YB-1 was only detectable in the G1- to S-phase transition and in the early S-phase. These observations underline the hypothesis, that Y-box proteins are envolved in the regulation of cell proliferation. Different proteins interacting with YB-1 were identified in the cytoplasm of HeLa cells. All identified poteins are envolved in the RNA metabolism, indicating a role of these protein complexes in the regulation of mRNA. The interaction of P32/SF2 (P35) with YB-1 alternates during the cell cycle with a maximum at the G1- to S-phase transition. A remarkable increase of the association of YB-1 and P32 was observed in the multidrug-resistant MCF7 cells compared with the parental cell line. Furthermore, YB-1 was detected in association with membrane-bound polysomes, suggesting a role of YB-1 at the translational regulation of the synthesis of polypeptides at the rough endoplasmic reticulum. It was shown, that YB-1 stimulate the translation of P-glycoprotein. This influence is specific, beause the translation of a set of control proteins (alpha factor, preprolactin, luciferase) was not effected by YB-1. It was shown, that YB-1 stimulate the expression of P-glycoprotein at the level of transcription as well as at the level of translation. This indicates a central role of YB-1 in the regulation of the biosynthesis of this protein. The correlation of the nuclear expression of YB-1 and the expression of P-glycoprotein was demonstrated in primary breast cancers. Taken together, YB-1 is a important factor for the development of a resistant phenotyp and therefore a possible new target for anti-cancer therapy.

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