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Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1993. / Vita. Includes bibliographical references (leaves [72]-90).

O mecanismo não clássico de testosterona induz resposta celular rápida ao nível de membrana, enquanto que a ação clássica se dá pela ligação da testosterona ao seu receptor androgênico intracelular (iAR) que regula a expressão gênica. A Epitestosterona, o 17α-epímero da testosterona, tem sido descrito como um anti-andrógeno, inibindo o efeito da testosterona ou diidrotestosterona sobre o sobre o iAR. No entanto, a epitestosterona apresenta um efeito não clássico similar ao da da testosterona, despolarizando o potencial de membrana das células de Sertoli e induzindo a captação rápida de Ca2+ nos testículos. O objetivo deste estudo foi analizar o efeito do tratamento com epitestosterona e testosterona em animais castrados quimicamente com a utilização de um antagonista do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), o cetrorelix. Ratos imaturos, a partir do 7º dia de idade receberam durante 7 dias o tratamento pela via intraperitoneal de acordo com os seguintes grupos: Controle (apenas o veículo hidroxipropil-beta-ciclodextrina, castrados (Cetrorelix (500 μg/kg/dia)), castrados com reposição de testosterona (2,5mg/kg/dia) (Cetrorelix+testosterona), castrados com reposição de epitestosterona (2,5mg/kg/dia) (cetrorelix+epitestosterona) e epitestosterona. Foram observados os efeitos dos tratamentos em parâmetros de desenvolvimento sexual de ratos imaturos como: peso corporal, peso testicular e medida da distância anogenital (DAG). Também foram feitos registros eletrofisiológicos da ação no potencial de membrana da testosterona nos túbulos seminíferos de testículos de ratos de todos os tratamentos. Para a avaliação a imunorreatividade ao iAR foi utilizado o anticorpo primário anti-iAR do tipo policlonal na concentração 1:250. Para o controle-negativo da técnica cortes de todas os tratamentos incubados com PBS-T. Para expressão foi utilizado o anticorpo primário anti-iAR do tipo policlonal na concentração de 1:1000 realizada pela técnica de Western Blot. A castração química com cetrorelix resultou na redução no peso dos testículos e da DAG. O tratamento com epitestosterona e testosterona restaurou tanto o peso testicular como a DAG. O efeito despolarizante em resposta à aplicação tópica da testosterona foi observado no grupo controle e no grupo de cetrorelix. Além disso, o grupo castrado com cetrorelix com reposição de epitestosterona impediu o efeito rápido da testosterona na despolarização da membrana celular. No grupo com reposição de testosterona, a resposta eletrofisiológica da testosterona na membrana também foi alterada. O tratamento com epitestosterona nos ratos castrados com cetrorelix produziu diminuição da expressão do iAR. Foi observada redução da imunorreatividade do iAR nos animais tratados com epitestosterona. Pode-se concluir que a epitestosterona participa do desenvolvimento genital em ratos imaturos, ou seja, produziu recuperação de AGD de forma semelhante à testosterona. Este resultado sugere que ambos os hormônios atuam pela mesma via de desenvolvimento deste parâmetro, provavelmente através de um mecanismo não-clássico. Além disso, o tratamento com o antagonista de GnRH e reposição de epitestosterona suprimiu a resposta não clássica da testosterona, mudando o padrão de via de sinalização da testosterona nas células de Sertoli. / The non-classical mechanism of testosterone induces a rapid cellular response at the membrane level, while the classical action is through the binding to the intracellular androgenic receptor (iAR) and the regulation of gene expression. Epitestosterone, the 17α-epimer of testosterone, has been described as an anti-androgen, inhibiting the testosterone or dihyidrotestosterone effect on the iAR. However, epitestosterone presents a non-classical effect similar to testosterone, depolarizing the membrane potential of Sertoli cells and inducing rapid Ca2+ uptake in testes. The aim of this study was to observe the effect of the treatment with epitestosterone and testosterone in rats chemically castrated with a gonadotropin-releasing hormone (GnRH) antagonist cetrorelix. From pnd 7 to pnd 14, the rats were given daily intraperitoneal injections with (i) hormones solvent, (2-hydroxypropyl β-cyclodextrin) as the control group (CTRL); (ii) 500 μg/kg/day of the GnRH antagonist cetrorelix as the cetrorelix group (CET); (iii) 500 μg/kg/day of cetrorelix + 2.5 mg/kg/day of testosterone as the cetrorelix plus testosterone group (CET+T); (iv) 500 μg/kg/day of cetrorelix + 2.5 mg/kg/day of epitestosterone as the cetrorelix plus epitestosterone group (CET+EpiT); and (v) 2.5 mg/kg of epitestosterone alone as the epitestosterone group (EpiT). The effect of different treatments were verified on the body and testicular weight and the anogenital distance (AGD). The potential and the membrane resistance of Sertoli cells were recorded by electrophysiological technique intracellular record. The electrophysiological effect of testosterone on membrane of Sertoli cells were evaluated in seminiferous tubules in testes from rats of the all experimental groups. For evaluating the immunoreactivity to the iAR we used the anti-iAR primary polyclonal antibody type in concentration 1: 250. For the negative control technique cuts all treatments incubated with PBS-T. For iAR expression we used the anti-iAR type polyclonal primary antibody at a concentration of 1: 1000 performed by the Western Blot technique. The chemical castration induced a reduction in testicular weight and AGD. The treatment with both epitestosterone and testosterone restored the AGD and the testicular weight. The depolarizing effect in response to topical testosterone application was observed in the control group and in the GnRH antagonist cetrorelix group. Moreover, in the GnRH antagonist cetrorelix replaced with the epitestosterone group, testosterone was not capable of changing the membrane potential. In the group replaced with testosterone, the membrane response to testosterone was smaller also. The treatment with epitestosterone in castrated rats also reduced the expression of the iAR in testes. The immunoreaction of iAR was reduced in the animals treated with epitestosterone. In conclusion, the effect of epitestosterone on genital development in immature rats, namely recovering of AGD, was similar to testosterone. This result suggest that both hormones act through the same pathway on this development parameter, probably by a non-classical mechanism. Additionally, the treatment with the GnRH antagonist plus epitestosterone suppressed the non-classical testosterone response, changing the pattern of testosterone signaling pathway through a membrane mechanism in Sertoli cells.

O mecanismo não clássico de testosterona induz resposta celular rápida ao nível de membrana, enquanto que a ação clássica se dá pela ligação da testosterona ao seu receptor androgênico intracelular (iAR) que regula a expressão gênica. A Epitestosterona, o 17α-epímero da testosterona, tem sido descrito como um anti-andrógeno, inibindo o efeito da testosterona ou diidrotestosterona sobre o sobre o iAR. No entanto, a epitestosterona apresenta um efeito não clássico similar ao da da testosterona, despolarizando o potencial de membrana das células de Sertoli e induzindo a captação rápida de Ca2+ nos testículos. O objetivo deste estudo foi analizar o efeito do tratamento com epitestosterona e testosterona em animais castrados quimicamente com a utilização de um antagonista do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), o cetrorelix. Ratos imaturos, a partir do 7º dia de idade receberam durante 7 dias o tratamento pela via intraperitoneal de acordo com os seguintes grupos: Controle (apenas o veículo hidroxipropil-beta-ciclodextrina, castrados (Cetrorelix (500 μg/kg/dia)), castrados com reposição de testosterona (2,5mg/kg/dia) (Cetrorelix+testosterona), castrados com reposição de epitestosterona (2,5mg/kg/dia) (cetrorelix+epitestosterona) e epitestosterona. Foram observados os efeitos dos tratamentos em parâmetros de desenvolvimento sexual de ratos imaturos como: peso corporal, peso testicular e medida da distância anogenital (DAG). Também foram feitos registros eletrofisiológicos da ação no potencial de membrana da testosterona nos túbulos seminíferos de testículos de ratos de todos os tratamentos. Para a avaliação a imunorreatividade ao iAR foi utilizado o anticorpo primário anti-iAR do tipo policlonal na concentração 1:250. Para o controle-negativo da técnica cortes de todas os tratamentos incubados com PBS-T. Para expressão foi utilizado o anticorpo primário anti-iAR do tipo policlonal na concentração de 1:1000 realizada pela técnica de Western Blot. A castração química com cetrorelix resultou na redução no peso dos testículos e da DAG. O tratamento com epitestosterona e testosterona restaurou tanto o peso testicular como a DAG. O efeito despolarizante em resposta à aplicação tópica da testosterona foi observado no grupo controle e no grupo de cetrorelix. Além disso, o grupo castrado com cetrorelix com reposição de epitestosterona impediu o efeito rápido da testosterona na despolarização da membrana celular. No grupo com reposição de testosterona, a resposta eletrofisiológica da testosterona na membrana também foi alterada. O tratamento com epitestosterona nos ratos castrados com cetrorelix produziu diminuição da expressão do iAR. Foi observada redução da imunorreatividade do iAR nos animais tratados com epitestosterona. Pode-se concluir que a epitestosterona participa do desenvolvimento genital em ratos imaturos, ou seja, produziu recuperação de AGD de forma semelhante à testosterona. Este resultado sugere que ambos os hormônios atuam pela mesma via de desenvolvimento deste parâmetro, provavelmente através de um mecanismo não-clássico. Além disso, o tratamento com o antagonista de GnRH e reposição de epitestosterona suprimiu a resposta não clássica da testosterona, mudando o padrão de via de sinalização da testosterona nas células de Sertoli. / The non-classical mechanism of testosterone induces a rapid cellular response at the membrane level, while the classical action is through the binding to the intracellular androgenic receptor (iAR) and the regulation of gene expression. Epitestosterone, the 17α-epimer of testosterone, has been described as an anti-androgen, inhibiting the testosterone or dihyidrotestosterone effect on the iAR. However, epitestosterone presents a non-classical effect similar to testosterone, depolarizing the membrane potential of Sertoli cells and inducing rapid Ca2+ uptake in testes. The aim of this study was to observe the effect of the treatment with epitestosterone and testosterone in rats chemically castrated with a gonadotropin-releasing hormone (GnRH) antagonist cetrorelix. From pnd 7 to pnd 14, the rats were given daily intraperitoneal injections with (i) hormones solvent, (2-hydroxypropyl β-cyclodextrin) as the control group (CTRL); (ii) 500 μg/kg/day of the GnRH antagonist cetrorelix as the cetrorelix group (CET); (iii) 500 μg/kg/day of cetrorelix + 2.5 mg/kg/day of testosterone as the cetrorelix plus testosterone group (CET+T); (iv) 500 μg/kg/day of cetrorelix + 2.5 mg/kg/day of epitestosterone as the cetrorelix plus epitestosterone group (CET+EpiT); and (v) 2.5 mg/kg of epitestosterone alone as the epitestosterone group (EpiT). The effect of different treatments were verified on the body and testicular weight and the anogenital distance (AGD). The potential and the membrane resistance of Sertoli cells were recorded by electrophysiological technique intracellular record. The electrophysiological effect of testosterone on membrane of Sertoli cells were evaluated in seminiferous tubules in testes from rats of the all experimental groups. For evaluating the immunoreactivity to the iAR we used the anti-iAR primary polyclonal antibody type in concentration 1: 250. For the negative control technique cuts all treatments incubated with PBS-T. For iAR expression we used the anti-iAR type polyclonal primary antibody at a concentration of 1: 1000 performed by the Western Blot technique. The chemical castration induced a reduction in testicular weight and AGD. The treatment with both epitestosterone and testosterone restored the AGD and the testicular weight. The depolarizing effect in response to topical testosterone application was observed in the control group and in the GnRH antagonist cetrorelix group. Moreover, in the GnRH antagonist cetrorelix replaced with the epitestosterone group, testosterone was not capable of changing the membrane potential. In the group replaced with testosterone, the membrane response to testosterone was smaller also. The treatment with epitestosterone in castrated rats also reduced the expression of the iAR in testes. The immunoreaction of iAR was reduced in the animals treated with epitestosterone. In conclusion, the effect of epitestosterone on genital development in immature rats, namely recovering of AGD, was similar to testosterone. This result suggest that both hormones act through the same pathway on this development parameter, probably by a non-classical mechanism. Additionally, the treatment with the GnRH antagonist plus epitestosterone suppressed the non-classical testosterone response, changing the pattern of testosterone signaling pathway through a membrane mechanism in Sertoli cells.

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Belo Horizonte, MG, Brasil / A esquistossomose é uma doença parasitária causada por parasitos do gênero Schistosoma. Apesar das tentativas de controle e introdução do tratamento com praziquantel, a doença persiste. Desse modo, o desenvolvimento de uma vacina poderá contribuir para o controle da doença. Dentre outras evidências, o alto nível de proteção alcançado pela vacinação com cercárias irradiadas em camundongos e a presença de indivíduos naturalmente resistentes à infecção por Schistosoma mansoni em áreas endêmicas sugerem a existência de mecanismos que induzem proteção contra esquistossomose. Por meio de experimentos de Western-blotting bidimensional utilizando soro de indivíduos de área endêmica para esquistossomose e extrato proteico de vermes adultos, selecionamos a proteína fosfoglicerato mutase de S. mansoni (SmPGM) para ser testada em ensaios de imunização em camundongos, uma vez que spots correspondentes a esta proteína foram reconhecidos pelo soro de indivíduos naturalmente resistentes à infecção e também porque análises in silico do seu potencial antigênico indicaram que SmPGM é uma das proteínas de S. mansoni que mais possuem peptídeos antigênicos. A região codificadora do gene foi inserida em vetor de expressão em células de mamíferos e após certificar a expressão da proteína por Western-blotting usando anticorpo anti-His (C-term) e extrato proteico de células HEK 293T transfectadas, outra construção de DNA similar, que não expressa a proteína em fusão com 6xHis, foi usada nos ensaios de imunização gênica em camundongos. Entretanto, não houve redução no número de vermes adultos recuperados de camundongos vacinados e desafiados, bem como no número de ovos liberados nas fezes e retidos no fígado e intestino. Além disso, não houve alteração na ovoposição das fêmeas, nem no número e tamanho dos granulomas. A imunização gênica não foi capaz de induzir resposta humoral, resposta imune celular e produção de citocinas. Sendo assim, foram realizados experimentos de imunização de camundongos com dois peptídeos sintéticos de SmPGM, que também não resultou em proteção pelos parâmetros analisados. Este projeto também teve como objetivo identificar proteínas de membrana, principalmente do tegumento do parasito. Para isso, um extrato proteico de vermes adultos de S. mansoni enriquecido com proteínas de membrana foi obtido e também utilizado em experimentos de Western-blotting bidimensional. Foram detectados spots proteicos que reagiram diferencialmente aos pools de soro de indivíduos de área endêmica para esquistossomose. Entretanto, todos os spots imunorreativos foram submetidos à identificação por espectrometria de massas. / The schistosomiasis is a parasitic disease caused by parasites of genus Schistosoma. Even with the attempts to control the disease and the introduction of the treatment with the praziquantel drug, the disease persists. Thereby, the development of one long lasting protection, based in vaccine therapy, would be a great benefit for the disease control. Among others evidences, the high protection level achieved by vaccination with irradiated cercarie in mice and the presence of naturally resistant individuals to infection by S. mansoni in endemic areas suggest the existence of mechanisms that induce protection against schistosomiasis. By the two-dimensional Western-blotting experiments using pool of serum of individuals from schistosomiasis endemic area and adult worm protein extract, we selected the protein S. mansoni phosphoglycerate mutase (SmPGM) to be tested in immunization assays in mice, since your corresponding spots were recognize by the pool of serum of naturally resistant individuals to infection and also because in silico analysis of its antigenic potential indicated that SmPGM is one of the S. mansoni proteins that have more antigenic peptides. The codion region of the corresponding gene was inserted into a plasmid vector for gene expression in mammalian cells and after ensuring the protein expression by Western blotting using anti-His (C-term) antibody and protein extract of transfected HEK 293T cells, another similar DNA construction, without the 6xHis-tag, was used to DNA immunization assays in mice. However, there was no reduction in the number of adult worms recovered from vaccinated and challenged mice, as well as in the number of eggs released in feces and retained in the liver and intestine. Furthermore, there was neither change in the female oviposition, nor in the number and area of the granulomas. The DNA immunization was not able to induce humoral, cellular immune response and cytokine production. Thus, in mice immunizations were also performed with two SmPGM synthetic peptides. This immunization protocol also resulted in lack of protective immunity against S. mansoni infection according to the analyzed parameters. This project also aimed to identify membrane proteins, mainly of the S. mansoni parasite tegument. For this, a protein extract of S. mansoni adult worms enriched with membrane proteins was obtained and also used in two-dimensional Western-blotting experiments. Protein spots that reacted differentially to the serum pools of individuals from endemic area for schistosomiasis were detected. However, all immunoreactive spots were subjected to mass spectrometry identification.

Made available in DSpace on 2016-05-16T12:51:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marcos_almeida_ini_mest_2014.pdf: 14714832 bytes, checksum: be975491bb39d63940e3b535442ff649 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A histoplasmose é uma micose cosmopolita causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum, cujo habitat é o solo rico em excretas de aves e morcegos. Esta infecção ocorre a partir da inalação de propágulos de H. capsulatum e apresenta um amplo espectro clínico, variando de formas leves a disseminadas, a depender do inóculo infectante, do status imunológico do hospedeiro e da virulência da cepa. O diagnóstico da histoplasmose é baseado em aspectos clínicos, epidemiológicos, radiológicos e laboratoriais, embora alguns sintomas possam ser confundidos com outras doenças, tais como a tuberculose e outras micoses. O teste de referência para a confirmação do diagnóstico é o isolamento e identificação de H. capsulatum em cultivo. Entretanto, na ausência dos mesmos, a sorologia tem sido utilizada para o diagnóstico presuntivo da histoplasmose através da detecção de anticorpos. O principal complexo antigênico utilizado para a detecção de anticorpos anti-H. capsulatum é a histoplasmina, constituída principalmente pelos antígenos C, H e M. Estes últimos, em sua forma nativa, são glicoproteínas contendo epítopos protéicos específicos e glicosídicos inespecíficos. Deglicosilações químicas pelo metaperiodato de sódio (NaIO4) provaram aumentar a sensibilidade e especificidade em métodos imunoenzimáticos, tais como Western blot e ELISA, reduzindo a reatividade cruzada com outros fungos O principal objetivo do presente estudo foi validar o método imunoenzimático (Western blot) para a detecção de anticorpos no diagnóstico da histoplasmose. Desta forma, foi realizado um estudo casocontrole, utilizando 118 amostras de soro de pacientes com histoplasmose e 118 amostras de soro de indivíduos com história clínico-epidemiológica compatível com micose sistêmica, saudáveis ou acometidos por outra micose ou tuberculose, residentes no estado do Rio de Janeiro. As amostras foram coletadas no período de 2000 a 2013 e encaminhadas ao Laboratório de Micologia do Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Os parâmetros de validação diagnóstica foram calculados considerando a categorização dos resultados obtidos em uma tabela 2 X 2 e analisados pelo SPSS 17.0. O Western blot demonstrou uma sensibilidade de 94,9%, especificidade de 94,1%, acurácia de 94,5% e uma precisão quase perfeita. As fitas demonstraram-se viáveis para utilização por até cinco anos após a sensibilização com o antígeno HMIN-PT. Estes resultados comprovam a validade do ensaio imunoenzimático (Western blot) para detecção de anticorpos anti-H. capsulatum utilizando HMIN-PT como uma ferramenta de boa acurácia no diagnóstico da histoplasmose e reprodutível. Desta forma, contribuindo para o melhoramento do diagnóstico desta micose, uma vez que esta técnica permitirá a obtenção de resultados em menos de 24 horas, o que supõe um grande avanço a despeito das técnicas existentes na atualidade e poderá vir a ser implantada e disponibilizada para outros centros do Sistema Único de Saúde. / Histoplasmosis is a worldwide systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Histoplasma capsulatum. The fungus lives in soil that contains large amounts of birds or bats droppings. This infection occurs through inhalation of spores of H. capsulatum and has a wide clinical spectrum, ranging from mild to disseminated forms that depend on the infecting inoculum, the immune status of the host and the virulence of the strain. The diagnosis of histoplasmosis is based on clinical, epidemiological, radiological and laboratory aspects; however, some symptoms may be confused with other diseases, such as tuberculosis and other mycoses. The reference test for the confirmation of the diagnosis of histoplasmosis is the isolation and identification of H. capsulatum in culture. However, in the absence of it, serology has been used for the presumptive diagnosis of histoplasmosis through antibody detection. The principal antigenic complex used to detect antibodies anti-H. capsulatum is the histoplasmin, consisting mainly of antigens C, H and M. These antigens, in their native forms, are glycoproteins containing specie-specific protein epitopes and non-specific glycosides. Chemical deglycosylations by sodium metaperiodate (NaIO4) have shown to increase the sensitivity and specificity of immunoenzymatic methods, such as Western blot and ELISA, reducing cross-reactivity with other fungi. The aim of this study was to validate the immunoassay method (Western blot) to detect antibodies in the diagnosis of histoplasmosis Therefore, a case-control study was conducted using 118 serum samples from patients with histoplasmosis, and 118 serum samples from individuals with clinical and epidemiological history compatible with systemic mycosis, either healthy or suffering from other mycosis or tuberculosis. These patients were residents in the state of Rio de Janeiro and the samples, collected from 2000 to 2013, were sent to the Mycology Laboratory of the Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Diagnostic validation parameters were calculated based on the categorization of results obtained in a 2 x 2 table and analyzed using SPSS Statistics 17.0. The Western blot was shown sensitivity of 94.9%, specificity of 94.1%, accuracy of 94.5% and also almost perfect precision. Besides, the strips have been proved to be viable for use or at least five years after the sensitization with antigen HMIN-PT. These results prove the validity of the enzyme immunoassay (Western blot) for the detection of antibodies anti-H. capsulatum, using HMIN-PT as a good accuracy tool in the diagnosis of histoplasmosis and reproducible, contributing to improve the diagnosis of this mycosis, since this technique allows obtaining results in less than 24 hours which implies a breakthrough despite existing at present and will eventually be deployed and made available to other centers belonging to the Public Health System

O mecanismo não clássico de testosterona induz resposta celular rápida ao nível de membrana, enquanto que a ação clássica se dá pela ligação da testosterona ao seu receptor androgênico intracelular (iAR) que regula a expressão gênica. A Epitestosterona, o 17α-epímero da testosterona, tem sido descrito como um anti-andrógeno, inibindo o efeito da testosterona ou diidrotestosterona sobre o sobre o iAR. No entanto, a epitestosterona apresenta um efeito não clássico similar ao da da testosterona, despolarizando o potencial de membrana das células de Sertoli e induzindo a captação rápida de Ca2+ nos testículos. O objetivo deste estudo foi analizar o efeito do tratamento com epitestosterona e testosterona em animais castrados quimicamente com a utilização de um antagonista do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), o cetrorelix. Ratos imaturos, a partir do 7º dia de idade receberam durante 7 dias o tratamento pela via intraperitoneal de acordo com os seguintes grupos: Controle (apenas o veículo hidroxipropil-beta-ciclodextrina, castrados (Cetrorelix (500 μg/kg/dia)), castrados com reposição de testosterona (2,5mg/kg/dia) (Cetrorelix+testosterona), castrados com reposição de epitestosterona (2,5mg/kg/dia) (cetrorelix+epitestosterona) e epitestosterona. Foram observados os efeitos dos tratamentos em parâmetros de desenvolvimento sexual de ratos imaturos como: peso corporal, peso testicular e medida da distância anogenital (DAG). Também foram feitos registros eletrofisiológicos da ação no potencial de membrana da testosterona nos túbulos seminíferos de testículos de ratos de todos os tratamentos. Para a avaliação a imunorreatividade ao iAR foi utilizado o anticorpo primário anti-iAR do tipo policlonal na concentração 1:250. Para o controle-negativo da técnica cortes de todas os tratamentos incubados com PBS-T. Para expressão foi utilizado o anticorpo primário anti-iAR do tipo policlonal na concentração de 1:1000 realizada pela técnica de Western Blot. A castração química com cetrorelix resultou na redução no peso dos testículos e da DAG. O tratamento com epitestosterona e testosterona restaurou tanto o peso testicular como a DAG. O efeito despolarizante em resposta à aplicação tópica da testosterona foi observado no grupo controle e no grupo de cetrorelix. Além disso, o grupo castrado com cetrorelix com reposição de epitestosterona impediu o efeito rápido da testosterona na despolarização da membrana celular. No grupo com reposição de testosterona, a resposta eletrofisiológica da testosterona na membrana também foi alterada. O tratamento com epitestosterona nos ratos castrados com cetrorelix produziu diminuição da expressão do iAR. Foi observada redução da imunorreatividade do iAR nos animais tratados com epitestosterona. Pode-se concluir que a epitestosterona participa do desenvolvimento genital em ratos imaturos, ou seja, produziu recuperação de AGD de forma semelhante à testosterona. Este resultado sugere que ambos os hormônios atuam pela mesma via de desenvolvimento deste parâmetro, provavelmente através de um mecanismo não-clássico. Além disso, o tratamento com o antagonista de GnRH e reposição de epitestosterona suprimiu a resposta não clássica da testosterona, mudando o padrão de via de sinalização da testosterona nas células de Sertoli. / The non-classical mechanism of testosterone induces a rapid cellular response at the membrane level, while the classical action is through the binding to the intracellular androgenic receptor (iAR) and the regulation of gene expression. Epitestosterone, the 17α-epimer of testosterone, has been described as an anti-androgen, inhibiting the testosterone or dihyidrotestosterone effect on the iAR. However, epitestosterone presents a non-classical effect similar to testosterone, depolarizing the membrane potential of Sertoli cells and inducing rapid Ca2+ uptake in testes. The aim of this study was to observe the effect of the treatment with epitestosterone and testosterone in rats chemically castrated with a gonadotropin-releasing hormone (GnRH) antagonist cetrorelix. From pnd 7 to pnd 14, the rats were given daily intraperitoneal injections with (i) hormones solvent, (2-hydroxypropyl β-cyclodextrin) as the control group (CTRL); (ii) 500 μg/kg/day of the GnRH antagonist cetrorelix as the cetrorelix group (CET); (iii) 500 μg/kg/day of cetrorelix + 2.5 mg/kg/day of testosterone as the cetrorelix plus testosterone group (CET+T); (iv) 500 μg/kg/day of cetrorelix + 2.5 mg/kg/day of epitestosterone as the cetrorelix plus epitestosterone group (CET+EpiT); and (v) 2.5 mg/kg of epitestosterone alone as the epitestosterone group (EpiT). The effect of different treatments were verified on the body and testicular weight and the anogenital distance (AGD). The potential and the membrane resistance of Sertoli cells were recorded by electrophysiological technique intracellular record. The electrophysiological effect of testosterone on membrane of Sertoli cells were evaluated in seminiferous tubules in testes from rats of the all experimental groups. For evaluating the immunoreactivity to the iAR we used the anti-iAR primary polyclonal antibody type in concentration 1: 250. For the negative control technique cuts all treatments incubated with PBS-T. For iAR expression we used the anti-iAR type polyclonal primary antibody at a concentration of 1: 1000 performed by the Western Blot technique. The chemical castration induced a reduction in testicular weight and AGD. The treatment with both epitestosterone and testosterone restored the AGD and the testicular weight. The depolarizing effect in response to topical testosterone application was observed in the control group and in the GnRH antagonist cetrorelix group. Moreover, in the GnRH antagonist cetrorelix replaced with the epitestosterone group, testosterone was not capable of changing the membrane potential. In the group replaced with testosterone, the membrane response to testosterone was smaller also. The treatment with epitestosterone in castrated rats also reduced the expression of the iAR in testes. The immunoreaction of iAR was reduced in the animals treated with epitestosterone. In conclusion, the effect of epitestosterone on genital development in immature rats, namely recovering of AGD, was similar to testosterone. This result suggest that both hormones act through the same pathway on this development parameter, probably by a non-classical mechanism. Additionally, the treatment with the GnRH antagonist plus epitestosterone suppressed the non-classical testosterone response, changing the pattern of testosterone signaling pathway through a membrane mechanism in Sertoli cells.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-05-03T14:16:07Z No. of bitstreams: 1 Marcus Vinicius Dias Falcao.pdf: 1474619 bytes, checksum: 0175beba567d6fd2060ec9dd863c927b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-03T14:16:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcus Vinicius Dias Falcao.pdf: 1474619 bytes, checksum: 0175beba567d6fd2060ec9dd863c927b (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / Brucellosis is an infectious disease with a chronic characteristic caused by the bacteria Brucella spp. The aim of this study was to develop and standardize a Western Blotting technique for use in bovine brucellosis serodiagnosis. Two groups were used: group I with 60 samples of true positive and true negative animals being 30 positive and 30 negative in CFT and group II with 383 field samples being 90 positive and 293 negative in CFT. The analysis using WB technique revealed the molecular weight ≤20 kDa as the most characteristic and reactive area for identification and separation of animals with natural infection from vaccinated. The sensitivity and specificity of WB as compared to AAT were 93% and 99% respectively, and when compared to TFC respectively were 97% and 98%. The WB standardized in this study may be used as confirmatory test, because it is more sensitive and specific with capacity for differentiation between naturally infected and vaccinated animals. / A brucelose é uma doença infectocontagiosa de caráter crônico causada por bactérias do gênero Brucella spp. Objetivou-se desenvolver e padronizar uma técnica de Western Blotting para uso no sorodiagnóstico da brucelose bovina. Dois grupos foram utilizados: o grupo I com 60 amostras de animais verdadeiros positivos e verdadeiros negativos, sendo 30 positivas e 30 negativas no TFC e o grupo II com 383 amostras de amostras de campo, sendo 90 positivas e 293 negativas na TFC. O resultado da análise das amostras no Western Blotting revelou banda com peso molecular ≤20 kDa como sendo a banda mais reativo e propriedade para identificação e separação de animais com infecção natural dos animais vacinados. A sensibilidade e especificidade do WB quando comparadas com o AAT foi, respectivamente, 93% e 99%, e quando comparadas com a TFC foi respectivamente, 97% e 98%. O WB padronizado neste estudo poderá ser empregado teste confirmatório, pois se trata de um teste mais sensível e específico e com capacidade de diferenciação entre animais naturalmente infectados e vacinados.

Orientador: Fábio Rogério / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T07:22:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Assis_CarlosViniciusAlmeidade_M.pdf: 1210366 bytes, checksum: f2d46d6b8c16b1647290224d152e20d8 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A busca por estratégias para o tratamento de doenças neurodegenerativas e neurotraumas tem sido realizada mediante o emprego de moléculas que possam atuar impedindo a morte de células nervosas e/ou estimulando a regeneração axonal e dendrítica. Dentre elas se encontram os fatores neurotróficos e, em especial, o fator neurotrófico ciliar (CNTF), membro da família das neurocinas que promove a sobrevivência de uma variedade de populações de neurônios, além de desempenhar papel importante na resposta do tecido nervoso à lesão. Seu mecanismo de ação se dá através da via Janus Quinase/Proteína Transdutora de Sinal e Ativadora de Transcrição (JAK/STAT), conhecidamente envolvida na expressão de diversos genes implicados na neuroproteção através da fosforilação da STAT3. Outra via de sinalização intracelular também relacionada com mecanismos de neuroproteção e regeneração axonal é aquela dependente da concentração citoplasmática do monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), cuja concentração intracelular também pode ser modificada farmacologicamente através da interferência nos seus processos de síntese e degradação. O cAMP está envolvido em diversos eventos fisiológicos envolvendo o sistema nervoso e sua proteção. Seu principal alvo é a Proteína Quinase A, a qual exerce funções, dentre elas, a de estimular vias de sinalização intracelulares comprometidas com a sobrevivência neuronal e regeneração axonal. A estratégia aplicada no presente estudo consistiu na inibição da degradação de cAMP através de um inibidor de fosfodiesterase tipo IV, Rolipram. Diversas evidências sugerem que existam importantes interações entre a atividade do cAMP e a ação de neurocinas que potencializam os efeitos protetores destas últimas. Tendo isso em vista, investigamos os efeitos da associação do Rolipram e CNTF na proteção de neurônios da medula espinal de ratos neonatos após secção do nervo isquiático. Foi estudado um lote de ratos para investigação a curto prazo (tratamento e sacrifício no mesmo dia) para a investigação das vias de sinalização envolvidas e outro a longo prazo (tratamento por cinco dias) para a investigação morfológica com os grupos CNTF (0,3ug/g), Rolipram (2,0ug/g), CNTF + Rolipram (C+R) (0,3ug/g e 2,0ug/g, respectivamente), PBS e DMSO. Os dois últimos foram agrupados em um grupo denominado CONTROLE para análise proteica. As conseqüências no crescimento dos animais (evolução ponderal) foram mais proeminentes, visto que o grupo C+R cresceu menos que os outros grupos, denotando um efeito deletério já a partir do segundo dia de intervenção (P3) no desenvolvimento dos animais. Os tratamentos rápidos desencadearam um padrão diversificado de resultados. O tratamento com CNTF aumentou a fosforilação de STAT3 (pSTAT3) e a STAT3 total. A proteína pró-apoptótica BAD fosforilada aumentou com C+R, porém sua forma total não sofreu alterações. Já o fator de transcrição proteína ligadora ao elemento responsivo ao cAMP (CREB) e sua forma fosforilada, pCREB, não apresentaram alterações após os diferentes tratamentos. Após o tratamento prolongado não houve diferença entre os grupos no índice de Sobrevivência Neuronal. Não observamos efeito aditivo com tratamento simultâneo de CNTF e Rolipram nas vias relacionadas com a sobrevivência neuronal no presente modelo de lesão nervosa periférica / Abstract: The search for strategies for the treatment of neurodegenerative diseases and neurotraumas has been performed through the use of molecules that may act as neuroprotective agents and avoid the death of neural cells and/or stimulate axonal and dendritic regeneration. Among these strategies, the neurotrophic factors, specially the ciliary neurotrophic factor (CNTF), member of the neurocytokines, have gained interest due to the fact of being capable of promoting the survival of a variety of neurons besides playing an important role in response to nervous injury. The mechanism of action is through Janus Kinase/ Signal Transducer and Activator of Transcription (JAK/STAT), known to be involved in the expression of a variety of genes implicated in neuroprotection by phosphorylation of STAT3. Another intracellular signaling via also related with neuroprotection and axonal regeneration mechanisms is the one dependent on the cytoplasmic concentration of cyclic adenosine monophosphate (cAMP), whose intracellular concentration may also be modified pharmacologically through the interference in the processes of its synthesis and degradation. cAMP has been reported to be involved in several physiological events involving the nervous system and its protection. Its main target is Protein Kinase A (PKA), which exerts functions such as neuronal survival and axonal regeneration. The strategy applied on this work consisted on the inhibition of the breakdown of cAMP through an inhibitor of phosphodiesterase type IV, Rolipram. It has been described important relationship between the activity of cAMP and action of neurocytokines that potentiate the neuroprotective effects of the latter. In the present work we investigated the effects of the association of Rolipram and CNTF on the protection of spinal motoneurons of neonatal rats after transection of sciatic nerve. A set of rats was used to investigate short period treatment (treatment and sacrifice in the same day) in order to analyse intracelullar signaling vias involved and other set to investigate a prolonged treatment (treatment for five days) to make a morphological analysis of the groups CNTF (0,3ug/g), Rolipram (2,0ug/g), CNTF + Rolipram (C+R) (0,3ug/g e 2,0ug/g, respectively), PBS and DMSO. For proteic analysis, the two latter were grouped in one group called CONTROL. C+R group showed failure to thrive, meaning that a deleterious effect occurred as of the second day of intervention (P3). Short period treatments showed different results. Treatment with induced both phosphorylation and total amount of STAT3. The pro-apoptotic protein BAD raised its levels in response to C+R, but the total levels were not affected. On the other hand, cAMP Responsive Element Binding Protein (CREB) and its phosphorilated form, pCREB, showed no alteration after the treatments. In the prolonged investigation there was no difference between the treatments in the Neuronal Survival Index. There was no additive effect after simultaneous treatment with CNTF and Rolipram in neuronal survival in the present model of peripheral nervous injury / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Charles University in Prague Pharmaceutical Faculty in Hradec Králové Department of Pharmacology and Toxicology Student: Anastasiya Shkut Supervisors: Mgr. Jana Mandíková, Virginia Motilva Ph.D. Title of diploma thesis: The role of melatonin in SIRT1 and p-AMPK regulation in HT-29 cell line. Sirituin 1 (SIRT1) is NAD+ dependent deacetylase present in wide range of organisms including mammals. It was found to extend life span in yeasts during calorie restriction (CR) conditions. SIRT1 deacetylates many regulator proteins and thus control metabolic status of cell as well as AMP-activated kinase (AMPK), which is also energy regulator enzyme depending on NAD+ levels in cell. Both of them play roles in cancer and could influence autophagy, although the exact mechanism remains unclear. We focused our study on hormone melatonin, which has anti-inflammatory and anti-cancer effects, to study its influence on human colon cancer cell line HT-29. If it has impact on SIRT1 and AMPK and what is hierarchic relationship between SIRT1 and AMPK. Also we observed its possible influence on autophagy. We used Western blotting (WB) technique and from our results it seems that melatonin has significant effect on SIRT1, which might activate AMPK as well as autophagy. Nevertheless some of results did not have sufficient...