A proteína ligada à vitamina D (VDBP) é a principal responsável pelo transporte dos metabólitos da vitamina D e a sua presença na urina pode indicar lesão tubulointersticial, conforme observado em ratos e humanos. A determinação urinária da proteína ligada ao retinol (RBP), responsável por carrear o retinol do fígado para os tecidos periféricos, por sua vez, está associada à fibrose intersticial dos rins. A albuminúria pode estar relacionada a lesões glomerulares e/ou tubulares (não reabsorção). A proteína de Tamm-Horsfall (THP) normalmente é observada na urina, sendo sintetizada exclusivamente pelas células epiteliais da alça de Henle e do túbulo contornado distal, entretanto quando não detectada, pode indicar lesão nestes segmentos do néfron e/ou diminuição do número de néfrons. Em cães, há poucos estudos sobre as referidas proteínas na urina, especialmente nos casos de doença renal crônica (DRC). A hipótese deste estudo seria de que a avaliação da razão proteína:creatinina urinária (RPC) em cães com DRC per si não forneceria informações suficientes, pois não identificaria os segmentos dos néfrons comprometidos, mas que a determinação de proteínas específicas, pela análise conjunta da eletroforese e do Western blotting, sinalizariam a presença de lesões glomerulares e/ou tubulares, e que a THP poderia estar ausente ou presente em menor intensidade nos estágios avançados da DRC, indicando lesão tubular distal e/ou perda importante do número de néfrons. O presente estudo objetivou avaliar a presença de albumina, VDBP, RBP e THP na urina de cães com DRC, nos estágios 1 ao 4 (IRIS), pela análise conjunta da eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e Western blotting. O total de 49 cães compuseram os grupos: grupo C clinicamente normal (n= 9), grupo E1 (estágio 1; n=10), grupo E2 (estágio 2; n=10), grupo E3 (estágio 3; n=10) e grupo E4 (estágio 4; n=10). Houve o predomínio de bandas de proteínas de baixo peso molecular (PM <60kDa) em todos os grupos de cães com DRC (E1, E2, E3 e E4), e especificamente para o grupo E4 que apresentava média da RPC de 4,37 e, portanto, esperar-se-ia o predomínio de proteínas de alto PM (PM> 60kDa). Neste grupo, além da imunodetecção da albumina, também foi identificada, em grande intensidade, proteínas de baixo PM (VDBP e RBP). No grupo E3 também foram imunodetectadas a VDBP e RBP, com média da RPC de 1,51 e de 3 a 7 bandas de proteínas de baixo PM. Ainda, a imunodetecção da VDBP e RBP foi constatada nos estágios inicias (E1 e E2) da DRC frente a valores da RPC normais (não proteinúricos), sendo este achado considerado como marcador precoce de lesão renal. A VDBP e RBP não foram identificadas em cães clinicamente normais. A menor intensidade de imunodetecção da THP nos estágios mais avançados pode sugerir mau prognóstico. Conclui-se que o valor da RPC per si não foi capaz de indicar a origem da proteinúria, se glomerular e/ou tubular, sendo necessário, portanto, a análise conjunta da eletroforese (PM) e do Western blotting (albumina, VDBP, RBP e THP) e que, assim, permitiu identificar o segmento do néfron comprometido que acarretou na perda ou na diminuição urinária de proteínas. / Vitamin D-binding protein (VDBP) is the main carrier of the Vitamin D metabolites and its presence in urine is associated with the development of tubulointersticial injury, according to previous studies in rats and humans. Retinol-binding protein (RBP) carries retinol from liver to peripheral tissues, and its urinary detection is also associated with tubulointersticial injury. Albuminuria suggests glomerular lesion, but also may indicate tubular dysfunction (impairment of reabsorption). The presence of Tamm-Horsfall protein (THP) is expected in the urine of clinically normal people and animals, because it is synthesized exclusively by the epithelial cells of the distal segment of nephron, and when it is not detected it may indicate distal tubular injury and/or massive nephrons loss. However in dogs, there are few studies about these urinary proteins especially in cases of chronic kidney disease (CKD). The hypothesis of the present study was to investigate that not only urinary protein-to-creatinine ratio (UPC) measurements would be enough to localize properly the injury to a specific nephron site, but also the evaluation of specifics urinary proteins by electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting could provide information regarding to the presence of glomerular and/or tubular injury; in addition, less excretion of THP, or its absence in urine, could be associated with advanced stages of CKD. The aim of the present study was to evaluate albumin, VDBP, RBP e THP in the urine of 40 CKD dogs, on stages 1 to 4 (IRIS), by using of electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting. Forty-nine dogs were subdivided into: C group healthy dogs (n= 9), E1 group (stage 1; n=10), E2 group (stage 2; n=10), E3 group (stage 3; n=10) e E4 group (stage 4; n=10). The predominance of low molecular weight proteins (MW <60kDa) was detected in all CKD groups, mainly in E4 group that the mean of UPC was 4.37, and then it would be expected high MW proteins findings (MW >60 kDa). In fact, in E4 group, albumin was immunodetected, however low molecular weight proteins (VDBP and RBP) were also detected and in high intensity. VDBP and RBP were also observed in E3 group (mean UPC = 1.51) and 3 to 7 bands of low molecular weight were detected. In the early stages of CKD (E1 and E2 groups), VDBP and RBP were also identified but UPC values were normal (non-proteinuric), which may suggest the role of these proteins as an early marker of renal injury. VDBP and RBP were not detected in healthy dogs. THP was observed in less intensity in the advanced stages of CDK that may suggest bad prognosis. In conclusion, UPC measurement per se was not able to indicate adequately the injury to a specific nephron site (e.g. glomerular and/or tubular), and therefore the additional information of electrophoresis (MW) and Western blotting (VDBP, RBP and THP) testing could allow the identification of the nephron site injured that caused loss (proteinuria) or decrease in urinary proteins.

A doença de Chagas ainda é causa importante da morte de milhares de pessoas nos países em desenvolvimento, sendo de grande importância a identificação e confirmação de indivíduos chagásicos, principalmente mulheres e crianças. Neste trabalho avaliamos o valor clínico dos resultados do teste sorológico TESAcruzi como confirmatório de infecção chagásica em amostras de sangue colhidas em papel de filtro . Foram estudadas 8.788 amostras de sangue coletadas em papel filtro (tipo Whatman nº4) de crianças de 0 a 5 anos de idade incompletos de zonas rurais de 13 estados do Brasil, enviadas ao Laboratório de Soroepidemiologia e Imunobiologia do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo pelo Laboratório de Chagas do Hospital das Clínicas-UFG, para confirmação e controle de qualidade da infecção chagásica. Foram utilizados os testes sorológicos ELISA - BIOELISACRUZI, IFI - IMUNOCRUZI e WB - TESAcruzi (BioMérieux-Brasil). Das 8.788 amostras de sangue analisadas, 166 (1,9%) foram reagentes por ELISA (cut off 0,3) e 313 (3,6%) por IFI a partir de 1/40. Todas as amostras reagentes ou duvidosas foram ensaiadas por TESAcruzi para confirmação dos resultados. Foram reagentes 77 eluatos (0,9%). Considerando que o TESAcruzi apresenta 100% de sensibilidade e 99,6% de especificidade, os valores preditivos positivos e negativos obtidos, conferem aos resultados um alto valor clínico para a confirmação de resultados positivos, negativos e inconclusivos na sorologia da doença de Chagas. A introdução do TESAcruzi na sorologia da doença de Chagas é uma ferramenta importante quando se deseja confirmar casos com sorologia duvidosa ou inconclusiva. / Identifying and confirming Chagas disease patients is a goal to be achieved at this moment, just when many countries from Latin America had announced its control an/or eradication. In this project we studied the TESAcruzi as confirmatory test for Chagas Disease diagnosis using serum samples collected from children (0-5 years old) living in different states of Brazil and selected by statistics criteria. The study is part of the seroepidemiological survey that is occurring in Brazil looking for ongenital or acquired Chagas disease. Blood samples collected by fingerprint in nº4 Whatman filter paper (10% of total and all reagents and inconclusive samples) were sent to our laboratory by central laboratory located in Goiania - Goias to confirm previous results. For this we used traditional commercial reagents, IgG indirect immunofluorescence - IgG-IFI, enzyme immunoassay - IgG - ELISA and introduced TESAcruzi, western blotting reagent, recently registered by BioMerieux S.A. From 8.788 samples 166 (1.9%) were reagents in IgG-ELISA (C.O = 0.300) and 313 (3.64%) by IgG IFI (C.O 1/40). From these, 77 (0.9%) were reagents in TESAcruzi. Considering the predictive values of TESAcruzi (NPV = 100% and PPV = 99.5%) the results obtained had high clinical value to define the Chagasic patients. TESAcruzi reagent seems to be an important tool for Chagas disease diagnosis when it is necessary to confirm reagents or inconclusive results.

Este estudo teve como objetivo investigar incialmente o efeito do pHf na qualidade da carne, nas concentrações de HSP27 e HSP70, bem como no perfil proteômico da carne (Longissimus thoracis) de bovinos cruzados - 1/2 (Simental Sul Africano x Nelore) de forma a contribuir para a predição de biomarcadores que poderão ser agregados em programas de melhoramento genético. Foram avaliados 415 bovinos (180 fêmeas e 235 machos imunocastrados) terminados em confinamento. As carcaças foram classificadas de acordo com pHf, mensurados 48 horas após o abate, em dois grupos: normal (pHf ≤ 5,80) e intermediário (pHf = 5,81 - 6,19). Os parâmetros físico-químicos pH, cor (L*, a* e b*), perda de água por cocção (PAC, %) e força de cisalhamento (FC, kg), foram mensurados para avaliar a qualidade da carne em dois tempos de maturação (1 e 14 dias). Para a quantificação de HSP27 e HSP70 foram selecionadas 38 amostras em função dos grupos de pHf, dentro de cada tempo de maturação, totalizando 76 amostras. Para a realização das análises proteômicas foram selecionadas três amostras de cada grupo de pHf nos dois tempos de maturação, totalizando doze amostras. Observou-se interação (p<0,05) entre os grupos de pHf e os tempos de maturação para a cor e FC. A concentração de HSP27 foi maior (p<0,05) em pHf intermediário e com 1 de maturação, para a HSP70 só foi possível observar maior concentração (p<0,05) aos 14 dias de maturação, as correlações indicam que as HSPs modulam a qualidade da carne. Foram identificadas 13 proteínas diferencialmente expressas (p<0,05) envolvidas com funções metabólicas (triosefosfato isomerase - TPI1; fosfoglicerato mutase 2 - PGAM2; malato desidrogenase - MDH1; piruvato quinase - PKM2; e adenalato quinase isoenzima 1 - AK1), estrutural (troponina I tipo 2 - TTNI2; tropomiosina cadeia beta - TPM2; troponina C tipo 2 - TNNC2; e cofilina 2 - CFL2) e defesa em resposta ao estresse (proteína deglicase DJ-1 - PARK7; αβ-cristalina - CRYAB; proteína do choque térmico 27 - HSPB1; e peroxirredoxina 1 - PRDX1). As correlações demonstraram que essas proteínas estão envolvidas na determinação do pHf e dos demais atributos da qualidade da carne. A bioinformática permitiu observar que essas proteínas estão envolvidas nas três categorias de ontologia gênica, sendo 18 termos de componentes celulares, 1 termo de função molecular e 61 termos dos processos biológicos, foram identificadas também 6 vias metabólicas. A proteína MDH1, esteve associada a mecanismos de produção de energia, confirmando o potencial desta como um biomarcador para a determinação do pHf assim como para a cor da carne, enquanto que a TPI1 foi relacionada somente no estabelecimento do pHf. Outras proteínas como a PKM2, com função metabólica, e a PARK7, com função protetora, estiveram associadas aos atributos maciez e cor da carne, respectivamente. Os resultados obtidos são de grande relevância no âmbito das ciências da carne e do melhoramento genético animal, por permitir a identificação de possíveis biomarcadores que poderão ser utilizados na seleção animal. / The objective of this study was to investigate the effect of pHf on meat quality, on the concentrations of HSP27 and HSP70, as well as on the proteomic profile in beef (Longissimus thoracis) of crossbreed cattle - 1/2 (South African Simmental x Nellore) - in order to explore the contribute to the prediction of biomarkers that can be added to the process of animal selection in breeding programs. Were evaluated 415 cattle (180 females and 235 immunocastrated males) feedlot-finished. Carcasses were classified according to pHu, measured 48 hours after slaughter, in two groups: normal (pHu ≤ 5.80) and intermediate (pHu = 5.81 - 6.19). The physical-chemical parameters pH, color values (L *, a * and b *), cooking loss (CL,%) and shear force (SF, kg) were measured to evaluate the meat quality in two aging times (1 and 14 days). For quantification of HSP27 and HSP70, 38 samples were selected according to the pHu groups, and aging time, totaling 76 samples. To perform the proteomic analysis were selected three samples from each group and aging time, totaling twelve samples. Color and SF meat quality attributes showed interaction (p<0.05) between pHu groups and aging times. The concentration of HSP27 was higher (p<0.05) at intermediate pHu and at 1 day of aging. It was only possible to observe a higher concentration (p<0.05) for HSP70 at 14 days of aging. Correlations analysis indicate that HSPs modulate the quality of meat. Thirteen differentially expressed proteins (p<0.05) were identified as involved with metabolic (triosephosphate isomerase - TPI, phosphoglycerate mutase 2 - PGAM2; malate dehydrogenase, cytoplasmic - MDH1; pyruvate kinase - PKM2; and adenylate kinase isoenzyme 1- AK1), structural (troponin I type 2 - TTNI2; tropomyosin beta chain - TPM2; troponin C type 2 - TNNC2; and cofilin 2 - CFL2) and defense in response to stress functions (protein deglycase DJ-1- PARK7; αβ-cristallin - CRYAB; heat shock protein 27 - HSPB1; and peroxiredoxin 1 - PRDX1). Correlations analysis showed that these proteins are involved in the determination of pHu and other attributes of meat quality. Using bioinformatics it was possible to observe that these proteins are involved in three gene ontology categories, which were 18 cellular components terms, 1 molecular function term and 61 biological processes terms. Other six metabolic pathways have also been identified. The MDH1 protein was associated with energy production mechanisms, confirming its potential as a biomarker for the determination of pHu as well as meat color, while TPI was related to the establishment of pHu only. Other proteins such as PKM2, with metabolic function, and PARK7, with protective function, were associated with the attributes of meat tenderness and color, respectively. The obtained results are of great relevance in the field of meat science and animal breeding genetic, it allows the identification of biomarkers that can be used in animal selection.

Diversas alterações genéticas estão associadas à patogênese do carcinoma epidermoide (CE), a neoplasia maligna mais comum de cabeça e pescoço. Algumas dessas alterações comprometem proteínas pertencentes à via de sinalização do AKT, envolvida em diferentes fenômenos celulares. Este projeto teve como objetivo estudar a expressão da proteína pAKT em linhagens celulares de carcinomas epidermoides de cabeça e pescoço, de forma a verificar possíveis alterações na expressão dessas moléculas em células de CE tratadas com Curcumina e Celecoxib. Foram utilizadas duas linhagens celulares de CE de cabeça e pescoço e uma linhagem de queratinócitos que foram divididas em quatro grupos: a. grupo controle não tratado; b. células tratadas com Curcumina, c. células tratadas com Celecoxib d. células tratadas com Curcumina e Celecoxib. A proliferação celular foi monitorada através do teste de viabilidade celular. A análise da expressão da proteína foi realizada através da técnica do Western Blot. Desta forma, foi possível entender em maior profundidade a ação do Celecoxib, da Curcumina e sua associação na via do AKT em carcinomas epidermoides de cabeça e pescoço. A associação de Curcumina com Celecoxib foi o tratamento que apresentou melhores resultados na redução da viabilidade celular. A linhagem SCC9 não apresentou expressão de pAKT após o tratamento com Curcumina e com a associação desta com o Celecoxib. A linhagem HaCat apresentou maior estabilidade na expressão de pAKT nos dois tempos de tratamento no grupo tratado com a associação das substâncias. A combinaçãoo da Curcumina com o Celecoxib mostrou resultados satisfatórios e promissores. / Several genetic changes are associated with the squamous cell carcinoma\'s (SCC) pathogenesis, the most common malignant head and neck tumor. Some of these changes compromise proteins that belong to the AKT signaling pathway, involved in different cellular\'s phenomena. The aim of this project was to study the expression of pAKT in head and neck SCC cell lines in order to investigate possible alterations in these molecules\'s expression in cells treated with Curcumin and Celecoxib. Two head and neck SCC cell lines and a line of keratinocytes was divided into four groups: a. control group: untreated; b. cells treated with Curcumin, c. cells treated with Celecoxib d. cells treated with Curcumin and Celecoxib. Cell proliferation was monitored by cell viability test. Analysis of the protein\'s expression was performed using the Western blot technique. Then was possible to understand the action of Curcumin, Celecoxib and its association in the AKT pathway in head and neck SCC. Curcumin\'s association with Celecoxib was the treatment that showed best results in cell viability reduction. The SCC9 cell line not presented pAKT expression after the treatment with Curcumin and its association with Celecoxib. The cell line HaCat showed greater stability in pAkt expression during the treatment period with the association of substances. The association of Curcumin and Celecoxib showed satisfactory and promising results.

Apesar das recomendações da Organização Mundial da Saúde, na reunião ministerial realizada em Amsterdam, Holanda em 2000, a tuberculose continua em ritmo crescente, atingindo principalmente os países em desenvolvimento e pessoas com o sistema imunológico comprometido, principalmente as infectadas pelo vírus da imunodeficiência adquirida. Os métodos utilizados no diagnóstico continuam os mesmos utilizados por muitos anos, cujas limitações impedem a ação rápida dos programas de saúde que buscam interromper a cadeia de transmissão da doença. Continuando uma linha de pesquisa do Laboratório de Soroepidemiologia e Imunobiologia do IMTSP, utilizando o método do Western Blotting, procuramos neste trabalho ampliar os conhecimentos da resposta imunológica de anticorpos em pacientes com tuberculose pulmonar, clinica e laboratorialmente definida, avaliando a participação das imunoglobulinas IgG, IgA e IgM, subclasses de IgG (IgG1 e IgG3) e a avidez da imunoglobulina IgG em amostras de soros colhidas no início e no final do tratamento. Nossos resultados mostraram que o melhor marcador imunológico foi a imunoglobulina IgG por apresentar melhor desempenho diagnóstico quando comparada com os resultados dos métodos microbiológicos e de dosagem de interferon gama, Quantiferon TB Gold. As frações protéicas que apresentaram melhor desempenho diagnóstico foram as de 38 e 30 KDa / Despite the recommendations of the World Health Organization, during the Ministerial meeting held in Amsterdam, Holland in 2000, tuberculosis continues at an important increasing rate, affecting mostly developing countries and people with severe compromised immune systems, especially those infected with human acquired immunodeficiency virus. The methods used for diagnosis are the same used for many years, whose limitations prevent the rapid action of countries health programs that seek to stop the chain of disease transmission. Continuing a line of research of the Laboratory of Seroepidemiology and Immunobiology of IMTSP using the method of Western blotting, in this study we tried to broaden the knowledge of the immune response of antibodies in patients with pulmonary tuberculosis, clinical and laboratory defined by evaluating the participation of IgG, IgA and IgM, IgG subclasses (IgG1 and IgG3) and immunoglobulin IgG avidity in serum samples collected in the beginning and end of treatment. Our results showed that the immunoglobulin IgG was best immunological marker when compared with the results of microbiological methods and determination of interferon gamma, QuantiFERON TB Gold. The proteins fractions that showed better diagnosis performance were 38 and 30 KDa

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La toxocarosis humana es una de las helmintiasis zoonóticas más reportada en el mundo. Dependiendo del órgano afectado, pueden distinguirse varias manifestaciones clínicas: toxocarosis sistémica, que afecta a la mayoría de los órganos; toxocarosis ocular; toxocarosis asintomática y toxocarosis encubierta. Esto hace muy complicado el diagnóstico de esta enfermedad. El propósito del presente estudio es contribuir al conocimiento de la toxocarosis humana en Chile, especialmente en el diagnóstico, mediante el reconocimiento de antígenos específicos para las diferentes manifestaciones clínicas de la enfermedad. Se usó la técnica de western blot y antígenos, tanto larvales somáticos (LS) como excretados-secretados (ES) de larvas de Toxocara canis, enfrentados a anticuerpos IgA e IgG. Los resultados muestran que existen antígenos definidos por su peso molecular (PM) que están presentes en ambos extractos antigénicos y que son reconocidos por las dos clases de inmunoglobulinas (27 y 20 kDa). El antígeno de 36 kDa presente en ambos extractos antigénicos y que sólo es reconocido por IgG. Otros antígenos sólo están presentes en LS (65 y 81 kDa), aunque también están presentes en otras parasitosis; o en ES (48 y 40 kDa). Algunos antígenos solamente fueron detectados cuando se utilizó un determinado extracto (LS o ES) con una clase de anticuerpos (101, 52, 45 y 15 kDa). Al seleccionar un antígeno específico en base a su PM, para cada una de las manifestaciones de toxocarosis humana, se observó que el mayor porcentaje de detección se obtuvo en la manifestación asintomática, con el antígeno de 40 kDa, en el sistema ES/IgA. También se analizó la presencia de antígenos específicos más frecuentes en una o dos manifestaciones de toxocarosis humana, determinándose paneles de antígenos específicos. Cuando se analizaron las 24 muestras de sueros de pacientes con otras parasitosis y negativas para toxocarosis humana, se observó reconocimiento cruzado de antígenos principalmente de PM superior a 50 kDa. Esto concuerda con lo reportado en literatura por otros autores y avala el uso de la técnica de western blot que permite diferenciar dichos antígenos. Se determinó que la correspondencia unívoca entre un determinado antígeno o panel de antígenos con una o dos manifestaciones clínicas de toxocarosis humana fluctúa entre 65% y 84%. Sin embargo, el hecho de encontrar antígenos específicos para algunas de las manifestaciones clínicas abre la posibilidad de optimizar las técnicas y utilizar antígenos purificados para maximizar la detección de tales antígenos / Financiamiento: Proyecto DID TNAC 24-02/02

Orientador: Henrique Nunes de Oliveira / Coorientador: Luis Artur Loyola Chardulo / Banca: Saulo da luz e Silva / Banca: Josineudson Augusto II de Vasconcelos Silva / Banca: Humberto Tonhati / Banca: Fernando Sebastian Baldi Rey / Resumo: A atuação das enzimas proteolíticas durante o post-mortem é um dos principais fatores que determinam a qualidade da carne, sendo as enzimas calpaína e calpastatina uma das principais atuantes neste processo. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre a expressão gênica dos genes CAPN1, CAPN2 e CAST, a quantificação das enzimas µ-calpaína, m-calpaína e calpastatina, dentro de grupos contrastantes para maciez e crescimento animal. Foram utilizados dados de 90 animais machos não castrados da raça Nelore, com idade aproximada de 24 meses, permanecendo em confinamento por 95 dias. Após o abate foram colhidas amostras do músculo Longissimus thoracis entre a 9ª e 13ª costelas, da meia-carcaça esquerda. As amostras coletadas foram utilizadas para medir a área de olho de lombo (AOL), espessura de gordura subcutânea (EGS), índice de marmorização (IM), perdas por cozimento, coloração instrumental da carne e força de cisalhamento (FC). A partir do restante da carne, foram coletadas alíquotas para a realização das análises de índice de fragmentação miofibrilar (MFI) e lipídeos totais (LT). Foram coletadas alíquotas para a análise da expressão gênica e quantificação das enzimas. Os dados de força de cisalhamento foram utilizados como critério para a separação em carne macia e dura. Também foram utilizadas o ganho de peso para a separação quanto ao crescimento animal. Os seguintes grupos (n=10) foram formados: Leve, Pesado, Duro e Macio. As análises estatísticas foram realizadas ut... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The role of proteolytic enzymes during the post-mortem is one of the main factors that determine the quality of the meat, and the enzymes calpain and calpastatin are one of the main factors in this process. The aim of this study was to evaluate the gene expression of the genes CAPN1, CAPN2 and CAST, and quantify the enzymes μ-calpain, m-calpain and calpastatin within contrasting groups animal growth, and thougness. 90 animals data were used uncastrated male Nellore, aged approximately 24 months remaining in confinement for 95 days. After slaughter were harvested Longissimus muscle samples thoracis between the 9th and 13th ribs, the left half-carcase. The samples were used to measure the ribeye area (REA), subcutaneous fat thickness (SFT), marbling index (MI), cooking loss, instrumental color of the meat and shear force (SF). From the rest of the meat, aliquots were collected to perform the myofibrillar fragmentation index analysis (MFI) and total lipids (TL). Were collected aliquots for the analysis of gene expression and quantification of enzymes. The data of shear force were used as criteria for the separation of tender and tough meat. The characteristics of weight gain for the separation on the animal growth were also used. The following groups (n=10) were formed: lightweight, Heavy, tough meat and tender meat. Statistical analyzes were performed using the GLM and MIXED procedure of Statistical Analysis System program. In this study there was no difference in the expressio... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Liu , Huan. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2011. / Includes bibliographical references (leaves 43-45). / Abstracts in English and Chinese. / Abstract --- p.i / 摘要 --- p.iii / Acknowledgement --- p.iv / Table of contents --- p.vi / Chapter Chapter 1 --- Introduction --- p.1 / Chapter 1.1 --- Gel electrophoresis of proteins --- p.1 / Chapter 1.1.1 --- Principles of gel electrophoresis --- p.1 / Chapter 1.1.2 --- Polyacrylamide gel --- p.3 / Chapter 1.1.3 --- Buffer systems --- p.5 / Chapter 1.1.4 --- Capillary electrophoresis --- p.6 / Chapter 1.2 --- Methods to transfer proteins from gel to membrane --- p.7 / Chapter 1.2.1 --- Simple diffusion --- p.8 / Chapter 1.2.2 --- Ultrasound transfer --- p.8 / Chapter 1.2.3 --- Tank transfer --- p.9 / Chapter 1.2.4 --- Semidry transfer --- p.9 / Chapter 1.2.5 --- Transfer efficiency improvements --- p.10 / Chapter 1.3 --- Visualizing immunoblots --- p.11 / Chapter 1.3.1 --- Membrane staining --- p.11 / Chapter 1.3.2 --- Radiometric detection in blotting --- p.12 / Chapter 1.3.3 --- Bioluminescence-enhanced detection --- p.13 / Chapter 1.3.4 --- Chemiluminescence-enhanced detection --- p.14 / Chapter 1.4 --- Miniaturized electrophoresis and blotting methods --- p.15 / Chapter 1.5 --- Objective of the project --- p.18 / Chapter Chapter 2 --- Dip-pen gel electrophoresis in capillaries --- p.20 / Chapter 2.1 --- Introduction --- p.20 / Chapter 2.2 --- Experimental section --- p.21 / Chapter 2.2.1 --- Materials and reagents --- p.21 / Chapter 2.2.2 --- PA gel fabrication in capillary --- p.22 / Chapter 2.2.3 --- Setup for electrophoresis in capillary --- p.23 / Chapter 2.3 --- Results and discussion --- p.24 / Chapter 2.3.1 --- PA gel polymerization quality at tip --- p.24 / Chapter 2.3.2 --- Separation efficiency in capillary --- p.25 / Chapter 2.4 --- Conclusions --- p.27 / Chapter Chapter 3 --- Western blotting by dip-pen electrophoresis --- p.28 / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.28 / Chapter 3.2 --- Experimental section --- p.30 / Chapter 3.2.1 --- Materials and reagents --- p.30 / Chapter 3.2.2 --- Protein sample preparation --- p.31 / Chapter 3.2.3 --- Dip-pen electrophoresis based Western blot --- p.31 / Chapter 3.2.4 --- Detection on membrane --- p.32 / Chapter 3.3 --- Results and discussion --- p.33 / Chapter 3.3.1 --- Separation performance on nitrocellulose membrane --- p.33 / Chapter 3.3.2 --- Comparison among different %T PA gel --- p.34 / Chapter 3.3.3 --- SDS-protein complexes capture and immunoblotting --- p.38 / Chapter 3.4 --- Conclusions --- p.39 / Chapter Chapter 4 --- Conclusions --- p.40 / Chapter 4.1 --- Summary --- p.40 / Chapter 4.2 --- Future perspective --- p.41 / References --- p.43

Many of today’s methods for the detection of biomolecules suffer from a high limit ofdetection due to poor signal generation upon recognition of target. By applying andoptimizing proximity ligation assay (PLA) in Western blotting (WB), the limit of detectionhas been lowered down to the picomolar range. In this report I have optimized the differentparameters that affect the signal generation and explored possibilities to increase the ease ofuse, by merging protocol steps and performing signal generating reactions at roomtemperature.

The glutathione-S-transferases (GSTs) (EC.2.5.1.18) are enzymes that participate in cellular detoxification of endogenous as well as foreign electrophilic compounds, function in the cellular detoxification systems and are evolved to protect cells against reactive oxygen metabolites by conjugating the reactive molecules to the nucleophile scavenging tripeptide glutathione (GSH, &amp / #61543 / -glu-cys-gly). The GSTs are found in all eukaryotes and prokaryotic systems, in the cytoplasm, on the microsomes, and in the mitochondria. Cytosolic GSTs have been grouped into seven distinct classes as: alpha (&amp / #61537 / ), mu (&amp / #61549 / ), pi (&amp / #61552 / ), sigma (&amp / #61555 / ), omega, theta (&amp / #61553 / ) and zeta (&amp / #61540 / ). In comparison with other GSTs, class theta enzymes have proven difficult to isolate and characterize. Two distinct theta GSTs have been identified in man, GSTT1-1 and GSTT2-2 three in the rat rGST1-1, rGSTT2-2 and 13-13 and one in the mouse. this study, a class theta GST (GSTT2-2), with high activity towards 1-MS was isolated and purified from bovine liver in 3% yield with a purification factor of 3-fold. The purification protocol included a sequential DEAE cellulose anion exchanger liquid chromatography column, S-hexylglutathione agarose affinity column, dye binding orange A and chromatofocusing columns. The enzyme activity and protein content decreased rapidly after the last step of purification. The purified GSTT2-2 showed significant activity only towards 1-MS as 77 nmole/min/mg. The GSTT2-2 purified from bovine liver had a molecular weigth (Mr) value of about 28,200 which was also confirmed by Western Blott Analysis. The purified farctions of GSTT2-2 with other kolon farctions were tested with anti GSTT2-2, antiGST alfa, antiGST mu and antiGST pi antibodies. The enzyme activities towards CDNB, 4-nitrobenzylchloride (NBC) and 1-menapthyl sulfate were measured as described by Habig and Jacoby.