Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Les cellules épithéliales de l'intestin possèdent une membrane plasmique spécialisée, la bordure en brosse, qui est constituée de protubérances en forme de doigts appelées microvillosités. Chaque microvillosité est composée d'un faisceau de filaments d'actine et d'un réseau en hélice de molécules de myosine I de la bordure en brosse (BBMI) formant des liens entre la membrane plasmique et les filaments d'actine. Lors de l'assemblage de la bordure en brosse, il se produit des phénomènes hautement dynamiques. En particulier, le nombre et la taille des microvillosités augmentent durant la dernière étape de différenciation des entérocytes adultes, comme au cours de la phase finale de l'embryongenèse. Le renouvellement rapide des protéines membranaires et du cytosquelette dans les entérocytes matures suggère également que des processus dynamiques ont lieu pour permettre à ces cellules de conserver leur morphologie. La dynamique des microvillosités pourrait être due à la polymérisation de l'actine qui est suffisante pour assurer la propulsion des bactéries, par exemple. Alternativement, BBMI pourrait être responsable de cette dynamique, soit en générant une force comme proposé par Sheetz pour l'extension des cônes de croissance des filopodes, soit en acheminant des composants membranaires au pôle apical de la cellule. Afin d'élucider la dynamique de BBMI et de l'actine dans la bordure en brosse des entérocytes, nous avons mis au point un instrument permettant la mesure de la mobilité tridimensionnelle des protéines dans des cellules vivantes en combinant l'imagerie de cellules vivantes en microscopie à deux photons avec la technique de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching). Nos résultats montrent que BBMI et l'actine sont mobiles, mais avec une dynamique différente. De plus, nous avons montré, pour la première fois dans des cellules vivantes, que BBMI a une activité motrice dans les microvillosités.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / L'interaction moléculaire de la cyclosporine A (CsA) avec ses deux cibles pharmacologiques principales, la P-glycoprotéine (P-gp) et la cyclophiline A (CypA), a été examinée au cours de cette étude. Dans une première approche, nous avons évalué l'efficacité avec laquelle la CsA et ses différents analogues interagissent avec la P-gp par deux méthodes. La première méthode utilisée consiste à mesurer l'activité ATPasique de la P-gp en présence de la CsA et de ses analogues. La P-gp a été solubilisée par une extraction séquentielle au CHAPS à partir des membranes des cellules d'ovaires d'hamster chinois résistantes à la colchicine (CHRC5). Ensuite, l'activité ATPasique de la P-gp solubilisée a été mesurée en absence ou en présence de la CsA et de ses analogues par une méthode continue où on mesure le taux d'oxydation de NADH en fonction du temps. La deuxième méthode utilisée consiste à mesurer l'accumulation de la rhodamine 123 à l'intérieur des cellules CHRC5 en présence de la CsA et de ses analogues. L'activité ATPasique de la P-gp a été inhibée par la CsA, par ses analogues et par ses métabolites à des concentrations de l'ordre du nM. Les métabolites de la CsA (AM1C, AM1, AM1C9 et AM9) ainsi que les métabolites de la CsG (GM4N, GM1 et GM9) causent une inhibition similaire de l'activité ATPasique de la P-gp. Parmi les analogues de la CsA étudiés, le PSC-833, une molécule non immunosuppressive, a été le meilleur inhibiteur de l'activité ATPasique de la P-gp. Le peptolide 280-446, un peptide cyclique non apparenté, a été presqu'aussi efficace que le PSC-833. Ces résultats révèlent que l'interaction des analogues de la CsA avec la P-gp n'est pas en corrélation avec leur activité immunosuppressive et que les modifications de la CsA en position 1 et 2 sont critiques pour leur interaction avec la P-gp. Dans une deuxième approche, nous avons caractérisé la CypA qui semble être présente dans les membranes à bordure en brosse (MBB) préparées à partir du cortex rénal de rat. Nous avons tenté de caractériser la nature de son attachement membranaire et de déterminer la quantité de la CypA dans les MBB. Nous avons également étudié les conditions où la CypA membranaire est relarguée, ainsi que son interaction avec la CsA. La CypA semble se trouver dans les MBB et dans la fraction soluble à une concentration de 4,9 et 3,6 g/mg de protéines, respectivement. Nous avons observé une extraction complète de la CypA des MBB par le Na2CO3 et par le CHAPS mais non par le NaC1, indiquant son attachement membranaire par des interactions hydrophobes. Nous avons aussi tenté de vérifier l'effet de différentes substances sur le relargage de la CypA des MBB. Ainsi, la CsA et le P-mercaptoéthanol n'ont pas entraîné un relargage de la CypA des MBB in vitro. Par contre, le substrat pour mesurer l'activité de peptidyle prolyle cis trans isomérase (PPIase) de la CypA, le peptide succinyl-alanine-alanine-cis-proline-phényl-pnitroanilide, cause un relargage significatif de la CypA associée aux MBB. Le photomarquage de la CypA relarguée et de la CypA qui reste membranaire suite à une centrifugation par un analogue photoactivable de la CsA (Diazérine-CsA) (Dz-CsA), démontre que la CypA relarguée est photomarquée plus efficacement que la CypA qui reste attachée aux MBB. La présence de la CypA au niveau des MBB, nous a incité à vérifier si la CypA recombinante pourrait se transférer dans les MBB in vitro. Ainsi, lorsque nous avons incubé la CypA recombinante en présence de MBB, elle se transfère à 40 % dans les MBB. Suite à cette observation, nous avons analysé l'effet de la formation des complexes CypA recombinante-CsA et CypA recombinante-CsA-Calcineurine sur la translocation de la CypA recombinante dans les MBB. Nos résultats révèlent que la translocation de la CypA recombinante dans les MBB diminue de 9 et de 38 %, lorsqu'elle se trouve sous une forme complexée avec la CsA ou avec la CsA/Calcineurine, respectivement. Afin de vérifier si la translocation de la CypA recombinante dans les MBB se fait par l'interaction avec une ou plusieurs autre(s) protéine(s) membranaire(s), nous avons procédé à la translocation de la CypA recombinante dans les MBB chauffées, dans les MBB prétraitées avec des concentrations croissantes de trypsine et dans des protéoliposomes préparés à partir des MBB. Nos résultats démontrent que le chauffage des MBB ne diminue pas la translocation de la CypA recombinante, et que la CypA recombinante se transfère au même taux dans les MBB que dans les protéoliposomes préparés à partir des MBB. Par contre, la translocation de la CypA recombinante diminue considérablement, lorsque les MBB sont prétraitées avec des concentrations croissantes de trypsine. Le relargage de la CypA associée aux MBB, ainsi que la translocation de la CypA recombinante dans les MBB a lieu de façon maximale à un pH proche du pH physiologique, soit aux pH 7 et 8, suggérant un équilibre dynamique entre la CypA cytosolique et la CypA membranaire dans les conditions physiologiques. Enfin, nous avons étudié l'effet des différents métaux divalents sur le photomarquage de la CypA des MBB, de la fraction soluble et de la CypA recombinante par un analogue photoactivable de la CsA (Dz-CsA). Parmi les métaux divalents étudiés (Mg2+, Mn2+, Ca2+, Zn2+ et Cis-Pt2+), seulement le Zn2+ a démontré une inhibition significative du photomarquage de la CypA des MBB, de la fraction soluble et de la CypA recombinante par la Dz-CsA. Cette inhibition causée par le Zn2+, est dépendante de la concentration et est de l'ordre du pM. Les agents réducteurs, le Hg2+ et le 13-mercaptoéthano1, ont aussi diminué le photomarquage de la CypA des MBB et de la fraction soluble par la Dz-CsA, tandis que la CypA recombinante, prétraitée avec le Hg2+ et le 13-mercaptoéthano1, démontre une augmentation du photomarquage par la Dz-CsA.

Le myo-inositol (MI) est un soluté organique impliqué dans diverses fonctions physiologiques de la cellule dont la signalisation cellulaire. Il est également un osmolyte compatible reconnu. Trois co-transporteurs de type actif secondaire responsables de son absorption ont été identifiés. Deux d’entre eux sont couplés au transport du sodium (SMIT1 et SMIT2) et le troisième est couplé au transport de protons (HMIT). L’objectif de cette étude a été la caractérisation du transport du MI par SMIT2 dans des membranes en bordure en brosse (BBMv) issues du rein de lapin et de l’intestin de rat ainsi qu’après expression dans les ovocytes de Xenopus laevis. La quantification de l’ARNm de SMIT1 et de SMIT2 dans le rein nous a appris que SMIT1 est majoritairement présent dans la médullaire alors que SMIT2 est principalement localisé dans le cortex. Ces résultats ont été confirmés par immunobuvardage en utilisant un anticorps dirigé contre SMIT2. Grâce à l’inhibition sélective de SMIT1 par le L-Fucose et de SMIT2 par le D-chiro-inositol (DCI), nous avons démontré que SMIT2 semble le seul responsable du transport luminal de MI dans le tubule contourné proximal avec un Km de 57 ± 14 µM. Pour ce qui est de l’intestin, des études de transport de MI radioactif ont démontré une absence de transport de MI chez le lapin alors que l’intestin de rat présente un transport de MI très actif. Une quantification par qRT-PCR nous a permis de constater que l’intestin de lapin ne semble pas posséder les transporteurs de MI nécessaires. Comme pour le rein, SMIT2 semble le seul transporteur de MI présent au niveau du pôle apical des entérocytes intestinaux chez le rat. Il est chargé du prélèvement du MI de l'alimentation avec un Km de 150 ± 40 µM. Les analyses fonctionnelles exécutées sur SMIT2 de rat en électrophysiologie après expression dans les ovocytes de Xenopus laevis donnent sensiblement les mêmes résultats que pour les BBMv de rein de lapin et d’intestin de rat. Dans les ovocytes, SMIT2 présente une grande affinité pour le MI (270 ± 19 µM) et le DCI (310 ± 60 µM) et aucune affinité pour le L-fucose. Il est ii également très sensible à la phlorizine (16 ± 7 µM). Une seule exception persiste : la constante d’affinité pour le glucose dans les BBMv d’intestin de rat est 40 fois plus petite que celle observée sur les ovocytes de Xenopus laevis. Nous avons également testé la capacité de certains transporteurs de sucre présents à la surface des membranes apicales des entérocytes à prélever le MI. Vu que l'inhibition de ces transporteurs (SGLT1 et GLUT5) ne changeait rien au taux de MI radioactif transporté, nous en avons conclu qu'ils ne sont pas impliqués dans son transport. Finalement, l’efflux de MI à partir du pôle basolatéral des entérocytes n’est pas effectué par GLUT2 puisque ce dernier lorsqu'il est exprimé dans des ovocytes, est incapable de transporter le MI. / Myo-inositol (MI) is an organic solute involved in various aspects of cell physiology, including cell signaling. It is also known as a compatible osmolyte. Three secondary active MI cotransporters have been identified; two are Na+- coupled (SMIT1 and SMIT2) and one is H+-coupled (HMIT). The main aim of this study was to characterize MI uptake throught SMIT2 as expressed in epithelial cells and in Xenopus laevis oocytes. In order to achieve the characterization of this transport system, we used purified brush border membrane vesicles (BBMv) isolated from rabbit kidney and rat intestine. We first performed a quantification of mRNA levels in rabbit kidney using real time PCR for both SMIT1 and SMIT2. We found that SMIT1 is mainly expressed in the renal medulla while SMIT2 is mainly localized in the renal cortex. This result was confirmed on Western blots using an antibody raised against SMIT2. Through inhibition studies using selective substrates for SMIT1 (inhibited by L-fucose) and SMIT2 (inhibited by D-chiroinositol), we showed that SMIT2 seems to be responsible for all the apical transport of MI into the proximal convoluted tubule with a Km of 57 ± 14 µM. By transport studies we established that rabbit intestine seems to lack apical transport of MI while rat intestine has a very active uptake of this molecule. qRT-PCR quantification confirmed the absence of MI transporters in rabbit intestine. As for kidney, SMIT2 seems to be the only transporter responsible for apical MI uptake in enterocytes with a Km of 150 ± 40 µM. Functional analysis of rat SMIT2 activity, via electrophysiological studies in Xenopus oocytes, demonstrated similarities to the activities of SMIT2 from rat intestine and rabbit kidney. SMIT2 displays high affinities for MI (270 ± 19 µM), DCI (310 ± 60 µM) and no affinity for L-fucose. SMIT2 is very sensitive to phlorizin (Pz; 16 ± 7 µM). Although these functional characteristics essentially confirmed those found in rat intestine, a iv discrepancy exists between the two systems studied. Indeed, the affinity constant for glucose was approximately 40-fold lower in vesicles than in oocytes. We also tested the ability of SGLT1 and GLUT5, other sugar transport systems present in enterocytes apical membranes, to perform MI uptake. Because the inhibition of these transporters did not alter radiolabeled MI uptake, we concluded that they had no significant contribution to MI transport in rat intestine. Finally, the basolateral efflux of MI was not mediated by GLUT2 because when expressed in oocytes, this transporter was not able to transport MI.

Le myo-inositol (MI) est un soluté organique impliqué dans diverses fonctions physiologiques de la cellule dont la signalisation cellulaire. Il est également un osmolyte compatible reconnu. Trois co-transporteurs de type actif secondaire responsables de son absorption ont été identifiés. Deux d’entre eux sont couplés au transport du sodium (SMIT1 et SMIT2) et le troisième est couplé au transport de protons (HMIT). L’objectif de cette étude a été la caractérisation du transport du MI par SMIT2 dans des membranes en bordure en brosse (BBMv) issues du rein de lapin et de l’intestin de rat ainsi qu’après expression dans les ovocytes de Xenopus laevis. La quantification de l’ARNm de SMIT1 et de SMIT2 dans le rein nous a appris que SMIT1 est majoritairement présent dans la médullaire alors que SMIT2 est principalement localisé dans le cortex. Ces résultats ont été confirmés par immunobuvardage en utilisant un anticorps dirigé contre SMIT2. Grâce à l’inhibition sélective de SMIT1 par le L-Fucose et de SMIT2 par le D-chiro-inositol (DCI), nous avons démontré que SMIT2 semble le seul responsable du transport luminal de MI dans le tubule contourné proximal avec un Km de 57 ± 14 µM. Pour ce qui est de l’intestin, des études de transport de MI radioactif ont démontré une absence de transport de MI chez le lapin alors que l’intestin de rat présente un transport de MI très actif. Une quantification par qRT-PCR nous a permis de constater que l’intestin de lapin ne semble pas posséder les transporteurs de MI nécessaires. Comme pour le rein, SMIT2 semble le seul transporteur de MI présent au niveau du pôle apical des entérocytes intestinaux chez le rat. Il est chargé du prélèvement du MI de l'alimentation avec un Km de 150 ± 40 µM. Les analyses fonctionnelles exécutées sur SMIT2 de rat en électrophysiologie après expression dans les ovocytes de Xenopus laevis donnent sensiblement les mêmes résultats que pour les BBMv de rein de lapin et d’intestin de rat. Dans les ovocytes, SMIT2 présente une grande affinité pour le MI (270 ± 19 µM) et le DCI (310 ± 60 µM) et aucune affinité pour le L-fucose. Il est ii également très sensible à la phlorizine (16 ± 7 µM). Une seule exception persiste : la constante d’affinité pour le glucose dans les BBMv d’intestin de rat est 40 fois plus petite que celle observée sur les ovocytes de Xenopus laevis. Nous avons également testé la capacité de certains transporteurs de sucre présents à la surface des membranes apicales des entérocytes à prélever le MI. Vu que l'inhibition de ces transporteurs (SGLT1 et GLUT5) ne changeait rien au taux de MI radioactif transporté, nous en avons conclu qu'ils ne sont pas impliqués dans son transport. Finalement, l’efflux de MI à partir du pôle basolatéral des entérocytes n’est pas effectué par GLUT2 puisque ce dernier lorsqu'il est exprimé dans des ovocytes, est incapable de transporter le MI. / Myo-inositol (MI) is an organic solute involved in various aspects of cell physiology, including cell signaling. It is also known as a compatible osmolyte. Three secondary active MI cotransporters have been identified; two are Na+- coupled (SMIT1 and SMIT2) and one is H+-coupled (HMIT). The main aim of this study was to characterize MI uptake throught SMIT2 as expressed in epithelial cells and in Xenopus laevis oocytes. In order to achieve the characterization of this transport system, we used purified brush border membrane vesicles (BBMv) isolated from rabbit kidney and rat intestine. We first performed a quantification of mRNA levels in rabbit kidney using real time PCR for both SMIT1 and SMIT2. We found that SMIT1 is mainly expressed in the renal medulla while SMIT2 is mainly localized in the renal cortex. This result was confirmed on Western blots using an antibody raised against SMIT2. Through inhibition studies using selective substrates for SMIT1 (inhibited by L-fucose) and SMIT2 (inhibited by D-chiroinositol), we showed that SMIT2 seems to be responsible for all the apical transport of MI into the proximal convoluted tubule with a Km of 57 ± 14 µM. By transport studies we established that rabbit intestine seems to lack apical transport of MI while rat intestine has a very active uptake of this molecule. qRT-PCR quantification confirmed the absence of MI transporters in rabbit intestine. As for kidney, SMIT2 seems to be the only transporter responsible for apical MI uptake in enterocytes with a Km of 150 ± 40 µM. Functional analysis of rat SMIT2 activity, via electrophysiological studies in Xenopus oocytes, demonstrated similarities to the activities of SMIT2 from rat intestine and rabbit kidney. SMIT2 displays high affinities for MI (270 ± 19 µM), DCI (310 ± 60 µM) and no affinity for L-fucose. SMIT2 is very sensitive to phlorizin (Pz; 16 ± 7 µM). Although these functional characteristics essentially confirmed those found in rat intestine, a iv discrepancy exists between the two systems studied. Indeed, the affinity constant for glucose was approximately 40-fold lower in vesicles than in oocytes. We also tested the ability of SGLT1 and GLUT5, other sugar transport systems present in enterocytes apical membranes, to perform MI uptake. Because the inhibition of these transporters did not alter radiolabeled MI uptake, we concluded that they had no significant contribution to MI transport in rat intestine. Finally, the basolateral efflux of MI was not mediated by GLUT2 because when expressed in oocytes, this transporter was not able to transport MI.