Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-22Bitstream added on 2014-06-13T18:56:05Z : No. of bitstreams: 1 fernandes_cc_me_jabo.pdf: 1349174 bytes, checksum: b0d752648346a29041d0fbd5f330fbf6 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Anticorpos monoclonais se constituem na base de vários testes usados na detecção e na identificação de antígenos. Nesse contexto, tais imuno-reagentes têm sido extensivamente empregados na identificação de estirpes virais envolvidas na etiologia de surtos de bronquite infecciosa a campo, permitindo o aperfeiçoamento das técnicas de detecção e caracterização antigênica do vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBI). No presente estudo, uma biblioteca de fragmentos de anticorpos de galinha originalmente preparada por “phage display” contra a estirpe vacinal (H120) do VBI, foi usada para a seleção de fragmentos de anticorpos recombinantes com reatividade cruzada para as estirpes heterólogas IBVPR01, IBVPR05, isoladas de surtos a campo no Brasil e SE-17, isolada nos Estados Unidos. Após três ciclos de “panning”, foi identificado pelo ELISA um conjunto de 15 anticorpos scFv expressos em fagos e com reatividade cruzada para essas mesmas estirpes do VBI. A análise por Western-blotting revelou que três desses clones apresentavam fagos expressando fragmentos de anticorpos monoclonais com reatividade cruzada para a nucleoproteína N das três estirpes do VBI e também para a forma recombinante dessa nucleoproteína derivada da estirpe M41. Concluindo, os fragmentos de anticorpos monoclonais recombinantes scFv-N produzido em fagos interagem com um epítopo mais conservado da proteína N do VBI e apresentam um grande potencial para utilização na detecção e no diagnóstico direto desse vírus e no estudo de evolução de variantes desse vírus. / Monoclonal antibodies are the basis of various techniques used for antigen detection or characterization, and their use is specially recommended for the identification of viral strains involved in the etiology of outbreaks of infectious bronchitis, because these antibodies are homogeneous, highly specific and fully characterized, allowing the improvement of detection of immunological techniques and antigenic characterization of avian infectious bronchitis virus strains (IBV). We used a phage display library prepared previously against the IBV vaccine strain (H120) for the selection of new scFv antibody fragments reacting with heterologous IBV strains isolated from outbreaks in Brazil (IBVPR01, IBVPR05) and USA (SE-17). After three cycles of panning a set of 15 scFv antibodies was expressed in phages and exhibited crossreaction in ELISA with these three viral strains. Western-blotting analysis showed that three of this clone set were expressing scFv specific for the nucleoprotein of these IBV strains, as well as to the recombinant form of this protein derived from M41 strain of IBV. In conclusion, the recombinant fragments of monoclonal antibodies expressed by phage-display technique have a great potential for future use in immunodiagnostic techniques and study the evolution of variant strains of this virus.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-05Bitstream added on 2014-06-13T18:56:56Z : No. of bitstreams: 1 sousa_e_me_jabo.pdf: 361846 bytes, checksum: 88806de6aa141392c6646bc2ffc5421c (MD5) / Hy-Line do Brasil / Aves selvagens podem ser consideradas portadores/carreadores de agentes etiológicos patogênicos para galinhas de produção. O objetivo desse trabalho foi verificar, em aves selvagens, a presença de anticorpo contra: Mycoplasma gallisepticum (MG), Mycoplasma sinoviae (MS), Salmonella Pullorum (SP), Salmonella Gallinarum (SG), Vírus da Doença de Newcastle e Vírus da Bronquite Infecciosa; bem como a presença de Salmonella sp. Foram utilizadas 82 aves selvagens, e todas foram negativas na detecção de anticorpo anti-vírus da Doença de Newcastle e Bronquite Infecciosa, usando as técnicas de Inibição de Hemaglutinação e Soroneutralização, respectivamente. Para o diagnóstico de anticorpo anti Mycoplasma (MG e MS) foi utilizado inicialmente a técnica de Soroaglutinação Rápida em Placa, sendo sete aves positivas para MS e duas para MG. Amostras biológicas dessas aves foram posteriormente submetidas a técnicas de HI e/ou PCR, sendo todas negativas. Quanto ao diagnóstico de Salmonella sp., foi isolado Salmonella Muenchen da cultura de suabe de cloaca de uma curicaca; de uma seriema, foi isolado Salmonella Muenchen e Salmonella Saintpaul da cultura de órgãos e conteúdo intestinal, respectivamente; e do conteúdo intestinal de uma pomba foi isolado Salmonella Enteritidis. Apenas com os resultados dessa pesquisa, não foi possível concluir que as aves selvagens possam representar um risco sanitário para a avicultura. São necessários mais estudos envolvendo um número maior de aves e locais para elucidar o real potencial de transmissão e portador são das aves selvagens para os respectivos agentes pesquisados. / Wild birds can be considered carrier/transmitter of patogenic etiologic agents for chickens. The objective of this work was to verify in wild birds the presence of antibody Mycoplasma gallisepticum (MG), Mycoplasma sinoviae (MS), Salmonella Pullorum (SP), Salmonella Gallinarum (SG), Newcastle Disease Virus, and Infectious Bronchitis Virus; as well as the presence of Salmonella sp. Eighty-two wild birds were sampled, and all was negative for antibody anti-virus Newcastle Disease and Infectious Bronchitis, using the techniques of Hemagglutination Inhibition and Seroneutralization, respectively. For the detection of antibodies anti Mycoplasma (MG e MS) were used initially the Fast Serum Agglutination on Plate method, seven birds were positive for MS and two for MG. Subsequently the positive sera and/or traqueal swab were submitted for HI and/or PCR techniques being all exams negative. Regarding the diagnosis of Salmonella sp., Salmonella Muenchen was isolated from a culture of cloacal swab of a buff-necked Ibis; from a red-legged seriema, Salmonella Muenchen and Salmonella Saintpaul were isolated from culture of organs and intestinal content, respectively; and Salmonella Enteritidis was isolated of intestinal content from a dove. It was not possible to conclude that the wild birds can represent a sanitary risk for aviculture considering only these results. More studies are necessary to elucidate the real potential of transmission and carrier of wild birds for the researched agents.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCV07MA048.pdf: 2534646 bytes, checksum: 9ccc6e39362dcc90e7ad0070a0d03f75 (MD5) Previous issue date: 2007-10-05 / This report describes the occurrence of four natural outbreaks of Infectious Bronchitis (IB) accompanied by nephritis and pectoral myopathy. The objectives are to describe the macro and microscopical injuries of the kidneys and muscle. Three outbreaks affected different flocks of broilers. One case occurred in broiler breeders affecting two houses of a farm. In the broilers, high mortality and high index of discarding was observed and also high condemnation in the abattoir. Respiratory snicks, apathy and ununiformity were observed. In the flock of broiler breeders, decline of production and high mortality were noticed. All the animals where positive for IB serology, and positive results were also obtained on the flock where PCR was carried through. In the necropsy, swollen and renal pallor were observed, pallor and white streaks mainly of the deep pectoral muscles, and in some cases mild edema. In the histopathology examination, the kidney injuries consisted of moderate to intense glomerular hyperplasia, in some cases interstitial multifocal inflammatory infiltrate and tubular degeneration. In the muscle, interstitial edema was found, hyaline degeneration, vacuolation, hypercontraction and myophagia of the muscle fibres. In one case, moderate fibrosis was observed. In other cases, mild to moderate lymphocytic infiltration was observed in the trachea. In the broiler breeders, other than the described lesions, a peribrochial lymphoid hyperplasia and hyaline degeneration was noted in the pulmonary vessels. In all the cases a close relation was observed between renal and muscular injury / Relata-se a ocorrência de quatro surtos espontâneos de Bronquite Infecciosa (BI) cursando com nefrite e miopatia peitoral objetivando descrever as lesões macro e microscópicas do rim e músculo. Três surtos ocorreram em frangos de corte afetando diversos lotes. Um surto ocorreu em matrizes afetando dois núcleos de criação. Nos frangos de corte, foi observado em alguns lotes alta mortalidade, alto índice de descarte e em outros alta condenação no abatedouro. Também observou-se, ronquidão, apatia e desuniformidade. No lote de matriz, foi observada queda de produção e mortalidade elevada. Todos os animais em que foi realizada sorologia foram positivos para BI, o mesmo para o lote em que foi realizada PCR. Na necropsia, observou-se tumefação e palidez renal, palidez e estrias esbranquiçadas principalmente do músculo peitoral profundo, e em alguns casos leve edema. No exame histopatológico, as lesões renais consistiam de hiperplasia glomerular de moderada a intensa, em alguns casos degeneração tubular e infiltrado inflamatório multifocal intersticial. No músculo, foi observado edema intersticial, degeneração hialina, vacuolização, hipercontração e miofagia de fibras musculares. Em um caso observou-se fibrose moderada. Em outros foram observadas infiltração linfocitária de leve a moderada na traquéia. Nas matrizes, além das lesões descritas, observou-se hiperplasia linfóide peribronquial e degeneração hialina nos vasos pulmonares. Em todos os casos foi observada uma estreita relação entre lesão renal e muscular

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Liana Brentano / Banca: Maria da Glória Buzinaro / Resumo: Nesse estudo foi desenvolvido e aplicado o procedimento de imunocaptura para realizar a reação de transcrição reversa seguida pela reação em cadeia da polimerase (IC-RT-PCR) a fim de ser amplificada uma região 5'_ proximal do gene 81 do vírus da bronquite infecciosa (VBI) com 228 pb e de forma a fazer a detecção e a diferenciação desse vírus, comparando-se os resultados dessa metodologia com os obtidos na técnica convencional de RT-PCR. Todas as 11 estirpes do VBI testadas foram amplificadas pelas duas técnicas moleculares, enquanto que nenhum dos vírus heterólogos (Pneumovírus Aviário do grupo A e B, Vírus da Doença de Gumboro e o Vírus da Doença de Newcastle) ensaiados levaram a amplificação específica do gene 81. O limiar de detecção para a técnica de IC-RT-PCR foi idêntico ao do método de RT-PCR e correspondeu a 102.8 Doses Infectantes Embrionárias 50%. Para um total de 35 amostras de tecidos do trato respiratório testadas e provenientes de aves infectadas experimentalmente, 32 foram positivas pela técnica de IC-RT-PCR e também pela RT-PCR convencional, enquanto que o isolamento viral foi obtido para 22 dessas amostras. A análise do produto amplificado do gene 81 na IC-RT-PCR através da técnica de RFLP (restriction fragment length polymorphism), com as enzimas Alul e Mboll, permitiu a diferenciação das 5 estirpes de referências e dos 6 isolados de campo analisados em 4 diferentes genótipos, correspondentes às estirpes de referência M41, Connecticut, ou 8E-17, ou a um isolado de campo. Portanto, a técnica de IC¬RT -PCR demonstrou um grande potencial para ser aplicada no diagnóstico direto do VBI, apresentando vantagens sobre a técnica convencional de RT-PCR, as quais foram derivadas da combinação da especificidade da imunocaptura em fase sólida com a sensibilidade da reação de PCR, o que pode proporcionar ganho de tempo e menor custo para a manipulação de um maior número de amostras. / Abstract: In this study, the immunocapture procedure followed by reverse transcription and polymerase chain reaction (IC-RT-PCR) technique was standardized and applied for the amplification of 5'- proximal pari of 81 gene of infectious bronchitis virus (IBV) in infected f1uid or tissue samples, which were collected from embryonating chicken eggs or experimentally infected birds. The results of this technique were compared with those obtained in conventional RT-PCR. Ali eleven IBV strains tested were amplified, while none of the heterologous avian viral pathogens (Groups A and B Avian Pneumovirus, Newcastle Disease Virus and Gumboro Disease Vírus) gave positive results. The limit of detection for IC-RT¬PCR was identical to the common RT-PCR and corresponded to 102.8 50% embryonic infectious doses. Thirty two out of thirty five respiratory tissue samples collected from experimentally infected chickens were positive by both molecular techniques (IC-RT-PCR I common RT-PCR), whereas the vírus isolation test detected IBV in twenty two of these samples. The AluL and Mobll RFLP analysis of the 228 bp amplicon generated from IC-RT-PCR led to the discrimination of the 5 reference strains and 6 field IBV isolates in four genotypes; which were associated to the M41, to Connecticut, ar to 8E-17 strain, or to a field isolate. Therefore, the IC-RT-PCR demonstrated in this study a high potential for the application in the direct diagnosis of IBV and has relevant advantages over the conventional RT¬PCR, because it combines the specificity of the immunocapture in a solid phase with the sensitivity of the PCR, providing simplicity, rapidity and low cost for the manipulation of a high number of samples. / Mestre

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: José Moacir Marin / Banca: Liana Brentano / Resumo: Um método de diagnóstico baseado na associação entre as técnicas de RT-PCR e ELISA foi desenvolvido para a detecção do vírus da bronquite infecciosa das aves (VBI). Inicialmente, a especificidade e a sensibilidade analíticas dessa técnica, bem como dos métodos de RT-PCR e Nested-RT-PCR, foram determinadas, tendo-se demonstrado, para o primeiro parâmetro, apenas a detecção do VBI, enquanto que outros vírus heterólogos aviários testados, tais como pneumovírus aviário (APV / estirpe do grupo B), vírus da doença de Newcastle (NDV / estirpe La Sota) e vírus da doença de Gumboro (GDV - estirpe Lukert), não foram detectados. Quanto à avaliação da sensibilidade analítica dos métodos empregados neste estudo foi constatado que o RT-PCR-ELISA demonstrou ser 10 vezes mais sensível do que a RT-PCR, enquanto que a reação de Nested-PCR foi 100 vezes mais sensível que a RT-PCR e 10 vezes mais sensível que o RT-PCR-ELISA. A técnica de RT-PCR-ELISA, juntamente com os outros dois métodos de biologia molecular, foram aplicadas para a detecção das estirpes H-120 e A034 do VBI, em amostras de pulmão e traquéia obtidas de aves experimentalmente infectadas com essas duas estirpes virais. Os resultados obtidos nos diferentes métodos de biologia molecular foram comparados entre si e com a técnica padrão de isolamento viral em ovos embrionados, verificando-se que o RT-PCR-ELISA revelou-se tão específico quanto as técnicas de isolamento viral e Nested-PCR, porém foi menos sensível do que esses mesmos métodos na detecção do VBI. A técnica de RT-PCR-ELISA, utilizada pela primeira vez para o VBI, demonstrou o potencial de se constituir uma alternativa viável para um diagnóstico direto mais rápido e específico do VBI. / Abstract: A molecular biology method for the detection of avian infectious bronchitis virus (IBV) was developed combining the reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Firstly, the analytical specificity and sensitivity of RT-PCR-ELISA, RT-PCR and Nested-RT-PCR were assessed. The specificity of these methods were confirmed since only IBV was detected, while other heterologous avian viral pathogens such as pneumovirus (Group B), Newcastle disease virus (LaSota strain) and gumboro disease virus (Lukert strain) were not detected by these techniques. The sensitivity of these methods was established, indicating that the RT-PCR-ELISA was about ten times more sensitive than conventional RT-PCR, while Nested-PCR was a hundred more sensitive than RT-PCR and ten times more sensitive than PCR-ELISA. The RT-PCR-ELISA and the two molecular biology methods were also applied for the detection of IBV strains H-120 and A034, in lung and tracheal tissue samples collected from experimentally infected chickens. The results of these different methods were also compared with the standard diagnostic technique, the virus isolation in chicken embryonated eggs, showing that RT-PCR-ELISA was as specific as virus isolation and Nested-PCR, however it was less sensitive than these methods for the IBV detection. The RT-PCR-ELISA, applied for the first time for IBV detection and direct diagnosis in tissue samples, can be potentially applied as an useful alternative for the rapid and specific diagnosis of IBV. / Mestre

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: João Pessoa Araujo Júnior / Banca: Valéria Marçal Félix de Lima / Banca: Edison Luiz Durigon / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Resumo: O vírus da Bronquite infecciosa (VBI) é um Coronavírus aviário que infecta aves domésticas de corte e postura, ocasionando grandes perdas econômicas na indústria avícola. Dada a natureza altamente contagiosa e aguda da doença, há uma grande necessidade do desenvolvimento de métodos diagnósticos que possam ajudar na detecção e/ou caracterização de estirpes variantes do VBI. Sendo assim, para auxiliar no diagnostico laboratorial da infecção, foi construída uma biblioteca de fragmentos de anticorpos monoclonais pela técnica de Phage-display. Para tanto, após a imunização de galinhas com a estirpe vacinal H120, foi extraído o RNA total do baço das aves imunizadas e amplificadas as cadeias variáveis leve e pesada que foram unidas por linker, originando o fragmento gênico de cadeia única scFv. Após a realização de três ciclos de seleção foram obtidos 400 clones que foram avaliados em ensaios de ELISA e Western blotting para averiguação da especificidade dos mesmos frente às proteínas da estirpe H120. Após realização dos testes foram selecionados dois clones, um que apresentou grande reatividade para com a proteína de nucleocapsídeo (N) (scFv-N) e o outro com reatividade para com a subunidade 1 da glicoproteína de superfície (S) (scFv-S1). O anticorpo scFv-S1 quando utilizado em ensaio de vírus-neutralização em ovos embrionados mostrou titulo significativo de proteção. Já em testes de ELISA utilizando estirpes de referência e isolados brasileiros de campo do VBI, o anticorpo scFv-N foi capaz de detectar todas as estirpes (H120, M41, Arkansas, IBVPR05, IBVPR02, IBVPR01, IBVSC01), enquanto que o scFv-S1 pode discriminar as estirpes pertencentes ao sorotipo Massachusetts (H120, M41 e IBVSC01) das demais estirpes variantes avaliadas. Os fragmentos de anticorpos scFv-N e scFv-S1 também mostraram bons resultados quando utilizados na técnica... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Infectious bronchitis virus (IBV), the coronavirus of the chicken, is one of the main causes of economic loss within the poultry industry, affecting the performance of meattype and egg-laying domestic fowls. Given the highly contagious and acute nature of the disease, there is an urgent need for the development of diagnostic assays that can detect and/or characterize IBV strains. In order to improve the laboratory diagnosis of IBV infection, phage-displayed recombinant antibody library derived from splenic mRNA of chickens immunized with H120 vaccine strain of infectious bronchitis virus (IBV) was constructed as single chain variable fragments (scFv) by overlap extension polymerase chain reaction (PCR) of the individual heavy (VH) and light (VL) chain variable gene segments. After three rounds of panning selection, ten scFv phage display antibodies of 400 randomly chosen clones were demonstrated to react with IBV antigens by ELISA. The western blot analysis selected two scFv antibodies reacting strongly with nucleocapsid (N) (scFv-N) protein or subunit 1 of spike glycoprotein (S1) (scFv-S1) of IBV. The anti-S1 scFv antibody showed a significant neutralization titre in embryonating chicken egg test. In ELISA analysis using reference IBV strains and Brazilian field isolates, the anti-N scFv antibody was able to detect all strains (H120, M41, ARKANSAS, IBVPR05, IBVPR02, IBVPR01, IBVSC01), while the anti-S1 could discriminate Massachusetts serotype (H120, M41 and IBVSC01) between variant strains. A scFv-based indirect immunoperoxidase (IP) procedure was also applied to detect infectious bronchitis virus (IBV) antigens in formalin-fixed tracheal tissue sections. Thus, the results showed that scFv-N and scFv-S1 antibodies can be used for the detection and differentiation of IBV strains. / Doutor

Coronavírus, incluindo-se o Coronavírus aviário (ACoV), possuem o maior genoma composto por RNA conhecido entre os vírus. Aproximadamente dois terços desse genoma codificam proteínas não estruturais (Nsps), cujas funções parecem estar associadas à replicação e patogênese viral. Até o momento, esses alvos têm sido pouco explorados quanto a sua diversidade em diferentes linhagens de ACoV. O presente estudo teve como objetivo investigar a diversidade dos genes codificadores das proteínas não estruturais Nsp2 e protease Papaína-like (Plpro), utilizando-se linhagens brasileiras de ACoV. Para tanto, 10 linhagens de ACoV, isoladas em ovos embrionados, foram submetidas à RT-PCR direcionada aos genes codificadores de Plpro e Nsp2, seguindo-se o sequenciamento de DNA e a análise filogenética, juntamente com sequências homólogas obtidas no GenBank. Além disso, realizou-se a genotipagem por meio do sequenciamento parcial do gene codificador da proteína de espícula (região S1). Três das amostras virais obtidas e investigadas no presente trabalho apresentaram padrão de segregação discordante para os genes estudados. O isolado CRG I22 agrupou-se com linhagens virais pertencentes ao genótipo Massachusetts para S1 e com o grupamento de ACoVs brasileiros os genes da Nsp2 e Plpro. O isolado CRG I33 agrupou-se com linhagens virais pertencentes ao genótipo brasileiro para s1 e plpro e de maneira divergente para o gene da Nsp2. Para o isolado CRG I38, não foi obtida a genotipagem por s1, entretanto, similarmente ao observado para o isolado CRG I33, esse isolado agrupo-se com linhagens virais brasileiras para o gene plro e de maneira independente para o gene nsp2. As demais linhagens estudadas resultaram na formação de um grupamento especificamente brasileiro de ACoV, para os três genes estudados. Esses achados sugerem a ocorrência de recombinação nessas amostras discrepantes. Quanto às identidades médias entre as sequencias nucleotídicas analisadas, a região de s1 analisada apresentou as menores identidades (73,75% ±16,78), seguido pelo gene plpro (88,06% ±5,7) e do gene nsp2 (92,28% ±4,37), em acordo com a literatura. Assim sendo, os alvos investigados podem constituir ferramentas úteis na epidemiologia molecular do ACoV e na investigação de linhagens recombinantes do vírus. O presente estudo é o primeiro a investigar a diversidade genética de genes codificadores de proteínas não-estruturais em linhagens brasileiras de ACoV. Os resultados aqui apresentados reforçam a existência de um genótipo brasileiro de ACoV, para os 3 genes estudados. Entretanto, discrepâncias pontuais encontradas no padrão genotípico para s1, nsp2 e nsp3 permitem inferir uma diversidade genética maior do que a conhecida até o momento, possivelmente resultante de eventos de recombinação entre ACoVs brasileiros, ACoVs vacinais e outros ainda desconhecidos. Os resultados obtidos auxiliam na compreensão dos padrões e evolução dos ACoVs / Coronaviruses, including Avian coronavirus (ACoV), have the largest known RNA genome. Nearly two thirds of its genome codes for non-structural proteins (Nsps), whose functions appear to be linked to viral replication and pathogenesis. Hitherto these targets have been poorly explored regarding the ACoV lineages diversity. The present study aimed to assess the diversity of non-structural protein 2 (nsp2), papain-like protease (plpro) and spike protein (S1 subunit) coding genes, in Brazilian ACoV strains. To this end, 10 ACoV strains, isolated in embryonated eggs, had its 3rd and 5th passages submitted to RT-PCR targeting nsp2, plpro and s1, followed by DNA sequencing and phylogenetic analysis, herewith homologous sequences obtained from GenBank. Three of the ACoV strains sequenced showed a discordant segregation pattern for target genes. CRG I22 strain clustered with Massachusetts genotipe strains for S1, and with Brazilian cluster for nsp3 and plpro genes. CRG I33 strain, clustered with Brazilian strains for S1 and plpro genes, and was divergent for nsp2 gene. For CRG I38 strain, the S1 sequence was not obtained, however, similarly to what was observed for CRG I33, this strain grouped with the Brazilian lineage for plpro gene and was divergent for nsp2 gene. All the other ACoV here sequenced resulted in a specific Brazilian cluster for the three studied genes. Regarding the mean nucleotide identities measured, s1 gene showed the lowest identity (73.75% ±16.78), followed by plpro gene (88.06% ±5.7) and nsp2 gene (92.28% ±4.37), in accordance with previous reported data. Therefore, the targets of the present study are useful tools for ACoV molecular epidemiology studies and for the survey of recombinant ACoV strains. The presented study is the first one investigating the molecular diversity of non-structural proteins coding genes in Brazilian strains of ACoV. Results achieved herein reinforce the data over the circulation of ACoV Brazilian strains in this country, for the three investigated genes. However, divergences found between S1, nsp2 and plpro genetic patters allow inferring a higher molecular diversity than previously known. It is possible that this divergence is due to recombination events between ACoV from vaccines, Brazilian field strains and others still unknown. These results contribute on the comprehension over genetic patters and evolution of ACoV

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:57:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Paula_Oliveira.pdf: 1081819 bytes, checksum: 9e319c71a8b01c131e6f3917156db97d (MD5) Previous issue date: 2012-12-14 / Objective: to evaluate the characteristics of the users of metered-dose inhalers and its prevalence, among those who reported a diagnosis of asthma, bronchitis and/or emphysema. Methods: a population-based study in Pelotas, RS, Brazil, including 3,670 subjects aged 10 years or older. Results: About 10% of the sample referred at least one respiratory disease. Among these, 59% referred symptoms in the last year and of those, only half have used inhalers, showing difference between the quintiles of socioeconomic status (39% poorest quintile vs. 61% richest quintile p=0,01). There was no difference in the use of inhalers by age and sex. Regarding the pharmacological group, the emphysematous used a combination of bronchodilator (BD) plus corticosteroids in greater proportion than just BD. Only among those who reported a medical diagnosis of asthma and with actual symptoms, the proportion of use of inhalers was higher than 50%. Conclusion: metered-dose inhalers are underused among those who relate these diagnoses and the type of medicine used by the ones who referred emphysema is not in accordance with the recommendations in the consensus about these diseases. / Objetivo: avaliar as características dos usuários de inaladores dosimetrados e sua prevalência de uso, entre aqueles que referem diagnóstico de asma, bronquite e/ou enfisema. Métodos: estudo de base populacional realizado em Pelotas, RS, incluindo 3670 indivíduos, com 10 anos de idade ou mais. Resultados: Cerca de 10% da amostra referiu pelo menos uma das doenças respiratórias investigadas. Entre eles, 59% apresentaram sintomas no último ano e, destes, apenas metade usou inaladores, havendo diferença entre os quintis de nível socioeconômico (39% quintil mais pobre vs. 61% no quintil mais rico p=0,01). Não houve diferença no uso de inaladores por sexo e idade. Quanto ao grupo farmacológico, os enfisematosos utilizaram a combinação broncodilatador (BD) + corticoide em maior proporção do que apenas BD. Somente dentre os que referiram diagnóstico médico de asma e sintomas atuais, a proporção de uso de inalador foi maior que 50%. Conclusão: os inaladores dosimetrados são subutilizados entre os que referem estes diagnósticos e que o tipo de medicamento usado por aqueles que referiram enfisema não está de acordo com o preconizado nos consensos sobre estas doenças.

Chronic obstructive pulmonary disease is the fourth largest cause of death worldwide and the prevalence is predicted to increase even further to make it the third largest cause of death by 2020. The main cause of the disease is exposure to tobacco smoke. COPD is a complex disease and there is a strong need of better understanding of the pathogenetic mechanisms in order to come up with novel therapeutic interventions and preventive strategies. The golden standard to image the lungs today is to use computed tomography (CT) which is an imaging modality that involves ionizing radiation and could thus harm the patient, especially with repeated exposure. New techniques in the image acquisition of magnetic resonance imaging (MRI), an imaging modality that does not involve ionizing radiation, has emerged that allows for lung imaging. The work included segmentation of the lungs, image registration and partitioning of the lungs inorder to perform regional analysis. The results indicate that the mean value of the T1-parameter in the left and right lung is not affected to the same degree, where the left lung showed a greater decrease. The results also showed that the anterior parts of the lungs are not showing any statistically significant changes but the changes were instead seen in the center and posterior parts. Both lungs also showed results that indicate that the mean T1-value is recovered at the end of the longitudinal study, a phenomenon that couldn’t be explained and further studies have to be performed.

A Bronquite Infecciosa das Aves (BIG) é uma das doenças respiratórias aviárias de maior impacto na avicultura mundial. No Brasil, as estirpes BR-I (GI-11) e Massachusetts (GI-1) são as mais prevalentes nos planteis avícolas. O presente estudo teve como objetivos desenvolver reações de semi-nested PCR para o diagnóstico das estirpes BR-I e Mass, em amostras brasileiras obtidas durante o período de 2016 e 2017. Foram desenvolvidas duas reações de semi-nested PCR tendo como alvo a subunidade 1 do gene S, específicas para as estirpes BR-I e Mass. O limiar de detecção foi de 104 cópias de DNA/µL nas duas reações (3,76fg/µL na reação exclusiva de BR-I; e 5,58fg/µL e 5,57fg/µL na reação duplex de BR-I e Mass, respectivamente). Posteriormente, foram avaliados 572 pools de órgãos procedentes das 5 regiões do Brasil. Dentre estas amostras, 62,24% foram positivas para Coronavírus, sendo o alvo desta reação a região 3UTR. A reação de semi-nested PCR específica detectou a estirpe BR-I em 84,83% das amostras positivas para Coronavírus. A reação de semi-nested PCR duplex detectou 65,44% das amostras positivas para a estirpe BR-I; 7,35% positivas para a estirpe Mass e co-infecção da estirpe BR-I com Mass em 17,65% das amostras. Após a análise dos controles positivos (vacinas Mass e BR-I) no BLASTn, do resultado do sequenciamento dos produtos de PCR, da análise filogenética, da similaridade de nucleotídeos e a dedução em aminoácidos, foi confirmado o agrupamento esperado das sequências detectadas pelas reações PCR dirigidas para a estirpe BR-I ou Mass. Estes resultados confirmaram a presença predominante da estirpe BR-I, e em menor número, da estirpe Mass nos planteis avícolas do Brasil. As reações desenvolvidas no presente estudo serão valiosas no diagnóstico e na monitoria da doença. / Avian Infectious Bronchitis (IB) is one of the avian respiratory diseases with the greatest impact on poultry farming worldwide. In Brazil, strains BR-I (GI-11) and Massachusetts (GI-1) are the most prevalent in poultry flocks. The present study aimed to develop semi-nested PCR reactions for the diagnosis of IBV BR-I and Mass strains, in Brazilian samples obtained during the period of 2016 and 2017. Two semi-nested PCR reactions targeting the 1 subunit of the S gene were developed, specific for BR-I and Mass strains. The detection threshold was 104 copies of DNA/µL in both reactions (3,76fg/µL in the exclusive BR-I reaction; and 5,58fg/µL and 5,57fg/µL in the duplex reaction of BR-I and Mass, respectively). Subsequently, 572 organ pools from the 5 regions of Brazil were evaluated. Among these samples, 62,24% were positive for Coronavirus, being the target of this reaction the 3UTR region. The specific semi-nested PCR reaction detected the BR-I strain in 84,83% of the Coronavirus positive samples. The duplex semi-nested PCR reaction detected 65,44% of the samples positive for the BR-I strain, 7,35% positive for Mass strain, and co-infection of the BR-I and Mass strain in 17,65% of the samples. After the analysis of the positive controls (Mass and BR-I vaccines) in BLASTn, the result of the sequencing of the PCR products, phylogenetic analysis, nucleotide similarity and amino acid deduction, was confirmed the expected clustering of the sequences detected by the PCR reactions directed to BR-I and Mass strains. These results confirm the predominant presence of the BR-I strain, and to a lesser extent, the Mass strain in Brazilian poultry flocks. The reactions developed in the present study will be valuabe in the diagnosis and monitoring of the disease.