O objetivo deste trabalho foi avaliar se as enzimas secretadas pelo fungo de decomposição parda Gloeophyllum trabeum podem atuar como auxiliares às celulases comerciais na hidrólise de substratos celulósicos oxidados. Para isto foi realizada a oxidação de celulose microcristalina Avicel mediante reação de Fenton (Fe+2, H2O2) e tratamento com CuSO4. O substrato oxidado foi caracterizado e posteriormente foi determinado o efeito desta modificação sobre a eficiência hidrolítica de enzimas comerciais (Celluclast/Novozym) e sobre misturas destas enzimas comerciais suplementadas com extrato enzimático obtido de G. trabeum. As reações realizadas com Avicel indicaram que ambos tratamentos químicos foram efetivos para modificar grupos funcionais presentes na celulose. A caracterização fisicoquímica dos substratos oxidados permitiu concluir que o tratamento Fenton gerou transformações mais intensas na celulose do que o tratamento com CuSO4. O análise dos hidrolisados ácidos das amostras oxidadas por Fenton mediante espectrometria de massas (GC-MS) confirmou que a oxidação ocorre principalmente no C1. As hidrólises enzimáticas utilizando preparações com diferentes cargas das enzimas comerciais apresentaram uma diminuição significativa da conversão de celulose quando as amostras são tratadas com o reagente Fenton. Por outro lado, a celulose oxidada gerada pelo tratamento com CuSO4 ainda é eficientemente hidrolisada pelas enzimas. As duas amostras de celulose Avicel oxidadas também foi hidrolisada utilizando misturas de enzimas comerciais e extratos enzimáticos de G. trabeum. Em todas as condições ensaiadas a suplementação da mistura reacional com extratos enzimáticos do fungo de decomposição parda G. trabeum diminuíram a eficiência de hidrólise enzimática da celulose oxidada. O emprego do dobro de carga enzimática de enzimas comerciais permitiu recuperar os níveis de hidrólise observados na celulose in natura. / The goal of this work was to evaluate whether enzymes produced by the brown-rot fungus Gleophyllum trabeum would be able to act as auxiliary enzymes of commercial cellulases during the enzymatic hydrolysis of oxidized cellulose. To reach this goal an oxidation of microcrystalline-cellulose (Avicel) was performed by two differente reaction systems: Fenton reaction (Fe2+, H2O2) or CuSO4 treatments. The oxidized subtracts were characterized and the effect of cellulose modification on the hydrolytic efficiency of commercial enzymes, supplemented or not with the enzymes recovered from a G. trabeum culture, was determined. The Avicel treatment by the oxidative systems resulted in cellulose structural changes as evidenced by infrared spectroscopy, viscosity measurements and chemical characterization by HPLC and GC/MS chromatography of the monomers recovered after acid hydrolysis. The physicochemical characterization of the oxidized celluloses allowed to conclude that the transformation of the cellulose was more intense when Fenton treatment was used as compared with the CuSO4 treatment. The analysis of the acid hydrolysates by GC-MS indicated that the oxidation by Fenton reaction occurred mainly at the C1 of the cellulose chain, resulting in gluconic acid in the acid hydrolysates. A meaningful decrease of the cellulose conversion was observed when Fetnon-treated samples were submitted to enzymatic hydrolysis using different amounts of commercial enzymes. On the other hand, the CuSO4-oxidized cellulose was still efficiently hydrolyzed by high enzyme dosages. The oxidized Avicel substrates were also hydrolyzed using a mixture of the commercial enzymes with enzymes recovered from G. trabeum cultures. At all tested conditions, the supplementation of the reaction mixture with enzymatic extracts from G. trabeum decreased the enzymatic hydrolysis efficiency. Nevertheless, the normal levels of enzymatic hydrolysis were recovered when the commercial enzymes dosage two-fold increased.

Fungos de podridão branca e fungos de podridrão parda são capazes de degradar a biomassa lignocelulósica utilizando diferentes mecanismos. Os fungos de podridão parda degradam a celulose e a hemicelulose enquanto modificam a lignina, sendo, portanto, as enzimas hidrolíticas ativas em substrato rico em lignina. O arsenal enzimático diferenciado desses fungos torna-os alvos para prospecção de enzimas que podem ser aplicadas em diversos processos biotecnológicos. O fungo Gloeophyllum trabeum é uma das espécies mais compreendidas deste grupo, e sabe-se que é capaz de degradar a celulose sem produzir CBHs. Além disso já foi reportado uma GH5 proveniente desse organismo com caraterísticas processivas. Nossa tentativa de clonagem dessa enzima (GtGH5) em A. nidulans A773 não foi bem sucedida, todavia nosso grupo esta repetindo os passos de clonagem e expressão. No genoma desse organismo esta presente um gene que codifica uma GH45. A GtGH45 foi a clonada e expressa com alto rendimento em A. nidulans cepa A773. A expressão, secreção e acumulaçao da GtGH45 foi positiva após 72 h de incubação em meio líquido (maltose como indutor), confirma por eletroforese SDS-PAGE do extrato enzimático concentrado e dialisado. A massa molar de 18,4 kDa foi consistente com a predição da sequência de 204 amino-ácidos obtída apartir da sequência gênica e corrobora com a caracterização por espectometria de massas (18,9 kDa). A análise filogenética é consistente com estudos anteriores, agrupando a proteína alvo com outras GH45s de basidiomicetos na subfamília C. A enzima purificada foi testada para determinação da especificidade pelo substrato apresentando maior atividade em arabinoxilana, xilana, arabinoxilana e CMC e foi capaz de gero celo-oligômeros a partir da hidrólise de PASC. O pH ótimo em CMC foi 2,5, além se demonstrar ser temoestável em ensaio de Thermoflour. A hidrólise enzimática de substratos lignocelulósicos derivados de cana-de-açúcar mostrou que a GtGH45 foi eficiente para suplementar coqueteis enzimáticos comerciais, principalmente na conversão de xilana. / White-rot and brown-rot basidiomycetes are able to transform lignocellulosic materials through different mechanisms. The brown-rot fungi are able to degrade cellulose and hemicellulose meanwhile modifies lignin. The hydrolytic enzymes of these fungi act on a lignin-enriched substrate, which makes them targets to prospect new enzymes for polysaccharides hydrolysis. Gloeophyllum trabeum is one of the best understood fungal species in this group. An interesting processive GH5-endoglucanase (EG) has been described in this species suggesting an unusual pathway for lignocellulosic degradation without cellobiohydrolases (CBH). Our first attempt to clone this GtGH5 was default but our grup is trying a new attempt of heterologous expression of this protein. Furthermore, G. trabeum genome points out for a low molar mass GH45-EG. Here we report on a recombinant high-yield G. trabeum ATCC 11539 GtGH45 production system. Expression and secretion of endoglucanase GtGH45 was positive after 72 h incubation of the transformed A. nidulans stain A773 in stationary liquid cultures (maltose as inductor). The SDS-PAGE electrophoresis of ultra-filtrated extract showed a single-band GtGH45 over expressed band. The molar mass of 18,4 KDa was consistent with the predicted 204 amino acids sequence derived from gene sequence analyses and corroborates with mass spectometry characterization (18,9 KDa). Even more, the phylogenetic analyze is consistent to previews studies, clustering the target protein with others GH45 from basidiomycetes at subfamily C. The purified protein was assayed for substrate specificity showing activity against xylan, arabinoxylan and PASC. GtGH45 was able to produce cello-oligomers from PASC. The optimum pH was 2.5 with CMC as the substrate. Xylan conversion was enhanced when GtGH45 was mixed with commercial enzymes in enzymatic hydrolysis of alkaline-sulfite pretreated sugar cane bagasse.

O arroz (Oryza sativa L.) integral é rico em compostos fenólicos livres e conjugados (solúveis) e ligados (insolúveis). Atribui-se a estas substâncias propriedades benéficas à saúde humana devido à elevada ação antioxidante. Porém, pouco se conhece sobre o efeito do ambiente e de processos tecnológicos como a parboilização sobre os seus teores. Este trabalho teve como objetivo estudar a variabilidade nos teores de compostos fenólicos solúveis e insolúveis em arroz integral em função da região de plantio e safras. Avaliou-se também o efeito da parboilização nos fenólicos e sua atividade antioxidante. Fez parte do escopo desta pesquisa analisar a composição química de 9 amostras de arroz integral e compará-la ao arroz parboilizado integral, e com isso contribuir com dados para tabelas de composição de alimentos. Foram analisadas 54 amostras de arroz integral fornecidas pela Epagri/Estação Experimental de Itajaí, pertencentes a três cultivares comerciais, produzidas simultaneamente em três regiões do Estado de Santa Catarina por diferentes produtores em sistema irrigado e colhidas nas safras de 2007/2008 e 2008/2009. Todas as amostras referentes à safra 2007/2008 foram analisadas antes e após a parboilização. Os compostos fenólicos solúveis foram extraídos com EtOH 80% e os insolúveis com acetato de etila após tratamento em meio alcalino. O método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau foi empregado para a sua quantificação e os métodos ORAC (Oxygen radical absorbance capacity) e DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil) para avaliar a atividade antioxidante. O teor médio de compostos fenólicos totais no arroz integral foi da ordem de 1300 mg eq. ácido ferúlico/kg, sendo que a proporção de fenólicos solúveis e insolúveis foi de 55:45. As safras demonstraram ter maior influência nos teores de fenólicos do que as regiões de plantio. A parboilização ocasionou uma perda média de 32% dos compostos fenólicos totais, sendo a fração solúvel a mais afetada pelo processo. O teor médio de fenólicos insolúveis nas 27 amostras não sofreu alteração pela parboilização, apesar de variações individuais. Os métodos de DPPH e ORAC foram igualmente adequados para avaliar a atividade antioxidante dos extratos de arroz, antes e após a parboilização. No arroz não parboilizado a atividade antioxidante se deve majoritariamente aos fenólicos solúveis, enquanto no arroz parboilizado, as duas frações, solúvel como insolúvel, contribuíram quase equitativamente com a capacidade antioxidante. Os compostos fenólicos apresentaram forte correlação com a atividade antioxidante pelas metodologias de DPPH e ORAC. O arroz integral e o arroz parboilizado integral apresentaram similaridade em relação à composição química. / Brown rice (Oryza sativa L.) is rich in phenolic compounds which, from an analytical point of view, may be found in free, conjugated (soluble) and bound (insoluble) forms. These substances are known for their potential benefits in the prevention of oxidative stress-related diseases. However, the effects of technological processes, such as parboiling, on these compounds and their antioxidant capacity are yet unknown. The objective of this study was to evaluate the variability of phenolic compounds and their fractions (soluble and insoluble), as well as their antioxidant activity, in three economically attractive rice cultivars from different planting regions and harvest periods. Furthermore, the effect on these substances by the parboiling process of brown rice was also investigated. In addition, the chemical composition of nine samples of brown rice and parboiled brown rice were determined in order to contribute to food composition data tables. Fifty four brown rice samples of three commercial cultivars, provided by Epagri/Itajaí Experimental Station, were cultivated simultaneously with irrigation system by different producers in three regions of Santa Catarina and harvested in 2007/2008 and 2008/2009. Twenty seven samples, from the first harvest, were analyzed before and after parboiling. Soluble phenolic compounds were extracted with EtOH 80% and bound phenolics were released by NaOH, then extracted with ethyl acetate. The Folin-Ciocalteu spectrophotometric method was applied to quantify phenolic compounds, while antioxidant activity was measured by the oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay and by the 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging method. The average content of total phenolic compounds in non-parboiled brown rice was approximately 1300 mg eq. ferulic acid/kg, while the ratio between soluble and insoluble fractions was 55:45. The period of harvest had greater influence on the phenolic contents than cultivation area. The parboiling process decreased on about 32% the mean soluble phenolic content, while insoluble compounds were not affected, despite individual variations with gains and losses. Both, the ORAC and DPPH methods used to evaluate antioxidant activity, were equally suitable to assess parboiled and non-parboiled rice extracts. In non-parboiled rice antioxidant capacity was mainly due to soluble phenolics, while in parboiled rice both soluble and insoluble fractions contributed almost equally. Correlation coefficients between soluble phenolics and antioxidant activity were high for both DPPH and ORAC methods. Moreover, chemical composition was similar between parboiled and non-parboiled brown rice.

O controle da podridão parda do pessegueiro (Monilinia fructicola) é realizado essencialmente por aplicações preventivas de fungicidas, em sua maioria sistêmicos com modo de ação específico. O uso contínuo desses fungicidas pode levar à seleção de indivíduos resistentes ao ingrediente ativo e, consequentemente, à perda da eficiência do controle nos pomares. A evolução da população de isolados resistentes ao longo do tempo, na ausência do fungicida, pode ser prevista com estudos de habilidade competitiva entre isolados resistentes e sensíveis. Portanto, a quantificação da adaptabilidade (fitness) e da estabilidade, necessárias para caracterizar os isolados encontrados em campo, auxiliarão nas estratégias antirresistência. Embora a importância da determinação da adaptabilidade de isolados resistentes seja reconhecida, há poucos métodos descritos para a análise da habilidade competitiva. Assim, esse trabalho verificou a adaptabilidade, a estabilidade e a habilidade competitiva de isolados de M. fructicola com diferentes níveis de sensibilidade à azoxistrobina em experimentos in vitro e em frutos de pêssegos (in natura e enlatado) utilizando metodologias de avaliação diversas. A caracterização dos isolados foi realizada in vitro, in vivo e molecularmente. Foram avaliados o diâmetro da colônia e a esporulação in vitro; o período de incubação e de latência, a incidência e a severidade da doença e a esporulação in vivo dos isolados separadamente. Os dados de esporulação in vitro foram submetidos ao teste de Kruskal-Wallis e os dados de crescimento micelial ao teste de Tukey com 5% de probabilidade. Para a análise dos dados in vivo, utilizou-se a análise multivariada. Dez transferências em meio de cultura sem fungicida foram realizadas para o estudo da estabilidade de dois isolados resistentes (SP08435 e SP09839) e um sensível (PR09638). A esporulação, a porcentagem de germinação de conídios e o diâmetro da colônia dos isolados em meio de cultura com fungicida foram avaliados em quatro transferências (inicial, terceira, sexta e última transferência). A habilidade competitiva foi verificada pela evolução da porcentagem de indivíduos resistentes no tempo entre um isolado resistente (SP09839) e um sensível à azoxistrobina (PR09638). Modelos lineares ou modelos lineares generalizados (GLM) foram utilizados para descrever o progresso da proporção do isolado resistente ao longo do tempo. Os isolados resistentes exibiram esporulação in vitro e taxa de crescimento micelial semelhantes aos sensíveis, além de apresentarem-se no mesmo grupo de similaridade que os isolados sensíveis. Nenhuma mutação no cyt b foi associada à resistência de M. fructicola à azoxistrobina (G143A, G137R, e F129L) e em todos os isolados foi observado o íntron antes do códon 143. Mesmo após 10 transferências em meio de cultura sem fungicida, os isolados resistentes à azoxistrobina não reduziram sua sensibilidade nem sua capacidade de esporulação e crescimento fora do pêssego. Independentemente da metodologia utilizada para avaliar a habilidade competitiva, a resistência à azoxistrobina não correspondeu a um custo adaptativo para M. fructicola, pois a proporção do isolado resistente manteve-se inalterada ao longo das transferências. O uso de pêssego enlatado é recomendado na substituição de frutos in natura para experimentos de habilidade competitiva. / Control of brown rot in peaches (caused by Monilinia fructicola) is mainly by preventive applications of fungicides, mostly single-target site. Repeated use of these fungicides can, however, select for resistant pathogen populations, which may result in failure of disease control. The evolution of resistant isolates in a population over time can be predicted with competitive ability assays between sensitive and resistant isolates. Therefore, studies quantifying pathogen fitness and stability are necessary to characterize field isolates and improve anti-resistant strategies. However, there are limited reports concerning the methodology used in competitive ability assays. This study determined the fitness of M. fructicola isolates with different levels of sensitivity to azoxystrobin in trials in vitro and in vivo (in natura and canned peaches) with different monocyclic components. Isolates characterization were carried out in vitro, in vivo and molecularly. Mycelial growth rate and sporulation were estimated in vitro, and disease incidence, severity, lesion sporulation, incubation and latent period were evaluated in peach fruit for sensitive and resistant isolates. Sporulation in vitro data were analyzed by Kruskal-Wallis test and mycelial growth rate with the Tukey test at 5% probability. For the in vivo experiments, multivariate analysis were carried out. Ten consecutive transfers on non-amended media were conducted to determine the stability of isolates (two resistant and one sensitive). Sporulation, percent spore germination and colony diameter on azoxystrobin amended media were also evaluated four times (the first, the third, the sixth and the last transfer). Competitive ability was investigated by testing the percentage increase of resistant individuals five generations after inoculation with a mix of azoxystrobin sensitive and resistant isolates. The competitive ability of sensitive and resistant isolates were compared with different variables as colony-forming unit and spore germination. Linear or generalized linear models (GLM) were adjusted to compare the progress of resistant isolates over time. All resistant isolates had in vitro sporulation and mycelial growth rate similar to sensitive isolates. All isolates sequenced presented an intron close to codon 143 and did not have any of the point mutations commonly associated with resistance to QoI fungicides (G143A, G137R, and F129L). After 10 transfers in PDA, colony diameter of resistant isolates was not reduced in azoxystrobin-amended media with 1 μg.ml-1 nor was their sporulation in vitro For all parameters used to measure competitive ability, no fitness cost was associated to M. fructicola isolates resistant to azoxystrobin. Canned peach is a viable option for studies aiming to determine fitness cost of resistant isolates.

Mitochondria play a central role in lipid metabolism and pathology in obesity and type 2 diabetes mellitus. Mitochondria have been shown to associate with lipid droplets (LDs) in multiple tissues but the functional role of these peridroplet mitochondria (PDM) is unknown. This work reveals that PDM have unique protein composition and cristae structure, and remain adherent to the LD in the tissue homogenate. We developed an approach to isolate PDM based on their adherence to LDs. Comparison of purified PDM to cytoplasmic mitochondria reveals that (1) PDM have increased pyruvate oxidation, electron transport, and ATP synthesis capacities. (2) PDM have reduced beta oxidation capacity and depart from LDs upon activation of brown adipose tissue thermogenesis and beta oxidation. (3) PDM support LD expansion as Perilipin 5-induced recruitment of mitochondria to LDs increases ATP-dependent triacylglyceride synthesis. (4) PDM maintain a distinct protein composition due to uniquely low fusion-fission dynamics. We conclude that PDM represent a segregated mitochondrial population with unique structure and function that supports triacylglyceride synthesis. We suggest that increased mitochondrial recruitment to LDs may be part of a generalized adaptive response in physiological conditions that require LD expansion, such as post-prandial lipid synthesis and storage. Furthermore, PDM-mediated LD expansion may play a role in muscle and liver injury from lipotoxicity in conditions of nutrient excess, such as obesity and hyperlipidemia. A better understanding of PDM and LD biology may therefore lead to new therapies for lipotoxic tissue injury and insulin resistance. / 2020-10-24T00:00:00Z

Orientador: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Coorientador: Flávio Politi / Banca: Ilio Montanari Junior / Banca: Luis Vitor do Sacramento / Resumo: O Brasil é um dos maiores exportadores de carne bovina do mundo, entre 2003 e 2008 a receita com exportações cresceu de um bilhão para mais de cinco bilhões de dólares. Apesar disso, o setor enfrenta perdas consideráveis devido à ocorrência de infestações massivas de ectoparasitas como os carrapatos da espécie Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Ainda dentro do agronegócio, outra produção que se encontra em amplo crescimento e demonstrando grande potencial de ganho de espaço no mercado internacional é a ovinocultura, com rebanho estimado em 14 milhões de animais, colocando o Brasil em 18º lugar no ranking mundial de exportações. Porém, existem grandes perdas econômicas devido à existência de infestações com endoparasitas, como o nematódeo gastrintestinail da espécie Haemonchus contortus. Em paralelo à preocupação com os prejuízos financeiros no agronegócio, outra espécie de carrapato, Rhipicephalus sanguineus, desperta interesse dos pesquisadores por ser o vetor de microrganismos causadores de importantes doenças em cães nas regiões tropicais e subtropicais. Devido ao mau uso, acaricidas e nematicidas sintéticos tem ocasionado o fenômeno de resistência, com isso a busca por novas substâncias a partir de espécies vegetais configura-se numa alternativa muito promissora para o controle desses parasitas. A espécie Achyrocline satureioides (Lam.) D.C. (Asteraceae), popularmente conhecida como macela, possui em sua composição compostos fenólicos, sobretudo flavonóis e flavanonas, ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Brazil is one of the largest beef exporter in the world and between 2003 and 2008, revenue from exports grew from one billion to more than five billion dollars. Nevertheless, the sector is facing considerable losses due to the occurrence of massive infestations of ectoparasites such as tick species of Rhipicephalus (Boophilus) microplus. In the agribusiness, another production that is in ample growth and showing great potential for space gain in the international market is the sheep industry, with herd estimated at 14 million animals, placing Brazil in 18th position in the world exports ranking. However, there are great economic losses due to the infestations of endoparasites, such as the gastrointestinal nematodes species of Haemonchus contortus. In parallel to the concern about the financial losses in agribusiness, other tick species, Rhipicephalus sanguineus, arouses interest of researchers for being the vector of microorganisms that causes major diseases to dogs in tropical and subtropical regions. Due to misuse of synthetic antiparasitic, which causes the phenomenon of resistance to them, the search for new substances from plant species sets up a very promising alternative for the biological control. The species Achyrocline satureioides (Lam.) DC (Asteraceae), popularly known as macela, has in its composition phenolic compounds, particularly flavonols and flavanones in the inflorescences. Based on the aspects, this study aimed to analyze the effectiveness of extractives of the first Brazilian cultivar of A. satureoides developed in the CPQBA on ticks R. (B.) microplus and R. sanguineus, as well as on the nematode H. contortus, using in vitro assays. The essential oil and the extracts of inflorescences of macela have shown that this plant has high activity on engorged females of R. (B.)... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O peso corporal dos animais tende a ser relativamente estável durante longos períodos de tempo. Situações de restrição calórica ou aumento na ingestão de calorias levam a alterações fisiológicas compensatórias que resistem aos efeitos destas perturbações. De fato, o gasto energético aumenta em animais submetidos à dieta hipercalórica, a chamada termogênese facultativa, de modo a manter os estoques energéticos constantes. É possível que defeitos na termogênese facultativa estejam envolvidos no desenvolvimento da obesidade. O BAT, o principal sítio de termogênese facultativa, é ativado pela liberação de NE pelo Sistema Nervoso Simpático, que se liga aos receptores adrenérgicos b1, b2 e b3 expressos nos adipócitos marrons. Diversos estudos demonstram que os receptores b são importantes na proteção contra a obesidade, mas ainda não é claro qual o papel de cada isoforma neste processo. Assim sendo, o objetivo do nosso trabalho foi avaliar o papel das isoformas b1 e b2 na mediação da termogênese facultativa induzida pela dieta. Para tanto, nós tratamos camundongos com nocaute para o receptor adrenérgico b1 (KOb1) e camundongos com nocaute para o receptor b2 (KOb2) com dieta hipercalórica por 22 semanas. O peso corporal foi medido diariamente e o consumo de oxigênio foi determinado usando-se um sistema de respirometria aberto ao final do experimento. A composição corporal foi determinada pela análise da carcaça. Animais foram expostos ao frio de 4ºC por 4h e sua temperatura corporal foi medida em vários tempos e a resposta térmica do iBAT foi determinada pela infusão de NE ou agonista b adrenérgico. Além disso, foram determinados os níveis de RNAm das isoformas de receptores adrenérgicos b nos animais nocaute. Os resultados obtidos em nosso estudo mostram que os animais KOb1 e KOb2 tratados com dieta hipercalórica não desenvolvem obesidade mais severa do que os animais selvagens mas não são capazes de aumentar o consumo de oxigênio induzido pela dieta, sugerindo que estes receptores não são relevantes na termogênese induzida pela dieta. Por outro lado, nossos dados indicam que a presença do receptor b1 é exigida para termogênese induzida pelo frio, uma vez que os camundongos KOb1 são sensíveis ao frio e a capacidade termogênica do BAT destes animais em reposta à NE é bastante reduzida quando comparados com animais selvagens. A ausência do receptor b2 não piora a resposta dos animais ao frio sugerindo que esta isoforma não esteja envolvida na termogênese induzida pela dieta ou pelo frio. Os nossos achados indicam que a isoforma do receptor adrenérgico b1 é fundamental na termogênese induzida pelo frio, mas não pela dieta. Além disso, é provável que a termogênese induzida pela dieta seja regulada por mecanismos distintos da termogênese induzida pelo frio. / The body weight of animals tends to be relatively stable over long periods of time. Situations of caloric restriction or increase in intake of calories lead to compensatory physiological changes that resist the effects of these disorders. In fact, the energy expenditure increases in animals treated with diet hypercaloric called facultative thermogenesis, in order to keep to energy stock constant. Defects in this facultative thermogenesis may be related to the development of obesity. Brown adipose tissue is the main site of facultative thermogenesis and is activated by signaling of b1, b2 e b3 adrenergic receptors by Norepinephrine released by Sympathetic Nervous System. Several studies showed that the isoforms b of adrenergic receptors are important in mechanisms involved in obesity and also in promoting cold tolerance. Nonetheless, it is unclear the role of each isoform in these process. Therefore, the purpose of our study was to evaluate the role of isoforms b1 and b2 in mediate the facultative thermogenesis. For that, we fed nocaute mice for the adrenergic receptor b1 (KOb1) and nocaute mice for the adrenergic receptor b2 (KOb2) with high fat diet for 22 weeks. During treatment body weight was determined daily. By the end of the experiment oxygen consumption was measured using a system of open respirometry and body composition was determined by analysis of the carcass. We also exposed KOb1 and KOb2 animals to cold (4C). The thermogenic response of iBAT was evaluated through i.v NE infusion. The results obtained in our study showed that the animals KOb1 and KOb2 treated with high fat diet did not gain more fat when compared to wild type animals, but are unable to increase the oxygen consumption, suggesting that these receptors are not relevant in development of obesity. Furthermore, our data indicate that the presence of the b1 receptor is required for cold-induced thermogenesis, since the KOb1 mice are sensitive to cold and BAT thermogenic response is significantly impaired when compared with animals wild type. The absence of b2 receptor does not worsen the response of animals to cold suggesting that this isoform is not involved in the diet- or cold- induced thermogenesis. In conclusion, our findings indicate that the b1 isoform of the adrenergic receptor is critical in the cold-induced thermogenesis, but not in diet induced thermogenesis. Moreover, it is likely that the diet-induced thermogenesis and cold-induced thermogenesis are regulated by different mechanisms.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2017-03-07T12:48:04Z No. of bitstreams: 1 Francisco Alberto de Sousa Lima Filho.pdf: 1454767 bytes, checksum: 0054a45daadb72e9247013cb331f0853 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-07T12:48:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Francisco Alberto de Sousa Lima Filho.pdf: 1454767 bytes, checksum: 0054a45daadb72e9247013cb331f0853 (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Cassava (Manihot esculenta Crantz) plays an important role in human food. Among the diseases affecting this crop, the brown spot, caused by the fungus Passalora henningsii (Allesch.) R. F. Castañeda & U. Braun, is one the main diseases. The high intensity of this leaf spot, observed in the state of Pernambuco, together with the scarcity of information, demonstrate the need of further studies on this disease. Thus, the objectives of this research were: i) to develop, validate and verify the applicability of two diagrammatic scales to quantify the severity of brown spot on leaves and leaflets of cassava; ii) to study the epidemy of the disease in different areas in the Pernambuco state. To elaborate the diagrammatic scales, cassava leaves showing symptoms of the disease were scanned and the severity value was calculated using the Assess software. Two scales were developed, one to leaves and another to leaflets, each containing eight levels of severity (0.1; 0.6; 1.5; 3.0; 6.0; 11.0; 16.0 and 24.0%). The diagrammatic scales were validated by untrained evaluators, and both produced more accurate and precise estimates of the severity of brown spot of cassava. To assess the seasonality of brown spot in the Pernambuco state, 12 areas of commercial cultivation were selected during the season 2015/2016. The incidence was evaluated by counting the number of diseased leaves and the severity was measured with the aid of diagrammatic scale previously elaborated. This study showed that the disease occurs in all areas evaluated in the Pernambuco state, being mainly related to precipitation. Furthermore, it was found that some cultivars were more susceptible to disease. / A mandioca (Manihot esculenta Crantz) apresenta um importante papel na alimentação humana e animal, sendo a sexta cultura de maior produção no mundo. Dentre os problemas que afetam a cultura, destacam-se as manchas foliares, principalmente a mancha parda (MP), causada pelo fungo Passalora henningsii (Allesch.) R.F. Castañeda & U. Braun. A alta intensidade desta mancha foliar, observada no estado de Pernambuco, aliada à escassez de informações, demonstram a necessidade de estudos mais aprofundados acerca desta doença. Diante disso, os objetivos desta pesquisa foram: i) desenvolver, validar e verificar a aplicabilidade de duas escalas diagramáticas para quantificação da severidade da mancha parda em folhas e folíolos de mandioca; ii) estudar a epidemia da doença em diferentes áreas no Agreste de Pernambuco. Para elaborar as escalas diagramáticas, folhas de mandioca apresentando sintomas da doença foram digitalizadas e o valor de severidade calculado utilizando o software Assess. Foram desenvolvidas duas escalas, sendo uma para o folíolo central e outra para folha composta, cada uma contendo oito níveis de severidade (0,1; 0,6; 1,5; 3,0; 6,0; 11,0; 16,0 e 24,0%). As escalas foram validadas por avaliadores inexperientes, e verificou-se que ambas propiciaram estimativas mais acuradas e precisas da severidade da mancha parda. Para avaliar a sazonalidade da MP no Agreste de Pernambuco, foram selecionadas 12 áreas de cultivo comercial de mandioca durante a safra 2015/2016. A incidência foi avaliada pela contagem do número de folhas doentes e a severidade foi medida com o auxílio da escala de folha composta previamente elaborada. Este estudo mostrou que a doença ocorre em todas as áreas avaliadas no Agreste Meridional, estando relacionada principalmente com a precipitação. Além disso, foi verificado que algumas cultivares apresentam-se mais suscetíveis ao ataque do patógeno.

O objetivo deste trabalho foi avaliar se as enzimas secretadas pelo fungo de decomposição parda Gloeophyllum trabeum podem atuar como auxiliares às celulases comerciais na hidrólise de substratos celulósicos oxidados. Para isto foi realizada a oxidação de celulose microcristalina Avicel mediante reação de Fenton (Fe+2, H2O2) e tratamento com CuSO4. O substrato oxidado foi caracterizado e posteriormente foi determinado o efeito desta modificação sobre a eficiência hidrolítica de enzimas comerciais (Celluclast/Novozym) e sobre misturas destas enzimas comerciais suplementadas com extrato enzimático obtido de G. trabeum. As reações realizadas com Avicel indicaram que ambos tratamentos químicos foram efetivos para modificar grupos funcionais presentes na celulose. A caracterização fisicoquímica dos substratos oxidados permitiu concluir que o tratamento Fenton gerou transformações mais intensas na celulose do que o tratamento com CuSO4. O análise dos hidrolisados ácidos das amostras oxidadas por Fenton mediante espectrometria de massas (GC-MS) confirmou que a oxidação ocorre principalmente no C1. As hidrólises enzimáticas utilizando preparações com diferentes cargas das enzimas comerciais apresentaram uma diminuição significativa da conversão de celulose quando as amostras são tratadas com o reagente Fenton. Por outro lado, a celulose oxidada gerada pelo tratamento com CuSO4 ainda é eficientemente hidrolisada pelas enzimas. As duas amostras de celulose Avicel oxidadas também foi hidrolisada utilizando misturas de enzimas comerciais e extratos enzimáticos de G. trabeum. Em todas as condições ensaiadas a suplementação da mistura reacional com extratos enzimáticos do fungo de decomposição parda G. trabeum diminuíram a eficiência de hidrólise enzimática da celulose oxidada. O emprego do dobro de carga enzimática de enzimas comerciais permitiu recuperar os níveis de hidrólise observados na celulose in natura. / The goal of this work was to evaluate whether enzymes produced by the brown-rot fungus Gleophyllum trabeum would be able to act as auxiliary enzymes of commercial cellulases during the enzymatic hydrolysis of oxidized cellulose. To reach this goal an oxidation of microcrystalline-cellulose (Avicel) was performed by two differente reaction systems: Fenton reaction (Fe2+, H2O2) or CuSO4 treatments. The oxidized subtracts were characterized and the effect of cellulose modification on the hydrolytic efficiency of commercial enzymes, supplemented or not with the enzymes recovered from a G. trabeum culture, was determined. The Avicel treatment by the oxidative systems resulted in cellulose structural changes as evidenced by infrared spectroscopy, viscosity measurements and chemical characterization by HPLC and GC/MS chromatography of the monomers recovered after acid hydrolysis. The physicochemical characterization of the oxidized celluloses allowed to conclude that the transformation of the cellulose was more intense when Fenton treatment was used as compared with the CuSO4 treatment. The analysis of the acid hydrolysates by GC-MS indicated that the oxidation by Fenton reaction occurred mainly at the C1 of the cellulose chain, resulting in gluconic acid in the acid hydrolysates. A meaningful decrease of the cellulose conversion was observed when Fetnon-treated samples were submitted to enzymatic hydrolysis using different amounts of commercial enzymes. On the other hand, the CuSO4-oxidized cellulose was still efficiently hydrolyzed by high enzyme dosages. The oxidized Avicel substrates were also hydrolyzed using a mixture of the commercial enzymes with enzymes recovered from G. trabeum cultures. At all tested conditions, the supplementation of the reaction mixture with enzymatic extracts from G. trabeum decreased the enzymatic hydrolysis efficiency. Nevertheless, the normal levels of enzymatic hydrolysis were recovered when the commercial enzymes dosage two-fold increased.

Fungos de podridão branca e fungos de podridrão parda são capazes de degradar a biomassa lignocelulósica utilizando diferentes mecanismos. Os fungos de podridão parda degradam a celulose e a hemicelulose enquanto modificam a lignina, sendo, portanto, as enzimas hidrolíticas ativas em substrato rico em lignina. O arsenal enzimático diferenciado desses fungos torna-os alvos para prospecção de enzimas que podem ser aplicadas em diversos processos biotecnológicos. O fungo Gloeophyllum trabeum é uma das espécies mais compreendidas deste grupo, e sabe-se que é capaz de degradar a celulose sem produzir CBHs. Além disso já foi reportado uma GH5 proveniente desse organismo com caraterísticas processivas. Nossa tentativa de clonagem dessa enzima (GtGH5) em A. nidulans A773 não foi bem sucedida, todavia nosso grupo esta repetindo os passos de clonagem e expressão. No genoma desse organismo esta presente um gene que codifica uma GH45. A GtGH45 foi a clonada e expressa com alto rendimento em A. nidulans cepa A773. A expressão, secreção e acumulaçao da GtGH45 foi positiva após 72 h de incubação em meio líquido (maltose como indutor), confirma por eletroforese SDS-PAGE do extrato enzimático concentrado e dialisado. A massa molar de 18,4 kDa foi consistente com a predição da sequência de 204 amino-ácidos obtída apartir da sequência gênica e corrobora com a caracterização por espectometria de massas (18,9 kDa). A análise filogenética é consistente com estudos anteriores, agrupando a proteína alvo com outras GH45s de basidiomicetos na subfamília C. A enzima purificada foi testada para determinação da especificidade pelo substrato apresentando maior atividade em arabinoxilana, xilana, arabinoxilana e CMC e foi capaz de gero celo-oligômeros a partir da hidrólise de PASC. O pH ótimo em CMC foi 2,5, além se demonstrar ser temoestável em ensaio de Thermoflour. A hidrólise enzimática de substratos lignocelulósicos derivados de cana-de-açúcar mostrou que a GtGH45 foi eficiente para suplementar coqueteis enzimáticos comerciais, principalmente na conversão de xilana. / White-rot and brown-rot basidiomycetes are able to transform lignocellulosic materials through different mechanisms. The brown-rot fungi are able to degrade cellulose and hemicellulose meanwhile modifies lignin. The hydrolytic enzymes of these fungi act on a lignin-enriched substrate, which makes them targets to prospect new enzymes for polysaccharides hydrolysis. Gloeophyllum trabeum is one of the best understood fungal species in this group. An interesting processive GH5-endoglucanase (EG) has been described in this species suggesting an unusual pathway for lignocellulosic degradation without cellobiohydrolases (CBH). Our first attempt to clone this GtGH5 was default but our grup is trying a new attempt of heterologous expression of this protein. Furthermore, G. trabeum genome points out for a low molar mass GH45-EG. Here we report on a recombinant high-yield G. trabeum ATCC 11539 GtGH45 production system. Expression and secretion of endoglucanase GtGH45 was positive after 72 h incubation of the transformed A. nidulans stain A773 in stationary liquid cultures (maltose as inductor). The SDS-PAGE electrophoresis of ultra-filtrated extract showed a single-band GtGH45 over expressed band. The molar mass of 18,4 KDa was consistent with the predicted 204 amino acids sequence derived from gene sequence analyses and corroborates with mass spectometry characterization (18,9 KDa). Even more, the phylogenetic analyze is consistent to previews studies, clustering the target protein with others GH45 from basidiomycetes at subfamily C. The purified protein was assayed for substrate specificity showing activity against xylan, arabinoxylan and PASC. GtGH45 was able to produce cello-oligomers from PASC. The optimum pH was 2.5 with CMC as the substrate. Xylan conversion was enhanced when GtGH45 was mixed with commercial enzymes in enzymatic hydrolysis of alkaline-sulfite pretreated sugar cane bagasse.