A brusone, causada por Magnaporthe oryzae, é a principal doença da cultura do arroz no Brasil e no mundo. O manejo efetivo da doença pode ser obtido com o uso de cultivares resistentes. A alta variabilidade genética e a capacidade de adaptação do patógeno, por pressão de seleção, no entanto, tem diminuído o tempo de vida útil decultivares plantadas extensivamente por vários anos. Este estudo objetivou caracterizar a diversidade patogênica e a estrutura populacional de uma população contemporânea de M. oryzae do Sul do Brasil. Para tal, uma população de 224 isolados foi obtida de folhas e panículas sintomáticas coletadas em 17 municípios dos Estados do Rio Grande do Sul - RS (147 isolados) e Santa Catarina - SC (77 isolados) na safra 2012/13. Todos os isolados foram inoculados em uma série internacional de oito cultivares diferenciadoras e uma séria brasileira de oito cultivares de arroz irrigado. Uma subamostra de 192 isolados foi submetida a genotipagem com dez marcadores microssatélites. No total, foram identificados 75 patótipos pela série internacional e 38 patótipos pela série nacional. Os dois patótipos mais prevalentes foram o IH-1(23 isolados), encontrado somente no RS, e o BF-4 (38 isolados). Em SC, o patótipo mais prevalente foi o IB-46 (21 isolados) Já para os patótipos brasileiros, houve o predomínio do BD-15 (34 isolados) no estado do RS e BF-4 (38 isolados) em SC. Com base nos padrões gerados pelos microssatélites, os isolados foram agrupados em quatro subpopulações, ou linhagens, distintas. Duas linhagens, encontradas no RS, foram compostas uma por isolados da cultivar Puitá INTA CL e outra por isolados da cultivar Guri INTA CL. Uma terceira linhagem agrupou isolados apenas de Santa Catarina e, por último, uma linhagem agrupou isolados distribuídos nos dois estados e em diferentes cultivares. Não houve associação entre as linhagens e os patótipos brasileiros ou internacionais. O número de patótipos internacionais identificados neste estudo é o maior até então relatado em uma região produtora do Brasil. As informações geradas podem ser úteis para os programas de melhoramento na busca de fontes de resistência considerando as populações distintas nas regiões produtoras do sul do Brasil. / Blast, caused by Magnaporthe oryzae, is the main disease of rice in Brazil and worldwide. The disease is effectively managed with the use of resistant varieties. The high genetic variation and adaptation due to selection pressure in the pathogenic populations affects the durability of the resistance when a few and genetically uniform varieties are grown over large areas and many years. This study aimed to characterize the pathogenic diversity and population genetic structure in a contemporary population of M. oryzae from Southern Brazil. For such, 224 isolates were obtained from symptomatic leaves and panicles collected across 17 municipalities of Rio Grande do Sul (RS, 147 isolates) and Santa Catarina (SC, 77 isolates) states during the 2012/13 season. All isolates were inoculated in a set of eight differential international varieties and another set of eight differential Brazilian varieties or irrigated rice. A subsample of 192 isolates was genotyped using ten microsatellite markers. In total, 75 and 38 pathotypes were identified based on the international and Brazilian differential sets, respectively. The most prevalent pathotypes were IH-1 (23 isolates), found only in RS, and BF-4 (38 isolates) In SC, the most prevalent pathotype was the IB-46 (21 isolates). For the Brazilian pathotypes, BD-15 was the most prevalent in RS state (34 isolates) and BF-4 was the most prevalent in SC (38 isolates). The molecular analysis showed that the microsatellites markers were highly polymorphic, revealing high variation within and among the four populations structured by cultivar and geography. Two lineages were found solely in one of two varieties: Puitá INTA CL and Guri INTA CL. A third lineage was found only for isolates from SC State. Finally, a fourth lineage was composed of isolates spread out through both states and several varieties. No association was found between the lineages and the groups of international or Brazilian pathotypes. The number of international pathotypes identified in this study is the largest reported in a production region of Brazil. The information from this study may be useful for breeding programs targeting sources of resistance taking into account the current profile of the populations of the rice blast pathogen from Southern Brazil.

A brusone, causada por Magnaporthe grisea, é a doença mais importante do arroz. Uma vez que, o uso de cultivares resistentes é o método mais efetivo para o controle da doença, a pesquisa visa a identificação de novos genes que confiram resistência mais durável. O objetivo deste trabalho foi a identificação de cultivares que contenham os genes de resistência Pi-1, Pi-2 e Pi-11 utilizando marcadores moleculares. RG64, um marcador RFLP baseado em PCR, foi utilizado para verificar a presença do gene Pi-2 em 250 cultivares de arroz. Trinta e três cultivares apresentaram o mesmo perfil eletroforético da linha-quaseisogênica (NIL) C101A51, que contém o gene Pi-2. Verificou-se que 28 cultivares foram resistentes aos isolados inoculados, indicando que RG64 possui alta eficiência para a seleção de cultivares que contêm o gene Pi-2. Três marcadores microssatélites (RM) foram utilizados para verificar a presença do gene Pi-1 em 104 cultivares de arroz. Trinta cultivares, analisadas com RM254, apresentaram o mesmo perfil da NIL C104LAC, que contém o gene Pi-1. Verificou-se que 19 cultivares foram resistentes aos isolados inoculados. Três marcadores microssatélites foram utilizados para verificar a presença do gene Pi-11 em 104 cultivares de arroz. Oito cultivares, analisadas com RM210, apresentaram o mesmo perfil da NIL IR1529, que contém o gene Pi-11, mas somente uma foi resistente. Com exceção do RM254, os demais marcadores microssatélites tiveram baixa eficiência de seleção de cultivares com o mesmo perfil das NILs. Estes resultados indicam que o uso de marcadores moleculares pode ser útil para acelerar o processo de lançamento de cultivares com resistência à brusone. No entanto, ainda é preciso aumentar a eficiência de seleção, através de marcadores microssatélites com localização cromossomal mais próxima dos genes Pi-1 e Pi- 11. Em um futuro próximo, isto poderá ser possível com a disponibilização de mapas moleculares de maior resolução.

Made available in DSpace on 2015-07-13T12:10:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-19. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-13T12:25:26Z : No. of bitstreams: 1 000835322.pdf: 1349402 bytes, checksum: 6824fb0da8e130401e3643e5692b2aad (MD5) / A brusone, causada por Pyricularia oryzae, é a doença mais importante do trigo em todo Centro-Sul do Brasil. Seu controle tem dependido, fortemente do uso de fungicidas estrobilurinas, inibidores de quinona oxidase, QoI. Resistência aos fungicidas QoI (QoI-R) já foram constatadas para diversos patossistemas em todo o mundo. Neste trabalho testou-se a hipótese principal de que as populações brasileiras de P. oryzae associadas com o trigo permanecem sensíveis aos fungicidas QoI. Em contraste, foi testada a hipótese alternativa de que o uso extensivo e consecutivo de fungicidas QoI nas duas últimas décadas para o manejo da brusone do trigo na região Centro-Sul do Brasil, levou à emergência e a distribuição generalizada de QoI-R em populações de P. oryzae associadas ao trigo nas principais áreas de cultivo do país. Determinou-se, também, se outras espécies de plantas poáceas adjacentes a campos de trigo hospedavam populações QoI-R de P. oryzae, servindo como um reservatório de inóculo do patógeno resistente. Os principais objetivos foram estudar a ocorrência e a distribuição da resistência aos fungicidas QoI em populações de P. oryzae associadas ao trigo e a outras espécies de plantas poáceas adjacentes a campos de trigo no Centro-Sul do Brasil, examinando as mutações no gene citocromo b (cyt b) e determinando a sensibilidade dos isolados de P. oryzae a azoxistrobina em experimentos in vitro. Foi analisada a distribuição generalizada de QoI-R em populações de P. oryzae em campos brasileiros de trigo de 325 isolados, dos quais 198 foram derivados de trigo e 91 de outras plantas poáceas amostradas nos mesmos campos de trigo, em 2012, e 36 isolados de trigo obtidos em 2005. O sequênciamento do gene cyt b distinguiu nove haplótipos, dois compartilhados entre trigo e outras plantas poáceas e sete exclusivos de outras plantas poáceas. Quatro desses haplótipos... / Wheat blast disease caused by Pyricularia oryzae is the most important across central- southern Brazil. Its control has relied strongly on strobilurin fungicides (Quinone oxidase inhibitors, QoI). Resistance to QoI (QoI-R) has been reported for several pathosystems worldwide. In this study we tested the hypothesis that the main Brazilian populations of P. oryzae associated with wheat remain sensitive to QoI fungicides. In contrast, the alternative hypothesis that extensive and consecutive use of QoI fungicides in the last two decades for the management of wheat blast in the Center-South region of Brazil was tested, led to the emergence and widespread distribution QoI-R in populations P. oryzae associated with the wheat in the main growing areas of the country. It is determined also whether other species of grasses adjacent fields of wheat plants housed QoI R-populations of P. oryzae, serving as a resistant pathogen inoculum reservoir. The main objectives were to study the occurrence and distribution of resistance to QoI fungicides in P. oryzae populations associated with wheat and other species of plants grasses adjacent to wheat fields in South-Central Brazil, examining mutations in the cytochrome b gene (cyt b) and determining the sensitivity of the isolates of P. oryzae azoxystrobin in vitro experiments. In this study, we report the widespread distribution of QoI-R in populations of P. oryzae from Brazilian wheat fields of 325 isolates, of which 198 derived from wheat fields and 91 from weeds within wheat fields sampled in 2012, and 36 from wheat sampled in 2005. Sequencing of cytB gene distinguished nine haplotypes, two of which shared between wheat and weeds-derived isolates, and seven exclusive to weed isolates. Four of these haplotypes had the G143A mutation associated with resistance to QoI (QoI-R). While 90% of the wheat isolates of P. oryzae and 48% of the weed-derived ones sampled in 2012 ...

A brusone, causada por Magnaporthe grisea, é a doença mais importante do arroz. Uma vez que, o uso de cultivares resistentes é o método mais efetivo para o controle da doença, a pesquisa visa a identificação de novos genes que confiram resistência mais durável. O objetivo deste trabalho foi a identificação de cultivares que contenham os genes de resistência Pi-1, Pi-2 e Pi-11 utilizando marcadores moleculares. RG64, um marcador RFLP baseado em PCR, foi utilizado para verificar a presença do gene Pi-2 em 250 cultivares de arroz. Trinta e três cultivares apresentaram o mesmo perfil eletroforético da linha-quaseisogênica (NIL) C101A51, que contém o gene Pi-2. Verificou-se que 28 cultivares foram resistentes aos isolados inoculados, indicando que RG64 possui alta eficiência para a seleção de cultivares que contêm o gene Pi-2. Três marcadores microssatélites (RM) foram utilizados para verificar a presença do gene Pi-1 em 104 cultivares de arroz. Trinta cultivares, analisadas com RM254, apresentaram o mesmo perfil da NIL C104LAC, que contém o gene Pi-1. Verificou-se que 19 cultivares foram resistentes aos isolados inoculados. Três marcadores microssatélites foram utilizados para verificar a presença do gene Pi-11 em 104 cultivares de arroz. Oito cultivares, analisadas com RM210, apresentaram o mesmo perfil da NIL IR1529, que contém o gene Pi-11, mas somente uma foi resistente. Com exceção do RM254, os demais marcadores microssatélites tiveram baixa eficiência de seleção de cultivares com o mesmo perfil das NILs. Estes resultados indicam que o uso de marcadores moleculares pode ser útil para acelerar o processo de lançamento de cultivares com resistência à brusone. No entanto, ainda é preciso aumentar a eficiência de seleção, através de marcadores microssatélites com localização cromossomal mais próxima dos genes Pi-1 e Pi- 11. Em um futuro próximo, isto poderá ser possível com a disponibilização de mapas moleculares de maior resolução.

A brusone, causada por Magnaporthe grisea, é a doença mais importante do arroz. Uma vez que, o uso de cultivares resistentes é o método mais efetivo para o controle da doença, a pesquisa visa a identificação de novos genes que confiram resistência mais durável. O objetivo deste trabalho foi a identificação de cultivares que contenham os genes de resistência Pi-1, Pi-2 e Pi-11 utilizando marcadores moleculares. RG64, um marcador RFLP baseado em PCR, foi utilizado para verificar a presença do gene Pi-2 em 250 cultivares de arroz. Trinta e três cultivares apresentaram o mesmo perfil eletroforético da linha-quaseisogênica (NIL) C101A51, que contém o gene Pi-2. Verificou-se que 28 cultivares foram resistentes aos isolados inoculados, indicando que RG64 possui alta eficiência para a seleção de cultivares que contêm o gene Pi-2. Três marcadores microssatélites (RM) foram utilizados para verificar a presença do gene Pi-1 em 104 cultivares de arroz. Trinta cultivares, analisadas com RM254, apresentaram o mesmo perfil da NIL C104LAC, que contém o gene Pi-1. Verificou-se que 19 cultivares foram resistentes aos isolados inoculados. Três marcadores microssatélites foram utilizados para verificar a presença do gene Pi-11 em 104 cultivares de arroz. Oito cultivares, analisadas com RM210, apresentaram o mesmo perfil da NIL IR1529, que contém o gene Pi-11, mas somente uma foi resistente. Com exceção do RM254, os demais marcadores microssatélites tiveram baixa eficiência de seleção de cultivares com o mesmo perfil das NILs. Estes resultados indicam que o uso de marcadores moleculares pode ser útil para acelerar o processo de lançamento de cultivares com resistência à brusone. No entanto, ainda é preciso aumentar a eficiência de seleção, através de marcadores microssatélites com localização cromossomal mais próxima dos genes Pi-1 e Pi- 11. Em um futuro próximo, isto poderá ser possível com a disponibilização de mapas moleculares de maior resolução.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-01-13T17:55:23Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lorena Ferreira Peixoto - 2014.pdf: 2832669 bytes, checksum: ed2f415262daf1618ecdf785ad9bfb22 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-01-16T10:48:26Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lorena Ferreira Peixoto - 2014.pdf: 2832669 bytes, checksum: ed2f415262daf1618ecdf785ad9bfb22 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-16T10:48:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lorena Ferreira Peixoto - 2014.pdf: 2832669 bytes, checksum: ed2f415262daf1618ecdf785ad9bfb22 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-08-15 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Rice is a worldwide cultivated and consumed grain, playing an important role on the diet of half of the world’s population. Several losses in production and grain quality have been reported due to biotic factors, such as rice blast, caused by Magnaporthe oryzae, which is the major disease in rice crops. One of the most effective ways to control this disease is the use of resistant cultivars. However, the high genetic variability of the pathogen results in a rapid resistance loss. The discovery of highly fertile, hermaphrodites individuals outside of the rice center of origin, suggests that sexual reproduction may contribute to this genetic variability, which influences the appropriate control strategies. M. oryzae reproduction studies begins with the determination of mating types, controlled by two idiomorphic genes (MAT1-1 e MAT1-2), along with the sexuality (hermaphrodite, female or male) and fertility (number of perithecia). Another important approach under investigation for this crop is the detection of avirulence genes from M. oryzae, to understand the pathogen variability. Our study focused on the investigation of MAT1-1 or MAT1-2 genes, and the presence of the avirulence gene AVR1-CO39in field isolates collected from all rice production regions from Brazil. Sexuality and fertility were also characterized. 208 selected isolates were cultivated in PDA medium and the fungus mycelia were used for DNA extraction and PCR detection of the above-mentioned genes. For the sexual characterization, 106 field isolates were paired in Petri dishes containing rice bran medium with two reference isolates: KA-3 (MAT1-1) and GUY11 (MAT1-2), known worldwide for their mating type and high fertility. The AVR1-CO39 gene was only detected in two field isolates. One of them was able to infect the rice cultivar CO39, which has the resistance gene Pi-CO39(t). A mutation on AVR1-CO39 gene could impair the recognition of its effector by Pi-CO39(t) protein. Only one mating type (MAT1-2) was observed on the 208 field isolates. It was also observed that, among the 106 analyzed isolates, one (0,94%) was identified as a female; three (2,8%) as hermaphrodite, 62 (57,9%) as male; and 41 (38,3%) were not determined, considered infertile. We also observed the formation of perithecia inside of rice leaves. Despite the predominance of one mating type among rice field isolates, there is a possibility that sexual reproduction may occur as the other idiomorphic gene (MAT1-1) is present on field isolates collected from other Poaceae. The identification of highly fertile hermaphrodites and fertile-female individuals in this study also highlight this possibility. / O arroz é cultivado e consumido em todos os continentes, desempenhando um importante papel na dieta de mais da metade da população mundial. O seu cultivo vem sofrendo perdas na produção e na qualidade de grãos, devido a fatores bióticos como a brusone, causada pelo fungo Magnaporthe oryzae, que é a principal doença da cultura do arroz, representando uma ameaça à segurança alimentar mundial. O uso de cultivares resistentes é considerado o método mais efetivo para o controle da doença, porém, a alta variabilidade do patógeno resulta em uma rápida suplantação da resistência. Com a descoberta de isolados de alta fertilidade, hermafroditas, fora do centro de origem do arroz, sugere-se que a reprodução sexuada possa estar contribuindo para esta variabilidade genética, o que consequentemente influencia as estratégias apropriadas de controle. O estudo da reprodução sexuada em M. oryzae inicia-se com a definição dos tipos compatíveis, característica controlada pelo gene mating type com dois idiomorfos (MAT1-1 e MAT1-2); além das características como sexualidade (hermafrodita, fêmea ou macho) e fertilidade (número de peritécios). Outra abordagem de grande importância para a cultura é a detecção de genes de avirulência de M. oryzae, visando estudos de sua variabilidade. Dessa forma, o objetivo desta pesquisa foi investigar a presença dos genes MAT1-1 ou MAT1-2, e do gene de avirulência AVR1-CO39, em isolados coletados em todas as regiões produtoras de arroz do Brasil, além de caracterizá-los quanto à sexualidade e fertilidade. Foram selecionados 208 isolados que forma cultivados em BDA e seus micélios utilizados para extração de DNA e detecção dos genes citados. Para a caracterização sexual, 106 isolados de campo foram pareados em placa de Petri, contendo meio de farelo de arroz, com dois isolados: KA-3 (MAT1-1) e GUY11 (MAT1-2), os quais apresentam mating types e alta fertilidade, conhecidos mundialmente. O gene AVR1-CO39 foi detectado em apenas dois isolados, e um deles é patogênico à cultivar CO39, portadora do gene de resistência Pi-CO39(t), levantando a possibilidade de que uma mutação possa ter ocorrido, como deleção, o que impossibilita o reconhecimento do efetor pela proteína do gene Pi-CO39(t). Apenas um tipo compatível (MAT1-2) foi observado nos 208 isolados de campo. Foi observado também que, entre os 106 isolados analisados, um (0,94%), foi identificado como fêmea; três (2,8%), como hermafroditas; 62 (57,9%), como machos; e 41 (38,3%), como não determinados, sendo considerados inférteis. Observou-se também a formação de peritécios no interior da folha de arroz. Apesar do predomínio de um mating type, entre os isolados do arroz, há a possibilidade de ocorrência da reprodução sexuada, devido à presença do outro idiomorfo (MAT1-1) em isolados coletados de outras gramíneas, juntamente com a presença de hermafroditas e da fêmea-fértil, com alta fertilidade, de isolados MAT1-2 identificados nesse trabalho.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-20T18:33:23Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 20005358 bytes, checksum: 1121af69167ca6262a2059e1892c3134 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-20T18:33:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 20005358 bytes, checksum: 1121af69167ca6262a2059e1892c3134 (MD5) Previous issue date: 2003-12-12 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Em Magnaporthe grisea, agente causal da brusone, mutagênese insercional mediada por transformação tem constituído estratégia para a identificação de genes essenciais para a patogenicidade em arroz. A técnica REMI, integração mediada por enzima de restrição, merece destaque em virtude da eficiência de transformação e da predominância de integrações simples. Visando a implantação de programa de mutagênese insercional em M. grisea, os objetivos deste trabalho incluíram: (1) adequar as condições para a obtenção e regeneração de protoplastos do ascomiceto, (2) estabelecer sistema de transformação REMI em M. grisea, avaliando o potencial dos protoplastos e do vetor pAN7-1 e (3) selecionar e caracterizar mutantes com patogenicidade alterada em plantas de arroz. Produção eficiente de protoplastos foi alcançada com o uso simultâneo de 10 mg de Lysing Enzymes e 10 mg de Cellulase Onozuka R10 em 3 mL de MgSO 4 a 1,2 M / NaH 2 PO 4 a 0,01 M (pH = 5,8). Protoplastos de M. grisea I-22 liberados com 3 horas de hidrólise enzimática apresentaram maior capacidade de regeneração da parede celular. Quando expostos ao vetor pAN7-1, os protoplastos foram prontamente transformados para a resistência à higromicina. Quando pAN7-1- HindIII foi usado para transformar I-22 na presença de HindIII, a freqüência de transformantes foi 1,1 a 8,1 vezes superior ao tratamento sem a adição da endonuclease de restrição. No geral, a melhor concentração de HindIII foi 5 unidades/reação de transformação. A partir de testes de patogenicidade envolvendo 125 transformantes, principalmente gerados por REMI, foi possível selecionar cinco mutantes com alterações consistentes na patogênese. Dois desses mutantes, T108 e T93, causaram poucas lesões em folhas de arroz, enquanto o mutante T251 não foi patogênico. A alteração na patogenicidade de T108 foi acompanhada pela menor capacidade de desenvolvimento in vitro. Quando inoculado em plantas de arroz, o mutante T41 apresentou agressividade reduzida, caracterizada por lesões arredondadas de tamanho limitado. Por sua vez, o período de incubação para o mutante T72 foi mais longo do que o do isolado selvagem. Além disso, atrasos consideráveis na germinação de conídios e na formação de apressórios foram detectados em T72. Os mutantes T93 e T251 apresentaram fenótipos semelhantes quando em cultura, caracterizados pela pigmentação marrom. Análises Southern blots de quatro mutantes indicaram que em 50 % dos casos, T108 e T251, apenas uma cópia de pAN7-1 se integrou em um único sítio no genoma. No mutante T251 ocorreu evento REMI propriamente dito. Os mutantes T41 e T93 apresentaram padrões de integração mais complexos. / Transformation mediated-insertional mutagenesis of phytopathogenic fungi is an important tool to identify genes involved in pathogenicity. An improved version of this method is the restriction enzyme mediated integration, or REMI. We chose REMI to begin an insertional mutagenesis project in M. grisea. In this work, were reported the: (1) protoplasts production and regeneration of M. grisea, (2) transformation of protoplasts with pAN7-1 mediated by restriction enzyme and (3) identification and characterization of five transformants with pathogenicity defects in rice, at the phenotypic and molecular levels. The highest protoplasts production was obtained with Lysing Enzymes plus Cellulase Onozuka R-10 and the osmotic buffer MgSO 4 at 1.2 M / NaH 2 PO 4 at 0.01 M (pH = 5.8). The highest regeneration frequency was obtained with protoplasts produced after 3 hours of incubation. The I-22 protoplasts were readily transformed for hygromycin resistance. When pAN7-1-HindIII was used to transform fungal protoplasts in the presence of the HindIII, the transformation efficiency was increased 1.1 to 8.1-fold. The optimal HindIII concentration for enhanced transformation corresponded to 5 unit/transformation mix. Out of 125 transformants screened for the ability to infect rice plants, five showed changes in pathogenicity. The T108 and T93 mutants caused few lesions in rice leaves, while the T251 mutant was non-pathogenic. The alteration in pathogenicity of T108 was accompanied by reduced development in culture. The T41 mutant caused small and limited round lesions. The incubation period of the T72 mutant was longer than of wild type. Furthermore, late germination and appresorium formation was detected in the T72 mutant. The T93 and T251 mutants had similar phenotypes, characterized by a brown-pigmented colony. Four mutants (T41, T93, T108 and T251) were examined by Southern blots. The T108 and T251 mutants contained one copy of the vector integrated at a single site in the genome. REMI event occurred in the T251 mutant. More complex integration events were observed in the T41 and T93 mutants. / Tese importada do Alexandria

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-29T18:34:52Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1000132 bytes, checksum: f8825fd96a75440247eb51ddedd55c61 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-29T18:34:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1000132 bytes, checksum: f8825fd96a75440247eb51ddedd55c61 (MD5) Previous issue date: 2016-02-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Dois experimentos (Exp. 1 e Exp. 2) foram conduzidos em condições de campo para determinar o desenvolvimento da brusone em espigas, bem como a performance fisiológica e produtiva das cultivares BR-18 (moderadamente resistente) e Guamirim (suscetível) inoculadas com Pyricularia oryzae e tratadas (+F) ou não (‒F) com o fungicida epoxiconazole (13,3%) + pyraclostrobina (5%). Relativo a Guamirim ‒F, BR-18 ‒F (efeito da resistência) resultou em redução de 44 e 64% na incidência final e severidade final, respectivamente, no Exp. 1, e 3 e 49%, respectivamente, no Exp. 2. Para a Guamirim +F (efeito do fungicida) houve redução de 65 e 77% na incidência final e severidade final, respectivamente, no Exp. 1, e 64 e 95%, respectivamente, no Exp. 2. Similarmente, houve redução maior que 75 % na taxa temporal de progresso no tratamento combinando a aplicação do fungicida e resistência de hospedeiro. Resultados obtidos na análise de regressão indicaram que a severidade encontrada nas espigas e folhas durante o período de 10-14 dias após a antese (daa) proporcionou uma maior perda de produtividade comparado a severidade encontrada aos 18-22 daa, e que a severidade da brusone nas espigas possui maior efeito negativo comparado a severidade encontrada nas folhas. Relativo a Guamirim ‒F, houve aumento de 0.3 e 16 % na produtividade dos grãos para BR-18 ‒F, 20 a 61% para Guamirim +F e 26 e 83% para BR-18 +F nos Exp. 1 e Exp. 2, respectivamente. Os tratamentos envolvendo aplicação do fungicida e cultivar resistente manteve a integridade das folhas (baseado em HAD, HLAI, HAA e HRI) e performance fotossintética (baseado em Fv/Fm, Fm, Y(II), e Y(NPQ)) das espigas e folhas em relação ao tratamento cultivar Guamirim ‒F. Em conclusão, os resultados do presente estudo sugerem que a integração do tratamento com fungicida e resistência de cultivar como prática de manejo para o controle da brusone em espigas. Adicionalmente, dois experimentos foram conduzidos em condições de casa de vegetação para avaliar as alterações associadas com a produção e particionamento de fotoassimilados entre a espiga e a folha bandeira em plantas de trigo infectadas com P. oryzae. Ambos experimentos foram inoculados aos 10 e 20 daa com suspensão de esporos de P. oryzae. Os resultados demonstraram uma redução dos parâmetros de fluorescência da clorofila a (Fm, Fv/Fm YII and Y(NO)) em folhas bandeiras e espigas infectadas associada a menor concentração de clorofila a + b, carotenoides e redução da capacidade de fixação do CO2 pela RuBisCO em folhas bandeiras infectadas. Em folhas bandeiras e grãos obtidos de espigas infectadas, houve redução na concentração de açúcares solúveis com um aumento da razão da concentração de hexoses sobre sacarose em folhas bandeiras. Em folhas bandeiras, houve menor atividade da sacarose fosfato sintase (SPS) e menor expressão do gene sacarose sintase associadas ao aumento da expressão e atividade das invertases. Estas alterações relacionadas a síntese e degradação da sacarose sugerem uma condição dreno dos tecidos foliares infectados. No estágio final de infecção ocorreu uma redução da concentração de amido nos grãos e aumento da sua concentração em folhas bandeiras. Adicionalmente, houve redução na atividade e expressão da ADP-glicose pirofosforilase associada com a menor expressão dos genes β- e α-amilase em folhas bandeiras e espigas. Em conclusão, os efeitos negativos da brusone na qualidade e produtividade dos grãos em trigo podem ser associados com alterações na produção e particionamento de carboidratos durante o processo de formação dos grãos. / Two field experiments (Exp. 1 and Exp. 2) were carried out to evaluate the spike blast development as well as the physiological performance and grain yield of wheat cultivars BR-18 (partially resistant) and Guamirim (susceptible) inoculated with Pyricularia oryzae and treated or untreated with the fungicide 13.3% epoxiconazole + 5% pyraclostrobin. Relative to Guamirim-untreated, BR-18-untreated (resistance alone) led to 44 and 64% control of final incidence and severity, respectively, in Exp. 1, and 3 and 49% control, respectively, in Exp. 2. Guamirim-treated (fungicide alone) led to 65% control of incidence and 77% control of severity in Exp. 1, and 64% control of incidence and 95% control of severity in Exp. 2. Similarly, there was reduction higher than 75 % in the temporal rate of spike blast progress when host resistance and fungicide were combined. Results from regression analyses indicated that spike and leaf blast severity at 10-14 days after anthesis resulted in greater yield losses (highest negative slope) than severity at 18 to 22 days after anthesis, and that spike blast severity had a greater negative effect on yield than leaf blast severity. Relative to Guamirim-untreated, there was a 0.3 and 16% increase in mean yield for BR-18-untreated (resistance alone), 20 and 61% increase for Guamirim treated (fungicide alone), and 26 and 83% for BR-18 treated (moderate resistance + fungicide) in Exp. 1 and 2, respectively. By virtue of their effects on blast severity, fungicide application and cultivar resistant resulted in higher measures of leaf health (mean HAD, HLAI, HAA and HRI) and photosynthetic performance (based on F v /F m , F m , Y(II), and Y(NPQ)) of both spikes and leaves than the untreated susceptible reference treatment. Results from this study suggesting that the integration of these strategies may be the best approach for managing spike blast and useful for future efforts to develop crop loss models and management guidelines for wheat blast. Additionally, two experiments were carried out in greenhouse conditions to assess the changes associated with photoassimilates production and their partitioning in source-sink relationship on flag leaves and spikes of wheat plants infected with Pyricularia oryzae. Flag leaves and spikes were inoculated at 10 days after anthesis (daa) (Exp. 1) and at 20 daa (Exp. 2) with a conidial suspension of P. oryzae. There was an impairment on chlorophyll a fluorescence parameters (analyzed by F m , F v /F m YII and Y(NO)) on the infected flag leaves and spikes coupled with reduced concentrations of chlorophyll a + b and carotenoids as well as lower capacity of CO 2 fixation by RuBisCO in the infected flag leaves. In these leaves and grains obtained from the infected spikes, there were lower concentration of soluble sugars and an increase on the hexoses to sucrose ratio on the flag leaves. In the infected flag leaves, there was a lower sucrose phosphate synthase (SPS) activity and lower expression of sucrose synthase (Susy) gene coupled with higher expression and activity of acid invertases. These alterations, associated with synthase and degradation of sucrose, suggestss a status sink in the infected flag leaves. At advanced stages of fungal infection, the concentration of starch was reduced on grains whereas on the infected flag leaves its concentration was kept elevated. There were reduction on the activity of ADP-glucose pyrophosphorylase and on the expression of ADP-glucose pyrophosphorylase genes and down regulation of β- and α-amylase expression at late stages of fungal infection on flag leaves and spikes. In conclusion, the greatest effect of blast on both grains quality and yield can be associated with alterations in the production and partitioning of carbohydrates during the grain filling process.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:39:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 745259 bytes, checksum: d378fcf86e7bec345e93ab6ddc5b11c8 (MD5) Previous issue date: 2011-07-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Wheat (Triticum spp.) is a grass grown and used as an energy source worldwide being cultivated in several regions of Brazil. However, some diseases severity and ineffective chemical control have been threatening Brazilian wheat production. Among the diseases, the blast of wheat caused by the fungus Pyricularia grisea, is gaining a prominent role, being able to reduce crop yields by up to 70%. Chemical control of the disease has been unsatisfactory and there is little information on genetic resistance available in the literature. Resistance is the best way to control diseases by both economically and environmentally advantages. Given these facts, the objective of this study was to evaluate the resistance to blast of wheat genotypes for later use in breeding programs. It was obtained 10 different isolates of the cereal producing regions in Brazil. The isolates were transferred to PDA medium (potato dextrose agar) and after development and cleansing of the colonies were transferred to OA medium (oatmeal and agar) and maintained at a temperature of about 25 ° C and light regime of 12 hours for 10 days for sporulation of the fungus to occur. The concentration of the fungus used in the inoculations was adjusted to 1.2 x 105 spores / mL. In the first experiment, plants were inoculated when they had four leaves. The plants were kept under controlled conditions at 25° C and evaluated seven days after inoculation. Plants were classified according to the type of infection and later was calculated the Resistance Spectrum Relative (RSR) (percentage of isolates that the genotype expressed resistance) and the Disease Index (DI) (resistance of a genotype using all range of types of infection). The DI values were considered different (p≤0,05) if their confidence intervals (95%) did not overlap. Genotypes IVI 04033, VI 07443, VI 07505, IVI 04028, VI 07157, VI 04026, VI 98053 and VI 07160 were susceptible to more than 80% of isolates. Five varieties and four lines had a RSR greater than 50% and DIs smaller than 0.6. Among the lines stood out VI 04098 and VI 07094 with RSR greater than 80%, equating to the variety IPR 85. In the second experiment conducted under field conditions, inoculation was done staggered, according to the cycle of the genotypes, when plants reached the stage of 58-60 in Zadoks scale (1974), being applied 1L of suspension of P. grisea at a concentration of 1.2 x 105/mL per plot. Productivity was assessed by harvesting each plot area (3 m2). Disease incidence was assessed by the percentage of infected spikes and severity was assessed by the percentage of infected spikelets in each spike.The yield ranged from 879 to 3983 kg / ha, the incidence of the disease ranged from 0.86 to 84.24% and the severity ranged from 0.48 to 65.29%. Seven genotypes were classified as MR, three genotypes as MS and nine as S. The highlights were the cultivars CD 116, CD 104, IPR 85 and line VI 07094 with yields exceeding 3000 kg / ha and severity lower than 6%. The three variables yield, incidence and severity showed significant correlation with each other. / O trigo (Triticum spp.) é uma gramínea cultivada e utilizada como fonte de energia no mundo todo, sendo cultivado em várias regiões do Brasil. No entanto, a severidade de algumas doenças e o controle químico ineficaz, vêm ameaçando a triticultura brasileira. Entre as doenças, a brusone do trigo causada pelo fungo Pyricularia grisea, vem ganhando um papel de destaque, podendo reduzir a produtividade das lavouras em até 70%. O controle químico da doença tem sido insatisfatório e existem poucas informações sobre resistência genética disponível na literatura. O uso da resistência é a melhor maneira de controle de doenças, tanto pelas vantagens do ponto de vista econômico, quanto ambiental. Diante desses fatos, o objetivo deste trabalho foi avaliar a resistência de genótipos de trigo à brusone para posterior uso em programas de melhoramento genético. Foram obtidos 10 isolados de diferentes regiões produtoras do cereal no Brasil. Os isolados foram repicados para meio BDA (batata, dextrose e Agar) e após desenvolvimento e purificação das colônias foram transferidos para meio AV (aveia e Agar), sendo mantidos sob temperatura de aproximadamente 25ºC e regime de luz de 12 horas, durante 10 dias, para que ocorresse esporulação do fungo. A concentração do fungo empregada nas inoculações foi ajustada para 1,2 x 105 esporos/mL. No primeiro experimento, as plantas foram inoculadas quando apresentavam quatro folhas. As plantas foram mantidas em condições controladas a 25ºC e avaliadas sete dias após a inoculação. As plantas foram classificadas conforme o tipo de infecção e, posteriormente, foram calculados o Espectro de Resistência Relativo (ERR) (porcentagem de isolados que o genótipo expressou resistência) e o Índice de Doença (ID) (resistência de um genótipo usando toda a gama de tipos de infecção). Os valores de ID foram considerados diferentes (p≤0,05) caso seus intervalos de confianças (95%) não se sobrepusessem. Os genótipos IVI 04033, VI 07443, VI 07505, IVI 04028, VI 07157, VI 04026, VI 98053 e VI 07160 apresentaram suscetibilidade a mais de 80% dos isolados. Cinco cultivares e quatro linhagens apresentaram ERR maior que 50% e IDs menores que 0,6. Dentre as linhagens, destacaram-se VI 04098 e VI 07094 com ERR maiores que 80%, se equiparando a variedade IPR 85. No segundo experimento, conduzido em condições de campo, a inoculação foi feita de forma escalonada, de acordo com o ciclo dos genótipos de trigo, quando as plantas atingiram o estádio 58-60 da escala de Zadoks (1974), sendo aplicado 1L de suspensão de conídios de P. grisea na concentração de 1,2 x 105/mL por parcela. A produtividade foi avaliada pela colheita de cada parcela útil (3 m2). A incidência da doença foi avaliada pela porcentagem de espigas infectadas e a severidade foi avaliada pela porcentagem de espiguetas infectadas em cada espiga. A produtividade variou de 879 a 3983 kg/ha; a incidência da doença variou de 0,86 a 84,24% e a severidade variou de 0,48 a 65,29%. Sete genótipos que foram classificados como MR, três genótipos como MS e nove como S. Destacaram-se as cultivares CD 116, CD 104, IPR 85 e a linhagem VI 07094 com produtividades superiores a 3000 kg/ha e severidades menores que 6%. As três variáveis: incidência, produtividade e severidade, apresentaram correlação significativa entre si.

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The methodology currently recommended by the Ministry of Agriculture for fungi monitoring seed is the "Blotter test", however, the morphological characterization can often be uncertain due to the rapid growth of fungal invasion and the similarity between structures of some pathogens. Morphologically M. oryzae can be indistinguishable from some species, such as the causal agent of rice blast wheat and other grasses therefore the most adequate way for safe diagnosis is the molecular detection. In seeds percentage infestation is often low, which is nevertheless important because the seed of transmission capacity for the seedling, however small conidia concentrations may be insufficient for the molecular detection by techniques potentially used as PCR (Polymerase Chain Reaction). Technically a methodology for molecular amplification isothermal LAMP (Loop- Mediated Isothermal Amplification) simpler recently been developed, which allows to safely identify the target, due to the projection of specific primers based on exclusive regions of the genome of the organism. The technique has advantages as high sensitivity due to the recognition by the initiators of six regions of the target, in addition to specificity, speed and security in the diagnosis. It is important to consider the cost reduction compared with PCR, due to use of constant temperature and straightforward interpretation of results using turbidity generated in positive samples or color change if the addition of dyes, eliminating the use of devices, specialized professionals in handling high standard laboratories. The interpretation the results with the naked eye makes the seed control in environments such as laboratories, warehouses, cooperatives with minimal structure, reflecting positively on the proper targeting of lots, either for planting, consumption or disposal. Therefore, the aim of this study was to survey the main potentially destructive pathogenic fungi found in seeds, and develop a rapid detection kit by LAMP methodology for M. oryzae. / Considerada a doença mais destrutiva do arroz (Oryza sativa), a Brusone, causada pelo fungo Magnaporthe. oryzae é motivo de preocupação no mundo todo. Devido a capacidade de permanência do patógeno no solo e em restos culturais por longos e indeterminados períodos é essencial o monitoramento perante a entrada do patógeno em novas áreas, em razão do comprometimento dos próximos plantios. As sementes são consideradas as principais formas de disseminação da doença devido à capacidade de armazenamento, transporte e introdução em áreas indenes. A metodologia atualmente recomendada pelo Ministério da Agricultura para monitoramento de fungos em sementes é o “Blotter test”, entretanto, a caracterização morfológicapode muitas vezes ser incerta devido à invasão de fungos de crescimento rápido e a semelhança entre estruturas de alguns patógenos. Morfologicamente M. oryzae pode ser indistinguível de algumas espécies, como é o caso do agente causal da brusone de diversas gramíneas, portanto, a maneira mais adequada para diagnose segura é a detecção molecular. Em sementes, a porcentagem de infestação muitas vezes é baixa, o que não deixa de ser importante devido a capacidade de transmissibilidade da semente para a plântula, no entanto as pequenas concentrações de conídios podem ser insuficientes para a detecção molecular, por meio de técnicas potencialmente utilizadas como a PCR (Reação Polimerase em Cadeia). Tecnicamente mais simples, recentemente foi desenvolvida uma metodologia de amplificação molecular isotérmica LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification), que permite identificar de forma segura o alvo, em decorrência da projeção de iniciadores específicos, baseados em regiões exclusivas do genoma do organismo. A técnica apresenta vantagens como, alta sensibilidade devido ao reconhecimento pelos iniciadores de seis regiões do alvo, além da especificidade, agilidade e segurança no diagnostico. È importante considerar a redução de custos em comparação com a PCR, devido ao uso de temperaturas constantes, e interpretação direta dos resultados por meio da turbidez gerada em amostras positivas, ou mudança de coloração no caso da adição de corantes, dispensando o uso de aparelhos, profissionais especializados e manuseio em laboratórios de alto padrão. A intepretação dos resultados a olhos nus facilita o controle de sementes em ambientes como laboratórios, armazéns, cooperativas com estrutura mínima, refletindo positivamente sobre o direcionamento adequado de lotes, seja para o plantio, consumo ou descarte. Portanto, o objetivo deste trabalho foi realizar o levantamento dos principais fungos patogênicos potencialmente destrutivos encontrados em sementes, e desenvolver um kit de detecção rápida por meio da metodologia LAMP para M. oryzae.