Brustkrebs ist die häufigste diagnostizierte Krebserkrankung weltweit. Trotz der vielfältigen Behandlungsmöglichkeiten endet die Diagnose Brustkrebs in vielen Fällen noch immer tödlich. Aus diesem Grund ist die Entwicklung neuer Therapieansätze wichtig. Ein Therapieansatz, der in den letzten zehn Jahren immer mehr an Bedeutung gewonnen hat, ist die Immuntherapie. Allerdings konnte sie bei Brustkrebs noch keine großen Erfolge erzielen. Ursache hierfür ist die geringe Immunzellinfiltration in Brusttumoren. Um Brustkrebs für Immuntherapie empfänglicher zu machen, müssten Immuntherapeutika in Kombination mit Medikamenten angewendet werden, die die Immunzellinfiltration steigern. Um die Wirksamkeit solcher Medikamente in präklinischen Studien zu testen, braucht es eine Methode, mit der man die T-Zellverteilung innerhalb des Tumors darstellen kann. Für umfassendes Verständnis ist dreidimensionale Darstellung der Zellen im Tumor notwendig, da es einen großen Unterschied macht, ob sich die T-Zellen im Tumorstroma oder in unmittelbarer Nähe zu den Tumorzellen befinden. Die starke Fibrotisierung der Extrazellulären Matrix, die typisch für Brusttumoren ist, erschwert nicht nur die Immunzellinfiltration, sondern auch die Diffusion der fluoreszierenden Antikörper ins Gewebe. Im Zuge dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, um im dreidimensionalen CD4 und CD8-positive T-Zellen in Brusttumoren darzustellen. Dies gelang mittels Immunfluoreszenzfärbung und anschließender dreidimensionaler Aufnahme mithilfe optischer Sektionierung am Lichtblattmikroskop. Erreicht wurde dies durch deutliche Erhöhung der Inkubationszeiten, aggressive Permeabilisierung des Gewebes, Testen unterschiedlicher Antikörper bzw. Antikörperkombinationen und Entfärbung sowie Klärung des Tumorgewebes. Darüber hinaus konnten erste Schritte in der nachträglichen Bearbeitung der Aufnahmen inklusive Rekonstruktion der Zellen gemacht werden. Für die Anwendung des Verfahrens in Studien zur Medikamentenwirksamkeit ist noch weitere Optimierung notwendig. / Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer worldwide. Despite the wide range of treatment options available, the diagnosis of breast cancer is still fatal in many cases. For this reason, the development of new therapeutic approaches is important. One therapeutic approach that has become increasingly important in the last ten years is immunotherapy. However has not yet been very successful in breast cancer. The reason for this is the low level of immune cell infiltration in breast tumours. To make breast cancer more receptive to immunotherapy, immunotherapeutics could be used in combination with drugs that increase immune cell infiltration. In order to test the efficacy of such drugs in preclinical studies, a method is needed that can be used to visualise the T cell distribution within the tumour. For a comprehensive understanding, three-dimensional visualisation of the cells in the tumour is necessary, as it makes a big difference whether the T cells are located in the tumour stroma or in close proximity to the tumour cells. The strong fibrotisation of the extracellular matrix, which is typical of breast tumours, not only makes T cell infiltration, but also the diffusion of the fluorescent antibodies into the tissue difficult. In the course of this work, a method was developed to visualise CD4 and CD8-positive T cells in breast tumours in three dimensions. This was achieved by significantly increasing incubation times, aggressive permeabilisation of the tissue, testing different antibodies and antibody combinations and decolourisation as well as clarification of the tumour tissue. In addition, the first steps were taken in the subsequent processing of the images, including reconstruction of the cells. However further optimisation is still required before the method can be used in drug efficacy studies.

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine selektiv durchlässige Barriere dar, die den Austausch von Stoffen zwischen Blut und ZNS kontrolliert und so neuroprotektiv wirkt. Sie verhindert allerdings nicht nur die Passage toxischer Metaboliten, sondern verwehrt auch vielen therapeutischen Wirkstoffen den Zugang zum Gehirn. Die Forschung an Methoden zum Erreichen höherer Arzneimittelkonzentrationen im Gehirn ist deshalb essenziell für die Behandlung zerebraler Erkrankungen wie dem zerebral metastasierten Mammakarzinom. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, Wirkstoffe zu identifizieren, die die Permeabilität der BHS erhöhen. Die Substanzdatenbank LO1208 von Sigma-Aldrich wurde im Rahmen eines HTS auf ihre permeabilitätsbeeinflussenden Eigenschaften untersucht. Hierbei konnten 31 Substanzen identifiziert werden, welche die Permeabilität von BLECs um mindestens 50 % erhöhen. Aus diesen wurden 4-Amino-1,8-naphthalimid (PARP-Inhibitor) und GW2974 (TKI) für eine genauere Analyse ausgewählt. Als dritter Wirkstoff wurde Ibuilast (Inhibitor der PDE4, des MIF sowie des Toll-like-Rezeptor-4) untersucht, wobei dieser keine signifikante Veränderung der Permeabilität bewirkt. Die Messung des TEERs und der Permeabilität für Fluorescein bestätigten die Ergebnisse aus dem HTS, welches demnach zukünftig für Permeabilitätstests eingesetzt werden kann. Die Zellviabilität wird durch 4 Amino-1,8-naphthalmid nicht beeinflusst. GW2974 und Ibudilast zeigen bei 500 µM einen toxischen Einfluss auf MCF-7-Zellen. BLECs werden durch 100 µM GW2974 gehemmt. Es konnte gezeigt werden, dass die erhöhte Permeabilität mit einer Veränderung der TJ-Proteinexpression einhergeht. 4-Amino-1,8-naphthalimid senkt die Expression von Occludin auf mRNA- und Proteinebene. GW2974 vermindert zusätzlich die Expression von VE-Cadherin, Claudin-5 und ZO-1. Darüber hinaus wurde die Wirkung auf Effluxpumpen untersucht. Die Ergebnisse der mRNA- und Protein-expression weichen voneinander ab, weshalb eine genauere Untersuchung der Translationsvorgänge sinnvoll erscheint. Glut-1 wird in GW2974 behandelten Zellen überexprimiert, was auf eine erhöhte Aktivität der BLECs hinweist. GW2974 und 4-Amino-1,8-naphthalimid könnten durch ihre permeabilitätssteigernde Wirkung die Ansprechrate einer systemischen Behandlung von PatientInnen mit einem zerebral metastasierten Mammakarzinom erhöhen und somit ihre Prognose verbessern. Detaillierte Studien zu Kombinationstherapien, den notwendigen Wirkstoff-konzentrationen und eventuellen negativen neurologischen Wirkungen sollten erwogen werden. / The Blood-Brain Barrier (BBB) represents a selectively permeable barrier that controls the exchange of substances between the blood and the brain and thus has a neuroprotective effect. However, it not only prevents the passage of toxic metabolites, but also limits the access of therapeutic agents to the brain. Further research into methods to achieve higher drug concentrations in the brain is essential for the treatment of cerebral diseases such as cerebral metastatic breast cancer. The goal of this study was to identify drugs that increase the permeability of the BBB. The substance database LO1208 from Sigma-Aldrich was examined for its permeability-influencing properties as part of a high throughput drug screening (HTS). 31 of the examined substances showed an increase of the permeability on brain-like endothelial cells (BLECs) by at least 50%. Thereof 4-amino-1,8-naphthalimide (PARP inhibitor) and GW2974 (TKI) were selected for a more detailed analysis. Ibudilast (inhibitor of PDE4, MIF and Toll-like receptor-4) was found to be the third most active substance, although it did not cause any significant change in permeability. The measurement of the trans endothelial electrical resistance (TEER) and the permeability for fluorescein confirmed the results from the HTS and therefore is suggested to be used in further permeability tests in the future. Cell viability is not affected by 4 amino-1,8-naphthalmide. GW2974 and Ibudilast have a toxic effect on MCF-7 cells at a concentration of 500 µM, whereas BLECs are inhibited at a concentration of 100 µM of GW2974. The results show that the increased permeability is associated with a change in tight junction protein expression. 4-Amino-1,8-naphthalimide decreases the expression of occludin at mRNA and protein level. GW2974 also reduces the expression of VE-cadherin, claudin-5 and ZO-1. In addition to the abovementioned analysis, also the effect on efflux pumps was investigated. As the results of the mRNA and protein expression differ from each other, a more detailed analysis will be necessary to investigate the translation process. Glut-1 is overexpressed in GW2974-treated cells, which indicates an increased activity of the BLECs. GW2974 and 4-amino-1,8-naphthalimide could increase the response rate to systemic therapy of patients with cerebral metastatic breast cancer through their permeability-enhancing effect and thereby improve their prognosis. Detailed studies on combination therapies, the necessary drug concentrations and possible negative neurological effects are recommended to gain further insight.

The course of fatigue in patients with gynecologic and breast cancer

Die psychoonkologische Betreuung von Brustkrebspatientinnen spielt eine wichtige Rolle in der multimodalen Therapie des Mammakarzinoms. Als Hauptziele werden mit dieser eine Verbesserung der Lebensqualität und die Reduktion von Angst und Depression angestrebt. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, die Wirksamkeit eines neu-eingeführten screeninggestützten psychoonkologischen Behandlungspfades zu überprüfen. Weiterhin wurde der Verlauf der Lebensqualität der Patientinnen verfolgt und wichtige Einflussfaktoren identifiziert. 213 Brustkrebspatientinnen im Alter von 26-88 wurden untersucht. Standardisierte Messungen zur Lebensqualität (EORTC-QLQ-C30), zu Angst und Depressivität (HADS), zur Krankheitsbewältigung (MAC) und zu psychosozialen Belastungen (Checkliste psychosozialer Belastungen) wurden zu drei verschiedenen Zeitpunkten erfasst: null, sechs und 12 Monate nach Diagnosestellung. Die Interventionskohorte (110 Patientinnen) nahm an einem neu eingeführten Screening-basierten psychoonkologischen Behandlungspfad teil. Die Kontrollgruppe (103 Patientinnen) erhielt unsystematisch eine weitgehend flächendeckende psychoonkologische Betreuung. Signifikante Lebensqualitätsunterschiede der Kohorten fanden sich nach sechs Monaten entgegen unserer Erwartungen nicht. Nicht-Unterlegenheit des neuen psychoonkologischen Pfades konnte nachgewiesen werden. Aufgrund der fehlenden Wirksamkeit des psychoonkologischen Behandlungspfades konnte nicht gezeigt werden, dass Patientinnen mit initial hoher psychischer Belastung und Frauen mit gering ausgeprägtem Kampfgeist besonders vom psychoonkologischen Behandlungspfad profitierten. Negativer Vorhersagewert für die gesundheitsbezogene Lebensqualität nach 6 Monaten war ein hoher Ausgangs-HADS-Wert. Als positiven Prädiktor stellte sich ein geringer Ausgangs-Fighting-Spirit-Wert heraus - nicht wie initial vermutet - ein hoher. Im Gesamtkollektiv konnte im Verlauf eine stärkere Lebensqualitätsverbesserung der initial psychisch Belasteten und der Patientinnen mit viel Kampfgeist beobachtet werden. Dies ist wahrscheinlich auf verschiedene Faktoren zurückzuführen. Zum einen können die psychoonkologischen Interventionen beigetragen haben, zum anderen könnte das klinische Phänomen der Spontanremission dank einer erfolgreichen Krank-heitsverarbeitung eine Rolle gespielt haben. Das Verstreichen der Zeit und damit auch der Neben- und Nachwirkungen der operativen und der adjuvanten Therapien sind auch nicht zu vernachlässigen. Das Alter, das Vorliegen einer F-Diagnose, psychosoziale Belastungen, die Art der Krankheitsbewältigung, die jeweils erhaltene Therapie sowie persönliche Ressourcen wurden als Einflussfaktoren auf die Lebensqualität identifiziert. Unabhängiger wichtigster Vorhersagewert der Lebensqualität nach 6 Monaten war die Ausgangslebensqualität. Außerdem waren jüngere Patientinnen initial psychisch belasteter als ältere. Die untersuchten Mammakarzinompatientinnen erreichten eine geringere gesundheitsbezogene Lebensqualität im Vergleich zu Frauen der gesunden deutschen Normalbevölkerung. Die einheitliche Schaffung eines strukturierten und qualitätsgesicherten Angebotes für eine psychoonkologische Betreuung inklusive Screening psychischer Belastungen für Mammakarzinompatientinnen in den Brustzentren wäre hilfreich, um die gesundheitsbezogene Lebensqualität zu verbessern und psychischen Disstress zu reduzieren. Weitere Untersuchungen im Zeitverlauf und im Vergleich zu Kontrollgruppen zur Wirksamkeit psychoonkologischer Interventionen und deren Einfluss auf Lebensqualität und psychische Belastungen sind wünschenswert.

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Junge Brustkrebspatientinnen haben aufgrund des früheren Erkrankungsalters zusätzlich zu ihrer Krebstherapie besondere psychosoziale Probleme zu bewältigen. Ziel dieser Arbeit sollte es daher sein, die Ausprägung der gesundheitsbezogenen Lebensqualität, des psychischen Befindens, die psychische Komorbidität sowie das Vorhandensein von Fatigue im Verlauf des ersten postoperativen Jahres zu untersuchen. Außerdem sollte geprüft werden, welchen Einfluss eine Systemtherapie auf die oben genannten Parameter hat und ob sich gleichaltrige Frauen der Allgemeinbevölkerung bezüglich dieser Parameter von den Studienteilnehmerinnen unterscheiden. Die jungen Brustkrebspatientinnen wiesen zum Zeitpunkt der Operation eine eingeschränkte gesundheitsbezogene Lebensqualität, erhöhte Depressivität, Ängstlichkeit und Fatigue auf. Alle untersuchten Parameter waren innerhalb der Vergleichsstichprobe der Allgemeinbevölkerung besser ausgeprägt. Im ersten postoperativen Jahr kam es zu signifikanten Verbesserungen der gesundheitsbezogenen Lebensqualität, zur Abnahme von Ängstlichkeit und Depressivität sowie von Fatiguesymptomen. Allerdings nahm die Prävalenz psychischer Erkrankungen, insbesondere des somatoformen Syndroms, zu. Die signifikanten Unterschiede zu den Frauen der Allgemeinbevölkerung blieben im Großteil bestehen, allerdings gab es keine Unterschiede mehr in der Ausprägung der Depressivität zu t1. Entgegen unserer Hypothesen hatte der Erhalt einer systemischen Therapie nur wenig Einfluss auf die untersuchten Parameter. So zeigte sich, dass der Erhalt einer endokrinen Therapie zu einer signifikant geringeren Rollenfunktion und zu mehr genereller Fatigue führte, während eine verabreichte Chemotherapie nur die Rollenfunktion reduzierte. Systemische Therapien hatten keinen Einfluss auf die anderen Dimensionen der gesundheitsbezogenen Lebensqualität, die Fatigueausprägung, auf das psychische Befinden und die psychische Komorbidität. Allerdings ist die Validität dieses Ergebnisses eingeschränkt, da lediglich 5% der Studienteilnehmerinnen keine systemische Therapie erhielten und die endokrine Therapie bei allen Frauen zum Befragungszeitpunkt noch nicht abgeschlossen war. Junge Brustkrebspatientinnen sind zum Zeitpunkt der Operation und dem Jahr danach durch Einschränkungen der Lebensqualität, Ängstlichkeit und Depressivität sowie Fatigue belastet. Die Prävalenz psychischer Erkrankungen nimmt im ersten postoperativen Jahr von 23 auf 33% zu. Entsprechend sollte der behandelnde Arzt die Frauen nach psychoonkologischem Unterstützungsbedarf fragen. Da besonders die Prävalenz des somatoformen Syndroms zunimmt, wird eine ärztliche Differenzierung von organisch und psychisch bedingten Symptomen empfohlen, um einerseits die Belastung der betroffenen Frauen schnell und andererseits volkswirtschaftliche Kosten langfristig reduzieren zu können.

Trotz aller Fortschritte in Diagnostik und Behandlung bleibt die Therapie von BrustkrebspatientInnen – gerade bei tripelnegativen Mammakarzinomen, die nicht auf eine hormonelle Therapie ansprechen – eine Herausforderung. Eine wachsende Zahl von Belegen spricht dafür, dass Cadherine nicht nur in physiologischen Prozessen wie der Embryogenese, sondern auch in pathologischen Prozessen wie der Tumorprogression eine Rolle spielen, was diese Moleküle zu potenziellen Zielen einer targetspezifischen Tumortherapie macht. Im Mausmodell konnte bislang gezeigt werden, dass eine Herabregulierung von N-Cadherin das Mammakarzinomwachstum in vivo hemmt. N-Cadherin wird auch in humanem Brustkrebsgewebe aberrant exprimiert. In nur schwach invasiven Brustkrebszelllinien führte eine Überexpression von N-Cadherin in vitro zu einer Steigerung des migratorischen und invasiven Verhaltens der Zellen. In dieser Arbeit wurde an der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT der Einfluss einer Defizienz von N-Cadherin auf die Expression von E- und VE-Cadherin, sowie auf das Proliferations-, Migrations- und Invasionsverhalten der Zellen in vitro untersucht. Eine Charakterisierung der humanen Brustkrebszelllinien SUM149PT, der aus ihr hervorgegangenen mit shRNA transduzierten N-Cadherin-Knock-down-Klone und der Scramble-Kontrollen fand mittels Western Blot, RT-PCR, q-PCR und Immunfluoreszenzanalysen statt. Das Proliferationsverhalten der Zelllinien wurde mit Hilfe von Verdopplungszeitbestimmungen und Sphäroidversuchen analysiert. Um den Einfluss einer N-Cadherin-Defizienz auf die Migration zu untersuchen, wurden auf dem Prinzip der Boyden-Chamber basierende Versuche, sowie in vitro Wundheilungsversuche durchgeführt. Auch die Invasionsversuche basierten auf dem Prinzip der Boyden-Chamber. Eine zusätzliche Beschichtung mit Matrigel simulierte hier die extrazelluläre Matrix. Bei den Untersuchungen mittels Western Blot, RT-PCR und q-PCR wurde deutlich, dass die N-Cadherin defizienten Klone keine Veränderung in der E-Cadherin-Expression, jedoch interessanterweise eine starke Herabregulierung von VE-Cadherin aufweisen. Bei den Immunfluoreszenzanalysen wiesen SUM149PT und Scramble-Kontrollen eine Expression von N-Cadherin in der Zellmembran auf, während die N-Cadherin-defizienten Klone keine N-Cadherin-Expression zeigten. Wie schon in Western-Blot, RT-PCR und q-PCR zeigten die N-Cadherin defizienten Klone im Vergleich zu den SUM149PT und den Scramble-Kontrollen keine veränderte E-Cadherin-Expression. Bei Einsatz eines VE-Cadherin-Anitkörpers zeigten die N-Cadherin defizienten Klone keine Expression von VE-Cadherin, während SUM149PT und Scramble eine deutliche VE-Cadherin-Expression in der Zellmembran zeigten. Daraus lässt sich schließen, dass N-Cadherin möglicherweise die Expression von VE-Cadherin beeinflussen kann. In der Verdopplungszeitbestimmung ließen sich keine signifikanten Änderungen des Wachstumsverhaltens zwischen N-Cadherin defizienten Klonen und Kontrollzelllinien nachweisen. Um auch das dreidimensionale Wachstum der Zellen zu untersuchen, wurden Sphäroidversuche durchgeführt. Alle untersuchten Zelllinien bildeten stabile Sphäroide aus, die jedoch einen großen Saum an nicht integrierten Zellen aufwiesen. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied im Sphäroidwachstum zwischen N-Cadherin defizienten Klonen und Kontrollzelllinien. Die Herabregulierung von N-Cadherin scheint in humanen Mammakarzinomzelllinien in vitro keinen Einfluss auf das Wachstumsverhalten der Zellen zu haben. Im Boyden-Chamber-Assay zeigte sich, dass eine Herabregulierung von N-Cadherin bei der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT in vitro zu einer signifikanten Verringerung des Migrationspotenzials führt. Dieses Ergebnis wurde beim in vitro Wundheilungsversuch bestätigt. Hier zeigten die N-Cadherin defizienten Klone eine signifikant verringerte Flächenbedeckungsrate – also eine signifikant verringerte Geschwindigkeit mit der die aufeinander zuwanderndern Zellen eine freie Fläche bedecken – als die Kontrollzelllinien. Im Invasionsversuch zeigten die N-Cadherin defizienten Klone im Vergleich zu den Kontrollen eine hochsignifikant verringerte Invasivität. Eine Herabregulierung von N-Cadherin bei der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT führt also in vitro zu einer signifikanten Verringerung des Invasionspotenzials. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass N-Cadherin bei humanen Mammakarzinomzelllinien durch seinen positiven Einfluss auf Migration und Invasion der Zellen eine große Rolle beim Prozess des invasiven Wachstums und der Metastasierung spielt. Eine Anti-N-Cadherin-Therapie könnte auch bei BrustkrebspatientInnen, gerade mit tripelnegativen Mammakarzinomen, neue Möglichkeiten der Behandlung eröffnen. / Breast cancer is the most common cancer type for women and the most frequent type after lung cancer overall. In spite of all improvements in clinical diagnostics and treatment, the therapy of patients with breast cancer remains a difficult task. Therefore it is important to find new strategies of treatment, especially for patients with triple negative breast cancer that does not respond to hormone therapy. There is growing evidence that cadherins are not only important in physiological processes like embryogenesis but also in pathological processes like tumour progression. A so called cadherin switch has been implicated in carcinogenesis, in particular the loss of E-cadherin and the upregulation of N-cadherin. Thus, these molecules are an interesting subject of studies and a potential target for specific cancer therapy. It was shown previously that efficient silencing of N-cadherin in murine breast cancer cells inhibits tumour growth in vivo. N-cadherin is also aberrantly expressed in human breast cancer tissue. An overexpression of N-Cadherin in breast cancer cells enhances tumour cell motility, migration and invasion in vitro. In this thesis the impact of N-cadherin deficiency on the expression level of E- and VE-cadherin as well as its effect on proliferation, migration and invasion behaviour of breast cancer cells in vitro was investigated. The human breast cancer cell line SUM149PT, its N-cadherin deficient clones and scramble controls were characterised by Western Blot, RT-PCR, q-PCR and immunofluorescence staining. To analyse the impact of N-cadherin on the proliferation behaviour doubling time proliferation assays and spheroid assays were performed. A Boyden chamber assay and an in vitro wound healing assay were performed to investigate the effect of N-cadherin deficiency on cell migration. Furthermore, a Boyden chamber assay with a coating of Matrigel was used to study the invasion potential of the N-cadherin deficient cell clones and control cell lines. The results of Western Blot, RT-PCR and q-PCR show that silencing of N-cadherin expression in SUM149PT cells had no influence on E-cadherin expression, but significantly decreased VE-cadherin expression. With immunofluscence staining it was evidenced that SUM149PT and scramble controls express N-cadherin in the cell membrane, whereas N-cadherin deficient clones do not show any N-cadherin expression. There was no difference seen in E-cadherin expression between N-cadherin deficient clones and control cell lines. While SUM149PT and scramble controls expressed VE-cadherin in the cell membrane, N-cadherin deficient clones did not express VE-cadherin. These results suggest that N-cadherin may have an influence on the expression of VE-cadherin. No significant alteration in proliferation behaviour between N-cadherin deficient clones and controls could be shown with the doubling time proliferation assay. To investigate the impact of N-cadherin on the three-dimensional growth spheroid assays were performed. All cell lines formed stable speroids, however fringes of many not incorporated cells were found. There was no difference in spheroidgrowth between N-cadherin deficient clones and control cell lines. No influence of N-cadherin on cell proliferation in vitro could be seen. With the help of Boyden chamber assays it was shown that silencing of N-cadherin in the human breast cancer cell line SUM149PT results in a significant decrease of migration potential in vitro. This was confirmed with an in vitro wound healing assay. N-cadherin deficient clones showed a significantly reduced surface coverage rate than SUM149PT and scramble controls. A significant decrease of invasive cells in N-cadherin deficient clones in comparison to the controls was revealed in invasion assays. Thus silencing of N-Cadherin in the human breast cancer cell line SUM149PT leads to a significantly decreased invasion potential in vitro. The results presented this thesis provide evidence that N-cadherin is involved in invasive tumour progression and metastasis of the human breast cancer cell line SUM149PT by promoting cell migration and invasion. Anti-N-cadherin strategies could thus be a potential target specific therapy of cancer patients, particularly with triple negative breast cancer.

Trotz aller Fortschritte in Diagnostik und Behandlung bleibt die Therapie von BrustkrebspatientInnen – gerade bei tripelnegativen Mammakarzinomen, die nicht auf eine hormonelle Therapie ansprechen – eine Herausforderung. Eine wachsende Zahl von Belegen spricht dafür, dass Cadherine nicht nur in physiologischen Prozessen wie der Embryogenese, sondern auch in pathologischen Prozessen wie der Tumorprogression eine Rolle spielen, was diese Moleküle zu potenziellen Zielen einer targetspezifischen Tumortherapie macht. Im Mausmodell konnte bislang gezeigt werden, dass eine Herabregulierung von N-Cadherin das Mammakarzinomwachstum in vivo hemmt. N-Cadherin wird auch in humanem Brustkrebsgewebe aberrant exprimiert. In nur schwach invasiven Brustkrebszelllinien führte eine Überexpression von N-Cadherin in vitro zu einer Steigerung des migratorischen und invasiven Verhaltens der Zellen. In dieser Arbeit wurde an der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT der Einfluss einer Defizienz von N-Cadherin auf die Expression von E- und VE-Cadherin, sowie auf das Proliferations-, Migrations- und Invasionsverhalten der Zellen in vitro untersucht. Eine Charakterisierung der humanen Brustkrebszelllinien SUM149PT, der aus ihr hervorgegangenen mit shRNA transduzierten N-Cadherin-Knock-down-Klone und der Scramble-Kontrollen fand mittels Western Blot, RT-PCR, q-PCR und Immunfluoreszenzanalysen statt. Das Proliferationsverhalten der Zelllinien wurde mit Hilfe von Verdopplungszeitbestimmungen und Sphäroidversuchen analysiert. Um den Einfluss einer N-Cadherin-Defizienz auf die Migration zu untersuchen, wurden auf dem Prinzip der Boyden-Chamber basierende Versuche, sowie in vitro Wundheilungsversuche durchgeführt. Auch die Invasionsversuche basierten auf dem Prinzip der Boyden-Chamber. Eine zusätzliche Beschichtung mit Matrigel simulierte hier die extrazelluläre Matrix. Bei den Untersuchungen mittels Western Blot, RT-PCR und q-PCR wurde deutlich, dass die N-Cadherin defizienten Klone keine Veränderung in der E-Cadherin-Expression, jedoch interessanterweise eine starke Herabregulierung von VE-Cadherin aufweisen. Bei den Immunfluoreszenzanalysen wiesen SUM149PT und Scramble-Kontrollen eine Expression von N-Cadherin in der Zellmembran auf, während die N-Cadherin-defizienten Klone keine N-Cadherin-Expression zeigten. Wie schon in Western-Blot, RT-PCR und q-PCR zeigten die N-Cadherin defizienten Klone im Vergleich zu den SUM149PT und den Scramble-Kontrollen keine veränderte E-Cadherin-Expression. Bei Einsatz eines VE-Cadherin-Anitkörpers zeigten die N-Cadherin defizienten Klone keine Expression von VE-Cadherin, während SUM149PT und Scramble eine deutliche VE-Cadherin-Expression in der Zellmembran zeigten. Daraus lässt sich schließen, dass N-Cadherin möglicherweise die Expression von VE-Cadherin beeinflussen kann. In der Verdopplungszeitbestimmung ließen sich keine signifikanten Änderungen des Wachstumsverhaltens zwischen N-Cadherin defizienten Klonen und Kontrollzelllinien nachweisen. Um auch das dreidimensionale Wachstum der Zellen zu untersuchen, wurden Sphäroidversuche durchgeführt. Alle untersuchten Zelllinien bildeten stabile Sphäroide aus, die jedoch einen großen Saum an nicht integrierten Zellen aufwiesen. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied im Sphäroidwachstum zwischen N-Cadherin defizienten Klonen und Kontrollzelllinien. Die Herabregulierung von N-Cadherin scheint in humanen Mammakarzinomzelllinien in vitro keinen Einfluss auf das Wachstumsverhalten der Zellen zu haben. Im Boyden-Chamber-Assay zeigte sich, dass eine Herabregulierung von N-Cadherin bei der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT in vitro zu einer signifikanten Verringerung des Migrationspotenzials führt. Dieses Ergebnis wurde beim in vitro Wundheilungsversuch bestätigt. Hier zeigten die N-Cadherin defizienten Klone eine signifikant verringerte Flächenbedeckungsrate – also eine signifikant verringerte Geschwindigkeit mit der die aufeinander zuwanderndern Zellen eine freie Fläche bedecken – als die Kontrollzelllinien. Im Invasionsversuch zeigten die N-Cadherin defizienten Klone im Vergleich zu den Kontrollen eine hochsignifikant verringerte Invasivität. Eine Herabregulierung von N-Cadherin bei der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT führt also in vitro zu einer signifikanten Verringerung des Invasionspotenzials. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass N-Cadherin bei humanen Mammakarzinomzelllinien durch seinen positiven Einfluss auf Migration und Invasion der Zellen eine große Rolle beim Prozess des invasiven Wachstums und der Metastasierung spielt. Eine Anti-N-Cadherin-Therapie könnte auch bei BrustkrebspatientInnen, gerade mit tripelnegativen Mammakarzinomen, neue Möglichkeiten der Behandlung eröffnen.:Abkürzungsverzeichnis V 1 Einleitung 1 1.1 Tumorentstehung und -progression 1 1.2 Der Prozess der Metastasierung 4 1.2.1 Epithelial-mesenchymale Transition 4 1.3 Brustkrebs 7 1.3.1 Histologie und Klassifizierung 7 1.4 Cadherine 11 1.4.1 Klassische Cadherine 11 1.4.2 VE-Cadherin 13 1.4.3 N-Cadherin 14 2 Fragestellung 16 3 Material und Methoden 18 3.1 Material 18 3.1.1 Geräte 18 3.1.2 Verbrauchsmaterialien 20 3.1.3 Chemikalien, Reagenzien, Enzyme und Kits 22 3.1.4 Puffer, Ansätze und Gele 25 3.1.5 Antikörper 28 3.1.6 Primer 29 3.1.7 Zellkultur 30 3.1.8 Software 32 3.2 Methoden 33 3.2.1 Kultivierung der Zellen 33 3.2.2 Proteinisolierung und Western Blot 34 3.2.3 RNA-Isolierung und Polymerasekettenreaktion 36 3.2.4 Immunfluoreszenz 40 3.2.5 Untersuchung des Proliferationsverhaltens 41 3.2.6 Sphäroidversuch 43 3.2.7 Untersuchung des Migrationsverhaltens mittels Boyden-Chamber 44 3.2.8 Untersuchung des Migrationsverhaltens mittels in vitro Wundheilungsversuch 45 3.2.9 Untersuchung des Invasionsverhaltens 46 3.2.10 Statistische Analyse 49 4 Ergebnisse 50 4.1 Charakterisierung der N-Cadherin defizienten Klone 50 4.1.1 Untersuchung der E-, N- und VE-Cadherin-Expression auf mRNA-Ebene mittels RT-PCR und q-PCR 53 4.1.2 Untersuchung der E-, N- und VE-Cadherin-Expression auf Proteinebene mittels Western Blot 56 4.1.3 Untersuchung der E-, N- und VE-Cadherin-Expression und -Lokalisation mittels Immunfluoreszenzfärbung 57 4.2 Einfluss des N-Cadherin auf das Proliferationsverhalten 61 4.3 Einfluss des N-Cadherin auf die Sphäroidbildung 62 4.4 Einfluss des N-Cadherin auf das Migrationsverhalten 64 4.5 Einfluss des N-Cadherin auf das Invasionsverhalten 69 5 Diskussion 71 5.1 N-Cadherin-Defizienz hat keinen Einfluss auf die Expression und subzelluläre Lokalisation von E-Cadherin in der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 72 5.2 N-Cadherin-Defizienz führt zu deutlicher Herabregulierung der VE-Cadherin-Expression in der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 73 5.3 N-Cadherin-Defizienz hat keinen Einfluss auf die Proliferation der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 74 5.4 N-Cadherin-Defizienz hat keinen Einfluss auf die Sphäroidbildung der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 74 5.5 N-Cadherin-Defizienz führt zu signifikant verringerter Migration der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 75 5.6 N-Cadherin-Defizienz führt zu signifikant verringerter Invasion der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 76 6 Zusammenfassung 79 7 Abbildungsverzeichnis 83 8 Tabellenverzeichnis 84 9 Literaturverzeichnis 85 10 Danksagung 104 / Breast cancer is the most common cancer type for women and the most frequent type after lung cancer overall. In spite of all improvements in clinical diagnostics and treatment, the therapy of patients with breast cancer remains a difficult task. Therefore it is important to find new strategies of treatment, especially for patients with triple negative breast cancer that does not respond to hormone therapy. There is growing evidence that cadherins are not only important in physiological processes like embryogenesis but also in pathological processes like tumour progression. A so called cadherin switch has been implicated in carcinogenesis, in particular the loss of E-cadherin and the upregulation of N-cadherin. Thus, these molecules are an interesting subject of studies and a potential target for specific cancer therapy. It was shown previously that efficient silencing of N-cadherin in murine breast cancer cells inhibits tumour growth in vivo. N-cadherin is also aberrantly expressed in human breast cancer tissue. An overexpression of N-Cadherin in breast cancer cells enhances tumour cell motility, migration and invasion in vitro. In this thesis the impact of N-cadherin deficiency on the expression level of E- and VE-cadherin as well as its effect on proliferation, migration and invasion behaviour of breast cancer cells in vitro was investigated. The human breast cancer cell line SUM149PT, its N-cadherin deficient clones and scramble controls were characterised by Western Blot, RT-PCR, q-PCR and immunofluorescence staining. To analyse the impact of N-cadherin on the proliferation behaviour doubling time proliferation assays and spheroid assays were performed. A Boyden chamber assay and an in vitro wound healing assay were performed to investigate the effect of N-cadherin deficiency on cell migration. Furthermore, a Boyden chamber assay with a coating of Matrigel was used to study the invasion potential of the N-cadherin deficient cell clones and control cell lines. The results of Western Blot, RT-PCR and q-PCR show that silencing of N-cadherin expression in SUM149PT cells had no influence on E-cadherin expression, but significantly decreased VE-cadherin expression. With immunofluscence staining it was evidenced that SUM149PT and scramble controls express N-cadherin in the cell membrane, whereas N-cadherin deficient clones do not show any N-cadherin expression. There was no difference seen in E-cadherin expression between N-cadherin deficient clones and control cell lines. While SUM149PT and scramble controls expressed VE-cadherin in the cell membrane, N-cadherin deficient clones did not express VE-cadherin. These results suggest that N-cadherin may have an influence on the expression of VE-cadherin. No significant alteration in proliferation behaviour between N-cadherin deficient clones and controls could be shown with the doubling time proliferation assay. To investigate the impact of N-cadherin on the three-dimensional growth spheroid assays were performed. All cell lines formed stable speroids, however fringes of many not incorporated cells were found. There was no difference in spheroidgrowth between N-cadherin deficient clones and control cell lines. No influence of N-cadherin on cell proliferation in vitro could be seen. With the help of Boyden chamber assays it was shown that silencing of N-cadherin in the human breast cancer cell line SUM149PT results in a significant decrease of migration potential in vitro. This was confirmed with an in vitro wound healing assay. N-cadherin deficient clones showed a significantly reduced surface coverage rate than SUM149PT and scramble controls. A significant decrease of invasive cells in N-cadherin deficient clones in comparison to the controls was revealed in invasion assays. Thus silencing of N-Cadherin in the human breast cancer cell line SUM149PT leads to a significantly decreased invasion potential in vitro. The results presented this thesis provide evidence that N-cadherin is involved in invasive tumour progression and metastasis of the human breast cancer cell line SUM149PT by promoting cell migration and invasion. Anti-N-cadherin strategies could thus be a potential target specific therapy of cancer patients, particularly with triple negative breast cancer.:Abkürzungsverzeichnis V 1 Einleitung 1 1.1 Tumorentstehung und -progression 1 1.2 Der Prozess der Metastasierung 4 1.2.1 Epithelial-mesenchymale Transition 4 1.3 Brustkrebs 7 1.3.1 Histologie und Klassifizierung 7 1.4 Cadherine 11 1.4.1 Klassische Cadherine 11 1.4.2 VE-Cadherin 13 1.4.3 N-Cadherin 14 2 Fragestellung 16 3 Material und Methoden 18 3.1 Material 18 3.1.1 Geräte 18 3.1.2 Verbrauchsmaterialien 20 3.1.3 Chemikalien, Reagenzien, Enzyme und Kits 22 3.1.4 Puffer, Ansätze und Gele 25 3.1.5 Antikörper 28 3.1.6 Primer 29 3.1.7 Zellkultur 30 3.1.8 Software 32 3.2 Methoden 33 3.2.1 Kultivierung der Zellen 33 3.2.2 Proteinisolierung und Western Blot 34 3.2.3 RNA-Isolierung und Polymerasekettenreaktion 36 3.2.4 Immunfluoreszenz 40 3.2.5 Untersuchung des Proliferationsverhaltens 41 3.2.6 Sphäroidversuch 43 3.2.7 Untersuchung des Migrationsverhaltens mittels Boyden-Chamber 44 3.2.8 Untersuchung des Migrationsverhaltens mittels in vitro Wundheilungsversuch 45 3.2.9 Untersuchung des Invasionsverhaltens 46 3.2.10 Statistische Analyse 49 4 Ergebnisse 50 4.1 Charakterisierung der N-Cadherin defizienten Klone 50 4.1.1 Untersuchung der E-, N- und VE-Cadherin-Expression auf mRNA-Ebene mittels RT-PCR und q-PCR 53 4.1.2 Untersuchung der E-, N- und VE-Cadherin-Expression auf Proteinebene mittels Western Blot 56 4.1.3 Untersuchung der E-, N- und VE-Cadherin-Expression und -Lokalisation mittels Immunfluoreszenzfärbung 57 4.2 Einfluss des N-Cadherin auf das Proliferationsverhalten 61 4.3 Einfluss des N-Cadherin auf die Sphäroidbildung 62 4.4 Einfluss des N-Cadherin auf das Migrationsverhalten 64 4.5 Einfluss des N-Cadherin auf das Invasionsverhalten 69 5 Diskussion 71 5.1 N-Cadherin-Defizienz hat keinen Einfluss auf die Expression und subzelluläre Lokalisation von E-Cadherin in der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 72 5.2 N-Cadherin-Defizienz führt zu deutlicher Herabregulierung der VE-Cadherin-Expression in der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 73 5.3 N-Cadherin-Defizienz hat keinen Einfluss auf die Proliferation der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 74 5.4 N-Cadherin-Defizienz hat keinen Einfluss auf die Sphäroidbildung der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 74 5.5 N-Cadherin-Defizienz führt zu signifikant verringerter Migration der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 75 5.6 N-Cadherin-Defizienz führt zu signifikant verringerter Invasion der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 76 6 Zusammenfassung 79 7 Abbildungsverzeichnis 83 8 Tabellenverzeichnis 84 9 Literaturverzeichnis 85 10 Danksagung 104

Der erste Teil der vorliegenden Arbeit ist ein Review über die unterschiedlichen Studien aus den letzten zwanzig Jahren, die sich mit der Thematik: psychische Komorbidität bei (Brust-) Krebs auseinandersetzen. Die thematische Auseinandersetzung erfolgte zum Großteil in Form von Querschnittstudien. Das Fortbestehen der psychischen Komorbidität über Monate oder auch Jahre, nach dem Zeitpunkt der Diagnosestellung, ist erst in jüngster Zeit in das Blickfeld der Wissenschaft gerückt. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung verschiedener soziodemographischer und krankheitsspezifischer Faktoren und deren Einfluß auf die psychische Komorbidität. Die untersuchte Patientinnengruppe sind Frauen mit Brustkrebs. Das verwendete Screeninginstrument ist die Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS). Die Identifizierung der soziodemographischen und krankheitsspezifischen Faktoren, die psychische Komorbidität beeinflussen, ist ein noch junges Forschungsgebiet. Die Identifikation dieser Faktoren ist wichtig für die Erkrankten, um Chronifizierungsprozesse seelischen Leiden vorzubeugen. Das Ziel sollte sein, die psychische Komorbidität frühzeitig zu erkennen und zu behandeln. Dadurch kann die Lebensqualität der Frauen mit Brustkrebs gesteigert werden. Durch Fragebögen beispielsweise, als sekundär präventive Maßnahme, kann die psychische Komorbidität frühzeitig erkannt und therapiert werden. Ein zusätzlicher und nicht unerheblicher Aspekt ist dabei eine mögliche Kostenersparnis im Gesundheitswesen.