ZUSAMMENFASSUNG Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. Titel: Kosmetisches Ergebnis und Lebensqualität nach brusterhaltender Operation und unterschiedlicher Bestrahlung des Mammakarzinoms eingereicht von Katharina Schirm angefertigt an der Universitätsklinik für Strahlentherapie und Radioonkologie, Leipzig betreut von Prof. Dr. med. R.-D. Kortmann eingereicht im April 2013 Das Mammakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung der Frau. Die Therapie des lokal begrenzten Mammakarzinoms hat in den letzten 30 Jahren enorme Fortschritte gemacht. Die 10-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeit beträgt heute bei günstiger Tumorkonstellation (pT1 N0 M0) mehr als 90% [1]. Bei immer besser werdenden Heilungschancen erreichen daher eine gute Therapieverträglichkeit, das kosmetische Ergebnis und die Lebensqualität einen immer größeren Stellenwert. In dieser Untersuchung wurden 65 brusterhaltend operierte, rezidivfreie Mammakarzinompatientinnen mit einem mittleren Alter von 65 Jahren zum Untersuchungszeitpunkt und einem medianen follow up von 59,1 Monaten hinsichtlich 2er Hypothesen untersucht. Hypothese 1: „Das kosmetische Ergebnis nach brusterhaltender Mammakarzinomtherapie wird von der adjuvanten Bestrahlungstechnik (WBI ohne Boost, WBI mit 10,0 Gy percutanem Boost, WBI mit 16,0 Gy percutanem Boost, WBI mit interstitiellem Boost und alleinige interstitielle PBI) beeinflusst.“ Hypothese 2: „Die Lebensqualität nach brusterhaltender Mammakarzinomtherapie wird vom kosmetischen Ergebnis beeinflusst.“ Das kosmetische Ergebnis wurde auf einer 4 Punkte-Skala von „sehr gut“, „gut“, „zufriedenstellend, ordentlich“ bis „unzufrieden, schlecht“ von den Patientinnen selbst und dem untersuchenden Arzt bewertet. Zusätzlich wurden von jeder Patientin 3 standardisierte Fotos angefertigt. Diese wurden von 4 weiblichen und 4 männlichen Ratern aus unterschiedlichen Berufsgruppen beurteilt. Erstmals konnte neben der Interraterübereinstimmung (Fleiss Kappa) auch die Rangfolge der Kosmetikbewertungen beachtet werden (Konkordanzkoeffzient Kendall´s W). So wurden Abweichungen von „sehr gut“ zu „gut“ zwischen den Ratern weniger gravierend als die Abweichung von „sehr gut“ zu „unzufrieden“ gewertet. Die Erfassung der subjektiven Lebensqualität erfolgte mit Hilfe der EORTC QLQ-C30 und BR-23 [30] Fragebögen. Zum Vergleich dienten die Lebensqualitätsreferenzdaten gesunder Frauen im Alter von 16-92 Jahre (n=968) bzw. im Alter von 60-69 Jahren (n=197) aus dem Leipziger Raum [35]. Die subjektive Bewertung des kosmetischen Ergebnisses durch die Patientinnen fiel überwiegend sehr gut bis gut aus (44,6% sehr gut, 41,5% gut). Die ärztliche Kosmetikbewertung war insgesamt etwas schlechter als die der Patientinnen (21,5% sehr gut, 36,9% gut). Die Interrater-Übereinstimmung war schwach (κ=0,145). Auch die 8 Betrachter sowie die 8 Betrachter und der Arzt zeigten nur eine schwache Interrater-Übereinstimmung (mκ=0,24 - 0,25). Unter der Berücksichtigung der Rangfolge der Kosmetikbewertunegn (Konkordanzkoeffizeint Kendall´s W) konnte allerdings eine hohe Übereinstimmung der 8 Rater und des Arztes ermittelt werden (W=0,699). Hinsichtlich des kosmetischen Ergebnisses wurden Patientinnen mit alleiniger interstitieller Teilbrustbestrahlung (PBI) am besten bewertet (83,3% sehr gut – gut, p=0,048). Dabei ist kritisch zu erwähnen, dass diese Patientengruppe nur kleine Tumoren und keinen Lymphknotenbefall (11 x T1, 1 x T2, 12x N0) hatte. Eine percutane Boostbestrahlung führt zu signifikant (p=0,030) höheren (Grad III-IV) akute Nebenwirkungen (10 Gy pBoost 4 von 10), 16 Gy pBoost (2 von 9). Signifikant (p=0,040) mehr Fibrosen und Narbenveränderungen I.-III. Grades nach LENT-SOMA traten nach percutaner Bestrahlung der gesamten Brust und anschließender interstitieller Boostbestrahlung auf (20 von 24). Für das kosmetische Ergebnis spielen die Tumorgröße, die Anzahl der befallen Lymphknoten und das Operationsausmaß eine entscheidende Rolle. Die 5 verglichenen Bestrahlungskonzepte waren in dieser Untersuchung kritisch betrachtet hinsichtlich des kosmetischen Ergebnisses gleichwertig, die Hypothese „Das kosmetische Ergebnis nach brusterhaltender Mammakarzinomtherapie wird von der adjuvanten Bestrahlungstechnik (WBI ohne Boost, WBI mit 10,0 Gy percutanem Boost, WBI mit 16,0 Gy percutanem Boost, WBI mit interstitiellem Boost und alleinige interstitielle PBI) beeinflusst“ hat sich nicht bestätigt. Die Globaleinschätzung der Gesundheit und Lebensqualität fiel im untersuchten Kollektiv nach abgeschlossener Mammakarzinomtherapie durchschnittlich gut aus (MW 66,0 ± 22,4) und zeigte im Vergleich zu gleichaltrig gesunden Frauen kaum Unterschiede. Auch die Funktionsskalen und Symptomskalen wurden mit ausgezeichnet bis gut bewertet, zeigten im Vergleich zu gleichaltrigen gesunden Frauen (60-69 Jahre) aber signifikant schlechtere Bewertungen der Rollenfunktion / Arbeitsfähigkeit (p=0,017), sozialen Funktion (p=0,018), Schlafstörungen (p=0,035) und Kurzatmigkeit (p=0,016). Ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Lebensqualität und dem kosmetischen Ergebnis fand sich nur bei der ärztlichen Kosmetikbeurteilung und dem Lebensqualitätsteilbereich Sexualfunktion. Die Hypothese „Die Lebensqualität nach brusterhaltender Mammakarzinomtherapie wird vom kosmetischen Ergebnis beeinflusst“ kann somit nur im Teilbereich Sexualfunktion und auch nur in der kosmetischen Bewertung durch den Arzt bestätigt werden. Für die objektive Erfassung des kosmetischen Ergebnisses ist eine weitere Entwicklung und Etablierung objektiver, einheitlicher und durchgängig anwendbarer Messverfahren notwendig. Dabei sollten auch präoperative Bewertungen und Fotodokumentationen mit einbezogen werden. Letztlich spielen aber die Heilung, die Zufriedenheit und das Wohlbefinden der Patientinnen die entscheide Rolle. Die Erfassung der Nebenwirkungen und subjektiven Lebensqualität spielt daher im klinischen Alltag eine wichtige Rolle.:INHALTSVERZEICHNIS ABBILDUNGSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VII 1 EINLEITUNG 1 1.1 Epidemiologie 1 1.2 Therapie 3 1.3 Ziel dieser Arbeit 5 2 MATERIAL UND METHODEN 7 2.1 Versuchsplanung 7 2.2 Patienteneinschluss 8 2.3 Datenerhebung 9 2.3.1 Ablauf 9 2.3.2 Patientencharakteristika 10 2.3.2.1 Altersverteilung 10 2.3.2.2 Menopausenstatus 10 2.3.2.3 Body Mass Index (BMI) 10 2.3.2.4 Brustgröße 11 2.3.2.5 Nachbeobachtungszeit 11 2.3.2.6 Rezidivfreiheit 11 2.3.2.7 Sekundärmalignomrate 11 2.3.2.8 Familienstand 12 2.3.3 Tumorcharakteristika 12 2.3.3.1 Histologie 12 2.3.3.2 TNM Stadien 12 2.3.3.3 Grading 14 2.3.3.4 Rezeptorstatus 14 2.3.3.5 Her-2-Status 15 2.3.3.6 Risikoklassifizierung nach St. Gallen 2007 15 2.3.3.7 Tumorlokalisation 16 2.3.4 Therapie 17 2.3.4.1 Operationstechniken 17 2.3.4.2 2. Operation 17 2.3.4.3 Axilladissektion 17 2.3.4.4 Endokrine Therapie 17 2.3.4.5 Chemotherapie 18 2.3.4.6 Antikörpertherapie 18 2.3.4.7 Bestrahlungskonzepte 18 2.3.5 Nebenwirkungen 20 2.3.5.1 Akute Nebenwirkungen 20 2.3.5.2 Späte Nebenwirkungen 20 2.4 Beurteilung der Kosmetik 23 2.4.1 Beurteilung der Kosmetik durch den Untersucher 23 2.4.2 kosmetische Selbsteinschätzungen der Patientinnen 23 2.4.3 Beurteilung der Kosmetik durch die Rater 24 2.5 Beurteilung der Lebensqualität 26 2.5.1 EORTC-Fragenbögen 26 2.5.2 Referenzdaten zur Lebensqualität 26 2.6 Statistische Analyse 27 3 ERGEBNISSE 29 3.1 Patienteneinschluss 29 3.2 Patientencharakteristika 30 3.2.1 Altersverteilung 30 3.2.2 Menopausenstatus 30 3.2.3 Body Mass Index (BMI) 30 3.2.4 Brustgröße 31 3.2.5 Nachbeobachtungszeit 31 3.2.6 Rezidivfreiheit 32 3.2.7 Sekundärmalignomrate 32 3.2.8 Familienstand 33 3.3 Tumorcharakteristika 34 3.3.1 Histologie 34 3.3.2 TNM Stadien 34 3.3.3 Grading 36 3.3.4 Rezeptorstatus 36 3.3.5 Her-2-Status 37 3.3.6 Risikoklassifizierung nach St. Gallen 2007 37 3.3.7 Tumor-Lokalisation 37 3.4 Therapie 38 3.4.1 Operationstechniken 38 3.4.2 2. Operation 38 3.4.3 Axilladissektion 38 3.4.4 Endokrine Therapie 39 3.4.5 Chemotherapie 39 3.4.6 Antikörpertherapie 39 3.4.7 Bestrahlungskonzepte 39 3.5 Nebenwirkungen 44 3.5.1 Akute Nebenwirkungen 44 3.5.2 Späte Nebenwirkungen 44 3.5.2.1 Schuppung / Rauheit 44 3.5.2.2 Teleangiektasien 45 3.5.2.3 Fibrosen / Narbenveränderungen 46 3.5.2.4 Atrophien / Kontraktionen 46 3.5.2.5 Brustvolumendifferenzen 47 3.5.2.6 Mamillenstand 48 3.5.2.7 Brachiales Lymphödem und Armbeweglichkeit 48 3.5.2.8 Ein- und Austrittsstellen der Brachytherapiekatheter 48 3.6 Kosmetik 49 3.6.1 Kosmetikbewertung 49 3.6.2 Vergleich der Bestrahlungskonzepte 55 3.6.3 Vergleich der Einflussfaktoren und Nebenwirkungen 59 3.7 Lebensqualität 69 3.7.1 Globaleinschätzung 69 3.7.2 Funktionsskalen 71 3.7.3 Symptomskalen 75 4 DISKUSSION 79 4.1 Patientenkollektiv 79 4.2 Kosmetik 80 4.2.1 Testverfahren zur Beurteilung der Kosmetik 80 4.2.2 Kosmetisches Ergebnis und Einfluss der Bestrahlung 83 4.2.3 andere Einflussfaktoren auf das kosmetische Ergebnis 86 4.3 Lebensqualität 96 4.3.1 Testverfahren zur Beurteilung der Lebensqualität 96 4.3.2 Lebensqualität und kosmetisches Ergebnis 97 4.3.3 Lebensqualität rezidivfreier Patientinnen und gesunder Frauen 98 4.3.4 Mammakarzinomspezifische Lebensqualität und andere Einflussfaktoren 101 4.4 Kritische Diskussion 105 4.5 Ausblick 108 5 ZUSAMMENFASSUNG 109 6 LITERATURVERZEICHNIS 113 7 ANHANG 127 7.1 Datenerfassungsbogen 127 7.2 Patientenfragebogen 132 7.3 Studienübersicht 140 DANKSAGUNG 141 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 142 CURRICULUM VITAE 143

Obesity is a known risk factor for breast cancer. Since obesity rates are constantly rising worldwide, understanding the molecular details of the interaction between adipose tissue and breast tumors becomes an urgent task. To investigate potential molecular changes in breast cancer cells induced by co-existing adipocytes, we used a co-culture system of different breast cancer cell lines (MCF-7 and T47D: ER+/PR+/HER2- and MDA-MB-231: ER-/PR-/HER2-) and murine 3T3-L1 adipocytes. Here, we report that co-culture with adipocytes revealed distinct changes in global gene expression pattern in the different breast cancer cell lines. Our microarray data revealed that in both ER+ cell lines, top upregulated genes showed significant enrichment for hormone receptor target genes. In triple-negative MDA-MB-231 cells, co-culture with adipocytes led to the induction of pro-inflammatory genes, mainly involving genes of the Nf-κB signaling pathway. Moreover, co-cultured MDA-MB-231 cells showed increased secretion of the pro-inflammatory interleukins IL-6 and IL-8. Using a specific NF-κB inhibitor, these effects were significantly decreased. Finally, migratory capacities were significantly increased in triple-negative breast cancer cells upon co-culture with adipocytes, indicating an enhanced aggressive cell phenotype. Together, our studies illustrate that factors secreted by adipocytes have a significant impact on the molecular biology of breast cancer cells.:1. Einleitung ......................................................................................................... 4 1.1 Übergewicht und Adipositas – die Volkskrankheit des 21. Jahrhunderts ........ 4 1.2 Fettgewebe – Fett ist nicht gleich Fett ........................................................... 5 1.3 Fehlfunktionen des Fettgewebes bei Adipositas ............................................ 6 1.4 Der Zusammenhang zwischen Adipositas und Krebs ..................................... 7 1.4.1 Adipositas und die Tumormikroumgebung .................................................. 7 1.4.2 Adipositas-induzierte Inflammation und Krebs ............................................. 9 1.4.3 Die Insulin-IGF1-Achse................................................................................11 1.4.4 Östrogen-Synthese in adipösem Fettgewebe ............................................12 1.4.5 Tumorzellmetabolismus ..............................................................................12 1.5 Ziele der Arbeit ............................................................................................. 14 2 Publikation ...................................................................................................... 15 3 Zusammenfassung der Arbeit ......................................................................... 29 4 Literaturverzeichnis.......................................................................................... 34 5 Anlagen ........................................................................................................... 43 5.1 Supplemental Material .................................................................................. 43 5.1.1 Supplemental Figures ................................................................................45 5.1.2 Supplemental Tables ..................................................................................51 5.2 Erklärung über den wissenschaftlichen Beitrag des Promovenden zur Publikation ......................................................................................................... 66 5.3 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen und Symbole ............................ 67 5.4 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit .............................. 69 5.5 Lebenslauf ................................................................................................... 70 5.6 Publikationsverzeichnis ................................................................................ 72 5.7 Vorträge und Posterpräsentationen mit publizierten Abstracts ..................... 73 5.8 Danksagung ................................................................................................. 74

Das Mammakarzinom ist weltweit die häufigste krebsbedingte Todesursache bei Frauen. Fortschritte in der Therapie ermöglichen zwar eine Verlängerung der Lebens- dauer, jedoch kommt es dadurch vermehrt zur Bildung von Metastasen im zentralen Nervensystem (ZNS). Die Diagnostik und Behandlung von ZNS-Metastasen sind be- grenzt und die Lebensqualität sowie Lebensdauer der Betroffenen nimmt bei zerebraler Metastasierung rapide ab. Ziel aktueller Forschungsprojekte ist daher, Biomarker zu identifizieren, die Hinweise auf eine Brustkrebserkrankung oder Metastasierung liefern. So soll eine kostengünstige, risikoarme und minimalinvasive Methode etabliert werden, die zuverlässige Daten über die Prognose und dementsprechende Therapien erbringt. Diese Arbeit hatte daher die Absicht, mithilfe von qPCR Expressionsprofile von miRNAs aus Serumproben von Brustkrebspatientinnen zu erstellen und deren Funktion als prog- nostische Biomarker für eine Metastasierung ins ZNS zu erweisen. Anhand von Metas- tasierung und Rezeptorstatus wurden die Proben in Untergruppen eingeteilt und statis- tisch mit einer gesunden Kontrollgruppe verglichen. Insgesamt zeigte sich bei 26 miRNAs eine signifikante Dysregulation der Expression bei mindestens einer der Untergruppen. Insbesondere bei ZNS-Metastasen war das Expres- sionsmuster bei miRNA-122-5p, miRNA-296-5p, miRNA-490-3p und miRNA-576-3p sig- nifikant erhöht, während die Expression von miRNA-130a-3p, miRNA-148b-3p und miRNA-326 signifikant reduziert war. Basierend auf den Übereinstimmungen unserer Er- gebnisse mit den Daten bisheriger Forschungsprojekten wiesen vier miRNAs eine po- tenzielle Funktion als Biomarker für Metastasen auf: miRNA-122-5p, miRNA-490-3p und miRNA-130a-3p, miRNA-326. Bei ZNS-Metastasen zeigten besonders miRNA-122-5p und miRNA-490-3p statistisch relevante Veränderungen. Um den Einfluss von miRNAs auf den gesamten Körper darzustellen, wurde mithilfe ver- schiedener Datenbanken nach entsprechenden Zielgenen und Signalwegen für die 26 identifizierten miRNAs recherchiert. Neben dem Einfluss auf Stoffwechselwege und Er- krankungen, zeigte sich bei acht Targets ein Zusammenhang mit der Entstehung von Krebs. Ergänzend zur Identifikation von miRNA-Expressionsprofilen wurden Zellkulturversuche mit zerebralen Endothel- (cerebEND) und Brustkrebszellen (4T1) durchgeführt. Verwendet wurden zwei cerebEND- und eine 4T1-Zellreihe von Mäusen, von denen eine ce- rebEND-Kultur zuvor in der Arbeitsgruppe Burek mit einem miRNA-210-Vektor trans- fiziert wurde. Studien belegen den Einfluss von miRNA-210 auf den mitochondrialen Stoffwechsel, Angiogenese, Reaktionen auf DNA-Schäden, Apoptose und Zellüberleben sowie auf die Proteine BRCA1, PARP1 und E-Cadherin und schreiben ihr damit eine Funktion in der Krebsentstehung und Metastasierung zu. Zur Bestimmung der Proliferation und Aktivität der transfizierten cerebEND-210-Zellen im Verhältnis zur unbehandelten Kontrolle, wurden BrdU-Proliferationsassays und MTT- Assays mit verschiedenen Zellzahlen durchgeführt. Bei der Untersuchung der Prolifera- tion zeigte sich in beiden Versuchen eine erhöhte Aktivität der cerebEND-210-Zellen, da miRNA-210 vermutlich auch hier das Zellüberleben gesichert hat. Zudem wurde die An- heftung der Brustkrebszellen an den zerebralen Endothelzellen im Adhäsionsversuchs überprüft. Hierbei wurde eine Abnahme der Adhäsion der cerebEND-210-Zellen beo- bachtet. Vermutet wird eine Veränderung des Phänotyps der Rezeptorbindungen der cerebEND-210-Zellen. Die Ergebnisse der Zellkulturversuche dienen als Grundlage für weitere Experimente. / Breast cancer is the most common cause of cancer-related death in women worldwide. Although advances in therapy allow for increased longevity, this results in increased metastasis to the central nervous system (CNS). Diagnosis and treatment of CNS metastases are limited and the quality of life and lifespan of those affected decreases rapidly with cerebral metastasis. Therefore, the goal of current research projects is to identify biomarkers that provide evidence of breast cancer disease or metastasis. Thus, a low-cost, low-risk, and minimally invasive method should be established that yields reliable data on prognosis and corresponding therapies. Therefore, this work aimed to use qPCR to establish expression profiles of miRNAs from serum samples of breast cancer patients and prove their function as prognostic biomarkers for metastasis to the CNS. Based on metastasis and receptor status, samples were divided into subgroups and statistically compared with a healthy control group. Overall, 26 miRNAs showed significant dysregulation of expression in at least one of the subgroups. Specifically, in CNS metastases, the expression pattern of miRNA-122-5p, miRNA-296-5p, miRNA-490-3p and miRNA-576-3p was significantly increased, while the expression of miRNA-130a-3p, miRNA-148b-3p and miRNA-326 was significantly decreased. Based on the agreements of our results with the data of previous research projects, four miRNAs showed potential function as biomarkers of metastasis: miRNA-122-5p, miRNA-490-3p and miRNA-130a-3p, miRNA-326. In CNS metastases, miRNA-122-5p and miRNA-490-3p in particular showed statistically relevant changes. To demonstrate the influence of miRNAs on the whole body, we searched for corresponding target genes and signaling pathways for the 26 identified miRNAs using various databases. In addition to their influence on metabolic pathways and diseases, eight targets were found to be associated with the development of cancer. Complementary to the identification of miRNA expression profiles, cell culture experiments were performed with cerebral endothelial (cerebEND) and breast cancer (4T1) cells. Two cerebEND and one 4T1 cell lines from mice were used, one cerebEND culture of which was previously transfected with a miRNA-210 vector in the Burek group. Studies demonstrate the influence of miRNA-210 on mitochondrial metabolism, angiogenesis, DNA damage responses, apoptosis and cell survival, as well as on BRCA1, PARP1 and E-cadherin proteins, thus attributing it a function in carcinogenesis and metastasis. To determine the proliferation and activity of the transfected cerebEND-210 cells relative to the untreated control, BrdU proliferation assays and MTT assays were performed with different cell numbers. Proliferation assays showed increased activity of cerebEND-210 cells in both experiments, as miRNA-210 presumably ensured cell survival in this case as well. In addition, the attachment of breast cancer cells to cerebral endothelial cells was examined in the adhesion assay. Here, a decrease in adhesion of cerebEND-210 cells was observed. A change in the phenotype of receptor binding of cerebEND-210 cells is suspected. The results of the cell culture experiments serve as a basis for further experiments.

Die mitochondriale Entkopplung ist ein effektiver Weg, um die Thermogenese und basale metabolische Rate einer Zelle anzuheben. Im Versuchsaufbau mit malignen Zellen führte dies zu einer Apoptose. 2,4-DNP als spezifischer Entkoppler der Atmungskette zeigte in diesem Zusammenhang mittels LDH-Analysen an HACAT-, PA1-, BT20 und MDA-MB 231- Zellen eine dosisabhängige Wirkung auf die Zellproliferation in allen verwendeten Zelllinien, unter den verwendeten Tumorzellen am eindrucksvollsten bei den Ovarialkarzinom Zellen. Allen Zellarten gemeinsam war dabei eine Wachstumshemmung abhängig von der Länge der Inkubationszeit. Die mikrokalorimetrischen Analysen wurden an HACAT-, BT20- und MDA-MB 231- Zellen durchgeführt. Eine höhere 2,4-DNP-Konzentration führte dabei ebenfalls zu einer gesteigerten Wärmefreisetzung, wobei eine positive Korrelation zwischen Einwirkdauer und Wärmefreisetzung bestand. Eine signifikante Zytotoxizität ließ sich bei hohen DNP-Konzentrationen und bei langer Inkubationszeit in den PA1- und MDA-MB 231- Zelllinien nachweisen. MDA-MB 231- Zellen reagierten dabei besonders sensibel. In der aktuellen Tumortherapie bietet die Kombination von Alterationen der mitochondrialen und glykolytischen Abläufen neben den gängigen Behandlungsoptionen einen vielversprechenden Therapieansatz (8, 28). Durch den Einsatz von mitochondrialen Entkopplern als Ergänzung zu den herkömmlichen Therapieschemata könnte effektiv in den metabolischen Stoffwechsel der Zellen eingegriffen und neben der Tumorzellproliferation auch die Regression positiv beeinflusst werden. Das Ziel wäre, eine kontrollierte Apoptose bei möglichst wenigen systemischen Nebenwirkungen auszulösen. Hierzu werden im Rahmen der optimalen Dosisfindung für den Einsatz von 2,4-DNP jedoch weitere Versuchsansätze mit Inkubationszeiten von mindestens 48h benötigt. / Mitochondrial uncoupling is an effective way to raise the thermogenesis and basal metabolic rate of a cell. In the experimental setup with malignant cells, this led to apoptosis. In this context 2,4-DNP as a specific uncoupler of the respiratory chain showed a dose-dependent effect on cell proliferation in all cell lines used by means of LDH analyses on HACAT, PA1, BT20 and MDA-MB 231 cells. Among the used tumor cells this effect was most impressively documented in ovarian carcinoma cells. Common to all cell types was a growth inhibition dependent on the length of the incubation period. Microcalorimetric analyses were performed on HACAT, BT20, and MDA-MB 231 cells. A higher 2,4-DNP concentration also resulted in increased heat release, with a positive correlation between exposure time and heat release. Significant cytotoxicity was detected at high DNP concentrations and with long incubation times in the PA1 and MDA-MB 231 cell lines. MDA-MB 231 cells reacted particularly sensitively. In current tumor therapy, the combination of alterations of mitochondrial and glycolytic pathways offers a promising therapeutic approach in addition to current treatment options (8, 28). The use of mitochondrial uncouplers as an adjunct to conventional therapeutic regimens could effectively interfere with cell metabolism and positively influence regression in addition to tumor cell proliferation. The goal would be to induce controlled apoptosis with as few systemic side effects as possible. For this, however, further experimental approaches with incubation times of at least 48h are needed in the context of optimal dose finding for the use of 2,4-DNP.

Beta-Hydroxybutyrat (3OHB) ist ein physiologischer Ketonkörper,wie er zum Beispiel im Rahmen einer ketogenen Diät als alternativer Energielieferant produziert wird. Außerdem ist 3OHB ein Modulator von Zellhämostase und zahlreichen Signalwegen. Ziel dieser Arbeit war, zu untersuchen ob 3OHB die Polarisation von Makrophagen beeinflusst und ob er deren Interaktion mit Sphäroiden aus Brustkrebszellen beeinflusst wird. Die Makrophagen-Subtypen (M0, M1 und M2) wurden aus THP1-Zellen polarisiert. Die Subtypen wurden auf den Oberflächenmarker CCR7, sowie auf das Protein Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) untersucht. Außerdem wurde die Expression von Monocarboxylat-Transportern 1 und 4 (MCT1, MCT4) und die Expression von G-Protein-gekoppelten-Rezeptoren 41, 43 und 109A (GPR41, GPR43, GPR109A) untersucht. In den Tests zur Gen- und Proteinexpression konnte festgestellt werden, das die Transporterproteine und Oberflächenrezeptoren, die zur Verwertung von 3OHB und zu einer möglichen Beeinflussung der Zellen durch 3OHB notwendig sind, bei den Makrophagen-Subtypen vorhanden sind. Das Gelingen der Polarisation wurde zumindest für die M1‑Fraktion durch den durchgeführten IDO‑Versuch gesichert. Des Weiteren wurde eine mögliche Beeinflussung des Zytokinspektrums der Fraktionen durch die Polarisation, sowie durch unterschiedliches Angebot an Sauerstoff und Anwesenheit von 3OHB untersucht. Die Zusammenschau der experimentellen Ergebnisse lässt die Aussage zu, dass 3OHB eine immunmodulierende Wirkung auf die getesteten Makrophagen-Fraktionen hat. Weitere Schlussfolgerungen unserer Versuche waren nicht immer eindeutig, und zum Teil widersprechen sie den Ergebnissen aus bisherigen Studien, was die Komplexität der Interaktionen zwischen Zyto- und Chemokinen, Makrophagen-Subtypen und beeinflussenden Faktoren verdeutlicht, sodass man von einer Übertragbarkeit der in vitro Ergebnisse auf eine in vivo Situation aktuell nicht ausgehen kann. Zusätzlich wurden die vier Fraktionen auf ihr Migrations-und Invasionsverhalten untersucht, letzteres anhand von Sphäroiden aus der Brustkrebszelllinie BT20. Diese scheinen unter Einfluss von 3OHB ebenfalls moduliert, wobei hier noch vielfältige Möglichkeiten der weiteren Austestung dieser Annahme bestehen. / Beta-hydroxybutyrate (3OHB) is a physiological ketone body that is produced, for example, as part of a ketogenic diet as an alternative source of energy. In addition, 3OHB is a modulator of cell hemostasis and numerous signaling pathways. The aim of this work was to investigate whether 3OHB influences the polarization of macrophages and whether it affects their interaction with spheroids from breast cancer cells. The macrophage subtypes (M0, M1 and M2) were polarized from THP1 cells. The subtypes were analyzed for the surface marker CCR7, as well as for the protein indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO). In addition, the expression of monocarboxylate transporters 1 and 4 (MCT1, MCT4) and the expression of G-protein-coupled receptors 41, 43 and 109A (GPR41, GPR43, GPR109A) were examined. The tests on gene and protein expression showed that the transporter proteins and surface receptors required for the utilization of 3OHB and for a possible influence of 3OHB on the cells are present in the macrophage subtypes. The success of the polarization was ensured, at least for the M1 fraction, by the IDO experiment. Furthermore, a possible influence on the cytokine spectrum of the fractions by the polarization, as well as by different supply of oxygen and presence of 3OHB was investigated.The summary of the experimental results allows the conclusion that 3OHB has an immunomodulating effect on the tested macrophage fractions.Further conclusions of our experiments were not always clear and partly contradict the results of previous studies, which illustrates the complexity of the interactions between cyto- and chemokines, macrophage subtypes and influencing factors, so that a transferability of the in vitro results to an in vivo situation cannot be assumed at present. In addition, the four fractions were examined for their migration and invasion behavior, the latter using spheroids from the BT20 breast cancer cell line.These also appear to be modulated under the influence of 3OHB, although there are still many possibilities for further testing this assumption.

Anhand einer Analyse von deutschen Zeitungsartikeln, welche sich jeweils mit den Themen Brust- oder Lungenkrebs beschäftigen, wird in dieser Dissertation die Bedeutung von Prävention herausgearbeitet. Im Fokus der Fragestellung steht hierbei, wie sehr die Gesamtberichterstattung beider Krankheiten durch das Thema Prävention beeinflusst wird, ob ihre Prävention vorwiegend als positiv oder kritisch bewertet wird und wie sich die Präventionsschwerpunkte bei Brust- und Lungenkrebs unterscheiden. Hierzu werden 1020 Zeitungsartikel aus zwei Tageszeitungen und einem Wochenmagazin Themenbereichen zugeordnet und quantitativ verglichen. Anschließend werden die Artikel, bei denen der thematische Schwerpunkt auf der Prävention liegt, mittels einer Frameanalyse qualitativ ausgewertet.

Bei der adjuvanten Immuntherapie soll das Immunsystem von Tumorpatienten gezielt gegen Mikrometastasen aktiviert werden, die nach der operativen Entfernung des Primärtumors im Körper verbleiben. Tumor-assoziierte Antigene (TAA) spielen dabei die zentrale Rolle. Um der Heterogenität eines Tumors in der Expression einzelner TAAs Rechnung zu tragen, werden in modernen Vakzinierungsstrategien Pools von verschiedenen TAAs eingesetzt. Für das Mammakarzinom sind aber bislang nur wenige TAAs bekannt. Auf der Suche nach unbekannten Genen mit Mamma- bzw. Mammakarzinom-restringierter Expression in der Transkriptomdatenbank GeneExpress® wurde ein EST gefunden, das nur in 2 % der getesteten weibl. Normalgewebe ohne Mamma mit einer marginalen mittleren Expression von 16 FE (Fluoreszenzeinheit) detektiert wurde, aber in 63 % der Mammanormalgewebe (159 FE) und in 61 % der Mammakarzinome (339 FE) exprimiert wurde. Das korrespondierende UniGene-Cluster gab erste Hinweise auf die Zugehörigkeit dieses neuen Gens zu der Cytochrom P450 (CYP) Familie. Durch computergestützte Homologievergleiche mit verwandten Mitgliedern dieser Familie in Kombination mit RT-PCR konnte die cDNA-Sequenz dieses neuen CYP ermittelt werden: Durch Amplifikation der Gesamtlängen-cDNA wurden drei Transkripte in der Mammakarzinomzelllinie SK-BR-3 gefunden, die von zwei neuen CYP Genen stammen, CYP4Z1 und dem Pseudogen CYP4Z2P. Die cDNA von CYP4Z1 kodiert für ein 505 As großes Protein, das aufgrund von Homologien einer neuen Subfamilie innerhalb der CYP4 Familie zugeordnet werden kann. Sowohl die Sequenz als auch die vorhergesagte Sekundärstruktur zeigen alle charakteristischen Merkmale eines funktionellen Mitglieds dieser Familie. Aufgrund einer Nonsensemutation in Exon 8 kodiert die cDNA von CYP4Z2P (1436 bp) für ein verkürztes, nichtfunktionelles P450 von 340 As, das zu 96% identisch mit P450 4Z1 ist. Außerdem wurde in SK-BR-3 eine Spleißvariante von CYP4Z1 identifiziert. CYP4Z1 (50,8 kb) und CYP4Z2P (57,3 kb) liegen auf Chromosom 1p33-p34.1 und bestehen aus 12 Exons mit konservierten Exon-Intron-Grenzen. CYP4Z2P ist aus einer inversen Duplikation von CYP4Z1 hervorgegangen. Mittels Realtime RT-PCR mit cDNA von 17 Normalgeweben von gepoolten Spendern und von Mammakarzinomen konnte die auf Brustdrüsengewebe restringierte Expression beider Gene demonstriert werden: Die Expression von CYP4Z1 war in Mammakarzinomgewebe 3,6-mal höher als in Mammanormalgewebe, 60-mal höher als in Lunge und 84-mal höher als in Leber. Alle anderen getesteten weibl. Normalgewebe zeigten eine noch geringere Expression. Ein ähnlich stringentes Expressionsprofil ergab die Analyse von CYP4Z2P, allerdings mit einer deutlich niedrigeren Expressionsstärke. Das Mamma-restringierte Expressionsverhalten von CYP4Z1 wurde durch einen ?Cancer-Profiling-Array? (241 Tumor-/Normalgewebepaare von 13 Gewebetypen) bestätigt. Damit konnte gezeigt werden, dass CYP4Z1 bei 52 % der getesteten 50 Brustkrebspatientinnen im Tumor versus peritumoralem Normalgewebe überexprimiert war. Mit einem spezifischen Kaninchen-Antiserum konnte die Expression von P450 4Z1 Protein sowohl in CYP4Z1-transduzierten Zelllinien als auch in Mammagewebeproben mittels Western-Blot nachgewiesen werden. Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie von MCF-7 Zellen, die das Fusionsprotein CYP4Z1-EGFP exprimierten, und die subzelluläre Fraktionierung der CYP4Z1-Transduktanten zeigten P450 4Z1 als integrales Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums (ER). Für die Lokalisation und die Zurückhaltung im ER ohne Recycling aus dem Prä-Golgiapparat sind die ersten 32 As erforderlich, was Studien mit unterschiedlichen Deletionsmutanten aus der N-terminalen Sequenz von 4Z1 zeigten. Die Entdeckung eines neuen Mamma-spezifisch exprimierten P450 Enzyms eröffnet neue Möglichkeiten sowohl in Hinsicht auf eine Immuntherapie von Brustkrebs als auch für die Entwicklung neuer Chemotherapeutika, die spezifisch durch P450 4Z1 am Tumorort umgesetzt werden können.

Bei der adjuvanten Immuntherapie soll das Immunsystem von Tumorpatienten gezielt gegen Mikrometastasen aktiviert werden, die nach der operativen Entfernung des Primärtumors im Körper verbleiben. Tumor-assoziierte Antigene (TAA) spielen dabei die zentrale Rolle. Um der Heterogenität eines Tumors in der Expression einzelner TAAs Rechnung zu tragen, werden in modernen Vakzinierungsstrategien Pools von verschiedenen TAAs eingesetzt. Für das Mammakarzinom sind aber bislang nur wenige TAAs bekannt. Auf der Suche nach unbekannten Genen mit Mamma- bzw. Mammakarzinom-restringierter Expression in der Transkriptomdatenbank GeneExpress® wurde ein EST gefunden, das nur in 2 % der getesteten weibl. Normalgewebe ohne Mamma mit einer marginalen mittleren Expression von 16 FE (Fluoreszenzeinheit) detektiert wurde, aber in 63 % der Mammanormalgewebe (159 FE) und in 61 % der Mammakarzinome (339 FE) exprimiert wurde. Das korrespondierende UniGene-Cluster gab erste Hinweise auf die Zugehörigkeit dieses neuen Gens zu der Cytochrom P450 (CYP) Familie. Durch computergestützte Homologievergleiche mit verwandten Mitgliedern dieser Familie in Kombination mit RT-PCR konnte die cDNA-Sequenz dieses neuen CYP ermittelt werden: Durch Amplifikation der Gesamtlängen-cDNA wurden drei Transkripte in der Mammakarzinomzelllinie SK-BR-3 gefunden, die von zwei neuen CYP Genen stammen, CYP4Z1 und dem Pseudogen CYP4Z2P. Die cDNA von CYP4Z1 kodiert für ein 505 As großes Protein, das aufgrund von Homologien einer neuen Subfamilie innerhalb der CYP4 Familie zugeordnet werden kann. Sowohl die Sequenz als auch die vorhergesagte Sekundärstruktur zeigen alle charakteristischen Merkmale eines funktionellen Mitglieds dieser Familie. Aufgrund einer Nonsensemutation in Exon 8 kodiert die cDNA von CYP4Z2P (1436 bp) für ein verkürztes, nichtfunktionelles P450 von 340 As, das zu 96% identisch mit P450 4Z1 ist. Außerdem wurde in SK-BR-3 eine Spleißvariante von CYP4Z1 identifiziert. CYP4Z1 (50,8 kb) und CYP4Z2P (57,3 kb) liegen auf Chromosom 1p33-p34.1 und bestehen aus 12 Exons mit konservierten Exon-Intron-Grenzen. CYP4Z2P ist aus einer inversen Duplikation von CYP4Z1 hervorgegangen. Mittels Realtime RT-PCR mit cDNA von 17 Normalgeweben von gepoolten Spendern und von Mammakarzinomen konnte die auf Brustdrüsengewebe restringierte Expression beider Gene demonstriert werden: Die Expression von CYP4Z1 war in Mammakarzinomgewebe 3,6-mal höher als in Mammanormalgewebe, 60-mal höher als in Lunge und 84-mal höher als in Leber. Alle anderen getesteten weibl. Normalgewebe zeigten eine noch geringere Expression. Ein ähnlich stringentes Expressionsprofil ergab die Analyse von CYP4Z2P, allerdings mit einer deutlich niedrigeren Expressionsstärke. Das Mamma-restringierte Expressionsverhalten von CYP4Z1 wurde durch einen ?Cancer-Profiling-Array? (241 Tumor-/Normalgewebepaare von 13 Gewebetypen) bestätigt. Damit konnte gezeigt werden, dass CYP4Z1 bei 52 % der getesteten 50 Brustkrebspatientinnen im Tumor versus peritumoralem Normalgewebe überexprimiert war. Mit einem spezifischen Kaninchen-Antiserum konnte die Expression von P450 4Z1 Protein sowohl in CYP4Z1-transduzierten Zelllinien als auch in Mammagewebeproben mittels Western-Blot nachgewiesen werden. Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie von MCF-7 Zellen, die das Fusionsprotein CYP4Z1-EGFP exprimierten, und die subzelluläre Fraktionierung der CYP4Z1-Transduktanten zeigten P450 4Z1 als integrales Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums (ER). Für die Lokalisation und die Zurückhaltung im ER ohne Recycling aus dem Prä-Golgiapparat sind die ersten 32 As erforderlich, was Studien mit unterschiedlichen Deletionsmutanten aus der N-terminalen Sequenz von 4Z1 zeigten. Die Entdeckung eines neuen Mamma-spezifisch exprimierten P450 Enzyms eröffnet neue Möglichkeiten sowohl in Hinsicht auf eine Immuntherapie von Brustkrebs als auch für die Entwicklung neuer Chemotherapeutika, die spezifisch durch P450 4Z1 am Tumorort umgesetzt werden können.

Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag auf dem Teilvorgang der Migration epithelialer Zellen auf annähernd physiologischem Matrix-Untergrund. Im Zellkulturmodell wurde die migratorische Aktivität der aus dem humanen Mammakarzinom isolierten, schwach invasiven epithelialen Zelllinie MCF-7 untersucht. Es stellte sich die grundsätzliche Frage, ob eine Wnt-bedingte Invasionssteigerung, welche in vorangegangenen Untersuchungen gezeigt worden war, durch die gesteigerte migratorische Aktivität der Tumorzellen verursacht ist. Es sollten zwei an der Tumorprogression (Wnt5b) bzw. an deren Inhibition (Dkk-2) beteiligte Proteine auf den Invasions-Teilvorgang der Migration hin näher beleuchtet werden. Dazu wurden Untersuchungen in einem modifizierten Tumor-Migrationsassay auf extrazellulärer Matrix (ECM) durchgeführt. In Analogie zu den Vorgängen bei der Wundheilung wurde ein in Anlehnung an die bereits seit langem verwendete Methode des Scratchassays sowie an den etablierten Migrationsassay ein Konfrontationsassay auf ECM konzipiert. Der Einfluss von Wnt5b und Dkk-2 auf die Migration der schwach invasiven, epithelialen Zelllinie MCF-7 wurde schließlich im Migrationsassay sowie im neu etablierten Konfrontationsassay auf ECM näher untersucht. Es wurden dazu Messungen zur Migrationsaktivität der eingesetzten Zellen unter Stimulation mit Wnt5b und Dkk-2 erhoben. Jedoch zeigte sich in beiden Assay-Modellen auf ECM kein signifikanter Einfluss der beiden untersuchten Proteine auf das Migrationsverhalten der MCF-7-Zellen. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die Beobachtungen zum Teilaspekt der Migration nicht automatisch Rückschlüsse auf die Invasion zulassen. Letztere ist ein komplex zusammengesetzter Gesamtvorgang, dessen einzelne Bestandteile es noch weiter zu erforschen gilt.

Enterolignans (enterodiol and enterolactone) exhibit structural similarity to estradiol and have therefore been hypothesized to modulate hormone related cancers such as breast cancer. The bioactivation of the plant lignan secoisolariciresinol diglucoside (SDG) requires the transformation by intestinal bacteria including the deglycosylation of SDG to secoisolariciresinol (SECO) followed by demethylation and dehydroxylation of SECO to enterodiol (ED). Finally, ED is dehydrogenated to enterolactone (EL). It is unclear whether the bacterial activation of SDG to ED and EL is crucial for the cancer preventing effects of dietary lignans. The possible protective effect of bacterial lignan transformation on a 7,12 dimethylbenz(a)anthracene (DMBA)-induced breast cancer in gnotobiotic rats was investigated. Germ-free rats were associated with a defined lignan-converting consortium (Clostridium saccharogumia, Blautia producta, Eggerthella lenta, and Lactonifactor longoviformis). The rats colonized with lignan-converting bacteria consortium (LCC) were fed a lignan-rich flaxseed diet and breast cancer was chemical induced. Identically treated germ-free rats served as control. All bacteria of the consortium successfully colonized the intestine of the LCC rats. The plant lignan SDG was converted into the enterolignans ED and EL in the LCC rats but not in the germ-free rats. This transformation did not influence cancer incidence but significantly decreased tumor numbers per tumor-bearing rat, and tumor size. Cell proliferation was significantly inhibited and apoptosis was significantly induced in LCC rats. No differences between LCC and control rats were observed in the expression of the genes encoding the estrogen receptors (ERα and ERβ) and G-coupled protein receptor 30 (GPR30). Similar findings were observed for both insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and epidermal growth factor receptor (EGFR) genes involved in tumor growth. Proteome analysis revealed that 24 proteins were differentially expressed in tumor tissue from LCC and germ-free. RanBP-type and C3HC4-type zinc finger-containing protein 1 (RBCK1) and poly(rC)-binding protein 1 (PBCP1) were down-regulated by 3.2- and 2.0-fold, respectively. These proteins are associated with cell proliferation. The activity of selected enzymes involved in the degradation of oxidants in plasma and liver was significantly increased in the LCC rats. However, plasma and liver concentrations of reduced glutathione (non-enzymatic antioxidant) and malondialdehyde (oxidative stress marker) did not differ between the groups. In conclusion, the bacterial conversion of plant lignan to enterolignans beneficially influences their anti-cancer effect. However, the mechanisms involved in these effects remain elusive. / Enterolignanen (Enterodiol ED und Enterolacton EL) wird aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit zu Estradiol ein modulierender Einfluss auf hormonell bedingte Krebserkrankungen wie Brustkrebs nachgesagt. Das pflanzliche Lignan Secoisolariciresinoldiglucosid (SDG) wird durch Darmbakterien zum Enterolignan aktiviert. Dies erfolgt über dessen Deglykosylierung zu Secoisolariciresinol (SECO) gefolgt durch die Demethylierung und die Dehydroxylierung zu Enterodiol (ED). Schließlich wird ED zu Enterolacton (EL) dehydrogeniert. Es ist allerdings noch nicht bewiesen, dass die bakterielle Aktivierung von SDG zu ED und EL für die antikanzerogenen Wirkungen verantwortlich ist, die für dieses in der menschlichen Ernährung vorkommende Lignan beschrieben wurden. Um dies zu klären, wurde der Einfluss der bakteriellen Lignan-Transformation auf die Protektion gegenüber einem durch 7,12-Dimethylbenz(a)anthracen (DMBA)-induzierten Brustkrebs im gnotobiotischen Rattenmodell untersucht. Keimfreie Ratten wurden hierfür mit einem Konsortium aus vier Bakterienstämmen (Clostridium saccharogumia, Blautia producta, Eggerthella lenta, und Lactonifactor longoviformis) besiedelt, das die Umsetzung von SDG zu ED und EL katalysiert (LCC-Ratten). Ratten, die über den gesamten Versuchszeitraum keimfrei blieben, dienten als Kontrolle. Die Tiere wurden über 16 Wochen mit einer Leinsamen-Diät gefüttert, die reich an pflanzlichen Lignanen war. Während der Fütterung wurde bei allen Tieren Brustkrebs chemisch induziert. Das pflanzliche Lignan SDG wurde nur in den LCC Ratten zu den Enterolignanen ED und EL umgewandelt. Keimfreie Ratten zeigten keine Transformation von SDG. Die bakterielle Transformation von SDG hatte zwar keinen Einfluss auf die Inzidenz von Brustkrebs, jedoch verringerten sich durch die Besiedlung der Ratten mit SDG-transformierenden Bakterien die Anzahl von Tumoren pro tumortragender Ratte und die Tumorgröße deutlich. Zudem wurde die Zellproliferation in den LCC-Ratten deutlich gehemmt und die Apoptose induziert. Unterschiede in der Genexpression der Östrogenrezeptoren (ERα und ERß) und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPR30) wurden zwischen den LCC-Ratten und den Kontrolltieren nicht beobachtet. Ebenso verhielt es sich für die Gene des Insulinähnliche Wachstumsfaktoren 1 (IGF-1) und Epidermale Wachstumsfaktor rezeptoren (EGFR), welche in das Tumorwachstum involviert sind. Die Analyse des Proteoms des Tumorgewebes ergab 24 differentiell exprimierte Proteine zwischen keimfreien und LCC-Ratten. So wurden zum Beispiel die Proteine RanBP-type and C3HC4-type zinc finger-containing protein 1 (RBCK1) und poly(rC)-binding protein 1 (PBCP1), die mit der Zellproliferation assoziiert sind, in LCC-Ratten um das 3,2 bzw. 2,0-fache herunterreguliert. Die Aktivität ausgewählter antioxidativer Enzyme in Plasma und Leber war in den LCC-Ratten im Vergleich zu den keimfreien Tieren deutlich erhöht. Allerdings unterschieden sich die Konzentrationen von reduziertem Glutathion (nichtenzymatisches Antioxidans) und Malondialdehyd (oxidativer Stress-Marker) in Plasma und Leber nicht zwischen den beiden Besiedlungs-Gruppen. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die bakterielle Umwandlung von pflanzlichen Lignanen zu Enterolignanen deren antikanzerogene Wirkung entscheidend beeinflusst. Allerdings bleiben die zugrunde liegenden Mechanismen weiterhin ungeklärt.