Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2015-05-26T14:43:18Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertaçao Teresa.pdf: 858798 bytes, checksum: 366102ad9a523ad884dd83fab7fbdde1 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-26T14:43:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertaçao Teresa.pdf: 858798 bytes, checksum: 366102ad9a523ad884dd83fab7fbdde1 (MD5) Previous issue date: 2015-03-06 / CNPq / A levedura Dekkera bruxellensis foi identificada como principal contaminante dos processos de fermentação alcoólica em destilaria de vários países, com destaque para as encontradas no nordeste brasileiro. A presença dessas leveduras pode resultar em uma diminuição na produtividade do etanol combustível, causando grande prejuízo econômico. Atualmente, vários estudos estão sendo realizados para um melhor entendimento sobre a fisiologia dessa espécie e pouco se sabe sobre como essa levedura contaminante se instala no processo industrial. Assim, esse trabalho se propõe a investigar os possíveis pontos de surgimento desta levedura em destilarias do estado da Paraíba, no Nordeste Brasileiro, a partir de amostras coletadas da água de lavagem da cana-de-açúcar, do caldo misto da fermentação e da vinhaça, um resíduo industrial. As leveduras foram isoladas usando meios seletivos com WLN e YNB-Nit e posteriormente identificadas a partir de sequenciamento de DNA. Foram isoladas 157 espécimes de D. bruxellensis. Estes isolados estavam presentes nos três pontos de coletas em ambas as destilarias, mas com diferentes percentuais de distribuição. Na destilaria A o surgimento das leveduras foi ditribuido em 33.9% nas amostras de caldo misto, 13,1% nas de água e 53% nas de vinhaça. Na destilaria B as percentagens foram 19,8% para caldo misto, 33,4% para água de lavagem e 46,8 para vinhaça Este estudo mostra que a levedura D. bruxellensis está presente em todas as amostras analisadas e em quantidade significantes, sendo o nitrato presente nessas amostras o possível responsável poe essa presença. Entretanto, mais estudos acerca da presença de nitrato e a presença da levedura nessas amostras são necessários para confirmar a adaptação de D. bruxellensis em diferentes nichos ecológicos. / The Yeast Dekkera bruxellensis was identified as the main contaminant of fermentation processes in distillery many countries, especially those found in northeastern Brazil. The presence of these yeasts can result in a decrease in fuel ethanol productivity, causing great economic damage. Currently, several studies are being conducted to a better understanding of the physiology of this species and little is known about how this contaminant yeast settles in the industrial process. Thus, this study aims to investigate the possible points of emergence of this yeast in distilleries in the state of Paraíba, in Northeastern Brazil, from samples collected wash sugarcane water, the mixed fermentation broth and vinasse , an industrial residue. The yeasts were isolated using selective media with WLN and YNB-Nit and later identified from DNA sequencing. They were isolated 157 specimens of D. bruxellensis. These isolates were present in the three collection points in both distilleries, but with different percentage distribution. The distillery in the emergence of yeast was ditribuido at 33.9% in mixed juice samples, 13.1% water and 53% in the vinasse. In distillery percentages were 19.8% for mixed juice, 33.4% for wash water and 46.8 for vinasse This study shows that the yeast D. bruxellensis is present in all samples and in significant quantity, and the nitrate present in these samples the possible responsible poe this presence. However, more studies about the presence of nitrate and the presence of yeast in these samples are needed to confirm the adaptation of D. bruxellensis in different ecological niches.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:02:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3634_1.pdf: 1182297 bytes, checksum: 555f62e24f992ab833cb18ef506968ae (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A levedura Dekkera bruxellensis foi identificada como principal contaminante dos processos de fermentação alcoólica em destilarias do Brasil, do Canadá e dos EUA. Contagens elevadas desta levedura podem resultar em diminuição da produtividade etanólica, com conseqüente prejuízo econômico. Recentemente, esta levedura teve seu genoma parcialmente seqüenciado e foram identificadas seqüências correspondentes a genes do metabolismo do nitrato. A presença de tais genes indica que D. bruxellensis possa usufruir deste composto como fonte de nitrogênio, ao contrário de Saccharomyces cerevisiae, durante o processo fermentativo. Como estas leveduras competem no ambiente industrial, a presença de nitrato poderia ser um fator diferencial na adaptação de D. bruxellensis, visto que esta fonte pode estar presente no caldo de cana proveniente do processo de adubação da cana de açúcar. Assim, os objetivos deste trabalho foram analisar o perfil de expressão dos genes da via metabólica do nitrato de D. bruxellensis em meios laboratoriais e verificar se esta levedura expressa estes genes em caldo de cana industrial utilizando a técnica de PCR quantitativa (qPCR). As células de D. bruxellensis foram cultivadas em meios sintéticos contendo glicose como fonte de carbono na presença de amônia, de nitrato ou ambas as fontes. As células foram coletadas em pontos específicos para extração do RNA, síntese de cDNA e analise por qPCR utilizando o método 2-ΔΔCt para quantificação da expressão gênica. Como controle endógeno foi empregado o gene EFA1. Todos os quatro genes estudados apresentaram indução de sua expressão na presença de nitrato e foram sujeitos à repressão catabólica do nitrogênio quando a amônia estava presente no meio. Adicionalmente, a presença e o consumo de nitrato no caldo de cana foram investigados. Neste substrato, os genes apresentaram perfil de expressão diferente do observado nos meios YNB. O nitrato foi detectado no caldo de cana e seu consumo ao longo do tempo foi determinado. Este estudo comprova que os genes da assimilação do nitrato em D. bruxellensis são induzidos em presença deste composto e reprimidos na presença de amônia. As células de D. bruxellensis expressaram estes genes no caldo de cana. Entretanto, maiores estudos acerca da regulação da expressão dos genes desta via metabólica ainda são necessários para correlacionar esta expressão com a adaptação de D. bruxellensis no meio de fermentação alcoólica

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:02:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo767_1.pdf: 2982127 bytes, checksum: ec4ba15e127a34669d0fe0a656f86bc3 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / A levedura Dekkera bruxellensis vem se mostrando um importante microrganismo industrial, não apenas por causar eventos de contaminação em diversos processos fermentativos como também pela alta adaptação a esses processos. Este trabalho teve como objetivo principal identificar características genéticas básicas como composição genômica e cariotípica de linhagens industriais da levedura Dekkera bruxellensis a partir do uso de técnicas moleculares. Nesse trabalho, conseguimos visualizar o número e tamanho dos cromossomos das linhagens industriais de álcool combustível através da técnica de PFGE. Identificamos e analisamos estruturalmente os genes envolvidos na via do metabolismo central fermentativo através de busca no genoma seqüenciado, depositado no Banco de Dados do Projeto Dekkera bruxellensis. Analisamos a constituição genética e o status filogenético da D. bruxellensis em relação ao grupo ascomiceto através da análise dos genes piruvato descarboxilase (PDC) e álcool desidrogenase (ADH). Além disso, realizamos experimentos de expressão gênica por PCR em Tempo Real com os genes dbARO10 e dbADH em diversos meios com diferentes fontes de Carbono e Nitrogênio, verificando a resposta dessa levedura e analisando sua atividade enzimática para a fenilpiruvato descarboxilase e a álcool desidrogenase. Este foi um trabalho prospectivo, que fornece um painel inicial sobre a constituição genética desta levedura. Entretanto, algumas perguntas foram respondidas a partir dos resultados obtidos. Nos nossos trabalhos anteriores foi verificada a presença de dois padrões distintos de fingerprinting dos isolados de fermentação alcoólica. Esta variação de perfis refletiu-se nas variações cromossômicas, tanto em número quanto em tamanho. Pelas análises filogenéticas foi possível também, posicionar a D. bruxellensis dentro do grupo dos ascomicetos para os genes estudados

Brettanomyces bruxellensis est un microorganisme qui est considéré comme la cause majeure des défauts microbiologiques du vin. L’importance de cette levure à l’échelle industrielle est liée au fait qu’elle est isolée à partir de substrats différents tels que la bière, le kombucha, les molasses utilisées pour la production de bioéthanol et autres. Ce projet a pour objectif d’étudier la diversité génétique de l’espèce en se basant sur une large population d’isolats provenant de niches écologiques et géographiques variées. Pour ce faire, une méthode de génotypage robuste (analyse microsatellite) a été optimisée et appliquée sur la population, mettant en évidence la coexistence de populations diploïdes et triploïdes à l’échelle globale. Puis, la relation entre regroupement génétique et traits physiologiques a été explorée. Notamment, l'étude de la tolérance aux sulfites a été effectuée sur un sous-ensemble de souches représentatif de la population. Les résultats obtenus mettent en évidence un lien entre groupes génétiques et comportement vis-à-vis des sulfites. Des expériences de compétition en présence de dioxyde de soufre montrent un avantage sélectif des souches tolérantes aux sulfites par rapport aux souches sensibles, suggérant ainsi une adaptation spécifique au principal antiseptique utilisé en œnologie. Ce travail contribue à une meilleure connaissance de cette levure d’altération du vin en termes de diversité génétique et phénotypique et permet d’émettre des hypothèses sur les stratégies évolutives d'adaptation au milieu anthropique de cette espèce modèle non conventionnelle. / Brettanomyces bruxellensis is a microorganism described as the first cause of microbial spoilage of wine. Its industrial relevance is highlighted by the fact that this yeast is isolated from different substrates such as beer, kombucha, bioethanol fermentation molasses and others. This project aims to explore the genetic diversity of the species by studying a large population of isolates from various geographical and ecological niches. For this purpose, a robust genotyping method (microsatellite analysis) was optimized and applied on the population, thus highlighting the coexistence of diploid and triploid populations worldwide. Further, the relation between genotypic clustering and physiological traits was studied. Namely, sulphite tolerance assay was performed on a subset of strains representative of the total population. The results reveal a link between genetic group and growth profile in the presence of sulphur dioxide. Competition experiments in presence of sulphites highlight a selective advantage of sulphite tolerant strains compared to sulphite sensitive ones, thus suggesting a specific adaptation to the main antimicrobial used in winemaking. This work contributes to a deeper understanding of this wine spoilage microorganism in means of genetic and phenotypic diversity and sheds light on putative evolutionary strategies for adaptation to human related environment of this non-conventional model yeast species.

Thesis (PhD)--Stellenbosch University, 2015. / ENGLISH ABSTRACT: In the current study, two isolates showing killer activity against several wine yeast species in a previous study were identified to strain level and found to belong to the yeast species Candida pyralidae. The identified yeast strains and a Kluyveromyces wickerhamii yeast strain used as a control exhibited killer activity against B. bruxellensis known for its spoilage characteristics in red wine, and against several strains of the genus Brettanomyces on white and red grape juice medium. The killer yeasts inhibited neither the growth of S. cerevisiae nor that of the lactic acid bacteria Oenococcus oeni and Lactobacillus plantarum strains. Yeasts are reported to secrete killer toxins, which can play a role in yeast microbial interactions under winemaking conditions. The C. pyralidae strains were found to secrete two novel killer toxins, designated CpKT1 and CpKT2. These killer toxins were stable and active under winemaking conditions, pH 3.5 - 4.5 and temperature ranges between 15 and 25°C. Ethanol and sugar concentrations found during winemaking did not affect the activity and stability of these killer toxins. Although, the killer toxins differed with regards to their biochemical and environmental stability and activity, they were found to have a similar mode of action. The killer toxins induced a fungistatic effect on B. bruxellensis sensitive cells in addition to binding to the cell wall of the sensitive cells, inducing cell surface and plasma membrane damage as did the Kwkt killer toxin secreted by K. wickerhamii. According to the author’s knowledge this is the first report on the identification of novel killer toxins secreted by C. pyralidae strains isolated from a wine environment as well as the identification of the mode of action of killer toxins on B. bruxellensis cells. This indeed provides great research scope in this field. The exoproteomes consisting of the killer toxins Kwkt, CpKT1 and CpKT2 revealed the presence of exo-glucanases and glucosidases, respectively. The enzymes KwExg1 (exoglucanase) and KwSun4 (glucosidase) retrieved from K. wickerhamii’s exoproteome were identified as the potential toxins, but their killer activity could not be confirmed. These findings suggest that hydrolytic enzymes possess killer activity, as previously reported in literature. However, further investigation is needed to identify the killer toxins characterized in this study. / AFRIKAANSE OPSOMMING: In die huidige studie is twee isolate wat in ’n vorige studie “killer” aktiwiteit teenoor verskeie wyngisspesies vertoon het, tot op rasvlak geïdentifiseer en daar is gevind dat hulle aan die gisspesie Candida pyralidae behoort. Die geïdentifiseerde gisrasse en ’n Kluyveromyces wickerhamii gisras wat as kontrole gebruik is, het “killer” aktiwiteit getoon teenoor B. bruxellensis, wat bekend is vir sy bederfkarakter in rooi wyn, en ook teenoor verskeie rasse van die genus Brettanomyces in wit en rooi druiwesapmedium. Die “killer” giste het nie die groei van óf S. cerevisiae óf van die melksuurbakteria Oenococcus oeni en Lactobacillus plantarum-rasse geïnhibeer nie. Giste word berig om “killer” gifstowwe uit te skei, wat ’n rol kan speel in gis mikrobiese interaksies onder wynbereidingstoestande. Die C. pyralidae-rasse is gevind om twee nuwe “killer” gifstowwe af te skei, wat CpKT1 en CpKT2 genoem is. Hierdie “killer” gifstowwe was stabiel en aktief onder wynbereidingstoestande, pH 3.5 - 4.5 en temperatuur tussen 15 en 25°C. Die etanol- en suikerkonsentrasies wat onder wynbereiding voorkom, het nie die aktiwiteit en stabiliteit van hierdie “killer” gifstowwe beïnvloed nie. Hoewel die “killer” gifstowwe met betrekking tot hulle biochemiese en omgewingstabiliteit en aktiwiteit verskil het, is daar gevind dat hulle ’n eenderse modus van aksie het. Die “killer” gifstowwe het ’n fungistatiese effek op B. bruxellensis sensitiewe selle geïnduseer, buiten dat dit aan die selwand van die sensitiewe selle gebind het, en het seloppervlak- en plasma-membraanskade geïnduseer, net soos die Kwkt “killer” gifstof wat deur K. wickerhamii afgeskei is. So ver die skrywer weet, is hierdie die eerste verslag van die identifisering van nuwe “killer” gifstowwe wat deur C. pyralidae rasse afgeskei word wat uit ’n wynomgewing geïsoleer is, asook van die identifikasie van die modus van aksie van “killer” gifstof op B. bruxellensis selle. Dit verbreed dus beslis die navorsingsomvang van hierdie gebied. Die eksoproteome, bestaande uit die “killer” gifstowwe Kwkt, CpKT1 en CpKT2, het die teenwoordigheid van ekso-glukanases en glukosidases onderskeidelik onthul. Die ensieme KwExg1 (eksoglukanase) en KwSun4 (glukosidase) wat vanuit K. wickerhamii se eksoproteoom herwin is, is as die potensiële gifstowwe geïdentifiseer, maar hulle “killer” aktiwiteit kon nie bevestig word nie. Hierdie bevindings suggereer dat hidrolitiese ensieme “killer” aktiwiteit besit, soos voorheen in die literatuur berig is. Verdere ondersoeke word egter benodig om die “killer” gifstowwe wat in hierdie studie gekarakteriseer is, te identifiseer.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-17T15:22:13Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Luciana Pereira.compressed.pdf: 4618352 bytes, checksum: dfc01e0d1bf57db6a0daaa7da4bafdf1 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T15:22:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Luciana Pereira.compressed.pdf: 4618352 bytes, checksum: dfc01e0d1bf57db6a0daaa7da4bafdf1 (MD5) Previous issue date: 2013 / FACEPE / A levedura Dekkera bruxellensis tem sido conhecida por sua adaptação aos processos fermentativos industriais, tendo chegado a situações que suplanta a levedura do processo Saccharomyces cerevisiae possuindo rendimentos equivalentes. Apesar de possuir grande adaptabilidade ao ambiente industrial, ainda são escassos trabalhos que se dediquem ao estudo de suas características fisiológicas e bioquímicas e que expliquem seu sucesso adaptativo. Este trabalho teve por objetivo descrever o metabolismo fermentativo da levedura GDB 248 em situações que simulem os processos fermentativos industriais na produção do álcool combustível bem como, sua tolerância aos diferentes fatores de estresse presentes no ambiente industrial. Foram realizadas fermentações com reciclo celular em meios sintético e caldo de cana. Os resultados mostraram que as células de D. bruxellensis possuem baixa eficiência no consumo da sacarose (consumo máximo 30%), maior tendência de conversão de açúcar em biomassa, mas exibem rendimentos em etanol próximos ao de S. cerevisiae. Os experimentos de tolerância aos fatores de estresse adicionados nas fermentações mostraram que D. bruxellensis possui, quando comparada a S. cerevisiae, tanto tolerância similar ao etanol quanto sensibilidade a ácidos orgânicos (acético e lático). Não foi detectada a produção de acido acético nas culturas de D. bruxellensis, tendo em ácido lático produção similar a S. cerevisiae. Para avaliar a tolerância de D. bruxellensis ao estresse, foram realizadas curvas de sobrevivência celular na presença dos agentes de estresse: H2O2, etanol, KCl, e após um choque térmico, relacionando o envolvimento de três proteínas de choque térmico no padrão transcricional desta resposta. Em conjunto, os resultados mostraram que as células de D. bruxellensis foram mais sensíveis aos fatores de estresse testados, quando comparados a S. cerevisaie, apesar de exibir tolerância similar ao etanol. Os genes HSP22, HSP24 e HSP82 são apenas responsivos ao choque térmico, mas suas proteínas não conferem tolerância às células. Por fim, para avaliar o comportamento desta levedura em outro substrato, frequentemente utilizado em destilarias no Brasil, e assim, compararmos o melhor desempenho desta espécie realizamos fermentações com reciclo em melaço e, desta vez, determinamos o conteúdo intracelular de trealose e glicogênio. No melaço, D. bruxellensis mostrou comportamento similar quanto à assimilação de sacarose, tendo tendência ao desvio do açúcar para biomassa e rendimento final em etanol equivalente ao produzido pelas células de S. cerevisiae. Mas, neste substrato, foi detectado a produção de ácido acético por esta levedura em quantidades superiores ao detectado nas culturas com S. cerevisiae. Quanto ao conteúdo intracelular dos carboidratos de reserva, só foi possível a detecção de glicogênio em quantidades inferiores a S. cerevisiae, pois nenhuma produção de trealose foi detectada em nossos ensaios.

Memoria para optar al título profesional de Ingeniero Agrónomo Mención Enología y Vitivinicultura / El propósito del estudio fue evaluar la eliminación de Brettanomyces bruxellensis por medio de aplicaciones de ozono en mezcla gaseosa a presiones de trabajo y tiempos de exposición diferentes. La investigación se realizo con bloques de madera de roble americano en formato viniblock, los cuales fueron inoculados con las dos cepas de Brettanomyces bruxellensis utilizadas a lo largo del ensayo (cepa 1009 y 1451), donde se evaluó la mortalidad a través de un conteo directo en placas Petri post un periodo de incubación. Los mayores promedios de mortalidad obtenidos para la cepa 1009 (100%) fueron aquellos donde los bloques contaminados fueron expuestos a tiempos de 20 minutos de exposición y a una presión de trabajo de 1,8 bares, para ambas mediciones realizadas (efecto superficial y subsuperficial). En el caso de la cepa 1451 los mejores resultados fueron obtenidos al aplicarse las mismas condiciones anteriormente señaladas. La cepa 1009 tuvo una cinética de crecimiento mayor a la presentada en la cepa 1451, donde el número de colonias fue más numerosa, pero con lo que respecta al comportamiento que tuvieron frente al agente sanitizante sus promedios de mortalidad tendieron a igualarse, lo cual nos indica que ambas cepas son igualmente sensibles a las aplicaciones de ozono en mezcla gaseosa. Por lo que se concluye que el ozono es un buen sanitizante para las maderas de guarda ya que bajo ciertas condiciones de trabajo elimina la totalidad de las levaduras presentes, tanto a nivel superficial como bajo la madera, lo cual otorga la completa esterilidad de las maderas de guarda. / The purpose of this study was to evaluate the elimination of Brettanomyces bruxellensis through applications of ozone gas mixture at different pressures of work and exposure times. The research was carried out with blocks of American oak in viniblock format, which were inoculated with two strains of Brettanomyces bruxellensis used along the assay (strain 1009 and 1451), where mortality was evaluated through a direct count in Petri dishes post an incubation period. The highest average mortality obtained for strain 1009 (100%) were those contaminated blocks were exposed to times of 20 minutes of exposure and a working pressure 1.8 bar for both measurements (surface and subsurface effect) in the case of strain 1451 the best results were obtained when applying the same conditions stated above. The 1009 strain had higher growth kinetics to that presented in strain 1451, where the number of colonies was larger, but with regard to behavior which sanitizing agent were compared to averages of mortality tended to level out, which indicates that both strains are equally sensitive to ozone applications in a gaseous mixture. It that concludes the ozone is a good sanitizer for woods barrels because under certain working conditions eliminated all of yeast presents at both the surface and under the wood, which gives the complete sterility of the woods barrels.

Brettanomyces bruxellensis est une levure particulièrement redoutée des vinificateurs pour ses capacités d’altération organoleptique des vins. Elle est également associée à de nombreux produits fermentés et présente une importante diversité génétique en lien avec son origine écologique. L’analyse des profils microsatellites d’une collection importante d’individus (1318) d’origines géographiques variées montre une diversité génétique importante parmi les isolats de vin. Elle met notamment en évidence la coexistence d’individus diploïdes et triploïdes dans différentes régions du monde ainsi qu’à l’échelle d’un chai et d’un vin. La présence de certains génotypes dans plusieurs régions à travers le monde suggère la dispersion de cette espèce et une adaptation importante au milieu difficile qu’est le vin.La relation entre diversité génétique, matrice d’origine et traits physiologiques a été explorée. La nature des sucres utilisables pour supporter la croissance ainsi que les capacités de production de phénols volatils sont peu variables entre les souches étudiées, indépendamment de leur niveau de ploïdie ou de leur origine écologique. Néanmoins, les profils de croissance et de production de phénols volatils (vitesses et rendements) varient et traduisent des différences dans l’adaptation des souches au milieu et aux conditions d’oxygénation. Nos données suggèrent notamment une adaptation plus importante des souches triploïdes aux conditions physico-chimiques du vin. D’un point de vue pratique, l’influence de certains facteurs physico-chimiques, tels que les sucres et la température, sur le développement de B. bruxellensis dans les vins a été étudiée. Dans les vins rouges, la composition en sucres résiduels ne peut pas être considérée comme un outil de diagnostic du risque « Brett ». Néanmoins, les variations importantes de température observées dans les chais, jusqu’alors sous-estimées, pourraient expliquer en partie les phénomènes d’altération de vins rouges fréquemment observés au cours du premier été d’élevage en barrique. / The yeast species Brettanomyces bruxellensis is the most dreaded wine spoilage microorganism because of its repercussions on wine organoleptic wine alteration. It is also present in numerous fermented beverages and its high genetic diversity is partly associated with its ecological origin. Microsatellite analysis of a large collection of isolates (1318) from various geographical origins shows the species’ high genetic diversity, namely among wine strains. Notably, it highlights the coexistence of diploid and triploid individuals worldwide as well as at the region, winery and wine level. Isolation of some of the genotypes in several wine regions in the world suggests this species’ dispersion as well as the putative adaptation of these individuals to the harsh wine environment.The relationship between genetic diversity, matrix type, and physiological traits was further explored. The type of consumable sugars in relation to growth and phenol volatile production capacities of the studied strains, are independent from the ploidy level or ecological origin of the latter. Nevertheless, growth and phenol volatile production profiles (rates and yields) vary, highlighting differences in strains’ growth capacity in different media and aeration conditions. In particular, our data suggests an important adaptation of triploid strains to wine-type environment. From a practical point of view, influence of physicochemical parameters (such as sugars and temperature) on B. bruxellensis’ development in wine has been investigated. In red wine, residual sugar profiles don’t seem to be a relevant tool to estimate the risk associated with “Brett” spoilage. However, the important temperature variations occurring in wine cellars could be a possible explanation for contamination frequency during the first summer of barrel-ageing.

Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2014. / ENGLISH ABSTRACT: Brettanomyces bruxellensis has become of increasing interest over the past few decades yet this complex red wine spoilage yeast is still poorly understood and strain variance also leads to the contradictory results reported in literature. This yeast is responsible for the production of phenolic compounds, associated with off-flavours that render wine unpalatable. Sulphur dioxide (SO2) is the most commonly used antioxidant and antimicrobial preservative instrumental in the control of spoilage yeasts such as B. bruxellensis. However, its diploid/triploid genome is enriched for genes that provide the yeast a fortuitous advantage, under conditions permissive for growth, with genotype-dependent SO2 tolerance phenotypes observed among numerous strains. This study investigates the metabolic, physiological and genetic responses associated with SO2 exposure. It also explores the environmental cues responsible for the onset of non-SO2 induced morphological characteristics. These morphological characteristics were investigated using fluorescent probes and microscopy in the presence of SO2 and in the absence thereof, in YPD media. Pseudohyphae formation was observed to be a highly strain dependent feature and less pronounced in the presence of 0.6 mg/L molecular SO2. This study also reports on the metabolic response observed over a 3-week period, following exposure to SO2, in a synthetic wine medium. The following metabolites were consistently monitored during the course of the experiment: acetic acid, acetaldehyde, D-glucose and D-fructose. Utilization of sugars was retarded in the presence of SO2 for up to 10 days in the presence of 1.2 mg/L molecular SO2 and overproduction of acetaldehyde was prominent, with a peak at day 10. The study further highlights the expression profiles observed for the SSU1 gene (referring to SO2 tolerance) and the PAD gene (referring to production of volatile compounds) under SO2 induced conditions in SWM, using qRT-PCR. The co-involvement of increased acetaldehyde production and elevated gene expression were indicative of B. bruxellensis yeast adapting to the presence of molecular SO2, allowing survival of this fascinating yeast. Sequencing of the SSU1 and PAD genes suggests the probable existence of different alleles of these genes that could explicate SO2 tolerance and phenolic compound production associated differences among strains of this species. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Hoewel Brettanomyces bruxellensis oor die afgelope paar dekades toenemende belangstelling gewek het, word hierdie komplekse rooiwynbederfgis steeds swak verstaan en lei rasvariasie ook tot teenstrydige resultate in die literatuur. Hierdie gis is verantwoordelik vir die produksie van fenoliese verbindings, wat geassosieer word met afgeure, wat die wyn onsmaaklik laat. Swaweldioksied (SO2) is die algemeenste preserveermiddel wat, weens antioksidant- en antimikrobiese eienskappe, instrumenteel in die beheer van bederforganismes, soos B. bruxellensis, gebruik word. Nogtans is die diploïede/triploïede genoom vir gene verryk, wat die gis ‘n toevallige voordeel bied tydens ongunstige toestande, met genotipe-afhanklike SO2 weerstandbiedende fenotipes wat onder verskeie rasse waargeneem word. Hierdie studie ondersoek die metaboliese, fisologiese en genetiese reaksies tydens SO2-blootstelling. Dit bestudeer verder die omgewingsleidrade wat vir die aanvang van die nie-SO2 geassosiseerde morfologiese eienskappe verantwoordelik is. Hierdie morfologiese eienskappe is ondersoek met behulp van fluoresserende bakens en mikroskopie in die teenwoordigheid van molekulêre SO2 en, in die afwesigheid daarvan, in YPD-medium. Pseudohyphae-vorming is as ʼn baie rasspesifieke eienskap waargeneem en is minder prominent in die teenwoordigheid van molekulêre SO2. Hierdie studie rappoteer ook oor die metaboliese reaksies waargeneem oor ‘n 3-weke tydperk, na blootstelling aan SO2, in ‘n sintetiese wynmedium. Die volgende metaboliete was voordurend gemonitor tydens die verloop van die eksperiment: asynsuur, asetaldehied, D-glukose en D-fruktose. Benutting van die suikers is in die teenwoordigheid van SO2 vertraag en oorproduksie van asetaldehied is prominent waargeneem. Hierdie studie beklemtoon verder die uitdrukkingsprofiele vir die SSU1-geen (verwys na SO2-weerstandbiedendheid) en die PAD-geen (verwys na die produksie van vlugtige verbindings) in SO2-geïnduseerde toestande in SWM, met behulp van qRT-PCR. Die gesamentlike invloed van beide verhoogde asetaldehied produksie en verhoogde uitdrukking van gene, was beduidend van B. bruxellensis-gis wat aanpas in die teenwoordigheid van molekulêre SO2, wat die oorlewing van hierdie fassinerende gis verseker. Volgordebepaling van die SSU1- en PAD-geen dui daarop dat daar waarskynlik meer as een verskillende alleel vir dié gene bestaan, wat die SO2-verdraagsaamheid en produksie van fenoliese verbindings, wat tans tussen verskeie spesies teenwoordig is, kan verduidelik.

As leveduras Dekkera/Brettanomyces estão envolvidas na deterioração de vinhos após o término das fermentações alcoólicas e maloláticas, tendo se apresentado como agente contaminante de processos contínuos de produção de etanol industrial. São caracterizadas pela morfologia celular típica (células alongadas e ogivais), alta produção de ácido e crescimento lento, porém de difícil identificação. Embora muitos trabalhos já tenham sido publicados acerca do seu papel na fermentação do vinho, pouco se conhece sobre o seu comportamento no processo de fermentação para produção de álcool combustível. Desta forma, este trabalho objetivou selecionar, identificar e caracterizar linhagens de Dekkera e Brettanomyces isoladas de processos fermentativos, através de testes de taxonomia clássica, moleculares (PCR e sequenciamento) e de biotipagem através do sistema killer, visando a avaliação de fermentações mistas de Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxellensis, a última em níveis de contaminação variando de 101 a 103 células/mL, em meio de caldo de cana, em processo de fermentação em batelada com reciclo celular (14 ciclos de 12 horas) para produção de etanol. Os testes morfológicos e fisiológicos/bioquímicos de oito linhagens selecionadas pela alta produtividade de ácido a partir da glicose e morfologia celular característica, apontaram os gêneros Dekkera ou Brettanomyces, sem possibilidade de identificação em nível de espécie devido à ambigüidade dos resultados dos testes fisiológicos. O sequenciamento da região ITS (Internal transcribed spacer) do DNA ribossomal confirmou somente três linhagens como Dekkera bruxellensis, sendo as demais predominantemente pertencentes à espécie Pichia guillermondii. O tamanho da região ITS, incluindo o gene 5,8S, variou de 400 500 pb entre as três linhagens. A utilização do sistema killer como método de biotipagem para leveduras Dekkera mostrou-se inviável devido ao fenótipo predominantemente neutro apresentado pelas linhagens. Somente a levedura killer CCA510 (Kluyveromyces marxianus) apresentou atividade inibitória contra as três linhagens de D. bruxellensis. Os ensaios fermentativos realizados com a linhagem de D. bruxellensis (CCA059) em fermentações puras e mistas com S. cerevisiae (CCA193, PE-02), mostraram que a levedura contaminante foi capaz de crescer em meio de caldo de cana, independentemente do tamanho do seu inóculo inicial (101 a 103 células/mL), impactando negativamente a fermentação etanólica, causando a diminuição da viabilidade de S. cerevisiae, diminuindo o pH do meio, decréscimo na produção de etanol e eficiência fermentativa, possivelmente devido à produção de ácido acético a partir do ART do meio de fermentação. Extrapolando-se os resultados obtidos em escala de laboratório para a escala industrial de uma destilaria de médio porte, a contaminação por Dekkera bruxellensis acarretaria uma perda de 6 milhões a 15 milhões de litros de álcool na safra, que deixariam de ser produzidos, dependendo do nível de contaminação. / Dekkera/Brettanomyces yeasts are found to be either contaminants in wine after completion of alcoholic and malolactic fermentations and in continuous fermentations for fuel alcohol production. They are characterized by typical cell morphology (elongated and ogival cells), high acid production and slow growth, however not easily identified. Although their role in wine fermentations is well-defined, a little is known about their behavior during fermentation for ethanol production. This work aimed the screening, identification and characterization of Dekkera and Brettanomyces strains isolated from fermentative processes, through classical taxonomic tests, molecular analysis (PCR and DNA sequencing) and biotyping by killer system. Following fermentation essays were carried out to evaluate mixed fermentations of Saccharomyces cerevisiae and Dekkera bruxellensis, the last one in contamination levels varying from 101 to 103 cells/mL, in sugar cane medium, using batch fermentation process with cell recycle (fourteen 12-hour cycles) for fuel ethanol production. Morphological and physiological/biochemical tests involving eight strains selected for their high acid production from glucose and typical cell morphology, pointed out to the genera Dekkera or Brettanomyces, without possibility of species identification due to the variability and ambiguity of physiological tests. DNA sequencing of the ITS (Internal transcribed spacer) region belonging to ribosomal DNA confirmed only three strains as Dekkera bruxellensis, the others were predominantly Pichia guilliermondii. The ITS region, including the 5,8S gene, varied from 400 to 500 bp among the three strains. The use of killer system as a biotyping method for Dekkera strains might not be applied because the strains were predominantly neutral to killer toxins. Only the killer strain CCA510 (Kluyveromyces marxianus) showed to have inhibitory activity against the strains of D. bruxellensis. The fermentative essays using a strain of D. bruxellensis (CCA059) in mixed and pure fermentations with S. cerevisiae (CCA193, PE-02), have shown that the contaminant yeast was able to grown in sugar cane juice, regardless of the initial inoculum size ((101 to 103 cells/mL), impairing the bioethanol fermentation, causing diminished S. cerevisiae viability, pH decrease, lower ethanol production and fermentative efficiency, mainly due to the acetic acid production from reducing sugar present in fermentation medium. Extrapolation of the results obtained in laboratory scale to industrial scale in a medium-sized distillery, have revealed that contamination by Dekkera bruxellensis would result in a alcohol loss of 6 millions to 15 millions of liters, which would not be produced, depending on the contamination level.