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Estudo do metabolismo e influência de fontes de nitrogênio na fisiologia e expressão gênica da levedura Dekkera Bruxellensis

Pita, Will de Barros 31 January 2012 (has links)
Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-08T14:48:36Z No. of bitstreams: 2 Tese de Doutorado_Will de Barros Pita_CCB_2012.pdf: 2965963 bytes, checksum: babbeaf0d359662414391200c3f5a596 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T14:48:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese de Doutorado_Will de Barros Pita_CCB_2012.pdf: 2965963 bytes, checksum: babbeaf0d359662414391200c3f5a596 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / CNPq; CAPES; FACEPE / A levedura Dekkera bruxellensis é consistentemente associada a contaminações de processos de fermentação alcoólica industrial. Na produção de vinhos, esta levedura é responsável pela produção de aromas indesejáveis, enquanto que na produção de etanol combustível, D. bruxellensis compete com Saccharomyces cerevisiae pelo substrato industrial. Apesar de compartilhar alguns fenótipos com S. cerevisiae, D. bruxellensis apresenta características peculiares, como por exemplo, a capacidade de utilizar nitrato como única fonte de nitrogênio. No ambiente industrial, as quantidades de açúcares são elevadas e, nesses casos, o fator limitante do crescimento é geralmente a disponibilidade de nitrogênio, um nutriente essencial para todas as formas de vida. O objetivo do presente trabalho foi investigar o metabolismo de diferentes fontes de nitrogênio e determinar a influência da natureza e da concentração destas fontes na fisiologia e expressão gênica de D. bruxellensis, em busca de potenciais fatores positivos de adaptação para esta levedura. Os resultados mostraram que a assimilação de nitrato pode favorecer D. bruxellensis no ambiente industrial, pois fornece o nitrogênio necessário para manter o crescimento desta levedura mesmo após a depleção da amônia no caldo de cana. Adicionalmente, a escassez de nitrogênio diminui a taxa de crescimento, consumo de açúcares e produção de etanol em D. bruxellensis. No entanto, a limitação de carbono é ainda mais drástica para o metabolismo celular, ocasionando redução significativa dos principais parâmetros fisiológicos. Com relação à assimilação de fontes de nitrogênio, as enzimas glutamato desidrogenase e glutamato sintase podem trocar de papéis como principal via de biossíntese de glutamato e que genes codificantes de permeases de nitrogênio estão sob rígido controle transcricional. Além disso, D. bruxellensis apresenta preferência pela utilização do metabolismo respiratório em detrimento da fermentação em condições limitantes de crescimento. Finalmente, um novo grupo de genes de referência para ensaios de expressão gênica em D. bruxellensis foi estabelecido. A partir dos resultados gerados no presente trabalho, é possível entender as repostas metabólicas de D. bruxellensis em diferentes fontes de nitrogênio, o que pode auxiliar na identificação de novos fatores de adaptação para esta levedura, que permitem o seu estabelecimento e manutenção no ambiente indutrial.
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Caracterização e comportamento fermentativo de linhagens de Dekkera contaminantes da fermentação alcoólica / Characterization and fermentative behavior of Dekkera strains contaminating alcoholic fermentation

Maria Cristina Meneghin 21 February 2008 (has links)
As leveduras Dekkera/Brettanomyces estão envolvidas na deterioração de vinhos após o término das fermentações alcoólicas e maloláticas, tendo se apresentado como agente contaminante de processos contínuos de produção de etanol industrial. São caracterizadas pela morfologia celular típica (células alongadas e ogivais), alta produção de ácido e crescimento lento, porém de difícil identificação. Embora muitos trabalhos já tenham sido publicados acerca do seu papel na fermentação do vinho, pouco se conhece sobre o seu comportamento no processo de fermentação para produção de álcool combustível. Desta forma, este trabalho objetivou selecionar, identificar e caracterizar linhagens de Dekkera e Brettanomyces isoladas de processos fermentativos, através de testes de taxonomia clássica, moleculares (PCR e sequenciamento) e de biotipagem através do sistema killer, visando a avaliação de fermentações mistas de Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxellensis, a última em níveis de contaminação variando de 101 a 103 células/mL, em meio de caldo de cana, em processo de fermentação em batelada com reciclo celular (14 ciclos de 12 horas) para produção de etanol. Os testes morfológicos e fisiológicos/bioquímicos de oito linhagens selecionadas pela alta produtividade de ácido a partir da glicose e morfologia celular característica, apontaram os gêneros Dekkera ou Brettanomyces, sem possibilidade de identificação em nível de espécie devido à ambigüidade dos resultados dos testes fisiológicos. O sequenciamento da região ITS (Internal transcribed spacer) do DNA ribossomal confirmou somente três linhagens como Dekkera bruxellensis, sendo as demais predominantemente pertencentes à espécie Pichia guillermondii. O tamanho da região ITS, incluindo o gene 5,8S, variou de 400 500 pb entre as três linhagens. A utilização do sistema killer como método de biotipagem para leveduras Dekkera mostrou-se inviável devido ao fenótipo predominantemente neutro apresentado pelas linhagens. Somente a levedura killer CCA510 (Kluyveromyces marxianus) apresentou atividade inibitória contra as três linhagens de D. bruxellensis. Os ensaios fermentativos realizados com a linhagem de D. bruxellensis (CCA059) em fermentações puras e mistas com S. cerevisiae (CCA193, PE-02), mostraram que a levedura contaminante foi capaz de crescer em meio de caldo de cana, independentemente do tamanho do seu inóculo inicial (101 a 103 células/mL), impactando negativamente a fermentação etanólica, causando a diminuição da viabilidade de S. cerevisiae, diminuindo o pH do meio, decréscimo na produção de etanol e eficiência fermentativa, possivelmente devido à produção de ácido acético a partir do ART do meio de fermentação. Extrapolando-se os resultados obtidos em escala de laboratório para a escala industrial de uma destilaria de médio porte, a contaminação por Dekkera bruxellensis acarretaria uma perda de 6 milhões a 15 milhões de litros de álcool na safra, que deixariam de ser produzidos, dependendo do nível de contaminação. / Dekkera/Brettanomyces yeasts are found to be either contaminants in wine after completion of alcoholic and malolactic fermentations and in continuous fermentations for fuel alcohol production. They are characterized by typical cell morphology (elongated and ogival cells), high acid production and slow growth, however not easily identified. Although their role in wine fermentations is well-defined, a little is known about their behavior during fermentation for ethanol production. This work aimed the screening, identification and characterization of Dekkera and Brettanomyces strains isolated from fermentative processes, through classical taxonomic tests, molecular analysis (PCR and DNA sequencing) and biotyping by killer system. Following fermentation essays were carried out to evaluate mixed fermentations of Saccharomyces cerevisiae and Dekkera bruxellensis, the last one in contamination levels varying from 101 to 103 cells/mL, in sugar cane medium, using batch fermentation process with cell recycle (fourteen 12-hour cycles) for fuel ethanol production. Morphological and physiological/biochemical tests involving eight strains selected for their high acid production from glucose and typical cell morphology, pointed out to the genera Dekkera or Brettanomyces, without possibility of species identification due to the variability and ambiguity of physiological tests. DNA sequencing of the ITS (Internal transcribed spacer) region belonging to ribosomal DNA confirmed only three strains as Dekkera bruxellensis, the others were predominantly Pichia guilliermondii. The ITS region, including the 5,8S gene, varied from 400 to 500 bp among the three strains. The use of killer system as a biotyping method for Dekkera strains might not be applied because the strains were predominantly neutral to killer toxins. Only the killer strain CCA510 (Kluyveromyces marxianus) showed to have inhibitory activity against the strains of D. bruxellensis. The fermentative essays using a strain of D. bruxellensis (CCA059) in mixed and pure fermentations with S. cerevisiae (CCA193, PE-02), have shown that the contaminant yeast was able to grown in sugar cane juice, regardless of the initial inoculum size ((101 to 103 cells/mL), impairing the bioethanol fermentation, causing diminished S. cerevisiae viability, pH decrease, lower ethanol production and fermentative efficiency, mainly due to the acetic acid production from reducing sugar present in fermentation medium. Extrapolation of the results obtained in laboratory scale to industrial scale in a medium-sized distillery, have revealed that contamination by Dekkera bruxellensis would result in a alcohol loss of 6 millions to 15 millions of liters, which would not be produced, depending on the contamination level.
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The effects of post-fermentation and post-bottling heat treatment on Cabernet Sauvignon (V. vinifera L.) glycosides and quantification of glycosidase activities in selected strains of Brettanomyces bruxellensis and Oenococcus oeni

Mansfield, Anna Katharine 10 August 2001 (has links)
Thermal processing has been used as a means of modifying the sensory aspects of wine. Cabernet Sauvignon wines were heated prior to dejuicing (3C per day from 25C to 42C) or after bottling (42C for 21 days) to determine the effects on total glycosides and glycosidic fractions. Total and phenol-free glycosidic concentrations in the wine and skins were quantified by analysis of glycosyl-glucose. Pre-dejuicing thermal vinification resulted in higher total glycosides (12%), phenol-free glycosides (18%), total hydroxycinnamates (16%), large polymeric pigments (LPP) (208%) small polymeric pigments (SPP) (41%), and lower monomeric pigments (42%) in wines. Skins had lower total glycosides (-16%), and no significant difference in phenol-free glycosides. Post-bottling heat treatment resulted in lower total (-15%) and phenol-free (-16%) glycosides, increased hue (25%), a 62% increase in LPP and a 29% decrease in monmeric pigments. A second study investigated the potential of enological spoilage microorganisms to affect wine aroma, flavor, and color. The activities of b-glucosidase were determined in model systems for fourteen strains of Brettanomyces bruxellensis yeast and nine strains of lactic acid bacteria (Oenococcus oeni). All Brettanomyces strains and seven Oenococcus strains exhibited enzymatic activity. B. bruxellensis b-glucosidase activity was primarily intracellular; O. oeni showed some extracellular activity. Yeasts and bacteria showing activity greater than 1000 nmole mL-1 g -1 for Brettanomyces, or 100 nmole mL-1 g -1 for Oenococcus, were evaluated for their effect on Viognier grape glycosides. Neither was active on native grape glycosides. / Master of Science
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Evaluation du risque Brettanomyces dans le vignoble libanais et étude cinétique de la bioconversion de l'acide p-coumarique en 4-éthylphénol / Evaluation of Brettanomyces risk in Lebanese vineyards and kinetic study of the bioconversion of p-coumaric acid into 4-ethylphenol

Kheir, Joyce 30 November 2012 (has links)
Les altérations sensorielles des vins dues à la présence des levures du genre Brettanomyces se caractérisent par une augmentation de la teneur en phénols volatils tel que le 4-éthylphénol. Le premier objectif de ce travail était de faire un état des lieux sur le risque « éthylphénol » au Liban en s'intéressant à la présence d'un précurseur (acide p-coumarique), du microorganisme responsable (Brettanomyces) et du produit final (4-éthylphénol) dans les vins élaborés dans ce pays. Une forte hétérogénéité de concentrations en acide p-coumarique a été observée avec des valeurs variant de 0 à 31,4 mg.L-1. Des niveaux importants de 4-éthylphénols de l'ordre de 1,367 mg.L-1 ont été détectés sur certains vins. Un dépistage du contaminant microbien a permis de confirmer pour la première fois la présence de Brettanomyces au Liban, les proportions restant toutefois assez faibles (3 % des échantillons testés). Une étude génétique a caractérisé les souches retenues qui se sont montrées diverses au sein de l'espèce. Le travail a porté ensuite sur l'analyse cinétique des étapes réactionnelles constituant le processus enzymatique de la bioconversion des substrats acide p-coumarique et 4-vinlphénol en 4-éthylphénol pour 5 souches de Brettanomyces bruxellensis d'origines libanaises et françaises. La variabilité entre les souches s'est exprimée aux niveaux génétique et cinétique. Des profils hétérogènes de bioréaction ont été mis en évidence en fonction de la nature des souches. L'analyse du bilan-matière a révélé l'existence probable de phénomènes d'adsorption sur les parois des Brettanomyces qui sont souche-dépendants. La dernière partie a été consacrée à l'évaluation du lien entre quantité de biomasse et production de 4-éthylphénol ainsi qu'à l'influence de quelques paramètres environnementaux (pH, source d'ammonium et milieu de culture) sur la cinétique réactionnelle. / Wine sensory alterations due to the presence of Brettanomyces yeasts are characterized by an increased content of volatile phenols such as 4-ethylphenol. The first aim of this work was to make an inventory of the "ethylphenol" risks in Lebanon by focusing on the presence of one precursor (p-coumaric acid), the microorganism provoking these risks (Brettanomyces) and the final product (4-ethylphenol) in wines produced in this country. High heterogeneity of p-coumaric acid concentration was observed with values ranging from 0 to 31,4 mg.L-1. Significant levels of 4-ethylphenols of about 1,367 mg L-1 have been detected in some wines. Screening of microbial contaminants confirmed the presence of Brettanomyces for the first time in Lebanon, with proportions remaining relatively low (3 % of samples tested). A genetic study has characterized the selected strains which are shown to be various within the species. The second objective of this study was the kinetic analysis of the reaction steps constituting the bioconversion enzymatic process of both substrates p-coumaric acid and 4-vinlphenol into 4-ethylphenol for 5 strains of Brettanomyces bruxellensis of different origins (Lebanon and France). Variability between strains was expressed at both levels, genetic and kinetic. Heterogeneous bioreaction profiles were identified according to strain's nature. The mass balance analysis revealed the possible existence of adsorption phenomena on the cell walls of Brettanomyces which are strain-dependent. The last part was devoted to the evaluation of the relationship between biomass concentration and production of 4-ethylphenol as well as the influence of some environmental parameters (pH, ammonium source and culture medium) on the reaction's kinetic.
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Développement de méthodes permettant la détection et la quantification de microorganismes d'altération du vin : étude de facteurs de développement / Development of methods for the detection and quantification of spoilage microorganisms in wine : study of growing factors

Longin, Cédric 18 November 2016 (has links)
Les nouvelles pratiques utilisées pour l’élaboration du vin amènent à une recrudescence des altérations microbiennes. C’est pourquoi, de nouvelles méthodes doivent être développées afin de quantifier ces microorganismes de façon précise, rapide et avec de faibles coûts. Les principales altérations du vin sont dues aux bactéries acétiques (BA) (A. aceti, A. pasteurianus, G. oxydans et Ga. liquefaciens) et à Brettanomyces bruxellensis. Par l’action d’enzymes, les 1ères transforment l’éthanol en acide acétique alors que B. bruxellensis transforme les acides hydroxycinnamiques en éthyles phénols (EP) (molécules odorantes désagréables). La cytométrie en flux couplée à la technique d’hybridation in situ en fluorescence a tout d’abord été étudiée. Aucun résultat reproductible n’a été développé pour les BA en vin rouge alors que pour B. bruxellensis, le protocole existant a été amélioré avec une quantification possible en 18 h. La PCR en temps réel a également été utilisées afin de quantifier ces microorganismes. Un protocole a été développé pour la quantification des BA en vin rouge (103 cellules/mL) avec l’utilisation d’un témoin interne microbiologique permettant de valider le rendement de l’extraction de l’ADN. Pour B. bruxellensis, trois kits commerciaux ont été analysés lors d’une étude interlaboratoires. Les quantifications se sont révélées significativement différentes des énumérations sur boite de Pétri avec une quantification des cellules mortes. De plus, il a été étudié et validé l’effet population de B. bruxellensis sur l’efficacité du SO2. Il ressort également de ces expérimentations que les cellules en état viable mais non cultivable ne produisent pas d’EP. / New practices used to elaborate wine lead to an increase of wine spoilage due to microorganisms. That is why, new technics have to be developed to quantify these microorganisms accurately, quickly and with low costs. The main wine spoilages are due to acetic acid bacteria (AAB) (A. aceti, A. pasteurianus, G. oxydans and Ga. liquefaciens) and Brettanomyces bruxellensis development. AAB transforms ethanol to acetic acid while B. bruxellensis transforms hydroxycinnamic acids to ethyl phenols (EP) (unpleasant odor molecules). In order to detect these wine spoilage microrganisms, flow cytometry coupled to fluorescent in situ hybridization has been assessed. No reproducible results have been developed for AAB in red wine while for B. bruxellensis, the existing protocol has been improved with a possible quantification after 18 h compared to 48-72 h in the previous protocol. The real-time PCR was also used to quantify these microorganisms. A protocol has been developed for the AAB quantification in red wine (103 cells/mL) with the use of a microbiological internal control to validate the DNA yield after extraction. For B. bruxellensis, three commercial kits were analyzed in an interlaboratory study. Quantifications were significantly different to the enumerations by Petri dish, with dead cell quantifications. Moreover, we demonstrated that the effectiveness of sulfite is dependent of the B. bruxellensis population. It also appears from these experiments that cells in viable but not culturable state do not produce EP.
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Investigating the impact of sulphur dioxide on Brettanomyces bruxellensis at a molecular and cellular level

Duckitt, Edward 03 1900 (has links)
Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2012. / ENGLISH ABSTRACT: The yeast Brettanomyces was isolated from beer in 1904 and associated with wine thereafter. A sporulating form, Dekkera, was discovered later. Brettanomyces bruxellensis produces high levels of volatile phenol off-flavours in wine. Sulphur dioxide (SO2) is the most widely used chemical preservative in wine. Yeasts have several mechanisms to cope with the SO2, namely Ssu1p, a membrane bound SO2 transporter; sulphite reduction, sulphite oxidation and acetaldehyde production. In unfavourable environmental conditions, certain yeasts can enter a viable-but-non-culturable (VBNC) state which is characterised by reduced metabolic rate, inability to reproduce on solid media and a reduction of cell size. VBNC can be triggered by chemical stress such as high SO2 levels. The objectives of this study were to examine the SO2 tolerance of B. bruxellensis and Saccharomyces cerevisiae, to quantify their rates of SO2 accumulation and efflux, determine the effect of SO2 on their energy metabolism and investigate if B. bruxellensis possesses an orthologue to S. cerevisiae SSU1. In this study, the identity of a number of Brettanomyces/Dekkera strains was confirmed using 5.8S rDNA-ITS RFLP analysis and DNA sequencing. Sporulation assays were used to confirm whether these strains belonged to the Dekkera or Brettanomyces genus. A method to accurately quantify SO2 in laboratory conditions was optimised. Molecular SO2 tolerance was tested by spotting fresh yeast cultures on media with SO2 and/or ethanol. Tolerance to SO2 and/or ethanol showed highly strain dependent results with S. cerevisiae showing the highest tolerance levels while B. bruxellensis tolerated SO2 and ethanol poorly but certain strains grew well with only SO2. The SO2 accumulation and efflux rates of 3 S. cerevisiae strains and 3 B. bruxellensis strains were determined. It was shown that the S. cerevisiae strains followed the same trends as previously found in literature whereas B. bruxellensis strains showed similar trends but displayed highly variable strain-dependent results. B. bruxellensis CB63 and S. cerevisiae VIN13 were investigated for their response to SO2 in two different media, TA and SWM, over a 48-hour and 32-day period respectively. Acetic acid, acetaldehyde, D-glucose, D-fructose (only in SWM) and ethanol (only in TA) were regularly monitored over the time course of each experiment. SO2 had the greatest impact on B. bruxellensis with decreased rates of glucose consumption and ethanol production as well as increased acetic acid. Acetaldehyde peaked shortly after SO2 addition with the subsequent restarting of sugar consumption for certain samples. This suggests that sufficient acetaldehyde was produced to bind free SO2 to reduce SO2 stress. Volatile phenols were quantified for day 32 of the SWM experiment. An increase of 4-ethyl guaiacol was correlated to higher molecular SO2 levels. SO2 negatively affected both yeasts energy metabolism, forcing the yeasts metabolism to adapt to ensure survival. In general, SO2 was shown to have a negative impact on all aspects of a yeasts growth and metabolism and that SO2 tolerance is highly strain dependent and a far more complicated characteristic than currently understood. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Die gis Brettanomyces is in 1904 uit bier geïsoleer en daarna met wyn geassosieer. 'n sporulerende vorm, Dekkera, is later ontdek. Brettanomyces bruxellensis produseer hoë vlakke van vlugtige fenol afgeure in wyn. Swaweldioksied (SO2) is die mees gebruikte chemiese preserveermiddel in wyn. Giste het verskeie meganismes om SO2 te hanteer, naamlik Ssu1p, 'n membraan-gebonde SO2 transporter, sulfietvermindering, sulfiet-oksidasie en asetaldehiedproduksie. In ongunstige omgewingstoestande kan sekere giste 'n lewensvatbare, maar nie-kultiveerbare (LMNK)-toestand aanneem wat gekenmerk word deur verlaagde metaboliese tempo, onvermoë om voort te plant op soliede media en 'n vermindering van die selgrootte. LMNK kan veroorsaak word deur chemiese stres, soos hoë SO2-vlak. Die doelwitte van hierdie studie was om die SO2 -bestandheid van B. bruxellensis en Saccharomyces cerevisiae te ondersoek, hul spoed van SO2 -opneming/akkumulasie en -uitskeiding te kwantifiseer, die invloed van SO2 op energiemetabolisme te bepaal en te ondersoek of B. bruxellensis oor ‘n soortgelyke geen as die S. cerevisiae SSU1 beskik. In hierdie studie is die identiteit van 'n aantal Brettanomyces/Dekkera-stamme bevestig deur 5.8S rDNA-ITS RFLP-analise en DNA-opeenvolging te gebruik. Sporulasietoetse is gebruik om te bevestig of hierdie stamme aan die genus Dekkera of Brettanomyces behoort. 'n Metode om SO2 onder laboratoriumtoestande akkuraat te kwantifiseer, is geoptimiseer. Molekulêre SO2- bestandheid is getoets deur vars giskulture op media met SO2 en/of etanol te groei. Bestandheid teen SO2 en/of etanol het stam-afhanklike resultate getoon, S. cerevisiae wat die hoogste toleransievlakke getoon het, terwyl B. bruxellensis SO2 en etanol swak tolereer, maar sekere stamme het goed gegroei met slegs SO2. Die SO2-akkumulasie en -uitskeidingtempo van 3 S. cerevisiae-rasse en 3 B. bruxellensis-stamme is bepaal. Daar is gevind dat die S. cerevisiae-rasse dieselfde tendens soos voorheen in die literatuur beskryf, gevolg het, terwyl B. bruxellensis-stamme soortgelyke tendense getoon het,maar hoogs veranderlike stamafhanklike resultate vertoon. B. bruxellensis CB63 en S. cerevisiae VIN13 is ondersoek vir hul reaksie tot SO2 in twee verskillende media, TA en SWM, oor 'n tydperk van 48-uur en 32-dae onderskeidelik. Asynsuur, asetaldehied, D-glukose, D-fruktose (slegs in SWM) en etanol (slegs in TA) is gereeld gemoniteer oor die verloop van elke eksperiment. SO2 het die grootste impak op B. bruxellensis met ‘n verlaagde tempo van glukoseverbruik en etanolproduksie, sowel as verhoogde asynsuur. ‘n Asetaldehiedhoogtepunt is bereik kort na die SO2-byvoeging met die daaropvolgende hervatting van suiker wat vir sekere monsters gebruik is. Dit dui daarop dat voldoende asetaldehied geproduseer is om vry SO2 te bind om SO2-stres te verminder. Vlugtige fenole is op dag 32 van die SWM-eksperiment gekwantifiseer. 'n Toename van 4-etiel-guajakol korreleer met hoër molekulêre SO2-vlakke. SO2 het beide giste se energiemetabolisme negatief beïnvloed, wat die gis dwing om sy metabolisme aan te pas om oorlewing te verseker. Oor die algemeen het SO2 'n negatiewe impak op alle aspekte van giste se groei en metabolisme, en SO2-bestandheid is hoogs stam–afhanklik. Dit is ook 'n baie meer ingewikkelde kenmerk as wat tans verstaan word.
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Produção de etanol de 2ª geração por Dekkera bruxellensis a partir de hidrolisado de bagaço de cana-deaçúcar

Codato, Carolina Brito 13 August 2013 (has links)
Made available in DSpace on 2016-06-02T18:55:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5512.pdf: 1675884 bytes, checksum: 47d8b8c6a94d1de848c43c964a5f3257 (MD5) Previous issue date: 2013-08-13 / Financiadora de Estudos e Projetos / Bioethanol is an alternative low cost fuel, which is conventionally obtained in Brazil from the fermentation of sugarcane juice, molasses, or a mixture of these. However, alternatively, ethanol could be obtained from lignocellulosic materials, wastes or agroindustrial byproducts composed of cellulose, hemicellulose and lignin, such as sugarcane bagasse. For each ton of cane processed, 250 kg of bagasse are obtained on average, which is usually burned for power generation industry. The microbial cultivation using these materials depend on the availability of substrates, accordingly, acid hydrolysis has been considered one of the most widely used process for the depolymerization of the hemicellulose fraction of lignocellulosic materials, due to their low cost and high efficiency. However, under conditions of high temperature and pressure, glucose and xylose released are degraded to 5- hydroxymethylfurfural (HMF) and furfural, respectively. These compounds are characterized by inhibiting the yeast used in the fermentation step, which influences the microbial metabolism and the conversion of hexoses and pentoses obtained in ethanol. In this context, the aim of this work was to evaluate the ability of a yeast strain, from the species Dekkera bruxellensis (CCA155) in producing ethanol from sugarcane bagasse hydrolysates, since it has shown to be a yeast tolerant to adverse conditions found in industrial fermentation processes. The results indicated that D. bruxellensis was capable of producing ethanol in a synthetic medium containing xylose or arabinose, and xylose or glucose as sole carbon sources, and when grown in concentrations of 50 or 100% sugarcane bagasse hydrolyzate, maximum specific speeds growth was similar, about 0.009 h-1, with cell productivity of about 0.035 gL-1h-1. In the bioreactor tests, the yeast displayed low specific growth rate during the first five days, 0.003 h-1, caused by a slow consumption of glucose. But in a second phase of growth, with a lower rate 0.001 h-1, there was an increase in xylose consumption, a period in that an increase in ethanol concentration with maximum yield of approximately 3.25 mg/L.h was observed. Therefore even with lower growth when compared to yeast fermentation conventionally used in ethanol industries, these results suggest the feasibility of the cultivation of D. bruxellensis in hydrolysates of sugarcane bagasse. / O bioetanol é um combustível alternativo, de baixo custo o qual convencionalmente é obtido no Brasil a partir da fermentação de caldo de cana-de-açúcar, melaço ou a mistura destes. Entretanto, alternativamente, o etanol poderia ser obtido a partir de materiais lignocelulósicos, resíduos ou subprodutos agroindustriais compostos por celulose, hemicelulose e lignina, tais como o bagaço de cana-de-açúcar. Para cada tonelada de cana processada, são obtidos, em média, 250 kg de bagaço, o qual é geralmente queimado para geração de energia na indústria. Os cultivos microbianos a partir destas matérias-primas dependem da disponibilização dos substratos, nesse sentido, a hidrólise ácida tem sido referida como um dos processos mais utilizados para a despolimerização da fração hemicelulósica dos materiais lignocelulósicos, devido ao seu baixo custo e alta eficiência. No entanto, em condições de alta pressão e temperatura, glicose e xilose liberadas são degradadas a 5-hidroximetilfurfural (HMF) e furfural, respectivamente. Estes compostos são caracterizados por inibirem as leveduras utilizadas na etapa de fermentação, o que influencia o metabolismo microbiano e a conversão das hexoses e pentoses obtidas em etanol. Neste contexto, o trabalho consistiu em avaliar a capacidade de uma linhagem da levedura Dekkera bruxellensis em produzir etanol a partir de pré-hidrolisados de bagaço de cana-de-açúcar, já que a mesma tem mostrado ser uma levedura tolerante a condições adversas encontradas em processos fermentativos industriais. Os resultados indicaram que D. bruxellensis foi capaz de produzir etanol em meio sintético contendo xilose ou arabinose, ou ainda xilose e glicose como únicas fontes de carbono, e quando cultivadas em concentrações de 50 ou 100% de pré-hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar, as velocidades específicas de crescimento máximas foram semelhantes, em torno de 0,009 h-1, com produtividade celular de aproximadamente 0,035 g.L-1 h-1. Os ensaios em biorreator demonstraram baixas velocidades específicas de crescimento nos primeiros cinco dias, 0,003 h-1, ocasionado por um lento consumo de glicose. Porém em uma segunda fase de crescimento, com velocidade específica menor 0,001 h-1, ocorreu um aumento no consumo de xilose, período que também se observou aumento na concentração de etanol com produtividade máxima de aproximadamente 3,25 mg/L.h. Portanto apesar de crescimento inferior quando comparado às leveduras convencionalmente usadas na fermentação etanólica industrial, estes resultados sugerem a viabilidade de cultivo da D. bruxellensis CCA155 em pré-hidrolisados de bagaço de cana-de-açúcar.
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Fisiologia molecular da levedura Dekkera bruxellensis

Leite, Fernanda Cristina Bezerra 29 February 2012 (has links)
Submitted by Chaylane Marques (chaylane.marques@ufpe.br) on 2015-03-13T19:43:51Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Leite(2012)_Tese Doutorado.pdf: 1676156 bytes, checksum: a0b7f1a26ca74955f4df21cc6a466fe0 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T19:43:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Leite(2012)_Tese Doutorado.pdf: 1676156 bytes, checksum: a0b7f1a26ca74955f4df21cc6a466fe0 (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / FACEPE / A levedura Dekkera bruxellensis tem sido identificada como principal contaminante do processo industrial de produção de álcool combustível e em vinícolas, mas estudos recentes mostraram que linhagens desta espécie podem apresentar rendimentos em etanol comparáveis aos mostrados por Saccharomyces cerevisiae, o principal microrganismo fermentador. Apesar de ter se mostrado um microrganismo bastante atrativo para aplicações industriais, poucos trabalhos têm sido dedicados ao estudo de sua fisiologia. Este trabalho teve por objetivo descrever a fisiologia da linhagem industrial da levedura D. bruxellensis GDB 248 quanto ao seu metabolismo de açúcares e o efeito repressor que a glicose exerce sobre o metabolismo do carbono. Foram realizados cultivos em frascos em diferentes fontes de carbono e em quimiostatos limitados em glicose ou sacarose. Nos experimentos em frascos com hexoses ou dissacarídeos, valores para taxas de crescimento e rendimentos em etanol e acetato foram calculados e nenhuma formação de piruvato, succinato ou glicerol foi observada. A análise elementar da biomassa de D. bruxellensis resultou na composição elementar CH1.754O0.583N0.149e o grau de redução (Nox) para esta biomassa se mostrou muito próximo ao descrito para a biomassa de S. cerevisiae. Nos experimentos em regime de quimiostato, o metabolismo desta levedura foi completamente respiratório e todo o açúcar consumido (glicose ou sacarose) foi convertido em apenas biomassa atingindo rendimento cerca de 25% maior que o observado para S. cerevisiae. Além disso, pulsos de glicose foram aplicados aos quimiostatos limitados em glicose ou sacarose e os resultados mostraram que as células de D. bruxellensis apresentam o efeito Crabtree observado pela rápida produção de etanol, mesmo em presença de oxigênio. No pulso de glicose aplicado ao quimiostato limitado em sacarose, foi observado o acúmulo de sacarose no reator, indicando a presença de mecanismo de repressão catabólica por glicose nestas células. Para avaliar o efeito repressor da glicose, a expressão relativa do gene DbFBP1 foi analisada por PCR em tempo real e foi observado que este gene está sujeito a uma forte regulação repressora exercida pela proteína quinase A em resposta a disponibilidade de glicose. Os dados deste trabalho possibilitaram uma melhor compreensão acerca da capacidade de conversão de diferentes açúcares a etanol, apesar da tendência ao metabolismo respiratório apresentado pelas células de D. bruxellensis e ainda foram gerados os primeiros dados a cerca do efeito repressor da glicose sobre o metabolismo destas fontes de carbono. Por fim, diante da escassez de dados genômicos para esta espécie, foi realizado um estudo para validar genes de referência para normalização de dados de ensaios de expressão gênica por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que os genes DbEFA1, DbEFB1 e DbYNA1 são suficientemente estáveis para esta aplicação e que o método geNorm é, de fato, o mais adequado para esta análise.

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