A alta atividade da enzima Aldeído-desidrogenase (ALDH) tem sido relatada como um marcador das células troncos tumorais (CTT) no câncer de mama. Sabe-se que essas células estão envolvidas na resistência ao tratamento radio e quimioterápico e podem ser responsáveis pela recorrência e disseminação metastática. A associação entre a quantidade de CTTs e a resposta a quimioterapia neoadjuvante (QNA) ainda não está estabelecida. Foi analisado retrospectivamente a expressão de ALDH1A1 por imunohistoquímica (IHQ) em amostras previamente analisadas por citometria de fluxo para ALDH1A1 no tumor primário de 61 pacientes com carcinoma ductal invasivo diagnosticado entre 2010 e 2012. A maioria das pacientes estava entre 51-70 anos (59%), na menopausa (65,6%) e com estádio clínico III (47,5%). A expressão positiva de receptores de estrógeno, progesterona e de HER2 foi de 67,2%, 52,5% e 45,9% respectivamente. A imunohistoquímica para ALDH1A1 foi realizada com lâminas da TMA e considerado positivos os casos com marcação citoplástica evidente em grupamentos de 5 ou mais células. Foi analisada a associação entre esses dados e o resultado da citometria de fluxo para ALDH1 e também a associação com os fatores prognósticos conhecidos. Não foi encontrada associação (p = 0,67) entre a porcentagem de células ALDH1+ com o resultado da imunohistoquímica positiva para ALDH1A1 (4,45% (1,7 - 10,1)) e negativa (3,2% (1,2 - 13,6)). Os dados não demonstraram associação da IHQ para ALDH1A1 ou da quantia de células ALDH1+ no tumor primário com a resposta patológica completa após quimioterapia neoadjuvante, sugerindo que essa população pode não ser um fator preditor isolado da resposta a QNA. Também não foi observado relação da IHQ para ALDH1A1 com os fatores prognósticos conhecidos. A sobrevida também não foi influenciada pela expressão de ALDH1A1 pela IHQ tanto na sobrevida global (p = 0,54; HR = 1,33 (0,52 - 3,39)) quanto na livre de doença (p = 0,35; HR = 1,67 (0,57 - 4,90)). Quanto a porcentagem de células ALDH1+ no tumor primário, também não houve impacto sobre a sobrevida global (p = 0,40; HR = 0,98 (0,92 - 1,03)), nem na sobrevida livre de doença (p = 0,55; HR = 0,98 (0,92 - 1,05)). A presença de células ALDH1A1 positivas na imunohistoquímica não se relaciona com a atividade da enzima analisada por citometria de fluxo e não apresenta associação com fatores prognósticos / The expressions of aldehyde-dehydrogenase (ALDH) has been reported as potential breast cancer stem-like cells (BCSLCs) markers. Those cells are known to be involved with treatment resistance and may be responsible for relapses and metastatic dissemination. The association between the quantity of BCSLCs and the response to neoadjuvant chemotherapy (NACT) remains unclear. We retrospectively analyzed the expression of ALDH1A1 by immunohistochemistry (IHQ) in 61 patients with invasive ductal carcinomas of the breast from 2010 to 2012 previously analyzed by flow cytometry (FCT). Most patients were aged between 51-70 years (59%), clinical stage III (47,5%) and menopausal (65,6%). The ER, PgR and HER2 positive expression rates were 67,2%, 52,5% and 45,9%, respectively. The aldehyde-dehydrogenase immunohistochemistry ware evaluated by TMA and considered to be positive cases with evident cytoplasmic staining in clusters of 5 or more cells. These data were correlated with the flow cytometry results and clinical and pathological features. No association between ALDH1+ cell population by FCT with ALDH1A1 positive (4,45% (1,7 - 10,1)) and negative (3,2% (1,2 - 13,6)) cases by IHQ were observed (p= 0,67). No relationship between ALDH1A1+ by IHQ nor ALDH1+ by FCT were found with the complete pathological response to therapy, suggesting that it might not be an isolated predictor of response to NACT. No relationship between IHQ was found with the clinicalpathological features. The overall survival was the same between the two groups by IHQ (p = 0,54; HR = 1,33 (0,52 - 3,39)) and also the disease free survival (p = 0,35; HR = 1,67 (0,57 - 4,90)). The FCT results did not correlate with the overall survival (p = 0,40; HR = 0,98 (0,92 - 1,03)), nor with the disease free survival (p = 0,55; HR = 0,98 (0,92 - 1,05)). The expression of ALDH1A1+ by immunohistochemistry have no association with the enzymatic function analyzed by flow cytometry and do not represent a prognostic factor

A engenharia de tecido ósseo associando células-tronco mesenquimais (CTMs) a biomateriais tem sido proposta como tratamento potencial para o reparo de defeitos ósseos, constituindo uma abordagem nova na área da medicina regenerativa e de amplo interesse para as áreas de cirurgia buco-maxilo-facial e ortopedia. A seleção das CTMs mais adequadas e o método utilizado para carreá-las nos sítios de defeitos ósseos são fatores importantes para o sucesso do tratamento. Como a osteoporose reduz a capacidade de regeneração dos ossos, seria de grande importância que a engenharia do tecido ósseo pudesse ser aplicada com sucesso nessa patologia. Assim, foi avaliado o potencial das CTMs de medula óssea (CTMs-MO) e de tecido adiposo (CTMs-TA) associadas ao arcabouço de vitrocerâmica BioS-2P ou a membrana de P(VDF-TrFE)/BT no reparo de defeitos ósseos em ratas osteoporóticas. A osteoporose foi induzida por ovariectomia e comprovada pela análise microtomográfica dos fêmures. Nas ratas osteoporóticas foram criados defeitos ósseos nas calvárias que foram tratados com implantação de BioS-2P associado à CTMs-MO e CTMs-TA ou com a implantação de membrana de P(VDF-TrFE)/BT combinada com a injeção de CTMs-MO e CTMs-TA. Ao final de 4 semanas, as análises microtomográficas e histológica mostraram que não houve formação óssea nos defeitos sem qualquer tratamento, mas nos defeitos tratados com implantação de BioS-2P ou membrana de P(VDF-TrFE)/BT houve formação óssea independente da presença de CTMs. Apenas os defeitos tratados com membrana de P(VDF-TrFE)/BT e injeção de CTMs-MO apresentaram maior formação óssea, mas não ocorreu a regeneração. / Bone tissue engineering based on the combination of mesenchymal stem cells (MSCs) and biomaterials, has been proposed as a potential treatment for the repair of bone defects, constituting a new approach in the field of regenerative medicine and of interest to the areas of oral and maxillofacial surgery and orthopedics. To select the most suitable MSCs and an efficient method to carry them to the bone defects are the key for the successful treatment. Considering that osteoporosis represents a challenge situation, it would be of the utmost importance that bone tissue engineering could be used in this pathological condition. Thus, the aim of this study was to evaluate the potential of MSCs harvested from bone marrow (MSCs-BM) and from adipose tissue (MSCs-AT) associated to a vitreous scaffold (BioS-2P) or to a membrane of P(VDF-TrFE)/BT in regenerate bone defects created in osteoporotic rats. Osteoporosis was induced by ovariectomy and confirmed by microtomography of the femurs. Defects created in calvaria of osteoporotic rats were implanted with either Bios-2P seeded with MSCs-BM and MSCs-AT or a membrane of P(VDF-TrFE)/BT combined with injection of MSCs-BM and MSCs-AT. After 4 weeks, microtomography and histological analyses showed that there was no bone formation in untreated defects but in those treated with BioS-2P or membrane of P(VDF-TrFE)/BT there was bone formation irrespective of the presence of MSCs. Only defects treated with membrane of P(VDF-TrFE)/BT and MSCs-BM injection resulted in greater bone formation but there was not full bone regeneration.

As células tronco mesenquimais derivadas do âmnio (AMSCs) são células multipotentes com alto potencial para se diferenciar em múltiplas linhagens. Podem ser isoladas sem recurso a procedimentos invasivos e usadas sem levantar quaisquer implicações éticas. O presente estudo visa isolar e caracterizar as células mesenquimais progenitoras da membrana amniótica de gatos domésticos para futura aplicação em terapia celular. As células foram isoladas de quatro membranas fetais, coletadas durante as campanhas rotineiras de castração em gatas no último terço de gestação, após anestesia geral. A porção dorsal do âmnio foi separada mecanicamente, lavada com PBS e submetida à digestão com colagenase. As células coletadas foram propagadas em cultivo (DMEN-F12/-MEM) e criopreservadas em várias passagens enquanto se efetuava a avaliação da cinética de crescimento e das características morfológicas. Em cultivo, as AMSCs demonstraram aderência à placa e uma morfologia similar a dos fibroblastos. A análise imunofenotípica revelou presença de marcadores específicos de MSCs CD73 e CD90 e ausência de marcadores hematopoiéticos CD34, CD45 e CD79 sugerindo a presença de células mesenquimais multipotentes na membrana amniótica de gatos domésticos. Em condições apropriadas, estas células diferenciaram-se em linhagens específicas osteogênica e adipogênica. Entretanto, após inoculação em camundongos imunodeficientes não foi registrado formação de teratomas. Estes achados sugerem que o âmnio de gatos domésticos pode ser considerado uma importante fonte de MSCs com maior atração para medicina regenerativa. / The amnion derived mesenchymal stem cells (AMSCs) are multipotent cells with a high ability to differentiate into multiple lineages. They can be obtained by non-invasive methods and therefore are exempt from the normal ethical problems involving stem cell use. The aim of this study was to isolate and characterize the progenitor mesenchymal cells from the cat amniotic membrane for future application in cell therapy. The cells were isolated from four fetal membranes collected after a routine ovarian hysterectomy process from cats in their third gestational trimester, under general anesthesia. The dorsal portion of amnion was mechanically separated, washed with PBS and subjected to collagenase digestion. The isolated cells were propagated in culture media (DMEMF12 or -MEM) and frozen in various passages while the growing kinetics and cell morphology were analyzed. In culture medium, AMSCs were adherent to the plastic culture dish and had a morphology similar to fibroblasts. Immunophenotyping assays showed the presence of MSCs specific markers CD73 and CD90 and absence of hematopoietic markers CD34, CD45 and CD79 suggesting the presence of multipotent mesenchymal cells in the cat amniotic membrane. Under appropriate conditions, these cells differentiated into osteogenic and adipogenic cell lineages. Moreover, after injection into immunodeficient mice, no tumors were generated. These findings suggest that the cat amniotic membrane can be considered an important and useful source of MSCs for regenerative medicine.

O carcinoma de mama é uma doença altamente prevalente e incidente. Em nosso meio, cerca de metade dos casos são diagnosticados em estádios localmente avançados e/ou disseminados. Nesta situação o índice de sucessos terapêuticos é pequeno. Recentemente vem sendo citado na literatura as células tronco tumorais (CTT) como aquelas responsáveis pelas recorrências tumorais, pois este tipo de células seria capaz de repovoar o hospedeiro com células tumorais de mesma origem. Postula-se também que este tipo de células é resistente ao tratamento quimioterápico. Assim, o prognóstico de uma paciente dependeria diretamente da quantidade de CTT presentes em seu tumor na época do tratamento. As expressões de CD44/CD24, CXCR4 e ABCG2 têm sido relatadas como potenciais marcadores de células tronco no câncer de mama (CTCM). A associação entre a quantidade de CTCMs e a resposta à quimioterapia neoadjuvante (QNA) permanece obscura. Métodos: Foram analisadas prospectivamente a expressão de CD44/CD24, CXCR4 e ABCG2 em 41 pacientes com câncer de mama localmente avançado ou metastático (CMLA) submetidas à QNA. O ensaio de mamosferas (Mammocult ®) foi estudado em 25 amostras. Idade média dos pacientes foi de 52,9 ± 10,3 anos. De acordo com o estádio clínico (EC), uma paciente foi classificada como IIa, 5 pacientes foram IIb, 10 foram IIIa, 16 foram IIIb, uma foi IIIc e 8 foram IV. O diâmetro médio do tumor clínico foi de 5,6 ± 3 centímetros. Os receptores de estrógeno (RE), receptores de progesterona (PgR) e HER2 positivos apresentaram as taxas de expressão de 65%, 58% e 46%, respectivamente. A porcentagem mediana de células ESA+/CD44+/CD24-, ESA+/CXCR4 + e ESA+/ABCG2 + foram determinados por citometria de fluxo em tumores frescos amostrados após a digestão do tecido. A relação entre as análises de citometria de fluxo e resposta clínica e patológica à terapia foi analisada. Resultados: A resposta clínica completa (RCC) e resposta patológica completa (PCR) foram observadas em 15 (36%) e 10 (24%) pacientes respectivamente. Não observamos uma associação significativa entre PCR, ER, PgR ou expressão HER2. Observamos uma associação entre o tamanho clínico com percentual de células ESA+/ABCG2+ dentro do tumor (p = 0,0481) e do grau tumoral com a capacidade de formação de esferas (p = 0,0392). Nenhuma correlação entre PCR e a população de células CD44+/CD24- dentro do tumor foi observada. Houve uma correlação positiva entre a expressão de ESA+/ABCG2+ e ESA+/CXCR4+ com o número de formação de mamosferas (p = 0,0007 e p = 0,0497, respectivamente). Esta correlação não foi significativa em comparação com células ESA+/CD44+/CD24-. Conclusões: O percentual de células cancerosas ABCG2+ dentro do tumor e do número de formação mamosferas são fatores preditivos de PCR em pacientes submetidos à QNA para CMLA. ABCG2 é um marcador potencial para CTCMs. Palavras chave: Câncer de mama, Célula tronco tumoral, Quimioterapia neoadjuvante, Taxanos, Fatores prognósticos. / Breast cancer is a disease highly prevalent and incident. In our country, about half of cases are diagnosed in advanced stages locally and / or disseminated. In this situation the therapeutic success rate is small. Recently been reported in the literature cancer stem cells (CSC) as those responsible for tumor recurrence, as this type of cells could repopulate the host cell tumor of the same origin. It is also postulated that this type of cells are resistant to chemotherapy. Thus the prognosis of a patient depend directly on the amount of CSC present in their tumor at the time of treatment. The expressions of CD44/CD24, CXCR4 and ABCG2 have been reported as potential breast cancer stem-like cell (CSLC) markers. The association between the quantity of CSLCs and the response to neoadjuvant chemotherapy (NACT) remains unclear. Methods: We prospectively analyzed the expression of CD44/CD24, CXCR4 and ABCG2 in 41 breast cancer patients with locally advanced or metastatic (CMLA) submitted to NAC. The assay mamosferas (Mammocult ®) was studied in 25 samples. Mean age of patients was 52.9 ± 10.3 years. According to the clinical stage (CS), one patient was classified as IIa, IIb 5 patients, 10 were IIIa, IIIb were 16, 1 and 8 have been IIIc IV. The mean diameter of tumor therapy was 5.6 ± 3 cm. The estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PgR) and HER2 showed positive expression rates of 65%, 58% and 46%, respectively. The median percentage of cells ESA+/CD44+/CD24-, ESA+/CXCR4+ and ESA+/ABCG2+ were determined by flow cytometry in tumors sampled after digestion fresh tissue. The relationship between flow cytometric analysis and clinical and pathological response to therapy was assessed. Results: The complete clinical response (CCR) and pathologic complete response (PCR) was seen in 15 (36%) and 10 (24%) patients, respectively. We did not observe a significant association between CRP, ER, PgR and HER2 expression. An association was observed between the size clinical percentage of cells ESA+/ABCG2+ within the tumor (p = 0.0481) and tumor grade with the ability to form spheres (p = 0.0392). No correlation between PCR and cell population CD44+/CD24-within the tumor was observed. There was a positive correlation between the expression of ESA+/ABCG2+ and ESA+/CXCR4+ with the number of training mamosferas (p = 0.0007 and p = 0.0497, respectivamenete). This correlation was not significant compared with cells ESA+/CD44+/CD24-. Conclusions: The percentage of ABCG2 + cancer cells within the tumor and the number of training mamosferas are predictors of CRP in patients undergoing NAC for CMLA. ABCG2 is a potential marker for CTCMs. Keywords: Breast cancer, stem cell tumor, neoadjuvant chemotherapy, taxanes, Prognostic factors.

A hematopoese tem sido bem descrita em modelos murinos nas últimas décadas, contudo, trabalhos demonstrando os mecanismos da hematopoese em humanos ainda são escassos. A derivação da primeira linhagem de células-tronco embrionárias humanas (CTEhs) em 1998, gerou novas perspectivas tanto para o estudo da hematopoese na tentativa de mimetizar o que ocorre naturalmente durante o desenvolvimento embrionário, quanto para a aplicação clínica das células hematopoéticas obtidas a partir da diferenciação dessas células. Contudo, apesar de inúmeros trabalhos terem demonstradoa obtenção de células hematopoéticas a partir de CTEhs, os protocolos têm gerado quantidades variáveis de células, com baixa eficiência e com propriedades funcionais de células primitivas. Desse modo, este trabalho procurou estabelecer um modelo próprio de diferenciação de CTEhs-H1 em células progenitoras hematopoéticas para que estas pudessem ser melhor caracterizadas e obtidas de forma mais eficiente. Para isto, foi desenvolvido um sistema de diferenciação baseado no co-cultivo da linhagem de CTEh-H1 com fibroblastos de embrião de camundongo (MEFs), em meio de diferenciação suplementado soro fetal bovino (SFB) e citocinas e fatores de crescimento hematopoéticos em baixas concentrações. Como resultado, o desenvolvimento do presente trabalho permitiu o estabelecimento de um método para geração de populações mistas de células enriquecidas em CPHs positivas para o marcador CD45, o qual mostrou ser coexpresso com outros marcadores hematopoéticos (CD31, CD43, CD71 e CD38), e células hematopoéticas maduras positivas para marcadores mielóide-específicos (235a, CD14, CD15, CD16) e com características morfológicas típicas. Foi demonstrado que as células obtidas expressavam genes relativos ao sistema hematopoético (CD45, CD31, runx1, tal1, lmo2, prom1, CD34 e notch1), e possuíam potencial clonogênico in vitro da ordem de 1/574 células plaqueadas. Em adição, corroboramos os achados de que as células hematopoéticas apresentam duas origens distintas: a partir do endotelio hemogênico e a partir de células com propriedades hemangioblásticas independentes do endotélio hemogênico. / Hematopoiesis has been well described in murine models in recent decades, however, studies demonstrating the mechanisms of hematopoiesis in humans are still scarce. The first human embryonic stem cells line (hESCs) derived in 1998, has generated new perspectives about the study of hematopoiesis as in attempting to mimic what naturally occurs during embryonic development, as for clinical application of hematopoietic cells obtained from the differentiation of these cells. However, although numerous studies have shown the production of hematopoietic cells derived from hESCs, the protocols have generated varying quantities of cells with low efficiency and functional properties of primitive stem cells. Thus, this study sought to establish our own model for hESC-H1 differentiation in hematopoietic progenitor cells so that they could be better characterized and obtained more efficiently. For this way, we developed a differentiation system based on co-culture of hESC-H1 line with inactivated mouse embryonic fibroblasts (MEFs) in differentiation medium supplemented with fetal calf serum (FCS) and cytokines and hematopoietic growth factors in low concentrations. As a result, the development of this study allowed the establishment of a method for generation of mixed population of cells enriched in hematopoietic progenitor cells positive for the marker CD45, which proved to be co-expressed with other hematopoietic markers (CD31, CD43, CD71 and CD38), and mature hematopoietic cells positive for myeloid-specific markers (235a, CD14, CD15, CD16) and morphological characteristics typical. It was shown that these cells expressed genes related to the hematopoietic system (CD45, CD31, runx1, TAL1, LMO2, prom1, CD34 and NOTCH1), and had clonogenic potential in vitro of 1/574 plated cells. In addition, we corroborate the findings that hematopoietic cells have two distinct origins: they can arise as from an hemogenic endothelium as from cells with hemangioblastic properties by an hemogenic endothelium-independent way.

Na espécie equina, as enfermidades osteoarticulares causam prejuízo econômico e impacto negativo no desempenho atlético, devido aos danos causados na cartilagem articular. A regeneração da cartilagem hialina e a manutenção da integridade das estruturas que a compõe norteiam a busca do tratamento ideal. Neste contexto, este estudo foi delineado com o objetivo de investigar a presença de células-tronco mesenquimais (CTMs) no líquido sinovial (LS) e na membrana sinovial (MS) de equinos com articulações hígidas, com osteocondrite dissecante (OCD) e com osteoartrite (OA) e compará-las, visando estabelecer qual fonte celular possui melhor característica fenotípica e capacidade de diferenciação celular, mais especificamente, aquela que seja superior em relação à capacidade condrogênica. Foram utilizados equinos machos e fêmeas de diferentes idades, totalizando 97 articulações. O LS e MS foram coletados durante artroscopia e as células foram cultivadas, e avaliadas por citometria de fluxo com os anticorpos CD44, CD90, CD105, CD34; e por imunocitoquímica com os anticorpos nanog, oct4, PGP 9.5, lisozima, vimentina e citoqueratina. Adicionalmente, o potencial de diferenciação das células foi avaliado para as linhagens condrogênica, osteogênica e adipogênica. Foi realizado teste de tumorigenicidade em camundongos Balb-Cnu/nu, para comprovar aplicabilidade clínica, e posteriormente, as CTMs provenientes de LS de articulações hígidas foram aplicadas em articulações de equinos. A identidade das células foi comprovada durante o cultivo demonstrando características de adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. A média percentual das populações positivas para CD90 foi de 64,9% (LS-H), 48,3% (LS-OCD), 48,1% (LS-OA), 66,6% (MS-H), 40,2% (MS-OCD) e 40,3% (MS-OA). A porcentagem de células positivas para CD44 foi de 1,18% (LS-H), 3,98% (LS-OCD), 14,2% (LS-OA), 1,9% (MS-H), 2,17% (MS-OCD) 8,56% (MS-OA). Não foi observada expressão dos anticorpos CD34 e CD105. Na análise imunocitoquímica foi detectada expressão positiva para os anticorpos: lisozima, PGP 9.5, PCNA e vimentina, e negativa para nanog, oct4 e citoqueratina. A multipotência (osteogênica, condrogênica e adipogênica) das células foi confirmada através da coloração Alizarin Red para detecção de matriz de cálcio, Oil Red O para detecção de gotículas de gordura e azul de toluidina, alcian blue e hematoxilina eosina para detecção de matriz de proteoglicanos. Com relação aos resultados do teste tumorigênico, nenhum órgão dos camundongos foi afetado, assegurando a aplicabilidade das células estudadas. Ainda, as articulações de equinos tratadas, não apresentaram quaisquer sinais de reação inflamatória após aplicação de células alogênicas. Por fim, concluímos que, a fenotipagem positiva de CD44 e CD90 somada à capacidade de diferenciação nas linhagens osteogênica e condrogênica confirma a presença de CTMs nas populações celulares obtidas de LS e MS de equinos. Também foi observado que as células de LS provenientes de articulações hígidas, são as de melhor utilização clínica, uma vez que apresentaram maior expressão de CD90 e demonstraram melhor capacidade de diferenciação celular em relação às células derivadas de articulações enfermas. Além disso, possuem método mais fácil de colheita em relação à colheita de MS, visando futura terapia celular na rotina clínica / In the equine species, osteoarticular diseases cause significant economic losses and negative impact on equine athletic performance. The hyaline cartilage regeneration and the maintenance of integrity of its components guide the search for the ideal treatment. In this scenario, this study aimed to investigate the presence of mesenchymal stem cell (MSCs) in the synovial fluid (SF) and in the synovial membrane (SM) of healthy equine joints, osteoarthritic (OA) and osteochondritic joints (OCD), comparing their potential as cellular sources, according to their differentiation ability, in particular with superior chondrogenic potential and the phenotypic characteristics of the MSCs. Ninety-seven equine joints from males and females of different ages were used to harvest cells. SF and SM were obtained during arthroscopy and the cells SF and SM were cultured and assessed for CD90, CD44, CD105 and CD34 markers by flow cytometry, and nanog, oct4, PGP 9.5, lyzozyme, vimentin and cytokeratin were assessed by immunocytochemistry. Additionally, cells were evaluated in vitro for their osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation potential. The tumorigenicity test was carried in Balb-C nu/nu mice, to verify the safety of cell sources and, later, mesenchymal stem cells harvested from healthy equine joints were injected into equine joints. The identity of these cells was confirmed during cell growth, through properties of plastic adhesion and fibroblastoid morphology. The mean percentage of CD90 positive cells was 64.9% (SF-H), 48.3% (SF-OCD), 48.1% (SF-OA), 66.6% (SM-H), 40.2% (SM- OCD) and 40.3% (SM-OA). The percentage of CD44 positive cells was 1.18 % (SF-H), 3.98% (SF-OCD), 14.2% (SF-OA), 1.9% (SM-H), 2.17% (SM-OCD) and 8.56% (SM-OA). The expression of CD34 and CD105 antibodies was not observed. Through immunocytochemical analysis, expression for lysozyme, PGP9.5, PCNA e vimentin antibodies was detected and negative expression for nanog, oct4 e cytokeratin was observed. The multipotent capacity of mesenchymal stromal cells for lineage differentiation (osteogenic, chondrogenoic and adipogenic) was confirmed with different staining techniques: Alizarin Red enabled detection of the calcium matrix, Oil Red O enabled the detection of fat droplets and Toluidin Blue, Alcian Blue and haematoxylin eosin enabled detection of proteoglycan matrix. Results of tumorigenic tests in mice showed no compromise of any internal organ, assuring applicability of the studied cells. Furthermore, equine joints treated with MSC harvested from healthy joints did not show any signs of an inflammatory reaction after injection of the allogeneic cells. The presence of cells with positive CD44 and CD90 phenotypes and with the ability to differentiate into osteogenic and chondrogenic lineages confirms the presence of MSCs in equine SF and SM. Cells obtained from healthy SF were more suitable for clinical application, for they presented higher CD90 expression and demonstrated greater differentiation capabilities, when compared to that of cells retrieved from compromised joints. In addition to that, SF derived cells are easier to obtain when compared to SM cells, aiming their future application clinical

A crescente demanda clínica para regeneração óssea tem dirigido esforços significativos para o desenvolvimento de novos biomateriais, incluindo aqueles aplicados em terapias baseadas em engenharia de tecidos. Neste contexto, os biovidros são considerados uma boa alternativa mas as suas propriedades mecânicas têm limitado a sua aplicação. Para melhorar tais propriedades sem afetar a biocompatibilidade, um novo material vitrocerâmico bioativo do sistema P2O5-Na2O-CaO-SiO2, chamado Biosilicato® com duas fases cristalinas (BioS-2P) foi desenvolvido. No entanto, os efeitos da adição das fases cristalinas sobre o comportamento biológico do BioS-2P ainda não foram estudados. Assim, os objetivos deste estudo foram investigar a capacidade do BioS-2P em induzir, in vitro, a diferenciação osteoblástica de células-tronco mesenquimais (CTMs); a capacidade do BioS-2P em aumentar, in vitro, a atividade dos osteoblastos em fase inicial de diferenciação (OBs) e osteoblastos da linhagem UMR-106 (UMRs); e a capacidade do BioS-2P em conduzir e induzir a neoformação óssea, in vivo, associado ou não a células. Células derivadas da medula óssea obtidas de fêmures de ratos foram cultivadas em meio de crescimento para obtenção de CTMs ou em meio osteogênico para obtenção de OBs. Essas células e UMRs foram cultivadas sobre discos de BioS-2P, Bioglass® 45S5 (45S5) e plástico de cultura (Controle) e utilizadas nas avaliações in vitro. Para as avaliações in vivo, defeitos de 5 mm criados em calotas de ratos foram implantados somente com arcabouços de BioS-2P ou com arcabouços de BioS-2P associados às CTMs ou aos OBs. Os dados foram comparados por teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Student Newman-Keuls, e o nível de significância adotado foi de 5%. As CTMs foram caracterizadas por apresentarem alta porcentagem de células expressando os marcadores de superfície CD29 e CD90 e baixa porcentagem expressando CD31, CD34, CD45 e CD106. A diferenciação osteoblástica das CTMs foi confirmada pela expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica fosfatase alcalina (ALP), runt-related transcriptor factor-2 (RUNX2), sialoproteína óssea (BSP) e osteocalcina (OC). CTMs cultivadas sobre discos de BioS-2P em meio não-osteogênico apresentaram diminuição da proliferação e aumento da atividade de ALP e da expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica ALP, RUNX2, osterix (OSX), proteína óssea morfogenética-4 (BMP-4), osteopontina (OPN) e OC, comprovando seu potencial osteoindutor similar ao 45S5. O BioS-2P foi capaz de aumentar a atividade de OBs e UMRs de maneira similar àqueles cultivados sobre o 45S5. OBs apresentaram diminuição na proliferação e aumento da atividade da ALP e da expressão dos genes marcadores da diferenciação osteoblástica RUNX2, OSX, BMP-4, OPN e OC. A análise em larga escala da expressão de mais de 23.000 genes mostrou que o BioS-2P induziu a sobre-expressão de genes envolvidos no aumento da atividade osteoblástica e a repressão de genes envolvidos na diminuição dessa atividade, em comparação com o Controle. Ao menos em parte, esse aumento da atividade osteoblástica foi atribuído à modulação das vias de sinalização proteíno-quinases ativadas por mitógenos (MAPK) e Wnt Canônica, e à modulação da expressão de microRNAs. UMRs crescidos sobre o BioS-2P corroboraram esses achados, pela capacidade em formar matriz mineralizada e por apresentarem aumento na expressão das proteínas ALP, RUNX2, dentin matrix protein-1 (DMP-1) e OPN. Arcabouços de BioS-2P (5 mm de diâmetro e 2 mm de altura com porosidade de 76 ± 5% e com tamanhos de poros variando entre 100 e 800 µm) implantados em defeitos na calota de ratos estimularam a formação de tecido ósseo, que ocorreu tanto na periferia como no interior dos defeitos e em íntimo contato com o material. A morfometria por microtomografia computadorizada não evidenciou qualquer diferença entre os parâmetros volume ósseo, volume ósseo/volume total, superfície óssea, superfície/volume ósseo, número de trabéculas, separação trabecular e espessura trabecular, avaliados na 4a, 8a e 12a semanas de implantação. As CTMs e os OBs foram carreados para os arcabouços de BioS- 2P (com eficiência de 90% e 81%, respectivamente) e essas células permaneceram nos defeitos por 14 dias. A combinação de arcabouços de BioS-2P com CTMs ou OBs, implantados por 8 semanas, resultou no mesmo padrão de formação óssea daquele observado para o arcabouço sem células. No entanto, essa combinação não resultou em aumento na quantidade de osso formado. Os resultados evidenciaram a capacidade do BioS-2P em induzir a diferenciação osteoblástica de CTMs e estimular a atividade osteoblástica de OBs, o que resultaria na neoformação óssea observada in vivo. No entanto, a combinação de BioS-2P com CTMs e OBs não foi capaz de aumentar a formação óssea e induzir o reparo dos defeitos ósseos. / The increasing clinical demand for bone regeneration has driven significant efforts to develop new biomaterials including those for tissue engineeringbased therapies. In this context, bioglasses emerges as a good alternative, but their use has been limited mainly due their poor mechanical properties. To improve these mechanical properties without affecting biocompatibility, a novel bioactive glass-ceramic of the P2O5-Na2O-CaO-SiO2 system, named Biosilicate® with two cristallyne phases (BioS-2P) was developed. However, the effects of these two phases on BioS- 2P biological behavior have not yet been evaluated. Thus, the aims of this study were to investigate the BioS-2P capability of inducing in vitro mesenquimal stem cell differentiation (MSC) towards osteoblasts; the BioS-2P capability to increase in vitro activity of osteoblasts derived from rat bone marrow at early stages of differentiation (OBs) and osteoblasts from rat cell line UMR- 106 (UMRs); and the BioS-2P capability to drive and induce bone formation in vivo, associated or not with cells. Bone marrow cells harvested from rat femurs were cultured either in growth media to obtain MSCs or in osteogenic media to obtain OBs. MSCs, OBs and UMRs were cultured on discs of BioS-2P, Bioglass® 45S5 (45S5) and tissue culture polystyrene (Control). For in vivo evaluations, 5-mm rat calvarial surgical defects were filled with BioS-2P with or without MSCs or OBs. Data were compared by non-parametric Kruskal-Wallis test followed by Student Newman- Keuls test and the significance level was set at 5%. MSCs were characterized by presenting high percentage of CD29 and CD90 surface markers and low percentage of CD31, CD34, CD45 and CD106 surface markers. Osteoblastic differentiation of MSCs was detected by gene expression of bone markers alkaline phosphatase (ALP), runt-related transcritption factor 2 (RUNX2), bone sialoprotein (BSP) and osteocalcin (OC). MSCs cultured on Bios-2P discs under non-osteogenic conditions exhibited a decrease on cell proliferation and an increase on ALP activity and gene expression of bone markers ALP, RUNX2, osterix (OSX), bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), osteopontin (OPN) and OC, confirming its osteoinductive potential similar to 45S5. Also, BioS-2P increased the OBs and UMRs activity, similar to 45S5. OBs cultured on Bios-2P discs presented a decrease in cell proliferation and an increase on ALP activity and gene expression of bone markers RUNX2, OSX, BMP-4, OPN and OC. The large-scale analysis of over 23,000 genes showed that the BioS-2P induced overexpression of genes positively related to osteoblastic activity and repression of genes negatively related with its activity, compared with control. At least in part, the increase on OBs activity was associated to the modulation of two main signaling pathways, the mitogen activated protein kinases (MAPK) and the Canonical Wnt, and the modulation of microRNAs expression. These findings were corroborated by UMRs grown on BioS-2P, which produced mineralized matrix and exhibited increased expression of the ALP, RUNX2, dentin matrix protein-1 (DMP-1) and OPN proteins, than on control. BioS-2P scaffolds (5 mm diameter and 2 mm heigh, presenting 76 ± 5% of total porosity, with poros size ranging from 100 to 800 µm) implanted in calvarial defects promoted new bone formation in close contatc to BioS-2P, both on periphery and in the center of the defect. The computed microtomography morphometry showed no difference between the evaluated parameters bone volume, bone volume / total volume, bone surface, surface / bone volume, number of trabeculae, trabecular separation and trabecular thickness, measured at 4, 8 and 12 weeks. MSCs and OBs were seeded into the scaffold (with efficiency of incorporation 90% e 81%, respectively) and they remained on the defects for 14 days. After 8 weeks, the same pattern of bone formation was observed, however, the combination of BioS-2P with cells did not increase the amount of new bone. The results showed the BioS-2P ability to induce osteoblastic differentiation of MSCs and to stimulate osteoblastic activity, resulting in new bone formation in vivo. However, the combination of BioS-2P with MSCs and OBs was not able to increase bone formation and induce the repair of bone defects.

A desnutrição proteico-energética (DPE) altera a hemopoese e, portanto, a geração de células imunológicas, bem como compromete o sistema imune. Desta forma, indivíduos desnutridos apresentam maior susceptibilidade a infecções. As células tronco mesenquimais (CTMs) possuem propriedades imunomodulatórias e são importantes na formação do estroma medular que sustenta a hemopoese. Visto que a L-glutamina (GLUT) é o aminoácido condicionalmente essencial mais consumido por CTMs, e que também apresenta capacidade imunomoduladora, investigou-se, neste trabalho, se a GLUT exerceria efeito sobre aspectos imunomodulatórios das CTMs em um modelo experimental de DPE. Para tanto, utilizou-se camundongos da linhagem BALB/c, os quais receberam rações normoproteica ou hipoproteica isocalóricas contendo, respectivamente, 12% e 2% de proteína por um período de 5 semanas. Após o isolamento e a caracterização de CTMs provenientes dos grupos controle (CTMct) e desnutrido (CTMdesn), cultivou-se essas células em 0, 0,6, 2 e 10mM GLUT, a fim de determinar a influência deste aminoácido sobre a expressão de fatores de transcrição e produção de citocinas por CTMct e CTMdesn. Adicionalmente, avaliou-se o efeito dos sobrenadantes das culturas de CTMct e CTMdesn sobre a proliferação e produção de citocinas por macrófagos e linfócitos esplênicos. Os animais desnutridos apresentaram anemia, leucopenia, hipoplasia medular e diminuição na concentração de proteínas séricas, albumina e préa-lbumina. A DPE não modificou a morfologia e o fenótipo das CTMs, bem como não alterou a expressão de proteínas reguladoras do ciclo celular. Por outro lado, a expressão de NFkB e STAT-3 e a produção de IL-1β, IL-6, IL-10 e TGF-β por CTMs foram alteradas pela DPE e variaram de acordo com as concentrações de GLUT testadas. O aumento na concentração de GLUT diminuiu a expressão de NFkB e induziu a expressão de STAT-3 por CTMs obtidas de ambos os grupos. Quanto a produção de citocinas por essas células, observou-se uma diminuição nos níveis de IL-β e IL-6 e uma elevação nos níveis de IL-10 e TGF-β com o aumento na concentração de GLUT. Variações na concentração desse aminoácido não alteraram a produção de IL-17 ou IFN-γ por CTMct e CTMdesn. Ademais, a concentração de GLUT alterou, de forma diretamente proporcional, a taxa de proliferação das CTMs. Os meios condicionados de CTMct e CTMdesn diminuíram a proliferação de macrófagos e linfócitos esplênicos estimulados com LPS, induziram aumento na produção da citocina antiinflamatória IL-10 por ambos os tipos celulares e diminuíram a produção das citocinas pró-inflamatórias IL-12 e TNF-α por macrófagos e IL-17 por linfócitos. Portanto, conclui-se que a GLUT possui efeito sobre a proliferação das CTMs, bem como a capacidade de imunomodular estas células. / Protein-energy malnutrition (PEM) alters hemopoiesis and, therefore, the generation of immune cells, and compromises the immune system. In this way, malnourished individuals are more susceptible to infections. Mesenchymal stem cells (MSCs) have immunomodulatory properties and are important in the formation of bone marrow stroma that supports hemopoiesis. Since L-glutamine (GLUT) is a conditionally essential amino acid, which is most consumed by MSCs, and present immunomodulatory capacity, this work investigated whether GLUT would have an effect on immunomodulatory aspects of MSCs in a PEM experimental model. For this purpose, BALB/c mice were used, which received isocaloric normoproteic or hypoproteic diets, containing respectively, 12% and 2% of protein for a period of 5 weeks. After isolation and characterization of MSCs from control (MSCct) and malnourished (MSCmaln) groups, these cells were cultured with 0, 0.6, 2 and GLUT 10mM in order to determine the influence of this amino acid on the expression of transcription factors and cytokine production by MSCct and MSCmaln. Besides that, the effect of MSCct and MSCmaln culture supernatants on proliferation and cytokine production by macrophages and splenic lymphocytes was evaluated. Malnourished animals presented anemia, leucopenia, marrow hypoplasia and decreased concentration of serum proteins, albumin and prealbumin. PEM did not change morphology and phenotype of MSCs or altered the expression of cell cycle regulatory proteins. On the other hand, the expression of NFkB and STAT-3 and the production of IL-1β, IL-6, IL-10 and TGF-β by MSCs were modified by PEM and varied according to the tested GLUT concentrations. An increase in GLUT concentration decreased NFkB expression and induced STAT-3 expression by MSCs obtained from both groups. Regarding the production of cytokines by these cells, an increase in GLUT concentration resulted in decreased IL-1β and IL-6 levels and increased IL- 10 and TGF-β levels. Changes in the concentration of this aminoacid did not alter IL- 17 or IFN-γ production by MSCct and MSCmaln. Furthermore, the concentration of GLUT changed, in direct proportion, the proliferation of MSCs. The conditioned media MSCct and MSCmaln decreased the proliferation of macrophages and splenic lymphocytes stimulated with LPS, induced an increase in the production of the antiinflammatory cytokine IL-10 by both cell types, and decreased the production of proinflammatory cytokines IL-12 and TNF-α by macrophages and IL-17 by lymphocytes. Therefore, it can be concluded that GLUT has an effect on the proliferation of MSCs and it has the capacity to immunomodulate these cells.

Protein malnutrition (PM) causes anemia and leukopenia by reduction of hematopoietic precursors and impaired production of mediators that induce hematopoiesis, as well as structural and ultrastructural changes in the bone marrow (BM) extracellular matrix. Hematopoiesis occurs in the bone marrow (BM) in distinct regions called niches, which modulate the processes of differentiation, proliferation and self-renewal of the hematopoietic stem cell (HSC). The perivascular niche, composed mainly by mesenchymal stem cells (MSC) and endothelial cells (EC), is the major modulator of HSC and its function extends to the migration of mature hematopoietic cells into the peripheral blood through the production of cytokines and growth factors. Thus, our hypothesis is that PM changes the perivascular niche and our objective is to evaluate whether PM affects the modulatory capacity of MSC and EC on hematopoiesis. C57BL/6 male mice were divided into Control and Malnourished groups, which received for 5 weeks, respectively, a normal protein diet (12% casein) and a low protein diet (2% casein). After this period, animals were euthanized, nutritional and hematological evaluations were performed, featuring the PM. We performed leukemic myelo-monoblasts cells transplantation and observed that these cells have a lower proliferation rate and are rather in the cell cycle G0/G1 phases in malnourished mice, indicating that the BM microenvironment is compromised in PM. MSC were isolated, characterized and differentiated in vitro into EC cells, which were evidenced by CD31 and CD144 markers. We performed the quantification of HSC and hematopoietic progenitors, as well as some regulators of proliferation and differentiation, ex vivo and after cultures with MSC or EC. We observed that PM reduces HSC and hematopoietic progenitors ex vivo. In PM, MSC promote increase in HSC and suppress hematopoietic differentiation, whereas ECs induce cell cycle arrest. Additionally, we verified that PM affects granulopoesis by decreasing the expression of G-CSFr in granule-monocytic progenitors. Thus, we conclude that PD compromises hematopoiesis due to intrinsic alterations in HSC, as well as alterations in the medullary perivascular niche. / A desnutrição proteica (DP) provoca anemia e leucopenia decorrente da redução de precursores hematopoéticos e comprometimento da produção de mediadores indutores da hematopoese. A hematopoese ocorre na medula óssea (MO) em regiões distintas chamadas de nichos, que modulam os processos de diferenciação, proliferação e auto renovação da célula tronco hematopoiética (CTH). O microambiente perivascular, composto principalmente por células tronco mesenquimais (CTM) e células endoteliais (CE), é o principal modulador das CTH e sua função se estende até a migração das células hematopoiéticas maduras para o sangue periférico, através da produção de citocinas e fatores de crescimento. Dessa forma, nossa hipótese é que a DP altera o microambiente perivascular e objetivamos avaliar se a DP afeta a capacidade modulatória das CTM e CE sobre a hematopoese. Utilizamos camundongos C57BL/6 machos, divididos em grupos Controle e Desnutrido, sendo que o grupo Controle recebeu ração normoproteica (12% caseína) e o grupo Desnutrido recebeu ração hipoproteica (2% caseína), ambos durante 5 semanas. Após este período, os animais foram eutanasiados, foi realizada a avaliação nutricional e hematológica, caracterizando a DP. Realizamos transplantes de mielomonoblastos leucêmicos e observamos que estas células apresentam menor taxa de proliferação e se encontram em maior quantidade nas fases G0/G1 do ciclo celular em camundongos desnutridos, indicando que o microambiente medular está comprometido. Isolamos CTM, que foram caracterizadas e diferenciadas in vitro em CE, o que foi evidenciado pelos marcadores CD31 e CD144. Quantificamos CTH e progenitores hematopoéticos, bem como reguladores de proliferação e diferenciação, ex vivo e após culturas com CTM ou CE. Observamos que a DP reduz CTH e progenitores hematopoéticos ex vivo. Na DP, as CTM promovem incremento de CTH e suprimem a diferenciação hematopoética, enquanto que as CE induzem parada no ciclo celular. Adicionalmente, observamos que a DP afeta a granulopoese por diminuição da expressão de G-CSFr nos progenitores grânulo-monocíticos. Dessa forma, concluímos que a DP compromete a hematopoese por alterações intrínsecas na CTH, como também por alterações ocasionadas no microambiente perivascular medular.

A terapia celular com células-tronco (CT) surgiu nos últimos anos como uma esperança para o tratamento de doenças, sem tratamento efetivo, como a osteoartrite (OA) em joelho. Nesse trabalho utilizamos células-tronco imaturas de polpa dentária humana (CTPD) cultivadas ou não em associação com biomateriais para o tratamento de lesões osteoarticulares em joelhos de ovinos. As CTPD humanas foram transduzidas com o gene repórter, EGFP, facilitando o monitoramento das mesmas in vitro e in vivo, após o implante na articulação femorotibiopatelar de ovinos. A capacidade de adesão e acomodação das células de polpa dentária no biomaterial foi observada in vitro 24 horas e um mês após sua aplicação no mesmo, sendo a viabilidade celular semelhante em ambos os períodos, porém com uma maior dispersão celular no período mais longo, segundo as análises realizadas por técnicas de microscopia eletrônica de varredura e histologia. Ainda para a realização das análises histológicas, foram realizadas técnicas para padronizar os métodos de descalcificação e inclusão do tecido ósseo-articular, prévio aos cortes. Exames radiográficos, ultrassonográficos e artroscópicos foram feitos para acompanhar a evolução dos tratamentos. Os resultados revelaram que as CTPD humanas aderem bem ao biomaterial e que em associação possuem uma excelente capacidade aparente de reconstituição do tecido lesado. Com a realização deste trabalho, concluímos que o protocolo de terapia utilizado é um bom modelo para o estudo de OA e serve para futuras aplicações clínicas. / Cell therapy with stem cells (CT) has emerged in recent years as a hope for the treatment of diseases without effective treatment, such as osteoarthritis (OA) in knee. In this work we use stem cells from immature human dental pulp (hSCIDP) in association or not with biomaterials for the treatment of osteoarticular lesions in sheep´s kneef. The human hSCIDP were transduced with the reporter gene EGFP, thus making easier monitoring these in vitro and in vivo after implantation in sheep´s femorotibiopatelar joint. The capacity of adhesion and accommodation of dental pulp cells in the biomaterial in vitro was observed 24 h and one month after its application, resulting in similar cell viability in both periods, but with a greater cell dispersion in the longer, period, according to analysis performed by scanning electron microscopy and histology. Moreover, some histological techiniques were performed to standardize the methods for inclusion and decalcification of bone tissue joints. Radiographic, ultrasonographic and arthroscopic analyses were made to monitor the progress of treatment. The results revealed that the human hSCIDP adhere well to the biomaterial and have an excellent apparent reconstitution of damaged tissue. With this work, we conclude that the therapy protocol used is a good model for studying OA and useful for future clinical applications.