O Transtorno Depressivo Maior (TDM) é uma condição neuropsiquiátrica que resulta em um substancial sofrimento pessoal, incapacidade e custos sociais. Devido à inacessibilidade ao encéfalo humano por questões práticas, éticas e às limitações encontradas pelo uso de modelos animais, o desenvolvimento de modelos in vitro acurados torna-se fundamental para o estudo desta doença. Neste aspecto, o surgimento da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) apresenta-se como uma importante ferramenta, uma vez que permite a recapitulação da diversidade genética dos pacientes e possibilita a produção de tipos celulares de interesse para o estudo da doença, como neurônios e glia. Entretanto, até o momento, não há registros da produção de modelos in vitro a partir de hiPSCs de pacientes com TDM. Visando preencher esta lacuna, o presente estudo teve por objetivo a produção e caracterização de dois tipos de modelos in vitro a partir de hiPSCs de pacientes com TDM: neurônios serotoninérgicos, uma cultura celular em monocamada, e organóides cerebrais, uma cultura celular em suspensão. 5 linhagens de hiPSCs de pacientes foram diferenciadas em neurônios com sucesso e no ensaio de imunocitoquímica, expressaram os marcadores 5-HT (serotonina), T5-HT (transportador de serotonina), nestina (presente em diferentes tipos de células neuronais) e Tuj1 (proteína do citoesqueleto, neurônio-específica), confirmando o fenótipo de neurônios serotoninérgicos. As céluas diferenciadas obtiveram também resultados positivos nos testes de imageamento de cálcio e de medidas da alteração no potencial de membrana, indicando que os neurônios diferenciados eram fisiologicamente funcionais. De 5 linhagens de hiPSCs (sendo uma controle e as outras 4 de pacientes com TDM), somente 1 linhagem sobreviveu ao processo de diferenciação, originando organóides cerebrais e apresentou expressão dos marcadores Sox2 (progenitoras neurais) e Tuj1 (neurônios maduros), indicando ainda uma estruturação correta da citoarquitetura, com as progenitoras localizadas mais internamente, na zona ventricular, ao redor dos lúmens preenchidos com líquido e com os neurônios maduros localizados na placa cortical, região mais externa dos agregados celulares. Apesar de o processo de produção dos organóides cerebrais necessitar de aperfeiçoamento e melhor padronização, a produção destes dois tipos de modelos in vitro, feitos a partir de hiPSCs de pacientes com TDM configura-se como um importante passo para a futura redução do uso de modelos animais em pesquisa, elucidação de mecanismos subjacentes à doença, identificação de biomarcadores diagnósticos e triagem de fármacos de maneira personalizada, visando permitir tratamentos mais baratos, adequados e eficientes para o TDM / Major Depressive Disorder (MDD) is a neuropsychiatric condition that results in substantial personal distress, disability, and social costs. The inaccessibility to the human brain due to practical and ethical issues and the limitations encountered by the use of animal models turn the development of accurate in vitro models into an essential factor to study this disease. In this regard, the emergence of human induced pluripotent stem cell technology (hiPSCs) is an important tool, since it allows the recapitulation of patient\'s genetic diversity and allows the production of cell types of interest for studying the disease, such as neurons and glia. However, to date, there are no records of the production of in vitro models from hiPSCs of patients with MDD. In order to fill this gap, the present study aimed at the production and characterization of two types of in vitro models from hiPSCs of patients with MDD: serotonergic neurons, a monolayer cell culture, and cerebral organoids, a suspension cell culture. 5 patients\' hiPSCs lines were successfully differentiated into neurons and, in the immunocytochemistry assay, they expressed the 5-HT (serotonin), T5-HT (serotonin transporter), nestin (present in several neuronal cell types) and Tuj1 (cytoskeleton protein, neuron-specific), confirming the phenotype of serotonergic neurons. Differentiated cells also obtained positive results in calcium imaging tests and measurements of membrane potential changes, indicating that differentiated neurons were physiologically functional. Of 5 hiPSCs lines (one control and the other 4 of patients with MDD), only 1 survived to the differentiation process, originating cerebral organoids which presented expression of Sox2 (neural progenitor) and Tuj1 (mature neurons) markers and a correct structuring of the cytoarchitecture, with the progenitors located more internally in the ventricular zone, around the lumens filled with liquid and with the mature neurons located in the cortical plate, the outermost region of the cellular aggregates. Although the cerebral organoids production process needs improvement and better standardization, the production of these two types of in vitro models, made from hiPSCs of patients with MDD, is an important step for the future reduction of animal models use, elucidation of disease underlying mechanisms, identification of diagnostic biomarkers and drug screening in a personalized manner, in order to allow cheaper, more adequate and more efficient treatments for MDD

A placenta é um anexo embrionário que tem atraído grande interesse como fonte de células-tronco para medicina regenerativa, devido à plasticidade fenotípica de alguns dentre os vários tipos celulares isolados a partir deste tecido. Apesar de terem a mesma origem, não fazem parte do embrião, portanto o uso da placenta como fonte de células embrionárias não provoca debates éticos. Uma característica que vale a pena mencionar, é que a placenta está envolvida na manutenção da tolerância do feto pelo organismo materno, pois contém células que apresentam propriedades imunomoduladoras. Por fim, o tecido placentário é disponibilizado após o parto e é geralmente descartado. Estas características tornam esse tecido de grande interesse para protocolos de terapia celular, tanto que tem surgido bancos de célulatronco de placenta humana. Alguns trabalhos demonstraram plasticidade de células extraídas da placenta, porém existe ainda a necessidade de se definir melhor a região de coleta e os métodos de extração e isolamento dessas células. Nosso grupo estabeleceu a cultura de células derivadas da região do trofoblasto extraviloso (TEV) de placenta humana a termo, que são as células responsáveis pelos mecanismos de imunotolerância materno-fetal. As células TEV apresentam os marcadores de pluripotencia Oct-4 e Nanog, e, portanto, podem reter mesmo extraídas da placenta a termo, alguma plasticidade celular, caracterizando-as como células-tronco. Entretanto, nossa experiência no cultivo destas células mostrou que existem limitações relacionadas ao tempo de cultivo celular e capacidade de proliferação das TEV, que certamente fornece argumentos sólidos para limitar o seu uso em protocolos de terapia celular em medicina regenerativa. / The placenta is attached embryo that has attracted great interest as a source of stem cells for regenerative medicine due to phenotypic plasticity of some of the various cell types isolated from this tissue. Despite having the same origin, they are not part of the embryo, so the use of placenta as a source of embryonic cells does not provoke ethical debates. A feature worth mentioning is that the placenta is involved in maintaining tolerance of the fetus by the mother, because it contains cells that have immunomodulatory properties. Finally, the placental tissue is present after birth and is usually discarded. These characteristics make this fabric of great interest for cell therapy protocols, which has emerged both banks of stem cells from human placenta. Some studies have demonstrated plasticity of cells extracted from the placenta, but there is still a need to better define the catchment area and the methods of extraction and isolation of these cells. Our group has established a culture of cells derived from the extravillous trophoblast region (TEV) from human placenta at term, which are the cells responsible for the mechanisms of maternalfetal immunotolerance. TEV cells have the pluripotency markers Oct-4 and Nanog, and therefore can retain, even extracted from the placenta at term, some cellular plasticity, characterizing them as stem cells. However, our experience in growing these cells showed that there are limitations related to the time of cell culture and proliferation capacity, which certainly provides strong arguments for limiting their use in cell therapy protocols in regenerative medicine.

As doenças cardiovasculares estão entre as principais causas de morte, principalmente aquelas decorrentes do infarto do miocárdio (IM). A terapia com células-tronco tem mostrado resultados promissores após o IM em estudos clínicos e experimentais, especialmente as células-tronco mesenquimais (MSC), por apresentarem notável potencial pró-angiogênico, anti-fibrosante e imunomodulador. Entretanto, nenhum estudo foi realizado quanto à variabilidade da frequência cardíaca (VFC), tono autonômico e sensibilidade do barorreflexo, que são considerados fatores de risco apreciáveis, e se encontram atenuados na insuficiência cardíaca (IC) induzida pelo IM. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi examinar o efeito do transplante de MSC de medula óssea sobre a modulação autonômica e a sensibilidade do barorreflexo em ratos com IC, induzida pelo IM. Para isso, foi realizada a ligadura da artéria coronária esquerda em ratos Wistar machos (220-360g), e após dois a três dias foi feita a avaliação da área infartada pelo SPECT. As MSCs foram injetadas, intravenosamente, sete dias pós-IM. A função cardíaca foi analisada pela ventriculografia, antes e um mês após o transplante. Após a reavaliação da ventriculografia, os animais foram submetidos a registros eletrocardiográficos, após receberem eletrodos implantados subcutaneamente no dorso, e cânula na veia jugular esquerda para determinação farmacológica do tono autonômico. Também, foi implantada cânula na artéria femoral para registro da pressão arterial, e análise da sensibilidade do barorreflexo. Logo após os registros, os animais foram sacrificados para coleta do coração e análise histopatológica. Para a infusão, as MSCs foram caracterizadas, segundo critérios da Sociedade Internacional de Terapia Celular. A área de lesão induzida logo após a ligadura da artéria foi semelhante entre os animais. Um mês após o tratamento, o tamanho do infarto foi reduzido no grupo tratado com MSC. Verificou-se redução da fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) após a ligadura coronariana, e previamente ao tratamento nos animais com IC. Um mês após a terapia com MSC, ou injeção de salina, não houve melhora da FEVE em ambos os grupos com IC. Os intervalos QT e QTc foram alongados pelo IM, enquanto as MSCs não tiveram efeito nestes parâmetros. A VFC mostrou redução do desvio padrão de valores sucessivos (SDNN) do intervalo RR (iRR) e a raiz quadrada da média da soma dos quadrados das diferenças de valores sucessivos (RMSSD) do iRR pós-IM, enquanto as MSCs preveniram essa redução. Na análise espectral, os espectros do iRR, após o infarto, mostraram potências menores, em unidades absolutas, das bandas de baixa frequência, LF, e alta frequência, HF, enquanto que as MSCs promoveram um aumento destes parâmetros. Os métodos não-lineares da VFC mostraram redução na entropia, e aumento da análise de flutuação depurada de tendência (DFA) do iRR pós-IM. A terapia com MSC preveniu a alteração da entropia e, também, protegeu o DFA. A frequência cardíaca foi semelhante entre os grupos; entretanto, a frequência intrínseca de marca-passo apresentou-se reduzida no grupo IC, enquanto o tratamento com MSC preservou esta atenuação. Foi observado menor tono vagal no grupo IC não tratado, enquanto o tratamento com MSC aumentou o tono vagal. O tono simpático não apresentou diferença entre os grupos. A sensibilidade do barorreflexo à bradicardia foi reduzida na IC, enquanto que as MSC preveniram essa redução. O colágeno intersticial apresentou-se aumentado na IC, mas não no grupo tratado com MSC. A pressão arterial (PA) sistólica, a PA média e os parâmetros da variabilidade da PA: SDNN e LF encontraram-se reduzidas nos grupos com IC, tratados ou não com MSC. Em conjunto, esses dados demonstram que a terapia com MSC reduziu a extensão do infarto e a fibrose intersticial no miocárdio remanescente do ventrículo esquerdo. Além disso, melhorou a modulação autonômica colinérgica do coração, a VFC e a sensibilidade barorreflexa. / Cardiovascular diseases are among the leading causes of death, especially those resulting from myocardial infarction (MI). Stem cell therapy has shown promising results after MI in both patients and experimental animals, especially those using mesenchymal stem cells (MSC), which present potential pro-angiogenic, anti-fibrotic and immunomodulatory. However, no studies have been conducted on the heart rate variability (HRV), autonomic tone and baroreflex sensitivity, which are considered risk factors and are attenuated in heart failure (HF) induced by MI. Thus, the main of this study was to examine the effect of bone marrow MSC transplantation on autonomic modulation and baroreflex sensitivity in rats with HF, induced by MI. Therefore, it was performed ligation of the left coronary artery of male Wistar rats (220-360g) and after two to three days, assessment was made of the area infarcted by SPECT. MSC were injected intravenously seven days post-MI. Cardiac function was assessed by ventriculography before and one month after transplantation. After reassessing the ventriculography, the animals underwent electrocardiographic recordings after receiving electrodes implanted subcutaneously on the back, and cannula in the left jugular vein for drug determination of autonomic tone. Also, cannula was implanted in the femoral artery for blood pressure recording and analysis of baroreflex sensitivity. Soon after the records, the animals were sacrificed for collection of the heart and histopathological analysis. For infusion, the MSC were characterized according to the criteria of the International Society for Cellular Therapy. The lesion area induced soon after artery ligation was similar among animals. One month after treatment, infarct size was reduced in the group treated with MSC. A reduction was observed in left ventricular ejection fraction (LVEF) after coronary ligation, and prior to treatment in HF animals. One month after the MSC therapy, or saline injection, there was no improvement in LVEF in both groups with HF. The QT and corrected QT intervals were lengthened by IM, while the MSC had no effect on these parameters. HRV showed a reduction in the standard deviation of successive values (SDNN) of the RR interval (RRi), and the root mean square of the successive (RMSSD) RRi after MI, while the MSC prevented this reduction. In spectral analysis, the RRi spectra, after infarction, showed lower power, in absolute units, of the low frequency, LF, and high frequency band, HF, while MSCs promoted an increase in these parameters. Nonlinear methods of HRV showed a reduction in entropy, and increased detrended fluctuation analysis (DFA) of RRi, post-MI. The MSC therapy prevented the change of entropy and also protected DFA. Heart rate was similar in both groups; however, the intrinsic heart rate was reduced in HF group, while treatment with MSC preserved this attenuation. A lower vagal tone was observed in HF untreated group, while treatment with MSC increased vagal tone. The sympathetic tone did not differ between groups. The baroreflex sensitivity to bradycardia was reduced in HF, while the MSC prevented this reduction. The interstitial collagen was increased in HF, but not in the group treated with MSC. Systolic blood pressure (BP), the mean BP and parameters of BP variability: SDNN and LF were reduced in the groups with HF, treated or not with MSC. Together, these data demonstrate that MSC therapy reduced the infarct size and interstitial fibrosis in the remaining myocardium of the left ventricle. In addition, the cells improved cholinergic autonomic modulation of the heart, heart rate variability and baroreflex sensitivity.

As proteína quinases C (PKC) pertencem à família das serina/treonina quinases, que vem sendo apontadas como importantes enzimas para os processos de proliferação e diferenciação das células tronco embrionárias (CTE), todavia, a função exata de cada isoforma dessa família ainda não está clara. Dados anteriores do nosso laboratório indicam que dentre as PKCs expressas em CTE, formas cataliticamente ativas da PKCβI são altamente expressas no núcleo das CTE murinas. Estas ao se diferenciarem expressam essa quinase no seu citoplasma ou deixam de expressar a mesma, e que a maioria dos alvos da PKCβI em CTE indiferenciada estão envolvidos em processos de regulação da transcrição de proteínas envolvidas em processos de proliferação/ diferenciação. Dando continuidade aos resultados anteriores do laboratório, no presente trabalho, com técnicas de proteômica e fosfoproteômica identificamos outros alvos nucleares da PKCβI em CTE indiferenciadas. Vimos que de fato inibindo-se a PKCβI diminuiu-se a fostorilação de fatores envolvidos com a indiferenciação das CTE. Dentre os alvos da PKCβI encontramos a proteína adaptadora, TIF1 que recruta proteínas remodeladoras de cromatina. Essa proteína é essencial para a manutenção do estado indiferenciado das CTE. In vitro a PKCβI foi capaz de fosforilar a TIF1β e inibindo-se a PKCβI por RNAi vimos uma diminuição na expressão da TIF1β e no fator de indiferenciação Nanog cuja expressão já foi demonstrada ser regulada pela TIF1β. Além disso vimos que inibindo-se a PKCβI com o peptídeo inibidor da PKCβI aumentou a expressão de proteínas reguladas pelo c-Myc. E que o RNAi para a PKCβI aumentou a expressão de proteínas que regulam a expressão do c-Myc. Não vimos nenhum efeito na fosforilação ou expressão do c-Myc após a inibição da PKCβI o que sugere que a PKCβI ative proteínas repressoras do c-Myc. Nossos estudos sugerem que a PKCβI regula a manutenção do estado indiferenciado das CTE regulando a expressão e atividade da Tif1β um possível alvo direto da PKCβI. Levando a modificações da cromatina e regulação da expressão de genes que mantém as CTE indiferenciadas. Outro ponto de regulação da PKCβI parece ser a nibição da atividade de c-Myc o que seria importante para a manutenção do estado indiferenciado visto que o c-Myc é um amplificador das vias de sinalização que mantém as células proliferando. Desta forma a PKCβI parece ter um papel central na regulação da expressão gênica de CTE à nível de modificações epigenéticas e a nível transcricional mantendo as CTE indiferenciadas. / The Protein kinase C (PKC) family of serine/treonine kinases, are being described as important enzymes for proliferation and diferentiation of embryonic stem cells (ESC), however, the exact function of the different isoenzymes of this family still is unclear. Previous data from our laboratory indicates that amongst the PKCs expressed in ESC, catalytically active forms of PKCβI are highly expressed in nucleus of murine ESC. When these cells differentiate this kinase can be found in the cytoplasm or not expressed at all, and that the majority of PKCβI targets in undifferentiated ESC are involved in the regulation of proteins involved in transcription of proteins involved in proliferation/ diferentiation. Continuing our previous work herewith using proteomics and phosphoproteomics techniques we identified other nuclear PKCβI targets in undifferentiated ESC. We indeed saw that inhibiting PKCβI decreased the phosphorylation of factors involved with maintainance of the undifferentiated state of ESC. Amongst the targets of PKCβI we found the adaptor protein, TIF1βI, that recruits cromatin remodeling proteins. This protein is essential for the maintenance of the undifferentiated state of ESC. In vitro PKCβI phosphorylated TIF1β and inhibiting PKCβI with RNAi decreased the expression of TIF1β and of the undifferentiation factor Nanog whose expression has been shown to be regulated by TIF1β. We also saw that inhibiting PKCβI with a peptide inhibitor increased the expression of proteins regulated by c-Myc, and that RNAi for PKCβI increased the expression of proteins that regulate the expression of c-Myc. We did not see any effect on the phosphorylation or expression of c-Myc after inhibition of PKCβI suggesting that PKCβI activates c-Myc repressor proteins. Our studies sugest that PKCβI regulates the maintenance of the undiferentiated state of ESC regulating the expression and activity of Tif1β a possibly a direct target of PKCβI, leading to chromatin modifications and regulation of genes that maintain ESC undiferentiated. Another form of regulation of PKCβI seems to be by inhibiting the activity of c-Myc which is importante to maintain ESC undifferentiated since c-Myc is na an amplifyer of signaling patheways that maintain ESC proliferating. Together PKCβI has a central role in the regulation of the gene expression of ESC at the level of epigenetic modifications and transcriptional regulation

O estudo das células-tronco cancerígenas (CTCs) durante o processo de malignização e no carcinoma epidermóide intra-bucal já instalado é essencial para um melhor entendimento de como essas células participam da formação e manutenção de uma neoplasia. Atualmente, a identificação de células com características de células tronco se dá principalmente através da expressão de marcadores celulares como o ALDH1 e o CD44. A proteína ALDH1 é responsável pela oxidação de aldeídos intracelulares e vem sendo utilizada para o isolamento de CTCs em inúmeros canceres incluindo casos de cabeça e pescoço. A proteína CD44 é uma glicoproteína envolvida na adesão e migração celular, também participa do processo de metástase e já foi associada às CTCs. Nesse trabalho, a expressão dessas proteínas foi analisada em 45 casos de displasias epiteliais e 13 casos de carcinomas epidermóide intra-bucais. As lesões displásicas foram classificadas em casos leves (19), moderados (18) e intensos (8) e foram também divididas em casos de baixo risco (22) e alto risco de transformação maligna (23). A expressão imunohistoquímica para a ALDH1 foi encontrada predominantemente na camada basal em 16 casos de displasias epiteliais e em 7 carcinomas epidermóides, com a marcação difusa pela epitélio neoplásico. A expressão imunohistoquímica de CD44 foi encontrada em 42 displasias epiteliais e em 12 carcinomas epidermóides, sendo que nas displasias, a expressão ocorreu predominantemente na camada basal do epitélio e no carcinoma epidermóide a expressão foi disseminada. Ambos marcadores exibiram aumento de expressão com a evolução do grau das displasias. / The study of cancer stem cells (CTCs) in the process of malignant transformation and intra-oral squamous cell carcinoma already installed is essential for a better understanding of how these cells participate in the formation and maintenance of a neoplasm. Currently, identification of cells with characteristics of stem cells is primarily through the expression of cell markers such as CD44 and ALDH1. The ALDH1 protein is responsible for the oxidation of intracellular aldehydes and has been used for the isolation of CTCs in numerous cancers including head and neck cases. The CD44 protein is a glycoprotein involved in cell adhesion and migration, also participates in the process of metastasis and has been associated with CTCs. In this work, the expression of these proteins was analyzed in 45 cases of epithelial dysplasia and 13 cases of intraoral squamous cell carcinomas. The dysplastic lesions were classified as mild (19), moderate (18) and intense (8) cases and were also divided into low-risk cases (22) and high risk of malignant transformation (23). The immunohistochemical expression for ALDH1 was found predominantly in the basal layer in 16 cases of epithelial dysplasia and squamous cell carcinoma in 7, with diffuse labeling by neoplastic epithelium. Immunohistochemical expression of CD44 was found in 42 epithelial dysplasias and 12 squamous cell carcinomas, and in dysplasias, the expression occurred predominantly in the basal layer of the epithelium and in squamous cell carcinoma expression was widespread. Both markers showed increased expression with the evolution of the degree of dysplasia.

A hipótese das células-tronco tumorais vem ganhando destaque como um dos principais modelos para explicar a formação de neoplasias malignas. CD44, ALDH1 e p75NTR são alguns dos marcadores usados com êxito para separar a subpopulação de células-tronco tumorais, mas sua expressão imuno-histoquímica nunca foi estudada em lesões de lábio causadas pela radiação ultravioleta (UV). O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão de CD44, ALDH1 e p75NTR em lábio normal (LN), queilite actínica (QA) e carcinoma epidermoide de lábio (CEL), além de estudar a expressão de p53 e correlacioná-la com a expressão dos marcadores de células-tronco tumorais. Para isso, foram selecionados blocos de material parafinado provenientes do serviço de patologia oral, resultando em 4 casos de LN, 43 casos de QA, subdivididos de acordo com o grau de displasia, e 20 casos de CEL. Os casos foram submetidos à reação imuno-histoquímica. Todos os casos foram positivos para CD44, com expressão membranosa e padrão de marcação praticamente invariável entre os grupos de QA e CEL (p=0,09). Os casos de LN foram negativos para o ALDH1; 51,1% e 55,5 % dos casos de QA e CEL, respectivamente, forma positivas para o ALDH1. A marcação era citoplasmática, geralmente em poucas células. Não houve diferença na expressão de ALDH1 entre os graus de displasia epitelial (p=0,37) e quando CEL era comparado à QA (p=0,9). Todos os casos de LN foram positivos para p75NTR; 95,3% e 80% dos casos de QA e CEL foram positivos para p75NTR. A expressão era membranosa/citoplasmática em LN e QA, em camada basal e parabasal, e citoplasmática em CEL, na região periféricas das ilhas. Houve diferença na expressão de p75NTR entre os grupos de displasia epitelial (p<0,001), mas não entre QA e CEL (p=0,4). Todos os casos de LN e QA foram positivos para p53; 80% dos casos de CEL foram positivos. A expressão foi nuclear apenas, mas não houve diferença na expressão de p53 entre os graus de displasia epitelial (p=0,33) e entre QA e CEL (0,24). Não houve correlação significativa entre CD44, ALDH1 e p75NTR, quando avaliados entre si, e não houve correlação entre p53 e os marcadores de células-tronco tumorais. Os marcadores de células-tronco tumorais estão presentes em lesões potencialmente malignas e malignas de lábio, porém suas expressões não variaram entre QA e CEL. A expressão de p75NTR variou entre os graus de displasia epitelial. / Cancer stem cell hypothesis is becoming one of the main models to explain the generation of malignant neoplasms. CD44, ALDH1 and p75NTR are some of the markers successfully used to sort the subpopulation of cancer stem cells. However, their immunohistochemical expression were not studied in lip lesions caused by ultraviolet radiation (UV) so far. The aim of this study was to evaluate CD44, ALDH1 and p75NTR expression in normal lip (NL), actinic cheilitis (AC) and lip squamous cell carcinoma (LSSC). We also evaluated p53 expression and its correlation with the expression of the stem cell markers. In order to do that, paraffin-embbeded cases were selected from the oral pathology service, giving a total of 4 cases of NL, 43 cases of AC and 20 cases of LSCC. Immunohistochemical staining was performed in all the sample. All cases were positive for CD44, showing a membranous staining and a pattern of expression almost invariable between the groups AC and LSSC (p=0,09). All cases of NL were negative for ALDH1; 51,1% of AC and 55,5% of LSCC were positive. It was observed cytoplasmic staining, usually in a few cells. The ALDH1 expression showed no difference between the grades of epithelial dysplasia (p=0,37) and between AC and LSCC (p=0,9). All cases of NL were positive for p75NTR; 95,3% of AC and 80% of LSCC were positive for p75NTR. We observed membranous/cytoplasmic staining in NL and AC in the basal and parabasal layer and cytoplasmic staining in LSCC in the peripheral layers of the tumor islands. P75NTR showed difference in the expression among the grades of epithelial dysplasia (p<0,001) but showed no difference between the groups AC and LSCC (p=0,4). All cases of NL and AC were positive for p53; 80% of LSCC were positive for p53. The protein showed nuclear expression with no difference among the grades of epithelial dysplasia (p=0,33) and between AC and LSCC (0,24). There was no significant correlation among CD44, ALDH1 and p75NTR was observed and no significant correlation between p53 expression and the stem cell markers. The stem cell markers are present in potentially malignant and malignant lesions of the lip, but their expression show no variation between AC and LSCC. The expression of p75NTR varied between the grades of epithelial dysplasia.

Algumas das estratégias utilizadas para entender a biologia de células tronco embrionária (CTE) são baseadas na identificação de cascatas de sinalização que induzem a diferenciação e auto-renovação das CTE através da interferência seletiva de processos específicos. A família das proteínas quinase C (PKC) é conhecida por participar dos processos de auto-renovação e diferenciação celular em CTE, entretanto, o papel específico das diferentes isoenzimas das PKCs ainda precisa ser elucidado. Desta forma investigamos. o papel das PKCs atípicas (aPKCs) em CTE indiferenciadas utilizando um inibidor específico para estas serina/ treonina quinases, o peptídeo pseudossubstrato das aPKCs, e fosfoproteômica. A maioria das proteinas identificadas cuja fosforilação reduziu após o tratamento com o inibidor das aPKC, são proteínas envolvidas com o metabolismo principalmente com a via glicolítica. Além disso, a inibição das aPKCs levou a redução do consumo de glicose, secreção de lactato, acompanhada da redução da atividade da lactato desidrogenase, e aumento da fosforilação oxidativa, sendo analisada através do consumo de oxigênio após o tratamento com oligomicina e FCCP. Verificamos também que as aPKCs são capazes de fosforilar diretamente a piruvato quinase. A glicólise aeróbica parece ser fundamental para a manutenção da indiferenciação das CTE, e demonstramos que as aPKCs participam deste processo auxiliando na auto-renovação das CTE indiferenciadas. Também observamos que as aPKCs assim como a PKC&#946;I modulam a fosforilação da &#945;-tubulina, porém ao passo que as aPKCs interagem com a &#945;-tubulina durante a interfase, a PKC&#946;I interage com a mesma apenas durate a mitose. Estes resultados motivaram a segunda parte da tese, na qual o papel da fosforilação da &#945;-tubulina pela PKC&#946;I foi investigado. O resíduo de treonina 253, conservado em diversas espécies de vertebrados e localizado na interface de polimerização entre a &#945;- e a &#946;-tubulina foi identificado, como um novo sítio de fosforilação da &#945;-tubulina pela PKC&#946;I. Este sítio não está em um consenso linear para a PKC, entretanto é um consenso formado estruturalmente, onde aminoácidos básicos distantes na sequência linear se tornam justapostos na estrutura terciária da proteína. Estudos de simulação por dinâmica molecular demonstraram que a interação entre a &#945; e &#946;-tubulina aumenta após esta fosforilação, uma vez que T253 fosforilada passa a interagir com K105, um residuo conservado na &#946;-tubulina. A fosforilação in vitro de &#945;-tubulina aumenta a taxa de polimerização da tubulina e a inibição da PKC&#946;I em células reduziu a taxa de repolimerização do microtubulo após o tratamento com nocodazol. Além disso, a importância da fosforilação deste sítio foi demonstrada pelo fato de que um mutante fosfomimético GFP-&#945;-tubulina, T253E ser mais incorporado no fuso mitótico ao passo que T253A foi menos incorporado do que a proteína selvagem. Nossos dados suportam a hipótese que os consensos estruturais formados podem ser importantes sítios de reconhecimento pelas quinases e que a fosforilação de T253 da &#945;-tubulina afeta a estabilidade do polímero. Em conclusão, utilizando métodos de fosfoproteômica e interferência seletiva de vias de sinalização, combinados a validações experimentais dos alvos identificados podemos propor a importância funcional das aPKCs e PKC&#946;I em CTE indiferenciadas. / Some of the strategies used to understand stem cell biology are based on the identification of signalling cascades that lead to differentiation and self-renewal of embryonic stem cells (ESC) by selective interference of specific signalling processes. The protein kinase C (PKC) family is known to participate in ESC self-renewal and differentiation, however, the specific role of the different PKC isoenzymes in these cells remains to be determined. Therefore, we investigated the role of atypical PKCs (aPKC) in undifferntiated ESC using a specific inhibitor for these serine/ threonine kinases, pseudo-substrate peptide of aPKCs, and phosphoproteomics. The majority of proteins whose phosphorylation decreased upon aPKC inhibition, are proteins involved in metabolism in particular with the glycolytic pathway. Besides that, inhibiton of aPKCs led to a decrease in glucose uptake and lactate secretion, followed by a decrease in lactate dehydrogenase activity, and an increase in mitochondrial activity as measured by oxygen consumption after treatment with olygomycin and a chemical uncoupler. We also verified that aPKCs are able to directly phosphorylated pyruvate kinase. Aerobic glicolysis seems to be fundamental for the maintainance of undifferentiated ESC, and we demonstrated that aPKCs participte in these processes helping to maintain self-renewal of undifferentiated ESC. We also observed that aPKCs as PKC&#946;I modulate the phosphorylation of &#945;-tubulin, however, while aPKCs interact with &#945;-tubulin during interfase PKC&#946;I interacts with &#945;-tubulin only during mitosis. These results lead to the second part of this thesis. We investigated the role of &#945;-tubulina phosphorylation by PKC&#946;I. Indentifying threonine 253, a conserved residue in several vertebrate species, of localized at the polymerization interface between &#945;- and &#946;-tubulin, as a phosphorylation site of &#945;-tubulin by PKC&#946;I. This site is not in a linear consensus for PKC, however, it is in a structuraly formed consensus, where basic aminoacids distant in the linear sequence are juxtaposed in the three dimentional protein structure. Simulation studies by molecular dynamics show that the interaction between &#945; and &#946;-tubulin increases upon this phosphorylation, once, phosphorylated T253 interacts with com K105, a conserved residue in &#946;-tubulin. The in vitro phosphorylation of &#945;-tubulin increased tubulin polymerization rate and inhibiton of PKC&#946;I in cells reduced repolimeration rate of microtubles upon treatment with nocodazole. Besides that, the importance of this phosphorylation site were demonstrated by the fact that a phosphomimetic mutant GFP-&#945;-tubulina, T253E is more incorporated in mitotic fuses while T253A is less than wild type. Our data support the hypothesis that structural consensus may be important sites recognized and that T253 phosphorylation of &#945;-tubulin afects the polymer stability. In conclusion, using phosphoproteomics methods and selective interference of signal transduction pathways combined with experimental validation studies of the identified targets we can propose roles for aPKCs and PKC&#946;I in undifferentiated ESC.

O estudo das células-tronco cancerígenas (CTCs) durante o processo de malignização e no carcinoma epidermóide intra-bucal já instalado é essencial para um melhor entendimento de como essas células participam da formação e manutenção de uma neoplasia. Atualmente, a identificação de células com características de células tronco se dá principalmente através da expressão de marcadores celulares como o ALDH1 e o CD44. A proteína ALDH1 é responsável pela oxidação de aldeídos intracelulares e vem sendo utilizada para o isolamento de CTCs em inúmeros canceres incluindo casos de cabeça e pescoço. A proteína CD44 é uma glicoproteína envolvida na adesão e migração celular, também participa do processo de metástase e já foi associada às CTCs. Nesse trabalho, a expressão dessas proteínas foi analisada em 45 casos de displasias epiteliais e 13 casos de carcinomas epidermóide intra-bucais. As lesões displásicas foram classificadas em casos leves (19), moderados (18) e intensos (8) e foram também divididas em casos de baixo risco (22) e alto risco de transformação maligna (23). A expressão imunohistoquímica para a ALDH1 foi encontrada predominantemente na camada basal em 16 casos de displasias epiteliais e em 7 carcinomas epidermóides, com a marcação difusa pela epitélio neoplásico. A expressão imunohistoquímica de CD44 foi encontrada em 42 displasias epiteliais e em 12 carcinomas epidermóides, sendo que nas displasias, a expressão ocorreu predominantemente na camada basal do epitélio e no carcinoma epidermóide a expressão foi disseminada. Ambos marcadores exibiram aumento de expressão com a evolução do grau das displasias. / The study of cancer stem cells (CTCs) in the process of malignant transformation and intra-oral squamous cell carcinoma already installed is essential for a better understanding of how these cells participate in the formation and maintenance of a neoplasm. Currently, identification of cells with characteristics of stem cells is primarily through the expression of cell markers such as CD44 and ALDH1. The ALDH1 protein is responsible for the oxidation of intracellular aldehydes and has been used for the isolation of CTCs in numerous cancers including head and neck cases. The CD44 protein is a glycoprotein involved in cell adhesion and migration, also participates in the process of metastasis and has been associated with CTCs. In this work, the expression of these proteins was analyzed in 45 cases of epithelial dysplasia and 13 cases of intraoral squamous cell carcinomas. The dysplastic lesions were classified as mild (19), moderate (18) and intense (8) cases and were also divided into low-risk cases (22) and high risk of malignant transformation (23). The immunohistochemical expression for ALDH1 was found predominantly in the basal layer in 16 cases of epithelial dysplasia and squamous cell carcinoma in 7, with diffuse labeling by neoplastic epithelium. Immunohistochemical expression of CD44 was found in 42 epithelial dysplasias and 12 squamous cell carcinomas, and in dysplasias, the expression occurred predominantly in the basal layer of the epithelium and in squamous cell carcinoma expression was widespread. Both markers showed increased expression with the evolution of the degree of dysplasia.

A hipótese das células-tronco tumorais vem ganhando destaque como um dos principais modelos para explicar a formação de neoplasias malignas. CD44, ALDH1 e p75NTR são alguns dos marcadores usados com êxito para separar a subpopulação de células-tronco tumorais, mas sua expressão imuno-histoquímica nunca foi estudada em lesões de lábio causadas pela radiação ultravioleta (UV). O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão de CD44, ALDH1 e p75NTR em lábio normal (LN), queilite actínica (QA) e carcinoma epidermoide de lábio (CEL), além de estudar a expressão de p53 e correlacioná-la com a expressão dos marcadores de células-tronco tumorais. Para isso, foram selecionados blocos de material parafinado provenientes do serviço de patologia oral, resultando em 4 casos de LN, 43 casos de QA, subdivididos de acordo com o grau de displasia, e 20 casos de CEL. Os casos foram submetidos à reação imuno-histoquímica. Todos os casos foram positivos para CD44, com expressão membranosa e padrão de marcação praticamente invariável entre os grupos de QA e CEL (p=0,09). Os casos de LN foram negativos para o ALDH1; 51,1% e 55,5 % dos casos de QA e CEL, respectivamente, forma positivas para o ALDH1. A marcação era citoplasmática, geralmente em poucas células. Não houve diferença na expressão de ALDH1 entre os graus de displasia epitelial (p=0,37) e quando CEL era comparado à QA (p=0,9). Todos os casos de LN foram positivos para p75NTR; 95,3% e 80% dos casos de QA e CEL foram positivos para p75NTR. A expressão era membranosa/citoplasmática em LN e QA, em camada basal e parabasal, e citoplasmática em CEL, na região periféricas das ilhas. Houve diferença na expressão de p75NTR entre os grupos de displasia epitelial (p<0,001), mas não entre QA e CEL (p=0,4). Todos os casos de LN e QA foram positivos para p53; 80% dos casos de CEL foram positivos. A expressão foi nuclear apenas, mas não houve diferença na expressão de p53 entre os graus de displasia epitelial (p=0,33) e entre QA e CEL (0,24). Não houve correlação significativa entre CD44, ALDH1 e p75NTR, quando avaliados entre si, e não houve correlação entre p53 e os marcadores de células-tronco tumorais. Os marcadores de células-tronco tumorais estão presentes em lesões potencialmente malignas e malignas de lábio, porém suas expressões não variaram entre QA e CEL. A expressão de p75NTR variou entre os graus de displasia epitelial. / Cancer stem cell hypothesis is becoming one of the main models to explain the generation of malignant neoplasms. CD44, ALDH1 and p75NTR are some of the markers successfully used to sort the subpopulation of cancer stem cells. However, their immunohistochemical expression were not studied in lip lesions caused by ultraviolet radiation (UV) so far. The aim of this study was to evaluate CD44, ALDH1 and p75NTR expression in normal lip (NL), actinic cheilitis (AC) and lip squamous cell carcinoma (LSSC). We also evaluated p53 expression and its correlation with the expression of the stem cell markers. In order to do that, paraffin-embbeded cases were selected from the oral pathology service, giving a total of 4 cases of NL, 43 cases of AC and 20 cases of LSCC. Immunohistochemical staining was performed in all the sample. All cases were positive for CD44, showing a membranous staining and a pattern of expression almost invariable between the groups AC and LSSC (p=0,09). All cases of NL were negative for ALDH1; 51,1% of AC and 55,5% of LSCC were positive. It was observed cytoplasmic staining, usually in a few cells. The ALDH1 expression showed no difference between the grades of epithelial dysplasia (p=0,37) and between AC and LSCC (p=0,9). All cases of NL were positive for p75NTR; 95,3% of AC and 80% of LSCC were positive for p75NTR. We observed membranous/cytoplasmic staining in NL and AC in the basal and parabasal layer and cytoplasmic staining in LSCC in the peripheral layers of the tumor islands. P75NTR showed difference in the expression among the grades of epithelial dysplasia (p<0,001) but showed no difference between the groups AC and LSCC (p=0,4). All cases of NL and AC were positive for p53; 80% of LSCC were positive for p53. The protein showed nuclear expression with no difference among the grades of epithelial dysplasia (p=0,33) and between AC and LSCC (0,24). There was no significant correlation among CD44, ALDH1 and p75NTR was observed and no significant correlation between p53 expression and the stem cell markers. The stem cell markers are present in potentially malignant and malignant lesions of the lip, but their expression show no variation between AC and LSCC. The expression of p75NTR varied between the grades of epithelial dysplasia.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-08-29T20:39:47Z No. of bitstreams: 1 Siane Campos. Avaliação dos efeitos de terapias com celulas de medula óssea modelo experimental de diabetes mellitus tipo 2.pdf: 7027812 bytes, checksum: 4b12aa1315741fb327aacac8f55889a7 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-29T20:39:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Siane Campos. Avaliação dos efeitos de terapias com celulas de medula óssea modelo experimental de diabetes mellitus tipo 2.pdf: 7027812 bytes, checksum: 4b12aa1315741fb327aacac8f55889a7 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / O diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é uma disfunção metabólica que afeta milhões de pessoas em números crescentes em todo o mundo. É caracterizado pela resistência dos tecidosalvo à insulina e/ou defeitos na sua secreção, acarretando uma hiperglicemia crônica, que pode gerar danos no sistema cardiovascular, nervoso, olhos, rins e fígado e representam um ônus para os sistemas de saúde. Doença de etiologia múltipla, o DM2 resulta da interação entre predisposição genética e fatores ambientais, destacando-se a obesidade. O tratamento do DM2 geralmente envolve mudanças de hábito e drogas anti-hiperglicemiantes ou hipoglicemiantes que podem acarretar efeitos colaterais. As recentes descobertas sobre a plasticidade e o potencial terapêutico das células-tronco de medula óssea indicam uma possível aplicação destas no tratamento do DM2 e suas complicações. Para investigar esse potencial, foi estabelecido um modelo de diabetes em camundongos C57Bl/6 através da administração de dieta hipergordurosa. Após o período de indução, os animais apresentavam obesidade, hiperglicemia, intolerância à glicose, proteinúria e esteato-hepatite não-alcoólica. Camundongos C57Bl/6 fêmeas não desenvolvem obesidade, hiperglicemia e DM2 quando submetidas à mesma dieta que os machos. Apenas os machos foram então tratados com células mononucleares de medula óssea e acompanhados durante seis meses. A terapia com células mononucleares de medula óssea não reduz o peso corpóreo dos animais obesos e diabéticos. Três e seis meses após a terapia, não foi observada redução da glicemia de jejum dos animais.Três meses após a terapia, observou-se redução da intolerância a glicose nos animais alimentados com dieta high-fat.Houve uma redução da fibrose perissinusoidal no fígado após 3 meses de terapia e esta diferença se manteve até 6 meses após a terapia. / Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a metabolic disorder that affects millions of people and grows worldwide. It is characterized by insulin resistance in peripheral tissues and/or impaired insulin secretion, leading to chronic hyperglycemia associated with long-term consequences that include damage and dysfunction of the cardiovascular system, eyes, kidneys and nerves. T2DM is a multifactorial disease determined by genetic and environmental factors, especially obesity. The usual treatment involves antihyperglycemic and hypoglycemic drugs that can provoke undesirable side effects. Recent findings on hematopoietic stem cell plasticity and therapeutic potential suggest their use as an alternative treatment for T2DM and its consequences. In order to investigate this potential, a model of diabetes was induced in C57Bl/6 mice through administration of a high-fat diet. Animals developed obesity, hyperglycemia, glucose intolerance, proteinuria and nonalcoholic steato-hepatitis. Female C57Bl/6 mice do not developed obesity, hyperglycemia and T2DM when submitted the male’s diet. After the induction period, only the male mice were treated with bone marrow mononuclear cells and observed during 6 months. Cell mononuclear from bone marrow therapy do not reduced body weight from obesity and diabetes animals. Three and six months after the therapy, we do not observed reduction from glycemia. Three months after the therapy, observed reduction glucose intolerance in mice high-fat fed. Reduction in fibrosis perisinusoidal liver after thee months from therapy and this difference still until six months after therapy.