O nicho endosteal da medula óssea abriga as células-tronco hemopoéticas (CTH) em quiescência/autorrenovação. As CTH podem ser classificadas em dois grupos: células que reconstituem a hemopoese em longo prazo (LT-CTH) e curto prazo (CT-CTH). Investigamos, neste trabalho, os efeitos da desnutrição proteica (DP) no tecido ósseo e a participação do nicho endosteal na sinalização osteoblasto-CTH. Para tanto, utilizamos camundongos submetidos à DP induzida pelo consumo de ração hipoproteica. Os animais desnutridos apresentaram pancitopenia e diminuição nas concentrações de proteínas séricas e albumina. Quantificamos as CTH por citometria de fluxo e verificamos que os desnutridos apresentaram menor porcentagem de LT-CTH, CT-CTH e de progenitores multipotentes (PMP). Avaliamos a expressão das proteínas CD44, CXCR4, Tie-2 e Notch-1 nas LT-CTH. Observamos diminuição da expressão da proteína CD44 nos desnutridos. Isolamos as células LT-CTH por cell sorting e avaliamos a expressão gênica de CD44, CXCR4 e NOTCH-1. Verificamos que os desnutridos apresentaram menor expressão de CD44. Em relação ao ciclo celular, verificamos maior quantidade de LT-CTH nas fases G0/G1. Caracterizamos as alterações do tecido ósseo femoral, in vivo. Observamos diminuição da densidade mineral óssea e da densidade medular nos desnutridos. A desnutrição acarretou diminuição da área média das seções transversais, do perímetro do periósteo e do endósteo na cortical do fêmur dos animais. E na região trabecular, verificou-se diminuição da razão entre volume ósseo e volume da amostra e do número de trabéculas, aumento da distância entre as trabéculas e prevalência de trabéculas ósseas em formato cilíndrico. Avaliamos a expressão de colágeno, osteonectina (ON) e osteocalcina (OC) por imuno-histoquímica, e de osteopontina (OPN) por imunofluorescência no fêmur e verificamos diminuição da marcação para OPN, colágeno tipo I, OC e ON nos desnutridos. Evidenciamos, pela técnica do Picrosírius, desorganização na distribuição das fibras colágenas e presença de fibras tipo III nos fêmures dos desnutridos, além de maior número de osteoclastos evidenciados pela reação da fosfatase ácida tartarato resistente. Os osteoblastos da região femoral foram isolados por depleção imunomagnética, imunofenotipados por citometria de fluxo e cultivados em meio de indução osteogênica. Observamos menor positividade para fosfatase alcalina e vermelho de alizarina nas culturas dos osteoblastos dos desnutridos. Avaliamos, por Western Blotting, a expressão de colágeno tipo I, OPN, osterix, Runx2, RANKL e osteoprotegerina (OPG), e, por PCR em tempo real, a expressão de COL1A2, SP7, CXCL12, ANGPT1, SPP1, JAG2 e CDH2 nos osteoblastos isolados. Verificamos que a desnutrição acarretou diminuição da expressão proteica de osterix e OPG e menor expressão gênica de ANGPT1. Avaliamos a proliferação das células LSK (Lin-Sca1+c-Kit+) utilizando ensaio de CFSE (carboxifluoresceína succinimidil ester). Foi realizada cocultura de células LSK e osteoblastos (MC3T3-E1) na presença e ausência de anti-CD44. Após uma semana, verificamos menor proliferação das LSK dos desnutridos. O bloqueio de CD44 das LSK do grupo controle diminuiu a proliferação destas em três gerações. Entretanto, nos desnutridos, esse bloqueio não afetou a proliferação. Concluímos que a DP promoveu alterações no tecido ósseo e nas CTH. Entretanto, não podemos afirmar que as alterações observadas no sistema hemopoético foram decorrentes de alterações exclusivas do nicho endosteal. / The bone marrow endosteal niche hosts hematopoietic stem cells (HSC) in quiescence/self-renewal. HSC can be classified into two groups: cells capable of renewing indefinitely (LT-HSC) or repopulating in the short term (ST-HSC). In this work, we investigated the effects of protein malnutrition (PM) on bone tissue and the involvement of the endosteal niche in osteoblast-CTH signaling. Therefore, we used mice subjected to PM induced by the consumption of hypoproteic feed. Malnourished animals presented pancytopenia and decreased concentration of serum protein and albumin. We quantified the HSC by flow cytometry and found that the malnourished ones had lower percentage of LT-HSC, ST-HSC and multipotent progenitors (MPP). We assessed the expression of the CD44, CXCR4, Tie-2 and Notch-1 proteins in LT-HSC. We observed decreased expression of CD44 protein with the malnourished ones. We isolated the LT-HSC cells by means of cell sorting and assessed the gene expression of CD44, CXCR4 and NOTCH-1. We found that malnutrition had lower expression of CD44. Regarding the cell cycle, we see greater amount of LT-HSC in the G0 and G1 phases. We characterized the changes of the femoral bone tissue in vivo. We observed a decrease in the bone mineral density and medullar density in malnourished animals. As for malnourished animals, the femoral cortical region showed a significant decrease in tissue area, periosteal and endosteal perimeter. The femoral trabecular region of malnourished animals showed decreased bone volume/tissue volume ratio, decreased trabecular number, increased trabecular separation and prevalence of rod-like trabeculae. We investigated the expression of collagen, osteonectin (ON) and osteocalcin (OC) by means of immunohistochemistry and the expression of osteopontin (OPN) by immunofluorescence and we found that malnourished animals showed decreased labeling for OPN, type I collagen, OC and ON in the cortical region of the femur. Picrosirius staining was used to analyze disorganization of collagen fibers and presence of type III fibers in the femurs of the malnourished. Cortical and trabecular regions of malnourished animals presented a higher number of osteoclasts as shown by tartrate-resistant acid phosphatase reaction. Moreover, osteoblasts were isolated from the femoral region by immunomagnetic depletion and immunophenotyped by flow cytometry and cultured in osteogenic induction medium. Results proved less positive for alkaline phosphatase and alizarin red in the cultures of osteoblasts of malnourished animals. We assessed, by means of Western blotting, type I collagen expression, OPN, osterix, Runx2, RANKL and osteoprotegerin (OPG) and, by real time PCR, the expression of COL1A2, SP7, CXCL12, ANGPT1, SPP1, JAG2 and CDH2 with the isolated osteoblasts. We found that malnutrition led to osterix and OPG decreased protein expression and lower ANGPT1 gene expression. We evaluated LSK cell (Lin-Sca1+c-Kit+) proliferation by CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester). LSK cells and osteoblasts (MC3T3-E1) cocultures were performed in the presence and absence of anti-CD44. After a week, we found lower proliferation of LSK in the malnourished. The LSK CD44 blocking in the control group decreased the proliferation of these three generations. However, as for the malnourished, such blockage did not affect proliferation. We concluded that the PM has promoted changes in bone tissue and the CTH. However, we can\'t claim that the alterations observed in hematopoietic system were due to endosteal niche-only changes.

INTRODUCTION: Breast cancer is the most common cancer in women worldwide and metastatic dissemination is the principal factor related to death by this disease. Breast cancer stem cells (bCSC), defined in this work as the ALDH1high/LIN-/ESA+ population, are thought to be responsible for metastasis and chemoresistance. The objective of this work is to find gene master regulators, in particular transcription factors (TFs), which are controlling the bCSC phenotype. METHODS: We used in this work two groups of datasets with transcriptome data, the discovery dataset group contains one dataset obtained by ourselves containing three paired samples comparing the bCSC and the bulk of the tumor (My Data - bCSC/Bulk dataset), a dataset with eight paired samples comparing the bCSC and cancer cells (Wicha - bCSC/CC dataset) and a dataset with 115 samples of breast cancer tissue (clinical response dataset). The second group, validation datasets, contains the BRCA-TCGA dataset with information of 621 samples, 4142 breast cancer samples of the Kmplot tool, 17 primary samples of BasL subtype and their information of grafting in patient derived xenografts and analyzes of cell lines (MF10A and HMLE). For the analyzes we used the paired t-test in the Limma R package, the ARACNE algorithm for the inference of regulons in the clinical response dataset, MRA-FET to define the master regulators of the bCSC phenotype, and GSEA to identify the biological meaning of the findings in the different datasets. RESULTS: We identified 12 TFs as master regulators of the bCSC phenotype, with nine of them forming two highly interconnected networks, one positively related with the bCSC phenotype formed by SNAI2, TWIST, PRRX1, BNC2 and TBX5 with its regulons, defined here as the mesenchymal transcription network and one negative correlated to the phenotype formed by SCML4, ZNF831, SP140 and IKZF3, defined as the immune response transcription network, totally unknown in the context of breast cancer in the literature. Although still with weak evidence, ZEB1 seems to control the two networks and can be responsible for the expression of ALDH1 and of the three remaining TFs: ID4, HOXA5 and TEAD1. As their names portray, our data showed in the different datasets, and independently of the molecular subtype and of the platform used, that the mesenchymal transcription network seems to be responsible for the bCSC phenotype and the immune response transcription network to the adaptive immune response in the tumor and a better prognosis for the patients. We also defined 10 membrane proteins as new markers and/or therapeutic targets of the bCSC. CONCLUSION: We found and described two TF networks that seem to control the bCSC phenotype, one of them totally unknown until now and correlated to a good prognosis. Our findings have a clear potential for clinical use. / INTRODUÇÃO: O cancer de mama é no mundo o câncer mais comum em mulheres e a disseminação metastática é o principal fator relacionado com a morte pela doença. Acreditasse que as células tronco do câncer de mama - bCSC, na sigla em inglês e definida neste trabalho com a população ALDH1high/LIN-/ESA+ - é responsável pela metástase e pela quimioresistência. O objetivo deste trabalho é encontrar genes que são essenciais para o controle do fenótipo das bCSC, em particular fatores de transcrição. MATERIAIS E MÉTODOS: Nesse trabalho nós utlizamos dois grupos de datasets com dados do transcriptoma, o grupo de datasets de descoberta contém um dataset gerado por nós com 3 amostras pareadas comparando as bCSC com o tumor total (My Data - bCSC/Bulk dataset), um dataset com 8 amostras pareadas comparando as bCSC com as células cancerígenas (Wicha - bCSC/CC dataset) e um dataset com 115 amostras de tecido de câncer de mama (Clinical Response dataset). O segundo grupo, grupo de validação, contém o dataset BRCA-TCGA com 621 amostras, as 4142 amostras de câncer de mama da ferramenta Kmplot, as 17 amostras humanas primárias do subtipo BasL e sua informação sobre a geração, ou não, de tumores em camundongos imunosuprimidos e a análise de linhagens celulares (MF10A e HMLE). Para a análise dos dataset utilizamos o test-t pareado no pacote Limma da liguagem R, o algoritmo ARACNE para a inferência de regulons no dataset Clinical Response, a análise MRA-FET para definir os Reguladores Mestres para o fenótipo das bCSC e a análise GSEA para identificar o significado biológico de nosso achados nos diferentes datasets. RESULTADOS E DISCUSSÃO: Nós identificamos 12 TFs como reguladores mestres, com 9 deles formando duas redes altamente conectadas, uma positivamente relacionada ao fenótipo bCSC formada por SNAI2, TWIST, PRRX1, BNC2 e TBX5 com seus regulons, e definida aqui como a rede de transcrição mesenquimal, e uma rede correlacionada negativamente, formada por SCML4, ZNF831, SP140 e IKZF3, definida aqui como a rede de transcrição da resposta imune e totalmente desconhecida da literatura no contexto do câncer de mama. Embora ainda com fraca evidencia, ZEB1 para controlar as duas redes e ser responsável pela expressão de ALDH1 e dos 3 TFs restantes: ID4, HOXA5 e TEAD1. Como mostram seus nomes, e independente do dataset, do subtipo molecular ou da plataforma utilizada, a rede de transcrição mesenquimal, parece ser responsável pela manutenção do fenótipo de células tronco cancerígenas e a rede de transcrição da resposta imune pela resposta imune adaptativa ao tumor e a um bom prognóstico para as pacientes. CONCLUSÃO: Nós encontramos e descrevemos duas redes de fatores de transcrição que parecem controlar o fenótipo das bCSC, uma delas totalmente desconhecida até agora e relacionada a um bom prognóstico. Nosso achados possuem um claro potencial para uso clínico.

Ao longo da vida reprodutiva dos machos, espermatozoides são formados pelas células-tronco espermatogoniais (SSCs, do inglês spermatogonialstemcells) por um processo conhecido como espermatogênese. O cultivo in vitro de SSCs abriu novas possibilidades para a preservação da linhagem germinativa, porém os protocolos requerem a adição de fatores de crescimento e exige a manutenção dessas células por um tempo prolongado, fazendo da criopreservação de SSCs uma alternativa para esse problema. A literatura científica ainda não definiu uma metodologia que seja eficaz na congelação das SSCs. O presente estudo teve por objetivo avaliar duas metodologias de vitrificação de tecido testicular de murinos. Para testar esse objetivo, testículosde camundongos da linhagem C57BL6 GFP+ com 8 a 10 dias de idade foramsubmetidos a dois protocolosde vitrificação de tecido testicular descritos na literatura (Protocolo EG+Sacarose e ProtocoloEG+DMSO+BSA). Após 4 a 12 semanas, os testículos vitrificados foram descongelados e as células testiculares dissociadas para avaliação da viabilidade e concentração. As SSCs foram selecionadas por meio de separação celular por \"beads\" magnéticas (MACS) com anticorpoThy1.2 e transplantadas para testículos de camundongos adultos da linhagem C57BL6 previamente tratados com o quimioterápico busulfan. Após seis semanas, os testículos destes animais foram coletados e os túbulos seminíferos dissociados para avaliação da formação de colônias pelas SSCs transplantadas. Houve diferença estatística (p<0,0001) na viabilidade das células entre o Protocolo EG+Sac e Protocolo EG+DMSO+BSA, sendo de 74,4% e 82,8%, respectivamente. Também houve diferença estatística (p<0,0001) na concentração de células obtidas entre o Protocolo EG+Sace Protocolo EG+DMSO+BSA, sendo de 0,43x106 e 1,35x106, respectivamente. Colônias formadas pelas SSCs transplantadas foram encontradas nos testículos dos animais transplantadas para os dois protocolos de vitrificação. De forma descritiva, podemos relatar queo número de colônias observadas para as células do Protocolo EG+DMSO+BSA foi maior comparado ao Protocolo EG+Sac. Portanto, conclui-se que os protocolos de vitrificação de tecido testicular de camundongos estudados foram capazes de preservar a viabilidade de células-tronco espermatogoniais possibilitando a formação de colônias por estas, sendo que o ProtocoloEG+DMSO+BSA de vitrificação foi mais eficiente. / Throughout the reproductive life of males, spermatozoa are formed by spermatogonial stem cells (SSCs) by a process known as spermatogenesis. The in vitro culture of SSCs created new possibilities for preservation of the germ line, but the protocols require the addition of growth factors and require the maintenanceof these cells for a prolonged time, making of the SSCs cryopreservation an alternative for this problem. The scientific literature has not yet defined a methodology that is effective in the freezing of SSCs. The present study aimed to evaluate two methodologies of vitrification of murine testicular tissue. To test this aim, testes of mice of the C57BL6 GFP + strain with 8 to 10 days old were submitted to two protocols of testicular tissue vitrification(Protocol EG+Sucrose and EG+DMSO+BSA). After 4 to 12 weeks, the vitrified testes were thawed and the testicular cells dissociated for viability and concentration assessment. The SSCs were selected by magnetic-activated cell sorting (MACS) using Thy1.2 antibodyand transplanted to testes of adult mice of the C57BL6 strainpreviously treated with thequimioterapicbusulfan. After six weeks, the testes of these animals were collected and seminiferous tubules dissociated to evaluate the formation of colonies by transplanted SSCs. There was a statistical difference (p<0.0001) in cell viability between Protocol EG+Suc and Protocol EG+DMSO+BSA, being 74.4% and 82.8%, respectively. There was also a statistical difference (p<0.0001) in the concentration of cells obtained between Protocol EG+Suc and Protocol EG+DMSO+BSA, being 0.43x106 and 1.35x106, respectively. Colonies formed by the transplanted SSCs were found in the testes of the transplanted animals for the two vitrification protocols. In a descriptive way, we can report that the number of colonies observedfor Protocol EG+DMSO+BSA cells was higher compared to the Protocol EG+Suc. Therefore, it is concluded that the mice testicular tissue vitrification protocols studied were able to preserve the viability of spermatogonial stem cellsallowing the formation of colonies by these cells and the vitrification ProtocolEG+DMSO+BSA was more efficient.

Orientador: Ana Liz Garcia Alves / Resumo: As terapias regenerativas com a utilização de células tronco mesenquimais (CTMs) têm sido amplamente empregadas com a finalidade de modificar a progressão de enfermidades locomotoras em animais de grande porte. Estudos sobre o comportamento das células tronco, portanto, mostram-se de extrema importância para que, cada vez mais, elucidar sua ação, efeito e eficácia nos tratamentos propostos. A inserção das CTMs derivadas do tecido adiposo de muares em microcápsulas de hidrogel gera expectativas promissoras para a proteção da célula contra anticorpos do receptor, bem como processos inflamatórios exacerbados, distribuição de agentes terapêuticos e supressão de processos inflamatórios. O presente trabalho teve por objetivo verificar o comportamento das CTMs após o encapsulamento em hidrogel, quanto a sua viabilidade, migração, além da avaliação morfológica e imuno-histoquímica. Avaliação da morfologia da cápsula, dos poros, a rugosidade por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e observação das células encapsuladas pela microscopia confocal de varredura a laser. A porcentagem de células viáveis manteve-se ao longo dos momentos em uma média de 93%, então o biomaterial permitiu a difusão de nutrientes e oxigênio adequadamente. A diminuição da quantidade de células no interior das cápsulas é justificada pela possível migração das mesmas através dos microporos das microcápsulas permitindo a aderência à placa de cultivo. Na avaliação morfológica foi possível identificar as células... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Regenerative therapies using mesenchymal stem cells (MSCs) have been widely widespread to treat locomotor diseases in large animals. Studies on the behavior of stem cells are extremely important to increase our knowledge regarding their action, effect and effectiveness in the proposed treatments. The insertion of muar adipose-derived MSCs into hydrogel microcapsules yields promising expectations for cell protection against immune response, as well as exacerbated inflammatory processes, delivery of therapeutic agents, and suppression of inflammatory processes. The present research aimed to verify the behavior of MSCs after hydrogel encapsulation, including cell viability, migration, morphological and immunohistochemical pattern. Evaluation of capsule morphology, pore size, roughness by scanning electron microscopy (SEM) and observation of encapsulated cells by confocal laser scanning microscopy. The percentage of viable cells remained throughout the moments at an average of 93%, so the biomaterial allowed the diffusion of nutrients and oxygen properly. A decreased amount of cells number inside the capsules is justified by the possible migration of them through the microcapsule micropores allowing adherence to the culture plate. The cells showed positive CD44 staining, absence in MHC II. The capsules were evaluated with SEM for their morphology, the area of circular and irregular pores and the size of the cells. It was possible to confirm the presence of stem cells in the micro... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Flávia Karina Delella / Resumo: Células tronco mesenquimais (CTMs) possuem papel relevante na manutenção da homeostase e reparação em casos de lesão tecidual através da renovação do estoque celular. Tais células são implicadas na medicina regenerativa e terapia celular como fontes promissoras, sendo o tecido adiposo uma rica e relevante fonte dessas células. Nesse sentido, as células tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (CTMs- TA) surgem como alternativa segura em estudos pré-clínicos e clínicos. As chamadas “Boas Práticas em Cultura Celular” (do inglês Good Manufacturing Practices - GMPs) tem sido utilizadas como uma nova abordagem para obtenção de controle de qualidade para fins terapêuticos. Neste contexto, o controle toxicológico dessas células surgem como uma questão relevante. Considera-se que os disruptores endócrinos mimetizam a ação de certos hormônios endógenos. Dessa forma, o BPA é conhecido por mimetizar o receptor de estrógeno e também causar alterações no processo de adipogênese. Já o TCDD possui afinidade com o receptor aril hidrocarboneto (AhR), assim como interfere através das vias de sinalização de estrógenos e andrógenos. Desta maneira, o presente estudo teve como objetivo geral testar o potencial de diferenciação das CTMs- TA humanas e de rato na presença dos compostos BPA e TCDD. Os objetivos específicos foram: a quantificação de proteínas relacionadas ao fenótipo de células- tronco, bem como de receptores específicos de ligação desses compostos, testes para verificação do po... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mesenchymal stem cells (CTMs) plays a relevant role in the maintenance of homeostasis and repair in cases of tissue injury through cell stock renovation. Such cells are implicated in regenerative medicine and cell therapy as promising sources, been the adipose tissue a rich and relevant source. In this sense, mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (ASCs) appears to be a safe alternative in preclinical and clinical studies. The so- called Good Manufacturing Practices (GMPs) have been used as a new approach to obtaining quality control for therapeutic purposes. In this context, the toxicological control approach becomes a relevant issue. Endocrine disrupting chemicals are thought to mimic the action of certain endogenous hormones. Thus, BPA is known to mimic the estrogen receptor and also cause changes in the process of adipogenesis. TCDD, on the other hand, has affinity with the aryl hydrocarbon receptor (AhR), as well as interfering with the estrogen and androgen signaling pathways. In this way, the present study had the rationale to test the differentiation potencial of human and rat MSCs in the presence of BPA and TCDD. The specific objectives were: quantification of proteins related to the stem cell phenotype, as well as specific binding receptors of these compounds, verification of apoptotic and genotoxic profile of these substances and also the quantification of the potential of adipogenic and osteogenic differentiation of these cells when exposed. First, ASC... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-03-17Bitstream added on 2014-06-13T19:43:01Z : No. of bitstreams: 1 penteado_fcl_dr_arafcf.pdf: 1008387 bytes, checksum: 40b22d48514b2c755f67d69d9ae8cff6 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Alguns trabalhos realizados recentemente relatam que as células-tronco mesenquimais (CTM) podem ser induzidas à aquisição de marcadores hepatocíticos pelo transplante em modelos animais de dano hepático, ou pelo cultivo in vitro com fatores de crescimento e citocinas. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o comportamento das CTM frente à indução da diferenciação hepatocítica. As CTM foram isoladas da medula óssea de quatro doadores saudáveis, caracterizadas e submetidas ao protocolo de indução à diferenciação hepatocítica in vitro e in vivo. As células induzidas in vitro apresentaram mudanças na sua morfologia, mostrando a morfologia semelhante à do hepatócito, porém, o perfil imunofenotípico não foi modificado. As células induzidas também não apresentaram o aumento dos transcritos de albumina, citoqueratina 18 e citoqueratina 19 quando analisadas por RT-PCR em tempo real, e não alteraram a expressão de albumina, citoqueratina 18 e alfafetoproteína como demonstrado por imunofluorescência. Quando analisadas in vivo, as CTM demonstraram o potencial migratório para o tecido hepático danificado de camundongos imunodeficientes. Em conjunto, os resultados sugerem que as CTM da medula óssea não são capazes de se diferenciar em hepatócitos quando estimuladas in vitro pela metodologia utilizado neste trabalho, mas são capazes de migrar para o tecido hepático danificado in vivo, o que sugere o seu papel no reparo do fígado. A contribuição para o reparo pode estar associada com o efeito parácrino dessas células. / Some recently works have been reported that mesenchymal stem cells (MSC) can be induced to the acquisition of hepatocytic markers for the transplant in animal models of liver damage, or for the in vitro culture with growth factors and cytokines. The present work aim is to evaluate the behavior of the MSC in front of the induction of the hepatocytic differentiation. The MSC was isolated from the bone morrow of 4 normal donators, characterized and submitted to the protocol of in vitro and in vivo induction of hepatocytic differentiation. The in vitro induced cells showed morphology changes acquiring hepatocytes-like morphology. However, the immunophenotypic profile of those cells was not modified. The induced cells did not present increase of the albumin, cytokeratin 18 and cytokeratin 19 transcripts, when analyzed by real time RTPCR. The expression of albumin, cytokeratin 18 and alpha foetoprotein was also not modified as demonstrated by immunofluorescence. In vivo, the MSC have demonstrated the migratory potential for the damaged liver of immunodeficient mice. Together, the results suggest that the bone morrow MSC are not capable of in vitro hepatocytic differentiating according to the approach in this work, but are capable to homming into damaged hepatic tissue in vivo. This migration capacity suggests their role in the repair mechanisms.

Submitted by MARIA JOSE MALAGUTTI FERREIRA null (malagutti10@yahoo.com.br) on 2016-06-02T19:36:08Z No. of bitstreams: 1 pdfjoiner.pdf: 15596648 bytes, checksum: db4be59e08d503c5f5b3a366b0c314de (MD5) / Rejected by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: O arquivo submetido não contém a folha de aprovação. A versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija esta informação e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2016-06-03T19:28:13Z (GMT) / Submitted by MARIA JOSE MALAGUTTI FERREIRA null (malagutti10@yahoo.com.br) on 2016-06-03T21:17:50Z No. of bitstreams: 2 pdfjoiner.pdf: 15596648 bytes, checksum: db4be59e08d503c5f5b3a366b0c314de (MD5) dissertacao.pdf: 957412 bytes, checksum: 0962d2f2c05f5f3752cb389be7bf7fea (MD5) / Rejected by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: A versão final da dissertação/tese deve ser submetida no formato PDF (Portable Document Format). O arquivo PDF não deve estar protegido e a dissertação/tese deve estar em um único arquivo, inclusive os apêndices e anexos, se houver. Por favor, corrija o formato do arquivo e realize uma nova submissão. Agradecemos a compreensão. on 2016-06-06T12:09:26Z (GMT) / Submitted by MARIA JOSE MALAGUTTI FERREIRA null (malagutti10@yahoo.com.br) on 2016-06-06T13:45:46Z No. of bitstreams: 1 dissertacao.pdf: 16505999 bytes, checksum: 2bad751dc7f5e6a56599b9731ecadd63 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-06-07T12:19:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 malaguttiferreira_mj_me_assis.pdf: 16424202 bytes, checksum: a8bc2a6fd56c317ab15caad2ca1f6025 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-07T12:19:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 malaguttiferreira_mj_me_assis.pdf: 16424202 bytes, checksum: a8bc2a6fd56c317ab15caad2ca1f6025 (MD5) Previous issue date: 2016-03-17 / O tecido adiposo (TA) representa, atualmente, uma importante fonte de células-tronco mesenquimais (CTM), uma vez que pode ser obtido de forma relativamente fácil, por meio de procedimentos pouco invasivos, com baixa incidência de morbi-mortalidade e com grande disponibilidade de material para pesquisa aplicada. Para utilização das CTM derivadas do TA, em protocolos de terapia celular em pacientes humanos, emprega-se, em média, uma quantidade significativa de células, da ordem 107 a 108 células/kg do paciente. A partir de uma pequena fração de tecido adiposo autólogo ou heterólogo pode-se expandir o número de células, por meio de procedimentos de cultivo celular “in vitro”, a fim de se obter um número adequado de células que resulte em eficácia terapêutica. Os procedimentos de cultivo prolongado “in vitro”, podem, no entanto, provocar efeitos genotóxicos e mutagênicos. Neste sentido, é de extrema importância o monitoramento da análise da estabilidade genética durante as culturas de CT destinadas aos procedimentos de terapia celular em pacientes humanos. Em função destes aspectos, este trabalho teve por objetivo analisar, por meio do Ensaio Cometa (EC) e Teste de micronúcleo (MCN), a integridade genômica de células-tronco mesenquimais oriundas do tecido adiposo (CT-TA), mantidas em cultura até a décima primeira passagem, avaliando os possíveis efeitos genotóxicos e mutagênicos do cultivo celular prolongado. Os resultados mostraram que no teste EC, não houve diferença estatística entre os controles e células mantidas em cultivo por diferentes passagens. Os testes de MCN, no entanto, mostraram aumento de micronúcleos, a partir da terceira passagem de cultivo celular, com aumento significativo a partir da sétima passagem, em relação à primeira passagem. Os resultados mostram efeitos genotóxicos sobre células-tronco mantidas em cultura para expansão celular e indicam a necessidade de novas análises, a fim de se avaliar com maior segurança o emprego com células-tronco em terapia celular resultantes de culturas celulares expandidas “in vitro” durante diferentes passagens. / The adipose tissue (AT) currently represents a major source of mesenchymal stem cells (MSC), since it can be obtained relatively easily by means of minimally invasive procedures, with low incidence of morbidity and mortality and a large availability of material for applied research. For use of MSC derived from AT in cell therapy protocols in human patients, is employed, on average, a significant amount of cells of the order 107 -108 cells / kg patient. From a fraction of autologous adipose tissue or heterologous one can expand the number of cells through cell culture procedures "in vitro" in order to obtain an adequate number of cells resulting in therapeutic efficacy. Prolonged culture procedures "in vitro" may, however, cause genotoxic and mutagenic effects. Therefore, it is extremely important to monitor the analysis of the genetic stability during CT crops to cell therapy procedures in human patients. Based on these aspects, this study aimed to analyze, through the comet assay (AC) and micronucleus test (MCN), the genomic integrity of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (CT-AT), maintained in culture until the eleventh passage, evaluating the possible genotoxic and mutagenic effects of prolonged cell culture. The results showed that the AC test, there was no statistical difference between the control and cells maintained in culture for different passages. The MCN tests, however, showed an increase in micronuclei after the third passage of cell culture, significant increase from the seventh passage to the first passage. The results show genotoxic effects on stem cells maintained in culture for cell expansion and indicate the need for further analysis in order to assess with greater certainty employment stem cells in cell therapy resulting from expanded cell cultures "in vitro" during different passages.

Submitted by MARINA LANDIM E ALVARENGA null (marina@fmvz.unesp.br) on 2016-06-10T20:23:13Z No. of bitstreams: 1 dissertacao final.pdf: 2069659 bytes, checksum: f8308625d294fd21d8e9fadd7f344c09 (MD5) / Rejected by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: O arquivo submetido está sem a ficha catalográfica. A versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija esta informação e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2016-06-15T18:05:22Z (GMT) / Submitted by MARINA LANDIM E ALVARENGA null (marina@fmvz.unesp.br) on 2016-06-26T01:29:11Z No. of bitstreams: 1 dissertacao final ficha.pdf: 2083568 bytes, checksum: 389a90011381796dbfd42b7a5be2f131 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-06-27T14:25:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 alvarenga_ml_me_bot.pdf: 2083568 bytes, checksum: 389a90011381796dbfd42b7a5be2f131 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-27T14:25:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alvarenga_ml_me_bot.pdf: 2083568 bytes, checksum: 389a90011381796dbfd42b7a5be2f131 (MD5) Previous issue date: 2016-04-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A utilização de terapias celulares no tratamento de lesões musculoesqueléticas cresce mundialmente em larga escala e é cada vez mais aceita. As células tronco mesenquimais (CTMs) são facilmente isoladas e expandidas in vitro, sendo tipicamente obtidas do próprio paciente (autóloga). Contudo, o uso de células provenientes de um animal doador (alogênica) e submetidas ao cultivo e a criopreservação, cria a oportunidade de iniciar o tratamento imediatamente após o diagnóstico. Há evidencias de que as CTMs possuem capacidade de imunomodulação, interagindo com os linfócitos T de diversas maneiras, além de não estimularem a indução de uma resposta imune complexa por não expressarem MHC II. Contudo, ainda há falta de consenso entre os estudos quanto a imunogenicidade das CTMs. Desta forma, o presente estudo objetivou avaliar a segurança da administração das células alogênicas em equinos através da análise de uma possível inflamação decorrente do implante alogênico de CTMs em músculo hígido de equinos, por meio de exame físico, ultrassonográfico, termográfico, histopatológico e pela expressão gênica de IL-1 beta e TNF- alfa. Os resultados demostraram que aplicação de CTM alogênicas é um processo seguro uma vez que não houveram alterações clínicas significativas, contudo uma segunda aplicação de CTM alogênicas de um mesmo doador levou ao aumento significativo da expressão gênica de TNF- alfa, podendo caracterizar uma resposta imune celular mais acentuada. Nossos resultados contribuíram para pesquisas futuras sobre tratamento de lesões musculoesqueléticas em equinos com CTMs, através da criação de bancos de células oriundas de doadores saudáveis. / The use of cell therapy for treatment of musculoskeletal injuries in horses is increasing in large scale worldwide. The mesenchymal stem cells (MSCs) are easily isolated and expanded in vitro, making them promising for use in clinical trials. Typically, these cells are obtained from the own patient (autologous), however, cell from a donor horse (allogeneic) expanded in vitro and cryopreserved create the opportunity of immediate treatment after diagnosis. There is evidence that MSCs have immunomodulatory capacity by interacting with T lymphocytes in several ways, and do not stimulate a complex immune response for not expressing MHC II. However, there is still a lack of consensus among the studies on the immunogenicity of MSCs. Thus, this study aimed to evaluate the safety of administration of allogeneic mesenchymal stem cells in horses. For such a possible inflammation reaction to the implantation was analysed through physical examination, ultrasound, thermography, histopathology and gene expression of IL 1beta and TNF-alpha. The results showed that the implantation of allogeneic MSCs is a safe process since there were no significant clinical changes in the animals, but a second application of allogeneic MSCs from the same donor led to significant increase in gene expression of TNF-alpha, which can characterize a cellular immune response. Our results contribute to future research on treatment of musculoskeletal injuries in horses using MSCs, by creating banks of cells derived from healthy donors.

Submitted by Ana Carolina Picolo Pasian (ana_781@hotmail.com) on 2018-04-20T19:54:18Z No. of bitstreams: 1 PARA DESPÓSITO.pdf: 1930882 bytes, checksum: 397a91ec261857e9a2bea286ae3eeb52 (MD5) / Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2018-04-23T13:24:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pasian_acp_me_bot.pdf: 1930882 bytes, checksum: 397a91ec261857e9a2bea286ae3eeb52 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-23T13:24:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pasian_acp_me_bot.pdf: 1930882 bytes, checksum: 397a91ec261857e9a2bea286ae3eeb52 (MD5) Previous issue date: 2018-02-27 / A medicina regenerativa é uma área em crescente expansão no Brasil e no mundo, a qual procura ampliar a capacidade natural de regeneração dos tecidos através da utilização de células, fatores de proliferação e biomateriais. Um dos ramos da medicina regenerativa é a terapia celular, vertente que utiliza células-tronco, visando a substituição de tecidos funcionalmente ou estruturalmente lesados, apresentando um caráter terapêutico. Na medicina LASERs e LEDs vem sendo estudados como ferramenta terapêutica, mostrando possuir capacidade bioestimulatória. Este campo é caracterizado por uma variedade de metodologias, que são utilizadas em uma gama considerável de aplicações. Na técnica de fotoestimulação, utiliza-se a luz para ativar moléculas e funções celulares, apresentando o potencial de afetar a proliferação e diferenciação e o metabolismo da célula, estimulando a fosforilação oxidativa e podendo reduzir a resposta inflamatória local. Entretanto para que essa resposta ocorra, inúmeros trabalhos afirmam sobre a importância da seleção de um comprimento de onda ideal, uma vez que a utilização de um comprimento inapropriado pode acarretar em resultados contrários aos esperados, como a bioinibição. Diante destes achados o presente trabalho propôs-se a avaliar a ação do LED 850nm, no regime pulsátil, nas doses de 3, 5 e 10J/cm² na cultura de célula-tronco mesenquimal (CTM) com Soro Fetal Bovino (SFB) e com Hormônios derivados de plaquetas (HDP), e na cultura de células de Linfoma linfoblástico tipo B, RAJI Cells na dose de 10J/cm². Em ambos experimentos de exposição a luz, o comprimento de onda 850 nm inibiu a proliferação celular. Na cultura de CTM o LED tornou o desdobramento celular mais lento e acarretou na diminuição da confluência celular, especialmente nas doses de 5 e 10J/cm². Na cultura de linfoma Linfoblástico tipo B, em apenas 1 semana de exposição o mesmo comportamento de bioinibição foi encontrado na dose de 10J/cm². O grupo não tratado apresentou 7,0 X 10 5 células, em média, por frasco enquanto que as células submetidas à irradiação sofreram diminuição do tempo de desdobramento sendo a concentração destas de 4,2X105 , em média, por frasco. / Regenerative medicine is a promising growing area worldwide, with the aim of restore and regenerate tissues and whole organs through the use of cells, proliferation factors and biomaterials. One branch of regenerative medicine is cell therapy, that uses stem cells, aiming at the substitution of functionally or structurally damaged tissues, presenting therapeutic fature. LASERs and LEDs are available as therapeutic tools, showing biostimulating ability. The photo-stimulation technique uses light to activate molecules and cellular functions, presenting potential to affect proliferation, cell differentiation and metabolism, stimulating oxidative phosphorylation and reducing the local inflammatory response. Data shows the importance of selecting an ideal wavelength, such as the use of an inappropriate choice, can lead to undisered results, such as bioinhibition. In the present work, we evaluated the action of LED 850nm, pulsatile, at the doses of 3, 5 and 10J/cm² in mesenchymal stem cells (CTM) with Bovine Fetal Serum (FBS) and with derived platelets – Hormones (HDP) and B-cell lymphoblastic cell culture, 10J /cm2 , RAJI cells. In all light exposure experiments, wavelength of 850 nm inhibited cell proliferation. CTM culture, LED had a low proliferation rate, resulting in a decrease in cellular confluence, especially at 5 and 10J/cm2 . Lymphoblastic lymphoma type B cells, in only one week of exposure presente the same behavior of bioinhibition at 10J/cm2 . The control group had 7.0 x 105 cells on per vial, while cells subjected to irradiation underwent the unfolding time at a concentration of 4.2 x 105 on average per vial.

Orientador: Ana Liz Garcia Alves / Resumo: A utilização de terapias celulares no tratamento de lesões musculoesqueléticas cresce mundialmente em larga escala e é cada vez mais aceita. As células tronco mesenquimais (CTMs) são facilmente isoladas e expandidas in vitro, sendo tipicamente obtidas do próprio paciente (autóloga). Contudo, o uso de células provenientes de um animal doador (alogênica) e submetidas ao cultivo e a criopreservação, cria a oportunidade de iniciar o tratamento imediatamente após o diagnóstico. Há evidencias de que as CTMs possuem capacidade de imunomodulação, interagindo com os linfócitos T de diversas maneiras, além de não estimularem a indução de uma resposta imune complexa por não expressarem MHC II. Contudo, ainda há falta de consenso entre os estudos quanto a imunogenicidade das CTMs. Desta forma, o presente estudo objetivou avaliar a segurança da administração das células alogênicas em equinos através da análise de uma possível inflamação decorrente do implante alogênico de CTMs em músculo hígido de equinos, por meio de exame físico, ultrassonográfico, termográfico, histopatológico e pela expressão gênica de IL-1 beta e TNF- alfa. Os resultados demostraram que aplicação de CTM alogênicas é um processo seguro uma vez que não houveram alterações clínicas significativas, contudo uma segunda aplicação de CTM alogênicas de um mesmo doador levou ao aumento significativo da expressão gênica de TNF- alfa, podendo caracterizar uma resposta imune celular mais acentuada. Nossos resultados contribuíram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The use of cell therapy for treatment of musculoskeletal injuries in horses is increasing in large scale worldwide. The mesenchymal stem cells (MSCs) are easily isolated and expanded in vitro, making them promising for use in clinical trials. Typically, these cells are obtained from the own patient (autologous), however, cell from a donor horse (allogeneic) expanded in vitro and cryopreserved create the opportunity of immediate treatment after diagnosis. There is evidence that MSCs have immunomodulatory capacity by interacting with T lymphocytes in several ways, and do not stimulate a complex immune response for not expressing MHC II. However, there is still a lack of consensus among the studies on the immunogenicity of MSCs. Thus, this study aimed to evaluate the safety of administration of allogeneic mesenchymal stem cells in horses. For such a possible inflammation reaction to the implantation was analysed through physical examination, ultrasound, thermography, histopathology and gene expression of IL 1beta and TNF-alpha. The results showed that the implantation of allogeneic MSCs is a safe process since there were no significant clinical changes in the animals, but a second application of allogeneic MSCs from the same donor led to significant increase in gene expression of TNF-alpha, which can characterize a cellular immune response. Our results contribute to future research on treatment of musculoskeletal injuries in horses using MSCs, by creating banks of cells derived ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre