A grande evolução tecnológica tem sido responsável pela introdução de diferentes contaminantes no ambiente, dentre os quais estão os éteres difenílicos polibromados (PBDEs). Os PBDEs representam uma importante classe de retardantes de chama adicionada aos diversos bens de consumo da vida moderna com a finalidade de retardar o processo de ignição e impedir a propagação de chamas. Atualmente, a crescente presença desses compostos em compartimentos ambientais e em amostras de fluídos biológicos tem levantado preocupações relacionadas com os possíveis efeitos tóxicos à saúde, no entanto tais efeitos são incertos devido à baixa disponibilidade de dados relacionados com a ação direta sobre o organismo humano. Desta forma, esse trabalho objetivou investigar os efeitos dos principais representantes de PBDEs: congênere PBDE-209, PBDE-99 e PBDE-47 sobre células de hepatoblastoma humano (HepG2) na faixa de concentração de 0.1-25µmol/L, em períodos de 24 e 48 horas, como uma alternativa de esclarecer os efeitos tóxicos dos PBDEs sobre a saúde humana, bem como correlacionar os efeitos entre os diferentes congêneres. As células HepG2 foram escolhidas devido as semelhanças com o metabolismo das células hepáticas normais. Também foi investigado o potencial dos três congêneres em induzir a morte celular após exposição aos PBDEs, sendo demonstrado potencial citotóxico diferenciado de acordo com o congênere investigado. Pela avaliação de ensaios de proliferação celular (SRB) e viabilidade celular (MTT) foi obtido que o congênere PBDE-209 induz morte celular em altas concentrações (10µmol/L, 25µmol/L) sendo esses efeitos iniciados primeiramente, por mecanismos citostáticos em concentrações menores. Enquanto isso, os PBDE-99 e PBDE-47 demonstraram elevado potencial citotóxico de forma concentração dependente, apresentando diferenças nas intensidades das concentrações avaliadas, relacionando-as com a facilidade de absorção e com os possíveis metabólitos formados. A investigação dos mecanismos citotóxicos foi realizada pelos ensaios de avaliação do potencial de membrana mitocondrial, exposição da fosfatidilserina na membrana externa celular e fragmentação nuclear. Esses ensaios evidenciaram que os congêneres investigados agem por indução de mecanismos apoptóticos, sendo os maiores resultados relacionados com os menores congêneres investigados. A avaliação dos mecanismos por vias necróticas foi realizada pela avaliação da atividade da LDH devido ao rompimento da membrana celular característico de mecanismos necróticos, não sendo obtidos resultados significativos. A avaliação do acúmulo de EROs ocasionado pela exposição aos congêneres demonstrou que os compostos investigados apresentam elevado potencial para induzir o estresse oxidativo, sendo inclusive relacionado com os efeitos citostáticos preliminares do congênere PBDE-209. A diferença dos resultados obtidos entre os três congêneres foi relacionada com as diferenças estruturais, as quais facilitam a absorção dos menores congêneres e com os possíveis metabólitos oriundos formados. Concluindo, estes resultados mostram os efeitos tóxicos dos PBDEs em células hepáticas e sugere a presença de efeitos adversos à saúde. Além disso, embora os congêneres PBDE-99 e PBDE-47 apresentem os maiores potenciais tóxicos, o efeito do congênere PBDE-209 não deve ser ignorado uma vez que o mesmo pode se intensificado com a exposição prolongada / Technologic demand has increased the different pollutants released in the environment. Polybrominated diphenyl ether (PBDE) is an important class of the flame retardants added in several good products with a wide range of toxic effects on biotic and abiotic systems. These compounds are release into environment through the loss during manufacture and of products containing PBDEs. Their toxic mechanisms on biologic systems still have not understood due to the existence of several different congeners, with different chemical and biological characteristics in the environment, and absence of their effects on the body. Therefore, in this study we examine effects of congeners PBDE-209, PBDE-99 and PBDE-47 on HepG2 cell line in order to understand their mechanism of action and their effects on the human health. Firstly, we evaluated citotoxic mechanism by SRB assay followed by MTT assay. This way, we showed that all tested PBDEs seem to cause cell death although PBDE-209 also causes cystostatic mechanism in lower concentration. The cytotoxic mechanism was observed in higher concentrations and it was suggested be evidences of apoptosis. Apoptotic mechanism was investigated by mitochondrial membrane potential, phosphatidyl serine exposure and nuclear fragmentation. Our results showed that all tested congeners were able to decrease mitochondrial membrane potential, to cause phosphatidyl serine exposure and a nuclear fragmentation with higher results found for BDE-99 and BDE-47 due structural difference that may facilities their absorption and their toxic metabolites Exclusion of necrotic mechanism was performed by LDH release assay. We evaluated reactive oxygen species (ROS) production and it was showed that apoptotics mechanisms is followed by oxidative stress in all congeners tested and suggest cytostatic mechanism is also mediated by ROS. These results are evidences of toxic effects of PBDEs on the cell line and health

A grande evolução tecnológica tem sido responsável pela introdução de diferentes contaminantes no ambiente, dentre os quais estão os éteres difenílicos polibromados (PBDEs). Os PBDEs representam uma importante classe de retardantes de chama adicionada aos diversos bens de consumo da vida moderna com a finalidade de retardar o processo de ignição e impedir a propagação de chamas. Atualmente, a crescente presença desses compostos em compartimentos ambientais e em amostras de fluídos biológicos tem levantado preocupações relacionadas com os possíveis efeitos tóxicos à saúde, no entanto tais efeitos são incertos devido à baixa disponibilidade de dados relacionados com a ação direta sobre o organismo humano. Desta forma, esse trabalho objetivou investigar os efeitos dos principais representantes de PBDEs: congênere PBDE-209, PBDE-99 e PBDE-47 sobre células de hepatoblastoma humano (HepG2) na faixa de concentração de 0.1-25µmol/L, em períodos de 24 e 48 horas, como uma alternativa de esclarecer os efeitos tóxicos dos PBDEs sobre a saúde humana, bem como correlacionar os efeitos entre os diferentes congêneres. As células HepG2 foram escolhidas devido as semelhanças com o metabolismo das células hepáticas normais. Também foi investigado o potencial dos três congêneres em induzir a morte celular após exposição aos PBDEs, sendo demonstrado potencial citotóxico diferenciado de acordo com o congênere investigado. Pela avaliação de ensaios de proliferação celular (SRB) e viabilidade celular (MTT) foi obtido que o congênere PBDE-209 induz morte celular em altas concentrações (10µmol/L, 25µmol/L) sendo esses efeitos iniciados primeiramente, por mecanismos citostáticos em concentrações menores. Enquanto isso, os PBDE-99 e PBDE-47 demonstraram elevado potencial citotóxico de forma concentração dependente, apresentando diferenças nas intensidades das concentrações avaliadas, relacionando-as com a facilidade de absorção e com os possíveis metabólitos formados. A investigação dos mecanismos citotóxicos foi realizada pelos ensaios de avaliação do potencial de membrana mitocondrial, exposição da fosfatidilserina na membrana externa celular e fragmentação nuclear. Esses ensaios evidenciaram que os congêneres investigados agem por indução de mecanismos apoptóticos, sendo os maiores resultados relacionados com os menores congêneres investigados. A avaliação dos mecanismos por vias necróticas foi realizada pela avaliação da atividade da LDH devido ao rompimento da membrana celular característico de mecanismos necróticos, não sendo obtidos resultados significativos. A avaliação do acúmulo de EROs ocasionado pela exposição aos congêneres demonstrou que os compostos investigados apresentam elevado potencial para induzir o estresse oxidativo, sendo inclusive relacionado com os efeitos citostáticos preliminares do congênere PBDE-209. A diferença dos resultados obtidos entre os três congêneres foi relacionada com as diferenças estruturais, as quais facilitam a absorção dos menores congêneres e com os possíveis metabólitos oriundos formados. Concluindo, estes resultados mostram os efeitos tóxicos dos PBDEs em células hepáticas e sugere a presença de efeitos adversos à saúde. Além disso, embora os congêneres PBDE-99 e PBDE-47 apresentem os maiores potenciais tóxicos, o efeito do congênere PBDE-209 não deve ser ignorado uma vez que o mesmo pode se intensificado com a exposição prolongada / Technologic demand has increased the different pollutants released in the environment. Polybrominated diphenyl ether (PBDE) is an important class of the flame retardants added in several good products with a wide range of toxic effects on biotic and abiotic systems. These compounds are release into environment through the loss during manufacture and of products containing PBDEs. Their toxic mechanisms on biologic systems still have not understood due to the existence of several different congeners, with different chemical and biological characteristics in the environment, and absence of their effects on the body. Therefore, in this study we examine effects of congeners PBDE-209, PBDE-99 and PBDE-47 on HepG2 cell line in order to understand their mechanism of action and their effects on the human health. Firstly, we evaluated citotoxic mechanism by SRB assay followed by MTT assay. This way, we showed that all tested PBDEs seem to cause cell death although PBDE-209 also causes cystostatic mechanism in lower concentration. The cytotoxic mechanism was observed in higher concentrations and it was suggested be evidences of apoptosis. Apoptotic mechanism was investigated by mitochondrial membrane potential, phosphatidyl serine exposure and nuclear fragmentation. Our results showed that all tested congeners were able to decrease mitochondrial membrane potential, to cause phosphatidyl serine exposure and a nuclear fragmentation with higher results found for BDE-99 and BDE-47 due structural difference that may facilities their absorption and their toxic metabolites Exclusion of necrotic mechanism was performed by LDH release assay. We evaluated reactive oxygen species (ROS) production and it was showed that apoptotics mechanisms is followed by oxidative stress in all congeners tested and suggest cytostatic mechanism is also mediated by ROS. These results are evidences of toxic effects of PBDEs on the cell line and health

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-11-10T11:06:55Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 14494167 bytes, checksum: fab8d8ee99ed6b81f44c5a418b81401f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-10T11:06:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 14494167 bytes, checksum: fab8d8ee99ed6b81f44c5a418b81401f (MD5) Previous issue date: 2014-07-02 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / O carcinoma hepatocelular é o mais frequente câncer primário do fígado e já se tornou a quinta neoplasia mais comum no mundo e a segunda causa de óbitos relatados por câncer. Estima-se que 2/3 das neoplasias humanas poderiam ser prevenidos pela modificação do estilo de vida, incluindo a dieta. Estudos farmacológicos intensificaram-se nos últimos anos com plantas da família Annonaceae, cujo interesse científico está nas acetogeninas, uma classe de compostos derivados de ácidos graxos com forte atividade antitumoral. Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Infectologia Molecular Animal, do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, na Universidade Federal de Viçosa, para avaliar in vitro as propriedades antitumorais de extratos foliares de 11 Anonáceas (9 espécies de 4 gêneros). Para isso, células tumorais hepáticas humanas da linhagem HepG2 (ATCC HB-8065 ) foram expostas a três concentrações dos extratos foliares de Anonáceas e do quimioterápico 5- Fluoruracil (5-FLU), em três períodos de tempo (24, 48 e 72 h), com análise espectrofotométrica da viabilidade celular pela metodologia do corante vermelho neutro. Foram conduzidos ensaios para avaliar o efeito dos extratos vegetais e do quimioterápico sobre o fluxo químico celular no meio de cultura durante os cultivos através da análise por Espectrometria de Emissão Atômica de diferentes especies químicas, e sobre o metabolismo e integridade celular, através da análise de marcadores tumorais e intermediários metabólicos. Todos os ensaios induziram à morte celular, com resultados distintos entre plantas da mesma espécie, com até 100% de citotoxicidade, sendo que nove Anonáceas exibiram efeito citotóxico com até 1/8 da concentração daquela utilizada para o quimioterápico 5-FLU. Nenhum dos ensaios com extratos foliares exibiu retomada da proliferação celular após 48 ou 72 h, o que foi verificado para os cultivos com o quimioterápico, clara evidência de quimiorresistência tumoral. O mecanismo de morte celular por apoptose foi confirmado através da citometria de fluxo para dois dos extratos escolhidos, incluindo 5-FLU. Não houve um padrão no efeito dos extratos sobre o fluxo de íons ou dos marcadores tumorais durante os cultivos das células hepatocarcinogênicas, que se mostrou variável dentro da espécie ou entre elas, ou dentro de um mesmo gênero ou entre eles, com interferência na absorção de alguns íons especialmente, Ca, Na, P, S e depleção intracelular total de outros (Se, Zn) para alguns dos tratamentos. Marcadores bioquímicos como aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e lactato desidrogenase (LDH) tiveram seus níveis elevados para alguns dos extratos utilizados, incluindo 5-FLU, resultado coincidente com a redução na absorção da glicose pelos hepatócitos tumorais, indícios da alteração no metabolismo e integridade celular. / The hepatocellular carcinoma is the most common primary liver cancer and has become the fifth most common cancer worldwide and the second leading cause of cancer deaths reported. It is estimated that two thirds of human cancers could be prevented by changes in lifestyle, including diet. Pharmacological studies have intensified in recent years with the Annonaceae plant family, whose scientific interest is in the acetogenins, a class of compounds derived from fatty acids with strong antitumor activity. The experiments were conducted at the Laboratory of Molecular Animal Infectious Diseases, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Federal University of Viçosa, to evaluate the in vitro antitumor properties of leaf extracts of 11 annonaceae (9 species of 4 genera). For this, human liver cancer cells HepG2 line (ATCC HB-8065 ) were exposed to three different concentrations of leaf extracts of Annonaceae and of the chemotherapeutic 5-fluorouracil (5-flu) in three time periods (24, 48 and 72 h), with spectrophotometric analysis of cell viability by the neutral red dye method. Assays were conducted to evaluate the effect of plant extracts and chemotherapeutic chemical flow cell on the culture medium during the cultivation by atomic emission spectrometry analysis of different chemical species, and the cellular integrity and metabolism, by analysis of tumor markers and metabolic intermediates. All assays induced cell death, with results between different plants of the same species, with up to 100% cytotoxicity, nine annonacea exhibited cytotoxic effect up to one eighth of the concentration of that used for the chemotherapeutic 5-flu. None of the trials with leaf extracts exhibited recovery of cell proliferation after 48 or 72 h, which was observed in cultures with chemotherapy, clear evidence of tumor chemoresistance. The mechanism of cell death by apoptosis was confirmed by flow cytometry for two extracts selected, including 5-flu. There was no pattern in the effect of the extracts on the flow of ions or of tumor markers during the cultivation of hepatic ocarcinogenic cells, which was variable within species or between or within the same genus or between them, interfering with the absorption of especially some ions, Ca, Na, P, S, and total depletion of other intracellular (Se, Zn) for some treatments. Biochemical markers such as aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) and lactate dehydrogenase (LDH) had their elevated levels for some of the extracts used, including 5-flu coincident result with a reduction in glucose uptake by tumor hepatocytes, evidence of changes in metabolism and cellular integrity.

Realizou-se um estudo estrutura-atividade sobre os efeitos citoprotetor/citotóxico de 5 flavonóides envolvendo processos mitocondriais, com ênfase na apoptose. Nossos resultados mostram que a dupla ligação na posição 2-3 / grupos 3-OH em conjugação com a função 4-oxo no anel C da estrutura dos flavonóides parece favorecer a interação destes compostos com a membrana mitocondrial, diminuindo a sua fluidez, e tanto inibindo a cadeia respiratória das mitocôndrias, quanto causando desacoplamento. Por outro lado, a estrutura o-di-OH no anel B parece favorecer a inibição da cadeia respiratória, sendo que a ausência desta estrutura parece favorecer a atividade desacopladora. Os flavonóides que não afetaram a respiração mitocondrial, induziram a transição de permeabilidade mitocondrial. A capacidade dos flavonóides em liberar o Ca2+ acumulado pelas mitocôndrias correlaciona-se com a sua capacidade de afetar a respiração mitocondrial e sua inabilidade em induzir a transição de permeabilidade mitocondrial. Já os dados referentes aos estudos da atividade protetora contra a formação de radicais livres demonstraram que a quercetina, luteolina e a galangina foram substancialmente mais potentes que a taxifolina e a catequina em conferir proteção contra a lipoperoxidação, embora somente a quercetina tenha sido um efetivo seqüestrador tanto de DPPH?, quanto de O2?-. Esses resultados sugerem que a dupla ligação na posição 2-3 em conjugação com a função 4-oxo na estrutura dos flavonóides são os fatores mais importantes na atividade antioxidante dos flavonóides sobre as mitocôndrias. Ainda, a presença da estrutura o-di-OH no anel B, conforme observado na quercetina, favorece essa atividade via seqüestro de O2?-, enquanto que a ausência dessa característica estrutural na galangina, a favorece via diminuição da fluidez de membrana e/ou desacoplamento mitocondrial. Os ensaios realizados para avaliar o efeito dos flavonóides sobre as células HepG2 mostraram que galangina, luteolina e quercetina são capazes de induzir morte celular. Esse efeito parece estar associado à dissipação do potencial de membrana mitocondrial e à diminuição na capacidade energética celular, mais pronunciada no caso dos dois primeiros; porém, como essa diminuição na concentração de ATP não é drástica, a morte celular pode ocorrer por apoptose. Os experimentos realizados para avaliar essa possibilidade sugerem uma ativação das caspases via mitocôndria, observada pelo aumento das atividades de caspase -9 e -3 e também pela exposição de fosfatidil serina. A taxifolina que não apresentou capacidade de produzir dano celular, apresentou, por outro lado, capacidade de prevenir parcialmente a diminuição de viabilidade das células HepG2 induzida pelo pró-oxidante t-butilhidroperóxido, aparentemente por meio de sua atividade antioxidante que inibiu, também de forma parcial, o acúmulo de espécies reativas de oxigênio. / We carried out a structure-activity study addressing the protective/toxic effects of 5 flavonoids (quercetin, taxifolin, luteolin, catechin and galangin) upon mitochondrial aspects with emphasis on the mechanisms potentially involved in cell apoptosis. The major findings were: The 2,3 double bond/3-OH group in conjugation with the 4-oxo function on the C-ring in the flavonoid structure seems favour the interaction of these compounds with the mitochondrial membrane, decreasing its fluidity either inhibiting the respiratory chain of mitochondria or causing uncoupling; while the o-di-OH on the B-ring seems favour the respiratory chain inhibition, the absence of this structure seems favour the uncoupling activity. The flavonoids not affecting the respiration of mitochondria induced MPT. The ability of flavonoids to induce the release of mitochondria-accumulated Ca2+ correlated well with their ability to affect mitochondrial respiration on the one hand, and their inability to induce MPT, on the other. The data concerning the protective activity against the free radical formation showed that quercetin, luteolin and galangin were far more potent than taxifolin and catechin in affording protection against lipid peroxidation, although only quercetin was an effective scavenger of both DPPH? and O2?-. These results suggest that the 2,3-double bound in conjugation with the 4-oxo function in the flavonoid structure are major determinants of the antioxidant activity of flavonoids on mitochondria, the presence of an o-di-OH structure on the B-ring, as occurring in quercetin, favouring this activity via O2?- scavenging, while the absence of this structural feature in galangin, favouring it via decrease in membrane fluidity and/or mitochondrial uncoupling. The assays addressing the flavonoids effects on HepG2 cells showed that galangin, luteolin and quercetin are able to induce cell death. This effect appears to be linked to the mitochondrial membrane potential dissipation and consequent decrease in the cellular energy charge, more pronounced for the galangin or luteolin treatment. However, since this decrease in ATP content is not drastic, the apoptosis process can occur. The set of experiments performed in order to evaluate this possibility demonstrated caspases-9 and -3 activation and also phosphatidylserine exposure on the cell membrane. On the other hand, taxifolin, that did not present ability to induce injury to the cell, was able to partially inhibit a viability decrease of HepG2 cell exposed to the pro-oxidant t-butylhydroperoxide, probably on account of its capacity to partially decrease ROS formation.

Realizou-se um estudo estrutura-atividade sobre os efeitos citoprotetor/citotóxico de 5 flavonóides envolvendo processos mitocondriais, com ênfase na apoptose. Nossos resultados mostram que a dupla ligação na posição 2-3 / grupos 3-OH em conjugação com a função 4-oxo no anel C da estrutura dos flavonóides parece favorecer a interação destes compostos com a membrana mitocondrial, diminuindo a sua fluidez, e tanto inibindo a cadeia respiratória das mitocôndrias, quanto causando desacoplamento. Por outro lado, a estrutura o-di-OH no anel B parece favorecer a inibição da cadeia respiratória, sendo que a ausência desta estrutura parece favorecer a atividade desacopladora. Os flavonóides que não afetaram a respiração mitocondrial, induziram a transição de permeabilidade mitocondrial. A capacidade dos flavonóides em liberar o Ca2+ acumulado pelas mitocôndrias correlaciona-se com a sua capacidade de afetar a respiração mitocondrial e sua inabilidade em induzir a transição de permeabilidade mitocondrial. Já os dados referentes aos estudos da atividade protetora contra a formação de radicais livres demonstraram que a quercetina, luteolina e a galangina foram substancialmente mais potentes que a taxifolina e a catequina em conferir proteção contra a lipoperoxidação, embora somente a quercetina tenha sido um efetivo seqüestrador tanto de DPPH?, quanto de O2?-. Esses resultados sugerem que a dupla ligação na posição 2-3 em conjugação com a função 4-oxo na estrutura dos flavonóides são os fatores mais importantes na atividade antioxidante dos flavonóides sobre as mitocôndrias. Ainda, a presença da estrutura o-di-OH no anel B, conforme observado na quercetina, favorece essa atividade via seqüestro de O2?-, enquanto que a ausência dessa característica estrutural na galangina, a favorece via diminuição da fluidez de membrana e/ou desacoplamento mitocondrial. Os ensaios realizados para avaliar o efeito dos flavonóides sobre as células HepG2 mostraram que galangina, luteolina e quercetina são capazes de induzir morte celular. Esse efeito parece estar associado à dissipação do potencial de membrana mitocondrial e à diminuição na capacidade energética celular, mais pronunciada no caso dos dois primeiros; porém, como essa diminuição na concentração de ATP não é drástica, a morte celular pode ocorrer por apoptose. Os experimentos realizados para avaliar essa possibilidade sugerem uma ativação das caspases via mitocôndria, observada pelo aumento das atividades de caspase -9 e -3 e também pela exposição de fosfatidil serina. A taxifolina que não apresentou capacidade de produzir dano celular, apresentou, por outro lado, capacidade de prevenir parcialmente a diminuição de viabilidade das células HepG2 induzida pelo pró-oxidante t-butilhidroperóxido, aparentemente por meio de sua atividade antioxidante que inibiu, também de forma parcial, o acúmulo de espécies reativas de oxigênio. / We carried out a structure-activity study addressing the protective/toxic effects of 5 flavonoids (quercetin, taxifolin, luteolin, catechin and galangin) upon mitochondrial aspects with emphasis on the mechanisms potentially involved in cell apoptosis. The major findings were: The 2,3 double bond/3-OH group in conjugation with the 4-oxo function on the C-ring in the flavonoid structure seems favour the interaction of these compounds with the mitochondrial membrane, decreasing its fluidity either inhibiting the respiratory chain of mitochondria or causing uncoupling; while the o-di-OH on the B-ring seems favour the respiratory chain inhibition, the absence of this structure seems favour the uncoupling activity. The flavonoids not affecting the respiration of mitochondria induced MPT. The ability of flavonoids to induce the release of mitochondria-accumulated Ca2+ correlated well with their ability to affect mitochondrial respiration on the one hand, and their inability to induce MPT, on the other. The data concerning the protective activity against the free radical formation showed that quercetin, luteolin and galangin were far more potent than taxifolin and catechin in affording protection against lipid peroxidation, although only quercetin was an effective scavenger of both DPPH? and O2?-. These results suggest that the 2,3-double bound in conjugation with the 4-oxo function in the flavonoid structure are major determinants of the antioxidant activity of flavonoids on mitochondria, the presence of an o-di-OH structure on the B-ring, as occurring in quercetin, favouring this activity via O2?- scavenging, while the absence of this structural feature in galangin, favouring it via decrease in membrane fluidity and/or mitochondrial uncoupling. The assays addressing the flavonoids effects on HepG2 cells showed that galangin, luteolin and quercetin are able to induce cell death. This effect appears to be linked to the mitochondrial membrane potential dissipation and consequent decrease in the cellular energy charge, more pronounced for the galangin or luteolin treatment. However, since this decrease in ATP content is not drastic, the apoptosis process can occur. The set of experiments performed in order to evaluate this possibility demonstrated caspases-9 and -3 activation and also phosphatidylserine exposure on the cell membrane. On the other hand, taxifolin, that did not present ability to induce injury to the cell, was able to partially inhibit a viability decrease of HepG2 cell exposed to the pro-oxidant t-butylhydroperoxide, probably on account of its capacity to partially decrease ROS formation.

Bastões plásticos quimioluminescentes, chamados light sticks, são usados por companhias pesqueiras e descartados nas praias. Moradores locais utilizam seus conteúdos como repelentes, óleo bronzeador e medicamento para dores nas articulações. Nós investigamos a reatividade das soluções de bastões de light sticks coletados em praias brasileiras e a toxicidade celular de seus conteúdos e também de soluções de light stick de bastões novos. Produtos da reação dos conteúdos de light stick descartado com 2\'-desoxiguanosina (dGuo) foram analisados por HPLC/UV/ESI-MS/MS. Um aduto foi purificado e caracterizado em espectrômetro de massas por Dissociação Induzida por Colisão (CID) e através de experimentos de 1H RMN. A estrutura do aduto revelou que o produto de degradação de bis(triclorofenil)oxalato é reativo para nucleófilos in vitro. O mesmo aduto foi detectado em DNA de timo de bezerro incubado in vitro com a solução do light stick descartado pelo uso HPLC/ESI-MS/MS. Além do DNA, albumina também foi modificada pelos conteúdos de light stick descartado. Células HepG2 foram incubadas por 16 h com 0.0125% - 0.12% (v/v) das soluções de light sticks: (i) coletadas na praia, (ii) obtidas imediatamente após a reação quimioluminescente no laboratório, e (iii) previamente a reação, contendo ou n-butil-ftalato, difenilantraceno, e bis(triclorofenil)oxalato (solução 1), ou dimetil-ftalato, H2O2, e salicilato de sódio (solução 2). A sobrevivência celular foi avaliada pelo teste do XTT, corante cristal violeta e lactato desidrogenase realizados em placas de 96 poços. Com as concentrações testadas foram obtidas significativamente a morte celular. O dano oxidativo ao DNA celular foi avaliado pela análise da 8-oxo-2\'-desoxiguanosina através do equipamento HPLC/ESI-MS/MS, que revelou aumento de alterações nas células tratadas com 0.006% das soluções de light stick de bastões descartados e novos. Nossos dados apontam genotoxicidade e citotoxicidade das soluções de light sticks e podem contribuir como alerta a autoridades públicas para proibição do uso incontrolado. / Chemiluminescent plastic rods, called light sticks, are used by fishery companies and littered on the shores. Local inhabitants use their contents as repellents, tanning oil, and medicine for joint pain. We have investigated the reactivity of spent light stick solutions collected on brazilian beaches and the cellular toxicity of their contents as well as that of brand-new light stick solutions. Products of the reaction of the spent light stick contents with 2\'-deoxyguanosine (dGuo) were analyzed by HPLC/UV/ESI-MS/MS. A dGuo adduct was purified and characterized in a Collision Induced Dissociation (CID) mass spectrometer and through 1H NMR experiments. The adduct structure revealed that a degradation product of bis(trichlorophenyl)oxalate is reactive towards nucleophiles in vitro. The same adduct was detected in calf thymus DNA incubated in vitro with spent light stick solution, by using HPLC/ESI-MS/MS. Besides DNA, albumin was also modified by spent light stick contents. HepG2 cells were incubated for 16 h with 0.0125% 0.12% (v/v) of light stick solutions: (i) collected on the beaches, (ii) obtained immediately after the chemiluminescent reaction in the laboratory, and (iii) previously the reaction, containing either n-butyl-phthalate, diphenylanthracene, and bis(trichlorophenyl)oxalate (solution 1), or dimethyl-phthalate, H2O2, and sodium salicylate (solution 2). Cell survival was evaluated by the XTT, crystal violet dye, and lactate dehydrogenase assays performed in 96 well plates. The concentrations tested were found to significantly kill cells. Oxidative damage to cellular DNA was assessed by 8-oxo-2\'-deoxyguanosine analysis via an HPLC/ESI-MS/MS equipment, which revealed increased changes in cells treated with 0.006% of spent and brand-new light stick solutions. Our data point to important genotoxicity and cytotoxicity of the light stick solutions and may contribute to alert public policies to ban their uncontrolled use.

Atualmente, a utilização de azo corantes pelas indústrias de tingimento constitui um problema ambiental e de saúde, considerando o lançamento de quantidades elevadas para o meio ambiente e a falta de dados toxicológicos dos corantes disponíveis para as indústrias. Vários estudos têm demonstrado o potencial genotóxico de diversos corantes azóicos, porém para os corantes Disperse Red 1, Disperse Orange 1 e o Disperse Red 13, não foram encontrados dados na literatura relativos à sua capacidade de dano ao material genético. Considerando que esses corantes são empregados em processos de tingimento no Brasil, esse trabalho teve como objetivo a avaliação de sua atividade mutagênica, utilizando o teste de micronúcleo (MN) em linfócitos humanos e em células HepG2. Os resultados obtidos no teste com linfócitos, demonstram que na menor concentração testada (0,2 µg/mL), o número de micronúcleos presentes foi semelhante ao controle negativo, mas esse número aumenta à medida que eleva-se a concentração. No entanto, a partir da concentração de 1,0 µg/mL, este valor começa a decair. Isso provavelmente se deve à citotoxidade dos corantes, levando à morte celular ou redução da divisão celular e, conseqüentemente, não há a formação de micronúcleo. Embora o perfil de mutagenicidade dos três corantes seja semelhante, o corante Disperse Red 13 parece ter maior potencial de dano sobre os linfócitos em relação aos demais, seguido pelo Disperse Red 1 e Disperse Orange 1, respectivamente. Os resultados obtidos para o teste de MN em células HepG2 foram semelhantes aos obtidos no teste feito em linfócitos. O aumento do número de micronúcleos em relação ao aumento da concentração dos corantes, ocorreu até o limite de 2,0 µg/mL em células HepG2, excetuando-se o corante Disperse Red 13, para o qual o limite foi de 1,0 µg/mL. E a partir desses pontos, considerados como limites, ocorreu uma redução no número de MN. Para este sistema celular, os três corantes parecem ter potencial mutagênico bastante semelhante. Portanto, a análise dos resultados mostrou que os corantes Disperse Red 13, Disperse Red 1 e Disperse Orange 1 são mutagênicos para sistemas celulares diferentes. Foi também avaliado Índice de Proliferação do Bloqueio de Citocinese (IPBC), que permite a avaliação de toxicidade celular ou atraso no ciclo celular por meio da determinação da proliferação celular nas culturas. Porém, neste estudo não foram observadas diferenças estatísticas entre o controle negativo e as concentrações testadas. Nossos resultados confirmam que os azo corantes constituem uma importante classe de contaminantes ambientais e devem ser avaliados e utilizados de forma cautelosa. / Currently, the use of azo dyes for the textile industries can causes direct and/or indirect effects on human health and on the environment, considering the discharge of industrial effluents that contain toxic dyes and the lack of reports in the literature about the toxic effects of these compounds. Several studies have been demonstrated the genotoxic effect of diverse azo dyes, however for the dyes Disperse Red 1, Disperse Orange 1 and Disperse Red 13 no information about their capacity to cause DNA damage was found in the literature. Considering that these dyes are used for dying processes in Brazil, the main of this work was the evaluation of the mutagenic activity of Disperse Red 1, Disperse Orange 1 and Disperse Red 13, using the micronucleus assay (MN) in human lymphocytes and HepG2 cells. For the lymphocytes assay, we observed that the number of micronucleus induced by the lowest concentration of each dye (0,2 µg/mL) was similar to the negative control. For the other concentrations we observed a dose response micronucleus formation, until 1,0 µg/mL. Above this concentration, the number of micronucleus has decreased, probably because of the cytotoxic effects of the dyes, which leads to cellular death or reduction of cellular division and, consequently, does not have the micronucleus formation. Although the mutagenicity profile of the three dyes is similar, Disperse Red 13 seems to be the strongest for the lymphocytes, followed by Disperse Red 1 and Disperse Orange 1, respectively. For the HepG2 cells the results were similar to the lymphocytes. For the three dyes we noted a dose dependent increase in the frequency of micronuclei. However, for the HepG2 the threshold for this increase was 2,0 µg/mL, except for Disperse Red 13, which the limit was at 1 µg/ml, after this point a reduction in the MN number occurred. For this cellular system, the three dyes seem to have similar mutagenic potential. Therefore, our results suggest that the dyes Disperse Red 13, Disperse Red 1 and Disperse Orange 1 are potentially mutagenic for different cellular systems. Besides, cytokinesis-block proliferation index (CBPI) was calculated, in order to evaluate cellular toxicity or delay in the cellular cycle through of the determination of the cellular proliferation in the cultures. No statistical difference was detected between the tested concentrations and the negative control. Our results confirmed that azo dyes constitute an important class of environmental contamination and they should be evaluated and used carefully.

Os azo corantes Disperse Red 1, Disperse Orange 1 e Disperse Red 13 são amplamente utilizados para o tingimento de fibras e são mutagênicos para o ensaio de Salmonella/microssoma e para o ensaio de micronúcleos. O aumento da complexidade e dificuldades para o tratamento de efluentes têxteis tem levado à busca constante de novas metodologias para o tratamento destes rejeitos. A cloração é um método amplamente empregado para a desinfecção de águas e efluentes, mas também para remover ou reduzir a cor do efluente a fim de atender o padrão de emissão da legislação brasileira. Porém, muitos trabalhos mostram que este tratamento muitas vezes não é capaz de remover a mutagenicidade dos corantes e em alguns casos pode até aumentar a toxicidade da amostra. Já a fotoeletrocatálise, aparentemente, é eficiente tanto na degradação desses compostos em amostras aquosas como na redução da atividade mutagênica, como demonstraram alguns ensaios preliminares. Este trabalho tem como objetivo a avaliação da eficiência do tratamento por fotoeletrocatálise na remoção da mutagenicidade dos azo corantes Disperse Red 1, Disperse Orange 1 e Disperse Red 13 presentes em amostras aquosas em comparação à cloração química convencional utilizando o teste de micronúcleos (MNs) em células HepG2. Os resultados demonstraram que a freqüência de MNs induzidos pelas diferentes concentrações testadas das soluções dos corantes estudados não foram significativamente diferentes do controle negativo. Nossos dados também revelaram que os índices de proliferação do bloqueio da citocinese (IPBC) em cultura de células HepG2 tratadas com os três corantes após a cloração e fotoeletrocatálise também não apresentaram diferenças estatísticas em relação aos seus respectivos controles negativos. A análise comparativa dos azo corantes Disperse Red 1, Disperse Orange 1 e Disperse Red 13 clorados e fotoeletrocatalisados com os corantes originais estudados pelo nosso grupo (CHEQUER, 2008; CHEQUER et al., 2009) mostrou uma diminuição no número de MNs indicando que após os tratamentos houve a remoção da mutagenicidade a partir da concentração de 1,0 µg/mL para os três corantes estudados. Portanto, podemos concluir que a cloração química convencional e a fotoeletrocatálise, nas condições testadas, são eficientes na remoção da mutagenicidade dos azo corantes Disperse Red 1, Disperse Orange 1 e Disperse Red 13 em relação à indução de micronúcleos. / The azo dyes Disperse Red 1, Disperse Orange 1 and Disperse Red 13 are widely used in dyeing processes and are mutagenic for Salmonella/microsome and micronucleus assays. The increasing of the complexity and difficulties for treatments of textile effluents has led to a constant search for new methodologies for the treatment of these wastewaters. Chlorination is a method extensively used for water and wastewaters disinfection and to remove or reduce the color of effluents in order to respect the standard of discharges issued by the Brazilian legislation. However, a lot of studies have shown that this treatment is not often able to remove the mutagenicity of the dyes, and in some cases it may even increase the toxicity of the sample. On the other hand, photoelectrocatalysis is apparently efficient both in the degradation of these compounds in aqueous samples and in reduction of the mutagenic activity, as demonstrated by some preliminary assays. This study aims to evaluate the efficiency of the photoelectrocatalysis treatment in the removal of the mutagenicity of the azo dyes Disperse Red 1, Disperse Orange 1 and Disperse Red 13 present in aqueous sample in comparison to conventional chemical chlorination using the micronucleus test (MNs) in HepG2 cells. The results showed that the frequency of MNs induced by different tested concentrations of the solutions of the studied dyes were not significantly different from the negative control. Our data also revealed that the cytokinesis-block proliferation index (CPBI) in cultures of HepG2 cells treated with the three dyes after chlorination and photoelectrocatalysis also showed no statistical differences related to the their respective negative controls. The comparative analysis of azo dyes chlorinated and photoelectrocatalysed Disperse Red 1, Disperse Orange 1 and Disperse Red 13 with the original dyes studied by our group (CHEQUER, 2008; CHEQUER et al., 2009) showed a decrease in the number of MNs indicating that after the treatments occurred the removal of the mutagenicity potencial at concentration of 1,0 µg/mL for the three dyes studied. Therefore, we conclude that conventional chemical chlorination and photoelectrocatalysis, under the conditions tested, are effective in removing of the mutagenicity of the azo dyes Disperse Red 1, Disperse Orange 1 and Disperse Red 13 related to induction of micronucleus.

Bastões plásticos quimioluminescentes, chamados light sticks, são usados por companhias pesqueiras e descartados nas praias. Moradores locais utilizam seus conteúdos como repelentes, óleo bronzeador e medicamento para dores nas articulações. Nós investigamos a reatividade das soluções de bastões de light sticks coletados em praias brasileiras e a toxicidade celular de seus conteúdos e também de soluções de light stick de bastões novos. Produtos da reação dos conteúdos de light stick descartado com 2\'-desoxiguanosina (dGuo) foram analisados por HPLC/UV/ESI-MS/MS. Um aduto foi purificado e caracterizado em espectrômetro de massas por Dissociação Induzida por Colisão (CID) e através de experimentos de 1H RMN. A estrutura do aduto revelou que o produto de degradação de bis(triclorofenil)oxalato é reativo para nucleófilos in vitro. O mesmo aduto foi detectado em DNA de timo de bezerro incubado in vitro com a solução do light stick descartado pelo uso HPLC/ESI-MS/MS. Além do DNA, albumina também foi modificada pelos conteúdos de light stick descartado. Células HepG2 foram incubadas por 16 h com 0.0125% - 0.12% (v/v) das soluções de light sticks: (i) coletadas na praia, (ii) obtidas imediatamente após a reação quimioluminescente no laboratório, e (iii) previamente a reação, contendo ou n-butil-ftalato, difenilantraceno, e bis(triclorofenil)oxalato (solução 1), ou dimetil-ftalato, H2O2, e salicilato de sódio (solução 2). A sobrevivência celular foi avaliada pelo teste do XTT, corante cristal violeta e lactato desidrogenase realizados em placas de 96 poços. Com as concentrações testadas foram obtidas significativamente a morte celular. O dano oxidativo ao DNA celular foi avaliado pela análise da 8-oxo-2\'-desoxiguanosina através do equipamento HPLC/ESI-MS/MS, que revelou aumento de alterações nas células tratadas com 0.006% das soluções de light stick de bastões descartados e novos. Nossos dados apontam genotoxicidade e citotoxicidade das soluções de light sticks e podem contribuir como alerta a autoridades públicas para proibição do uso incontrolado. / Chemiluminescent plastic rods, called light sticks, are used by fishery companies and littered on the shores. Local inhabitants use their contents as repellents, tanning oil, and medicine for joint pain. We have investigated the reactivity of spent light stick solutions collected on brazilian beaches and the cellular toxicity of their contents as well as that of brand-new light stick solutions. Products of the reaction of the spent light stick contents with 2\'-deoxyguanosine (dGuo) were analyzed by HPLC/UV/ESI-MS/MS. A dGuo adduct was purified and characterized in a Collision Induced Dissociation (CID) mass spectrometer and through 1H NMR experiments. The adduct structure revealed that a degradation product of bis(trichlorophenyl)oxalate is reactive towards nucleophiles in vitro. The same adduct was detected in calf thymus DNA incubated in vitro with spent light stick solution, by using HPLC/ESI-MS/MS. Besides DNA, albumin was also modified by spent light stick contents. HepG2 cells were incubated for 16 h with 0.0125% 0.12% (v/v) of light stick solutions: (i) collected on the beaches, (ii) obtained immediately after the chemiluminescent reaction in the laboratory, and (iii) previously the reaction, containing either n-butyl-phthalate, diphenylanthracene, and bis(trichlorophenyl)oxalate (solution 1), or dimethyl-phthalate, H2O2, and sodium salicylate (solution 2). Cell survival was evaluated by the XTT, crystal violet dye, and lactate dehydrogenase assays performed in 96 well plates. The concentrations tested were found to significantly kill cells. Oxidative damage to cellular DNA was assessed by 8-oxo-2\'-deoxyguanosine analysis via an HPLC/ESI-MS/MS equipment, which revealed increased changes in cells treated with 0.006% of spent and brand-new light stick solutions. Our data point to important genotoxicity and cytotoxicity of the light stick solutions and may contribute to alert public policies to ban their uncontrolled use.

Os azo corantes Disperse Red 1, Disperse Orange 1 e Disperse Red 13 são amplamente utilizados para o tingimento de fibras e são mutagênicos para o ensaio de Salmonella/microssoma e para o ensaio de micronúcleos. O aumento da complexidade e dificuldades para o tratamento de efluentes têxteis tem levado à busca constante de novas metodologias para o tratamento destes rejeitos. A cloração é um método amplamente empregado para a desinfecção de águas e efluentes, mas também para remover ou reduzir a cor do efluente a fim de atender o padrão de emissão da legislação brasileira. Porém, muitos trabalhos mostram que este tratamento muitas vezes não é capaz de remover a mutagenicidade dos corantes e em alguns casos pode até aumentar a toxicidade da amostra. Já a fotoeletrocatálise, aparentemente, é eficiente tanto na degradação desses compostos em amostras aquosas como na redução da atividade mutagênica, como demonstraram alguns ensaios preliminares. Este trabalho tem como objetivo a avaliação da eficiência do tratamento por fotoeletrocatálise na remoção da mutagenicidade dos azo corantes Disperse Red 1, Disperse Orange 1 e Disperse Red 13 presentes em amostras aquosas em comparação à cloração química convencional utilizando o teste de micronúcleos (MNs) em células HepG2. Os resultados demonstraram que a freqüência de MNs induzidos pelas diferentes concentrações testadas das soluções dos corantes estudados não foram significativamente diferentes do controle negativo. Nossos dados também revelaram que os índices de proliferação do bloqueio da citocinese (IPBC) em cultura de células HepG2 tratadas com os três corantes após a cloração e fotoeletrocatálise também não apresentaram diferenças estatísticas em relação aos seus respectivos controles negativos. A análise comparativa dos azo corantes Disperse Red 1, Disperse Orange 1 e Disperse Red 13 clorados e fotoeletrocatalisados com os corantes originais estudados pelo nosso grupo (CHEQUER, 2008; CHEQUER et al., 2009) mostrou uma diminuição no número de MNs indicando que após os tratamentos houve a remoção da mutagenicidade a partir da concentração de 1,0 µg/mL para os três corantes estudados. Portanto, podemos concluir que a cloração química convencional e a fotoeletrocatálise, nas condições testadas, são eficientes na remoção da mutagenicidade dos azo corantes Disperse Red 1, Disperse Orange 1 e Disperse Red 13 em relação à indução de micronúcleos. / The azo dyes Disperse Red 1, Disperse Orange 1 and Disperse Red 13 are widely used in dyeing processes and are mutagenic for Salmonella/microsome and micronucleus assays. The increasing of the complexity and difficulties for treatments of textile effluents has led to a constant search for new methodologies for the treatment of these wastewaters. Chlorination is a method extensively used for water and wastewaters disinfection and to remove or reduce the color of effluents in order to respect the standard of discharges issued by the Brazilian legislation. However, a lot of studies have shown that this treatment is not often able to remove the mutagenicity of the dyes, and in some cases it may even increase the toxicity of the sample. On the other hand, photoelectrocatalysis is apparently efficient both in the degradation of these compounds in aqueous samples and in reduction of the mutagenic activity, as demonstrated by some preliminary assays. This study aims to evaluate the efficiency of the photoelectrocatalysis treatment in the removal of the mutagenicity of the azo dyes Disperse Red 1, Disperse Orange 1 and Disperse Red 13 present in aqueous sample in comparison to conventional chemical chlorination using the micronucleus test (MNs) in HepG2 cells. The results showed that the frequency of MNs induced by different tested concentrations of the solutions of the studied dyes were not significantly different from the negative control. Our data also revealed that the cytokinesis-block proliferation index (CPBI) in cultures of HepG2 cells treated with the three dyes after chlorination and photoelectrocatalysis also showed no statistical differences related to the their respective negative controls. The comparative analysis of azo dyes chlorinated and photoelectrocatalysed Disperse Red 1, Disperse Orange 1 and Disperse Red 13 with the original dyes studied by our group (CHEQUER, 2008; CHEQUER et al., 2009) showed a decrease in the number of MNs indicating that after the treatments occurred the removal of the mutagenicity potencial at concentration of 1,0 µg/mL for the three dyes studied. Therefore, we conclude that conventional chemical chlorination and photoelectrocatalysis, under the conditions tested, are effective in removing of the mutagenicity of the azo dyes Disperse Red 1, Disperse Orange 1 and Disperse Red 13 related to induction of micronucleus.