Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias. / Las células madre mesenquimáticas (del inglés Mesenchymal Stem Cells, MSC), son células adultas indiferenciadas, que poseen propiedades de autorenovación, inmunomodulación y cuentan con una baja inmunogenicidad. Debido a ello son actualmente consideradas como potenciales agentes terapéuticos celulares para el tratamiento de variadas patologías. En el presente estudio se comparó el potencial de proliferación, inmunomodulación e inmunogenicidad in vitro de MSC derivadas de médula ósea (MO) y tejido adiposo (TA) fetal bovino. Las MSC fueron asiladas en base a su capacidad de adherencia al plástico y a su morfología fibroblastoide. El potencial de proliferación se determinó en dos concentraciones celulares (5000 y 8500 células/cm2) durante 10 y 15 días de cultivo, respectivamente. La expresión de genes de inmunomodulación indolamina 2,3 dioxigenasa (IDO), interleuquina 6 (IL-6), factor de crecimiento de transformante β1 (TGFβ1), prostaglandina E2 (PGE2) e interleuquina 10 (IL-10) fue cuantificada mediante PCR cuantitativo (Q-PCR) en MSC-MO y MSC-TA estimuladas con interferón γ (IFNγ). Adicionalmente, se cuantificaron los niveles de expresión de genes de inmunogenicidad complejo principal de histocompatibilidad I y II (MHC-I y II) y moléculas coestimuladoras de linfocitos T (CD80 y CD86). Además, se evaluó el efecto de medio condicionado de ambas líneas celulares estimuladas con IFNγ sobre la proliferación de linfocitos de sangre periférica (PBL) bovina activadas con aloantígenos. La población de MSC provenientes de MO y TA adherentes al plástico expresaron mayores (P<0,05) niveles de mRNA de marcadores mesenquimales (CD105, CD90 y CD73) en comparación a marcadores hematopoyéticos (CD45 y CD34). Las MSC-MO doblaron su población en menor (P<0,01) tiempo en comparación a MSC-TA (2,9 vs 4,4 días, respectivamente). La exposición de MSC-MO y MSC-TA a IFNγ activó la expresión de mRNA de IDO y aumentó (P<0,05) la concentración del metabolito de IDO, quinurenina en el medio condicionado de MSC. Además, ambas líneas celulares expresaron niveles de mRNA de IL-6, PGE2, TGFβ1 e IL-10 con o sin tratamiento de IFNγ. Las MSC-MO expresan mayores (P<0,05) niveles de mRNA de MHC-II en comparación con MSC-TA. El medio condicionado de ambas líneas celulares suprime la proliferación de PBL bovino. En conclusión, los potenciales de proliferación e inmunogenicidad de MSC son dependientes de la fuente de origen tisular, debido a que las MSC-MO poseen alto potencial de proliferación e inmunogenicidad en comparación a MSC-TA. Sin embargo, ambas líneas de MSC poseen similares potenciales de inmunomodulación. / Mesenchymal stem cells (MSC) are undifferentiated adult cells that possess self-renewal, immunomodulating and low immunogenicity properties. Hence, they are currently considered as potential therapeutic agents for the treatment of various pathologies. In the present study, proliferation, immunomodulation and immunogenicity in vitro potentials were compared between MSCs derived from bone marrow (BM) and adipose fetal bovine tissue (AT). MSC were isolated based on their ability to adhere to plastic and fibroblastoid morphology. The proliferation potential was determined at two cell concentrations (5000 and 8500 cells / cm2) during 10- and 15-days culture periods, respectively. Relative expression of indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO), interleukin-6 (IL-6), transforming growth factor β1 (TGFβ1), prostaglandin E2 (PGE2) and interleukin-10 (IL-10) were quantified using quantitative PCR (Q PCR) in MSC-BM and MSC-AT stimulated with IFNγ. Additionally, the mRNA levels of immunogenicity genes, major histocompatibility complex I and II (MHC-I and II) and T-cell costimulatory molecules (CD80 and CD86) were determined. In addition, the effect of conditioned medium from IFNγ-stimulated MSC was estimated on the proliferation of alloantigen-activated bovine peripheral blood lymphocytes (PBL). The plastic-adherent population of MSC derived from BM and AT expressed higher (P <0.05) mRNA levels of mesenchymal markers (CD105, CD90 and CD73) compared to hematopoietic markers (CD45 and CD34). MSC-MO doubled population in a shorter (P <0.01) time period compared to MSC-AT (2.9 vs. 4.4 days, respectively). Exposure of MSC-BM and MSC-AT to IFNγ activated the expression of IDO mRNA and increased (P <0.05) IDO-metabolite kinurenine concentration in conditioned medium of MSC. Both MSC lines expressed levels of IL-6, PGE2, TGFβ1 and IL-10 mRNA with or without IFNγ treatment. MSC-BM expresses higher (P <0.05) mRNA levels of MHC-II mRNA in comparison to MSC-AT. Conditioned medium of MSC cell lines suppress the proliferation of bovine PBL. In conclusion, the potential for proliferation and immunogenicity are tissue-source dependent, since MSC-MO has a high potential for proliferation and immunogenicity compared to MSC-TA. However, both MSC lines display similar potential for immunomodulation. / Financiamiento: Proyecto Fondef Idea ID15I10129 y PRONABEC y Beca Presidente de la República del Perú.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las células madre mesenquimáticas (MSC) son células multipotentes que pueden ser aisladas de diversas fuentes tisulares incluyendo médula ósea (MO) y tejido adiposo (TA). Tanto su potencial de diferenciación como la producción de factores inmunomoduladores, regenerativos, angiogénicos y antibacterianos han generado gran expectativa en el último tiempo sobre el potencial uso de las MSC para el tratamiento de enfermedades tanto en medicina humana como veterinaria. La utilización de MSC en el equino, responde principalmente a la necesidad de tratar patologías asociadas a la actividad deportiva. Las MSC provenientes de tejido adulto equino han demostrado capacidad in vitro de diferenciación tenogénica al ser expuestas al factor BMP-12. En el caso de MSC de origen fetal, se ha reportado que estas células poseen un mayor potencial de proliferación y diferenciación comparado con MSC obtenidas desde tejidos adultos. Sin embargo, el potencial de diferenciación tenogénica de las MSC derivadas de médula ósea fetal equina no ha sido previamente evaluado. El objetivo del presente estudio es evaluar el potencial in vitro de diferenciación tenogénica de MSC obtenidas de la medula ósea fetal equina. MSC provenientes de la MO fetal equina fueron sembradas a una concentración de 23 x 105 células/cm2 bajo el efecto de tres dosis de BMP-12 (25, 50 y 100 ng/mL). La expresión de los genes marcadores de tendón SCX, COL1α1, TNMD y DCN fue evaluada los días 0 y 21. Posteriormente, se evaluó el efecto de una dosis (50 ng/mL) de BMP-12 durante el proceso de diferenciación tenogénica. En ambos experimentos no se apreciaron diferencias morfológicas tanto para células control, como tratadas con BMP-12. La expresión del marcador tenogénicos TNMD no fue detectada en MSC. En tanto, los niveles de mRNA de SCX disminuyeron (P<0,05) el día 21 de cultivo tanto en MSC no expuestas a BMP-12, como en MSC tratadas con 25, 50 y 100 ng/mL de BMP-12. Los niveles de mRNA de COL1α1 no fueron distintos (P>0,05) en MSC controles y en MSC tratadas con 25, 50 y 100 ng/mL de BMP-12. En comparación, los niveles de expresión relativa del gen DCN, aumentaron (P<0,05) en MSC tratadas con 25 ng/mL de BMP-12. En la evaluación del efecto temporal se detectó una disminución (P<0,05) de SCX el día 21 en comparación con el día 0 en MSC tratadas con BMP-12. La expresión relativa del gen COL1α1 no fue distinta (P>0,05) en MSC tratadas con BMP-12 versus el control no tratado durante los 21 días de cultivo y las células de día 0. Los niveles de mRNA de DCN aumentaron (P<0,05) el día 21 en MSC 2 tratadas con BMP-12, en comparación con el día 0. En conclusión, la suplementación con BMP-12 en MSC fetales equinas durante 21 días disminuye los niveles de mRNA de SCX, lo que a su vez no permitió activar la transcripción del gen TNMD, ni aumentar la expresión de COL1α1. El aumento en la expresión del marcador tenogénico DCN en MSC tratadas con BMP-12 sugiere que este factor indujo un progreso en el proceso de diferenciación hacia un estadio avanzado de diferenciación tenogénica. / Mesenchymal stem cells (MSC) are multipotent cells than can be isolated from diverse tissue sources including bone marrow (BM) and adipose tissue (AT). The differentiation and immunomodulatory potentials, and the production of trophic factors involved in regenerative, angiogenic and antibacterial activity have generated great expectative on the potential use of MSC for the treatment of diverse pathologies in veterinary and human medicine. The use of MSC in equine responds mainly to the need to treat pathologies associated with sports activities. MSC from adult tissue have proven the capacity for in vitro tenogenic differentiation when exposed to BMP-12 factor. In MSC from fetal origin it has been reported that these cells have a greater proliferation and differentiation potential compared with MSC from adult sources. However, the potential for tenogenic differentiation of MSC derived from equine foetal BM has not been previously reported. The objective of the present study was to evaluate the in vitro tenogenic differentiation potential of MSC derived from equine fetal BM. Cells were seeded at a 23 x 105 cells/cm2 under the effects of three doses of BMP-12 (25, 50 and 100 ng/mL). The expression from tenogenic marker genes SCX, COL1α1, TNMD and DCN was evaluated at days 0 and 21. Cell morphology and relative expression of genes was evaluated at days 7, 14 and 21, as well an immunofluorescence evaluation of COL1α1 on day 21. No morphological differences were observed for both control and cells treated with BMP-12. The tenogenic marker TNMD was not detected in MSC. Levels of SCX decreased (P<0.05) on day 21 for both control and cells treated with 25, 50 and 100 ng/mL of BMP-12. In comparison, mRNA levels of COL1α1 were not different (P>0.05) in MSC control and treated with 25, 50 and 100 ng/mL of BMP-12. DCN relative expression levels increased (P<0.05) in MSC treated with 25 ng/mL of BMP-12. In the evaluation of the temporary effect, SCX levels decrease (P<0.05) on day 21 compared to day 0 on MSC treated with BMP-12. During the 21 days of culture, COL1α1 relative expression was not different (P>0.05) in MSC treated with BMP-12 versus the untreated control. DCN mRNA levels increased (P<0.05) on day 21 in MSC treated with BMP-12 compared to day 0. In conclusion, reduction in mRNA levels of SCX after BMP-12 treatment for 21 days may have prevented the activation of the TNMD gen and the increment of COL1α1 expression. The increase in expression of the tenogenic marker DCN in MSC treated with BMP-12 suggests that this 4 factor may have induced a progress in the differentiation process until an advanced state of tenogenic differentiation.

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias. / Las células madre mesenquimáticas (MSC) pueden ser candidatas adecuadas para la derivación de gametos in vitro debido a su abundancia y a su alto potencial de diferenciación. La diferenciación de las células germinales es un proceso complejo que requiere tanto de regulación endocrina y auto-paracrina en un entorno específico, como de interacciones directas celulares proporcionadas por las células somáticas del testículo. Las células de Sertoli (CS) juegan un papel esencial formando nichos para las células germinales y proporcionando factores esenciales para su diferenciación. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto del co-cultivo de CS en la diferenciación de MSC derivadas de tejido adiposo (MSC-TA) y medula ósea (MSC-MO) fetales bovinas hacia linaje de células germinales. Las CS fueron aisladas desde parénquima de testículo de toro adulto y fueron caracterizadas mediante cuantificación de la expresión del biomarcador de CS, Wilms tumor 1 (WT1) y de los niveles de mRNA de Receptor de Andrógeno (AR) utilizando citometría de flujo (FC) y PCR cuantitativo (Q-PCR). Las MSC fueron aisladas desde tejido adiposo y médula ósea mediante adherencia al plástico y posteriormente fueron co-cultivadas sobre monocapas de CS durante 21 días. Muestras de cultivos celulares fueron obtenidas cada 7 días y analizadas para determinación de niveles de mRNA de genes endógenos β-ACTINA y GAPDH, genes de pluripotencia OCT4 y NANOG, genes germinales FRAGILIS, STELLA, VASA y genes germinales de macho DAZL, SRY, PIWIL2 y STRA8 mediante Q-PCR. Adicionalmente se evaluó la expresión de Dazl, Nanog y Oct4 mediante FC e IF. Una alta proporción (85,5%±5,5) de CS fueron positivas para WT1. Los niveles mRNA DAZL y PIWIL2 aumentaron el día 14 de diferenciación en co-cultivos de MSC-TA/CS en comparación con los monocultivos y co-cultivos de MSC-MO/CS. Los niveles de mRNA de NANOG fueron activados en MSC-MO y MSC-TA co-cultivadas con CS luego de 7 y 14 días de cultivo. Los niveles de mRNA de OCT4 aumentaron (P<0,05) el día 14 en los co-cultivos de MSC-MO/CS y de MSC-TA/CS en comparación con los monocultivos. Los niveles de mRNA de CD73 aumentaron (P<0,05) en los co-cultivos el día 21 en comparación con los monocultivos de MSC-MO y MSC-TA, mientras los niveles de mRNA de CD105 disminuyeron (P<0,05) en el co-cultivo de MSC-TA/CS al día 21en comparación con el monocultivos de MSC-TA. Adicionalmente, los niveles de mRNA de SCP3 disminuyeron (P<0,05) en los co-cultivos de MSC-MO/CS y de MSC-TA/CS el día 7 y 14 en comparación con el monocultivo de MSC-TA y no se detectó en el día 21. Los patrones de expresión génica en los co-cultivos sugieren que las MSC fetales bovinas poseen potencial de diferenciación germinal y que las MSC-TA fetales bovinas tienen mayor capacidad de diferenciación en comparación a las MSC-MO. Considerando la disminución en la expresión de SCP3 en los co-cultivos, estos resultados sugieren que las MSC alcanzaron un estado de diferenciación germinal premeiótico temprano / Mesenchymal stem cells (MSC) may be suitable candidates for in vitro gamete derivation due to their abundant source and wide differentiation potential. Germ cell differentiation requires endocrine and auto/paracrine regulation in a specific environment, as well as direct cell-to-cell interactions provided by the somatic cells of the testis. Sertoli cells (SC) play an essential role by forming niches and providing essential factors for germ cell differentiation. The aim of the present study was to evaluate the effect of co-culture of SC on the germ cell differentiation potential of bovine fetal MSC derived from adipose tissue (MSC-TA) and bone marrow (MSC-BM). Sertoli cells were isolated from bull testis parenchyma and characterized by quantification of biomarker wilms tumor 1 (WT1) expression and androgen receptor (AR) mRNA levels using flow-cytometry (FC) and quantitative-PCR (Q-PCR) analyses. bfMSC were isolated from adipose tissue and bone marrow and were co-cultured over monolayers of SC for 21 days. Cell culture samples were obtained every 7 days and analyzed for endogenous genes β-ACTIN y GAPDH, pluripotency genes OCT4 y NANOG, germinal genes FRAGILIS, STELLA, VASA and male germinal genes DAZL, SRY, PIWIL2 and STRA8 using Q-PCR. A high (P < 0.05) proportion of SC (85,5%±5,5) were positive for WT1 and expressed high levels of WT1 and AR mRNA levels. Levels of DAZL and PIWIL2 mRNA were up-regulated at day 14 of differentiation in bfMSC-SC co-cultures compared to monocultures and co-cultures of MSC-BM/CS. NANOG mRNA levels were activated in MSC-BM and MSC-TA co-cultured with SC at days 7 and 14 of culture. OCT4 mRNA levels increased (P <0.05) at day 14 in co-cultures of MSC-BM/CS and MSC-TA/CS compared to monocultures. CD73 mRNA levels increased (P <0.05) in the co-cultures at day 21. CD105 mRNA levels were decreased (P < 0.05) in the co-culture of MSC-TA/CS at day 21 of culture compared to monoculture of MSC-TA. SCP3 mRNA levels were down-regulated in the co-cultures of MSC-BM/CS and of MSC-TA/CS at 14 day compared to monoculture and were not detected at day 21. Thus, the gene expression patterns in MSC suggest that they have the potential for germinal differentiation and that bfMSC-TA have greater differentiation capacity towards germinal lineage in relation to MSC-BM. Moreover, reduction in SCP3 mRNA throughout the process of germinal differentiation suggest that MSC achieved an early premeiotic germ cell differentiation state / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1161251.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina las diferencias estructurales y ultraestructurales, entre las células madre de cáncer de mama triple negativo (CMTN) y las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo. La separación de células con el fenotipo CD44+/CD24-, se realiza para las líneas celulares MDA-MB 436 y MDA-MB 231 mediante la técnica de separación inmunomagnética que emplea perlas magnéticas marcadas con monoclonales específicos para este fenotipo (Miltenyi), para lo cual utiliza el separador magnético MACS (Miltenyi) y las columnas MS (Miltenyi). Se encuentran diferencias morfológicas mediante microscopia electrónica de transmisión y microscopia electrónica de barrido entre las CMC y los otros inmunofenotipos seleccionados CD44+/CD24+ y CD44-/CD24-. Entre estas diferencias están la forma esférica y menor tamaño (13µm) de las CMC de la línea celular MDA-MB 436 en comparación a los otros inmunofenotipos. Se encuentran entre las células de la línea MDA-MB 436 que experimentan, transición de células mesenquimales a células epitelial (TME), y las células madre mesenquimales derivadas. Recomienda estudios a nivel de expresión e inmunomarcaje para corroborar la TME. / Tesis

Compara el porcentaje y calidad postdescongelamiento de células madre espermatogoniales (SSC) de alpaca proliferadas y no proliferadas in vitro. Para ello se emplearon biopsias testiculares de 22 animales provenientes del camal municipal de Huancavelica (aproximadamente 22 horas post mortem). Los parámetros espermáticos iniciales (movilidad y concentración) fueron evaluados en cada muestra a partir de espermatozoides epididimarios. Se obtuvieron suspensiones de células testiculares mediante digestiones enzimáticas y se evaluó la concentración y vitalidad de las células, luego, las células testiculares fueron cultivadas in vitro (FP), criopreservadas mediante un protocolo termocontrolado lento, descongeladas y proliferadas (CP), o proliferadas y luego criopreservadas (PC). La evaluación de las células fue realizada mediante citometría de flujo con marcadores específicos para SSC (DBA-FITC) y Flow Cellect mitopotential Red Kit para la calidad celular (Potencial mitocondrial activo y apoptosis). El porcentaje de SSC en las muestras PC fue de 6.3% ± 1.2, el cual fue mayor que el porcentaje de SSC en las muestras CP, que fue de solo 1.5% ± 0.3 (p< 0.05). La calidad de las SSC fue mejor preservada en las PC, que mostró un 72.6% de células con potencial mitocondrial activo (PMA), 7.8 % de células apoptóticas (A) y 8.1% de células en apoptosis temprana (EA), mientras que en las CP el porcentaje de PMA fue de 59.7%, y valores de 21.3% de apoptosis y 11.5 de apoptosis temprana, que difieren significativamente de las PC y las FP. Se concluye que el cultivo de células testiculares de alpaca previo a la criopreservación permite conservar un mayor porcentaje (6,3%± 1.2) de SSC que la criopreservación sin cultivo previo (1.5% ± 0.3); asimismo conserva la calidad de las SSC a diferencia de las células criopreservadas sin cultivo. De esta forma, el presente trabajo constituye un primer reporte en el cual las técnicas de cultivo celular y criopreservación permiten el mantenimiento del porcentaje y la calidad de las SSC de alpaca. / Tesis

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Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Evalúa el volumen, el recuento de células nucleadas totales (CNT), el recuento de células CD34+ de las USCU en el Instituto Nacional Materno Perinatal de Lima (INMP), y compararlos con criterios mínimos de celularidad NETCORD, determinando el porcentaje que satisface los criterios de aceptación para ser criopreservadas, obteniendo datos que sirven como referencia previa a la realización de un futuro BSCU público peruano. En cuanto a materiales y métodos; se colectaron 100 USCU, en bolsas de sangre simples con anticoagulante CPD, en partos vaginales por el método in útero. Se determina el volumen, recuentos de células nucleadas totales (CNT), por hematología y células CD34+ vivas, así como porcentaje de viabilidad celular, por citometría de flujo. El resultado determina que el 46% de las USCU deben ser descartadas por no alcanzar los umbrales mínimos de celularidad para ser criopreservadas en un BSCU. Se halla correlación positiva entre los parámetros de volumen, CNT y células CD34+. Determinando que las USCU de recién nacidos de mayor peso y de sexo femenino presentan mayor volumen y recuentos de células. No se encuentra relación de estos parámetros de celularidad con respecto a la edad materna. En conclusión es necesario que se tome en cuentas estas variables para optimizar la colecta de las USCU de nuestra población y obtener mayores volúmenes y recuentos de células que permita almacenar unidades de alta calidad en un futuro BSCU en nuestro país. / Tesis

Se realiza un estudio clínico en el lnstituto de Cirugía Maxilofacial e Implantologia tras pasar el comité ético del Centro Medica Teknon. Es un estudio randomizado, controlado utilizando un diseño tipo "split mouth" en el cual cada paciente sirve de propio control. SE realiza a 5 pacientes, con atrofia posterior del maxilar superior sin posibilidad de instalar implantes fueron tratados con reconstrucción mediante la técnica de elevación sinusal bilateral, rellenando un sena con Bio-ass (control) y el atm seno con Bio-oss + Stem cells y células progenitoras mesenquimales de la cresta Waca previamente expandidas en un birreactor. La randomización resulto en la utilización de las Stem cells, en el lado derecho en 3 casos y en el lado izquierdo en los resto: 2 casos. Se realizaron estudios radiológicos mediante radiología simple y TAC preoperatorio y postoperatorios comparando datos volumétricos y de densitometrías. Se instalaron implantes dentales realizando controles clínicos y análisis de estabilidad mediante RFA con la técnica de Ostell. Se termino el tratamiento con la instalación de prótesis dentales implanto soportadas y el estudio con el control de la cotocacion de las prótesis. Objetivos: Objetivo general: Valorar la contribución de las células madre adultas en la regeneración ósea en un modelo clínico experimental. Demostrar que es posible la regeneración ósea mediante ingeniería tisular en humanos. Objetivos específicos: 1. Evaluar la seguridad del empleo de células madre adultas en la reconstrucción del maxilar posterior atrófico 2. Valorar diferencias ultra estructurales entre el hueso regenerado en el seno maxilar reconstruido con stem celts y con el material osteo conductor aislado 3. Determinar si existen diferencias en el volumen óseo alcanzado con ambos métodos. 4. Analizar la respuesta postoperatoria de las zonas tratadas tras el empleo de las dos técnicas.

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Ciencias Animales. / Las células madre mesenquimales (CMM) son células progenitoras multipotentes que poseen potenciales de auto-renovación y diferenciación multilinaje (osteogénico, condrogénico y adipogénico). La capacidad de diferenciación de las CMM se extiende principalmente hacia linajes mesodérmicos como osteogénico, condrogénico y adipogénico; sin embargo, estudios recientes in vitro han demostrado que las CMM poseen capacidad para diferenciarse hacia tejidos ectodérmicos como el neuronal. El objetivo del presente estudio fue determinar la capacidad de diferenciación neurogénica in vitro de CMM bovinas aislada desde medula ósea (MO) fetal. La detección de marcadores mesenquimales CD90, CD105 y CD73, hematopoyéticos CD34 y CD45 y de pluripotencia OCT4 y NANOG fue realizada por medio de PCR-cuantitativo (Q-PCR) y citometría de flujo. El protocolo 1 de diferenciación neurogénica consistió en una pre-inducción neuronal por 24 horas con medio DMEM suplementado con 20% de suero fetal bovino (SFB) y una posterior inducción neuronal con Betamercaptoetanol (BME) durante 6 días. El protocolo 2 de diferenciación neurogénica consistió en medio DMEM suplementado con Fibroblast Growth Factor-basic (bFGF), Epidermal Growth Factor (EGF) durante 24 horas y posteriormente durante 120 horas con medio de cultivo suplementado con hidroxianisol butilado (BHA), cloruro de potasio, ácido valproico, forskolina y suplemento neuronal. Muestras celulares fueron obtenidas a las 0, 24, 96 y 144 horas de cultivo. La expresión de genes fue evaluada por Q-PCR e inmunofluorescencia. Los análisis de Q-PCR en CMM indiferenciadas, detectaron mayores (P<0,05) niveles de mRNA de marcadores mesenquimaticos CD73, CD90 y CD105 en relación a los niveles de CD34 (151.2, 245.1 y 238.1 veces, respectivamente). Mediante citometría de flujo se determinó una alta proporción de CMM positivas para marcadores mesenquimáticos CD29 (76,3%), CD73 (96,8%) y marcadores de pluripotencia Oct4 (94,6%) y Nanog (88,4%). En contraste, una alta proporción de CMM fue negativa para marcadores hematopoyéticos CD34 y CD45 (93,4% y 95,6%, respectivamente). Durante el el protocolo 1 de diferenciación neuronal se detectó una disminución (P<0,05) de los niveles de mRNA de NESTIN a las 24, 96 y 144 horas (3,7; 2 y 1 veces expresión de la hora 0). En comparación, los niveles de mRNA de MAP2 aumentaron (P<0,05) a las 24, 96 y 144 horas (2,4; 18,9 y 16 veces expresión de la hora 0). Los niveles de mRNA de TRKA aumentaron (P<0,05) a las 96 y 144 horas (6,6 y 8 veces expresión de la hora 0). En tanto los niveles de mRNA de NGF y de NANOG no fueron distintos entre el grupo control y diferenciación. Durante el protocolo 2 se detectó una disminución (P<0,05) de los niveles de mRNA de NESTIN a las 24, 96 y 144 horas (3,74; 0,3; 0,1 veces expresión de la hora 0). En comparación, la expresión de MAP2 aumentó (P<0,05) a las 96 y 144 horas (4,1; 22,8 veces expresión de la hora 0). Asimismo, los niveles de TRKA aumentaron (P<0,05) luego de 96 y 144 horas (51,3; 111,7 veces expresión de la hora 0) de diferenciación. Además, NGF presento un menor nivel de expresión en las CMM diferenciadas a las 0, 24, 96 y 144 horas de cultivo (1; 0,8; 16,2 y 17,4 veces la expresión de la hora 0), en comparación con el control (1; 5,8; 47,8 y 25,7 veces la expresión de la hora 0), respectivamente. El perfil de expresión relativa de genes obtenido en el protocolo 2 es concordante con el obtenido en el ensayo de inmunoflorescencia asociada a NESTIN, MAP2, TRKA y PrPC. A pesar de que las CMM expuestas a BME presentan cambios morfológicos similares a un perfil neuronal, los valores de expresión génica no indican la adopción de un fenotipo neurogénico. Como ha sido reportado previamente, estos cambios pueden deberse a efectos citotóxicos del BME más que a inducción neurogénica. Sin embargo, el protocolo 2 utilizado en este estudio indujo cambios morfológicos y un perfil de expresión génica asociado a diferenciación neurogénica. En conclusión, las CMM de origen fetal bovino indiferenciadas poseen mayoritariamente un perfil mesenquimático y bajo condiciones de cultivo in vitro adecuadas poseen un potencial de diferenciación neurogénica. / Mesenchymal stem cells (MSC) are multipotent progenitor cells that possess the potential for self-renewal and multilineage differentiation (osteogenic, chondrogenic and adipogenic). Despite MSC have been isolated from several tissues, the most common source of isolation is the bone marrow (BM), both for clinical and research purposes. The differentiation capacity of MSC extends primarily to mesodermal lineages; however, recent studies have shown that MSC have also the potential to differentiate into ectodermal cell types such as neuronal. The aim of this study was to determine the potential for in vitro neurogenic differentiation of MSC isolated from fetal bovine BM. Detection of mesenchymal markers CD90, CD105 and CD73, hematopoietic markers CD34 and CD45 was performed by Quantitative-PCR (Q-PCR) and flow cytometry. Protocol 1 of neurogenic differentiation consisted in pre-induction for 24 hours with DMEM supplemented with 20% fetal bovine serum (FBS), and induction with beta-mercaptoethanol (BME) for 6 days. Protocol 2 of neurogenic differentiation consisted in culture of MSC in DMEM supplemented with Fibroblast Growth Factor-basic (FGFb) and Epidermal Growth Factor (EGF) for 24 hours, followed by culture in DMEM supplemented with butylated hydroxyanisole, KCl, valproic acid, forskolin, neural supplement for 120 hours. Cell samples were taken at 0, 24, 96 and 144 hours of culture. Analyses indicated that mRNA levels of mesenchymal markers CD73, CD90 and CD105 were higher (151.2, 245.1 and 238.1 fold, respectively; P <0.05) relative to CD34. Moreover, flow cytometry detected a high proportion of MSC positive for mesenchymal markers CD29 (76.3%), CD73 (96.8%), pluripotent markers Oct4 (94.6%) and Nanog (88.4%). In contrast, high proportion of MSC were negative to hematopoietic markers CD34 and CD45 (93.4% and 95.6%, respectively). During protocol 1 of neuronal differentiation, NESTIN mRNA levels decreased (P <0.05) at 24, 96 and 144 hours (3,7; 2 and 1 fold 0 hours). In contrast, levels of mRNA of MAP2 increased (P <0.05) at 24, 96 and 144 hours (2,4; 18,9 and 16 fold 0 hours). Similarly, levels of TRKA mRNA increased (P<0.05) at 96 and 144 hours (6,6 and 8 fold 0 hours). NGF and NANOG mRNA levels were not significantly different between treatments. During protocol 2, NESTIN mRNA levels decreased (P <0.05) at 24, 96 and 144 hours (3.74, 0.3, 0.1 fold 0 hours). In comparison, MAP2 mRNA levels increased (P <0.05) at 96 and 144 hours (4,1; 22,8 fold 0 hours). In addition, NGF mRNA levels were lower (P<0,05) in differentiated MSC at 0, 24, 96 and 144 hours of culture (1; 0.8; 16.2 and 17.4 fold the expression at 0 hours) compared to control (1; 5.8; 47.8 and 25.7 fold 0 hours). The gene relative expression values in differentiated MSC were consistent with immunofluorescence patterns. Although BME induced neuron-like changes in MSC morphology, gene expression profiles showed no indication of the adoption of a neurogenic phenotype. As reported before, BME-induced morphological changes may be due to cytotoxic effects rather than neurogenic induction. However, the second protocol induced morphologic changes and a gene expression pattern associated to neurogenic differentiation. In conclusion, undifferentiated MSC isolated from fetal bovine BM possess a mesenchymal profile and under adequate in vitro culture conditions may be induced into neurogenic differentiation. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 11100205.

Existen diferentes tipos de células madre en la sangre del cordón umbilical: células hematopoyéticas, células mesenquimales y células progenitoras del tejido endotelial. Pero hay un cuestionamiento particular el cual es objeto de discusión y consiste en qué tipo de banco de células madre debe ser promovido; los bancos públicos o los bancos privados. La discusión es necesaria debido a que se presentan posiciones que sostienen criterios que se oponen uno a otro. La primera controversia bioética gira alrededor del cuestionamiento si es apropiado o no promover la creación de bancos para la conservación de sangre de cordón umbilical autóloga. En este sentido es necesario considerar antes que nada, qué probabilidades hay que las unidades de un cordón umbilical pueda ser usada en el futuro para el niño que donó dicha sangre. Para el análisis de la documentación se usaron fuentes primarias y secundarias. En el desarrollo de la investigación, se consideraron los principios éticos y de rigor científico y como una de las consideraciones finales, el fomento a través de medios y de organismos estatales, de una verdadera cultura de difusión de la necesidad de contribuir a la formación de bancos nacionales de sangre de cordón umbilical, tanto por parte de las autoridades, como para estimular la participación masiva de las parturientas.