El presente trabajo de investigación permitió conocer el tratamiento de la noticia sobre células madre, tema que por su complejidad no llega al lector de manera clara y entendible. Los objetivos que se plantearon en la investigación fueron: señalar las fuentes periodísticas, identificar los titulares periodísticos, mostrar la información colateral e identificar los géneros y recursos periodísticos sobre células madre publicadas en el diario El Comercio. Los instrumentos utilizados fueron las entrevistas a expertos en el campo del periodismo científico y una guía de observación que fue elaborada por la investigadora, y posteriormente válida por expertos en el tema.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Compara la supervivencia global y libre de enfermedad en pacientes mayores de 18 años con leucemia linfática aguda con y sin trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos en el Hospital Nacional Edgardo Rebagliati Marttins en Lima, Perú. Realiza un estudio transversal donde se revisaron 100 historias clínicas. Se obtuvieron 50 historias clínicas de pacientes sometidos a trasplante de progenitores hematopoyéticos entre los años 2008 - 2012 y 50 historias clínicas de pacientes sometidos solo a quimioterapia según protocolo vigente de leucemia linfática aguda en el mismo período, todos mayores de 18 años con datos completos en las historias clínicas y que hayan continuado seguimiento. Se compararon los grupos con prueba chi cuadrado, y se estableció la sobrevida global y libre de enfermedad según método de Kaplan-Meier. Encuentra que un total de 100 pacientes cumplieron los criterios de selección, la sobrevida libre de enfermedad a 5 años fue de 42% post quimioterapia más trasplante de progenitores hematopoyéticos. La sobrevida libre de enfermedad a 5 años fue de 11% post quimioterapia. Se observa una sobrevida global a 5 años post quimioterapia más trasplante de progenitores hematopoyéticos fue 79%, en comparación al 48% de los que solo recibieron Quimioterapia. Además, el costo total de realizar el trasplante de progenitores hematopoyéticos asciende a $285,857 versus $264,140 con quimioterapia. Concluye que la eficacia clínica del trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos como tratamiento de pacientes adultos portadores de leucemia linfática aguda, ha demostrado ser mejor en cuanto costo-efectividad comparado con las obtenidas solo con tratamiento quimioterápicos. / Tesis

[ES] Cada año, cientos de miles de nuevos casos en todo el mundo son diagnosticados anualmente con fibrilación auricular, estimándose que aproximadamente 33.5 millones de personas viven con esta compleja enfermedad. Sin embargo, se hizo evidente que la fibrilación auricular es una enfermedad multifacética y progresiva. Por lo tanto, se requiere el desarrollo de nuevos modelos experimentales que recapitulen este complejo mecanismo. Por esta razón, esta tesis ha navegado a través del intrincado panorama del remodelado de la fibrilación auricular desde un punto de vista electrofisiológico, estructural e inmunológico, utilizando un modelo in vitro de cardiomiocitos atriales derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC-aCM). El modelo demostró ser capaz de recapitular mecanismos de reentrada, así como remodelados genéticos correlacionados con cambios electrofisiológicos, estructurales e inmunológicos similares a los observados en pacientes con fibrilación auricular, demostrando su valor como modelo para estudiar los mecanismos de iniciación de la arritmia. Además, la tesis exploró enfoques optogenéticos innovadores para la perturbación del potencial de acción en hiPSC-aCM, demostrando su posible uso para la terminación de la arritmia. En conclusión, esta tesis de doctorado realiza una contribución significativa al desarrollo y prueba de un nuevo modelo in vitro de fibrilación auricular en atrios humanos, proporcionando una base sólida para futuras mejoras en los objetivos terapéuticos y medicamentos. / [CA] Cada any, centenars de milers de nous casos a tot el món són diagnosticats anualment amb fibrilació auricular, estimantse que aproximadament 33.5 milions de persones viuen amb aquesta complexa malaltia. No obstant això, es va fer evident que la fibril·lació auricular és una malaltia multifacètica i progressiva. Per tant, es requereix el desenvolupament de nous models experimentals que recapitulen aquest complex mecanisme. Per aquesta raó, aquesta tesi ha navegat a través del intrincat panorama del remodelat de la fibrilació auricular des d'un punt de vista electrofisiològic, estructural i immunològic, utilitzant un model in vitro de cardiomiòcits atrials derivats de cèlules mare pluripotents induïdes humanes (hiPSC-aCM). El model va demostrar ser capaç de recapitular mecanismes de reentrada, així com remodelats genètics correlacionats amb canvis electrofisiològics, estructurals i immunològics similars als observats en pacients amb fibril·lació auricular, demostrant el seu valor com a model per estudiar els mecanismes d'iniciació de l'arítmia. A més, la tesi va explorar enfocs optogenètics innovadors per a la pertorbació del potencial d'acció en hiPSC-aCM, demostrant el seu possible ús per a la terminació de l'arítmia. En conclusió, aquesta tesi de doctorat realitza una contribució significativa al desenvolupament i prova d'un nou model in vitro de fibril·lació auricular en atris humans, proporcionant una base sòlida per a futures millores en els objectius terapèutics i medicaments. / [EN] Each year hundreds of thousands of new cases worldwide are annually diagnosed with atrial fibrillation (AF), estimating that approximately 33.5 million of people worldwide live with this complex disease. However, it became clear that AF is not only a prevalent cardiac arrhythmia but also a multifaceted and progressive one. Thus, the development of new experimental models that recapitulate this complex mechanism is required. For this reason, this thesis has navigated through the intricate landscape of AF remodeling under an electrophysiological, structural and immunological point of view using an in vitro model of human induced pluripotent stem cell-derived atrial cardiomyocytes (hiPSC-aCM). The model showed to be able to recapitulate re-entry mechanisms as well as genetic remodeling correlated to electrophysiological, structural and immunological changes similar to those observed in AF patients, demonstrating its value as model for studying initiation arrhythmia mechanisms. Furthermore, the thesis explored innovative optogenetic approaches for action potential perturbation in hiPSC-aCM, demonstrating their possible use for arrhythmia termination. In conclusion, this PhD thesis makes a significant contribution to the development and testing of a new human atrial in vitro model of AF, providing a strong basis for future improvements of therapeutic target and drugs. / Casini, M. (2024). The use of human induced pluripotent stem cell-derived atrial cardiomyocytes for studying arrhythmia mechanisms [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/204142

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques de Barcelona (IIBB-CSIC IDIBAPS) / Les patologies renals s’han convertit en una problemàtica a nivell mundial, en l’actualitat poden afectar a una de cada 9 persones al llarg de la seva vida i porten associats elevats costos econòmics. Malgrat els últims avenços científics i millores en el tractament d’aquestes patologies, el transplantament renal i la diàlisi continuen sent les dues úniques opcions terapèutiques efectives en el tractament de la insuficiencia renal. La regeneració de l’epiteli renal és determinant en la recuperació del pacient ja que determina que es pugui restablir la funcionalitat d’aquest òrgan. L’obtenció de precursors renals a partir de cèl•lules mare que puguin integrar-se i regenerar el ronyó lesionat s’ha convertit en una àrea de recerca biomèdica molt important. L’objecte d’estudi d’aquesta tesi va ser conèixer els mecanismes involucrats en la diferenciació de les cèl•lules mare embrionàries (ESCs) i les cèl•lules mare adiposes (ASCS) cap al llinatge epitelial renal ja que aquestes cèl•lules poden ser una potencial font d’aquests precursors renals amb capacitat regenerativa. Recentment s’ha descobert que els miRNAs, que tenen la funció de regular l’expressió gènica en l’etapa post-transcripcional, són essencials en la diferenciació de les cèl•lules mare i s’han trobat miRNAs específics que regulen la diferenciació a un llinatge cel•lular en concret. En aquest sentit, el nostre objectiu general en aquest treball va ser estudiar el paper dels miRNAs en la diferenciació de cèl•lules mare a progenitors epitelials renals. Per això, primer de tot es van realitzar experiments de diferenciació en que els cossos embrionaris (EBs) induïts a partir de les cèl•lules mare embrionàries (ESCs) es van cultivar amb un medi de cultiu suplementat amb all-trans-retinoic acid (ATRA) i activina A, i les cèl•lules mare adiposes (ASCs) amb un medi amb una concentració fisiológica de glucosa suplementat amb ATRA. Amb aquests protocols de diferenciació, es van obtenir cèl•lules amb característiques de progenitors renals. Els EBs cultivats amb el protocol de diferenciació expressaven els marcadors de l’organogènesi renal inicial (Pax2, WT1, Wnt4, Notch2 i Wnt9b). Les ASCs cultivades amb ATRA varen canviar la seva morfologia a una morfologia epitelial i van expressar marcadors tant de l’organogènesi renal inicial (Pax2, WT1, Wnt4, Six2 i Megalina) com els marcadors epitelials (Citoqueratina 18, E-caderina). Un anàlisis de miRNAs va demostrar que la família de miRNAs let-7 es sobreexpressava durant la diferenciació dels EBs i que el miRNA let-7e més concretament era essencial en l’expressió dels marcadors Pax2, Wt1i Wnt4 ja que la seva silenciació disminuïa l’expressió d’aquests gens. En les ASCs, en canvi, es va demostrar que el miRNA let-7e també augmentava en la diferenciació i que a més tenia característiques d’inductor de la diferenciació, essent essencial en l’expressió tant dels marcadors de l’organogènesi renal (Pax2, Wt1, Wnt4, Megalina) com del marcador epitelial CK18. Profunditzant en el paper del miRNA let-7e en la diferenciació, es va demostrar amb experiments de Western blot, que el miRNA let-7e modula els nivells de β-catenina a través d’un mecanisme que implica la inhibició de la PKCβ i la conseqüent disminució en la fosforilació de la GSK3β (Ser-9) i que això és imprescindible per la correcta diferenciació de les ESCs. Per altra banda, en les ASCs es va demostrar utilitzant l’assaig del gen reporter de la luciderasa, que el miRNA let-7e inhibeix directament l’expressió de la metal•loproteinasa 9 i que d’aquesta manera modula la diferenciació de les ASCs al llinatge epitelial renal. / Role of miRNA in stem cell differentiation Renal diseases have become a worldwide problem that can affect one in nine people throughout their life. Despite recent scientific advances, kidney transplantation and dialysis are still the only two effective therapeutic options in renal failure. The regeneration of the epithelium is critical for patient recovery as it determines the restoration of the kidney functionality. Cell precursors obtained from renal stem cells that can regenerate and integrate the injured kidney have become an important research area. The aim of our study was to determine the mechanisms involved in the differentiation of embryonic stem cells (ESCs) and adipose stem cells (ASCs) to renal epithelial lineage as these cells can be a source of these renal precursors with regenerative potential. It was recently discovered that miRNAs, which have the function of regulating gene expression in the post-transcriptional level, are essential in the differentiation of stem cells. In this sense, our main objective was to study the role of miRNAs in stem cells differentiation to renal epithelial progenitors. For this purpose, We have carried out experiments of stem cells differentiation. Embryoid bodies (EBs) from ESCs were cultured with activin A and ATRA and ASCs where cultured in a medium with physiological concentration of glucose supplemented with ATRA, obtaining progenitor cells with renal epithelial characteristics. EBs expressed the early kidney organogenesis markers (Pax2, WT1, Wnt4, Notch2 Wnt9b) and ASCs changed their morphology to a more epithelial one and expressed both markers of kidney organogenesis (Pax2, WT1, Wnt4, SIX2 i Megalin) and epithelial markers (cytokeratin-18 and E-cadherin). Furthermore, miRNA analysis and the subsequent overexpression and silencing of the miRNA let-7e in stem cells, demonstrates that this miRNA has characteristics of differentiation inductor and that is essential in the expression of both kidney organogenesis markers and epithelial markers. Furthermore, the ESCs, let-7e miRNA modulates β-catenin levels through a mechanism involving inhibition of PKCβ and the consequent decrease in the phosphorylation of GSK3 (Ser-9). Moreover, it was demonstrated using the luciferase assay, that the miRNA let-7e directly inhibits expression of gelatinase B (MMP9) in ASCs and thereby modulates its renal epithelial differentiation.

Embryonic stem cells (ESC) are derived from the inner cell mass (ICM) of the blastocyst and have the capacity for unlimited proliferation while retaining their potential to differentiate into a wide variety of cell types when cultured in vitro. These properties have made of human embryonic stem cells (hESC) an excellent model on which to study the conditions required for differentiation into specific cell lineages, and consequently the possibility of transplanting specific cell types into damaged tissues. The continued turn over of ESC while maintaining an undifferentiated state is dependent on unusual cell cycle properties. These unusual proliferative properties are responsible for the generation of tumours when these cells are injected into adult animals. Thus, the study of the unusual proliferative properties of hESC needs to be addressed if their potential is to be realized. To date, most studies of the cell cycle in hESC have been descriptive, lacking functional studies that reveal the mechanisms of how the cell cycle maintains pluripotency and self- renewal of hESC. In this thesis we sought to understand the mechanisms of cell cycle control of hESC. We asked the question if a single cell cycle gene could regulate the self-renewal or pluripotency properties of hESC using a gain and loss of gene function strategy. We have identified that the protein expression of the p27Kip1 cell cycle inhibitor was low in human pluripotent cells, but its expression increased during differentiation together with changes in the cell cycle structure of pluripotent cells. By adopting a gain and loss of function strategy we increased or reduced its expression in undifferentiating conditions to define its functional role in self-renewal and pluripotency of Hesc, using undifferentiation conditions, overexpression of p27Kip1 in hESC lead to a G1 phase arrest with an enlarged and flattened hESC morphology and consequently loss of self-renewal ability. Loss of p27Kip1 caused an increase of self-renewal while maintaining an undifferentiated phenotype. Moreover, we have shown that a change in the balance of p27Kip1 levels in undifferentiated hESC affects expression of the mesoderm markers: BRACHYURY and TWIST. We have found that expression changes of TWIST are associated with the presence of p27Kip1 protein in the TWIST1 gene promoter. The results presented in this thesis have interesting implications in stem cell biology. Firstly, these results define that the maintenance of p27Kip1 protein levels at a certain level is essential for self-renewal and pluripotency of hESC. Secondly, p27Kip1 is involved in the regulation of TWIST which is upregulated in several types of tumours and induces an epithelial-mesenchymal transition to facilitate tumor metastasis. / Las células madre embrionarias humanas (conocidas como hESC por sus siglas en inglés de human embryonic stem cells) son derivadas de la masa celular interna de los blastocistos y poseen la capacidad para auto-renovarse ilimitadamente, reteniendo su potencial para diferenciarse hace una amplia variedad de tipos celulares (pluripotencia), cuando son cultivadas in vitro. Estas propiedades permiten el estudio de las condiciones requeridas para la diferenciación hacia linajes específicos y la posibilidad de trasplantar tipos celulares específicos en tejidos dañados. El continuo recambio de las hESC al mismo tiempo que mantienen un estado de indiferenciación es dependiente de sus inusuales propiedades proliferativas. El objetivo de esta tesis doctoral fue el estudio de los mecanismos de control del ciclo celular de las hESC. Nos preguntamos si una única proteína del ciclo celular podría regular las propiedades de auto-renovación o pluripotencia de las hESC. En esta tesis doctoral identificamos que la expresión proteica del inhibidor del ciclo celular p27Kip1 era baja en diversas líneas celulares humanas pluripotentes pero aumentó durante la diferenciación, al mismo tiempo que la estructura del ciclo celular cambió. Mediante una estrategia de ganancia y pérdida de función, aumentamos o reducimos la expresión de p27Kip1 a fin de definir su función en la auto-renovación y la pluripotencia de las hESC. En condiciones de indiferenciación, la sobreexpresión de p27Kip1 en las hESC resultó en un arresto del ciclo celular en fase G1 y un cambio hacia una morfología más grande y aplanada, y consiguiente pérdida de la propiedad de auto-renovación. La pérdida de p27Kip1 causó un aumento de la auto-renovación manteniendo un fenotipo indiferenciado. También, hemos demostrado que un cambio en la expresión de p27Kip1 en hESC indiferenciadas afecta la expresión de los reguladores de mesodermo: BRACHYURY y TWIST. Además, hemos descubierto que los cambios en la expresión de TWIST están asociados con la presencia de la proteína p27Kip1 en el promotor de TWIST1. Estos resultados definen que los niveles de expresión de p27Kip1 son críticos para la auto-renovación y la pluripotencia de las hESC y sugieren una función para p27Kip1 en el control de la transición de epitelio a mesénquima.

[ES] El cáncer de pulmón es el tumor más frecuente y también el que presenta mayor mortalidad en términos absolutos, suponiendo hasta más del 18% de los fallecimientos por cáncer en el mundo al año. El cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) representa casi el 85% de todos los tumores de pulmón. Tanto las alteraciones genéticas como la heterogeneidad y el microambiente tumoral influyen en la agresividad de los tumores de CPNM. Un factor que contribuye a la heterogeneidad tumoral es la presencia de células madre tumorales (CSC, Cancer Stem Cells). La metástasis y recurrencia tumoral después del tratamiento han sido atribuidas al crecimiento y supervivencia de esta subpoblación celular. La falta de marcadores específicos de CSC de pulmón representa una dificultad para identificarlas, y los marcadores de superficie conocidos hasta el momento no son válidos para separar poblaciones de CSC, por lo que se hace necesaria la generación de nuevos ensayos experimentales para aislar CSC de manera más robusta. La identificación de CSC podría ser la base para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas personalizadas, basadas en la selección de una combinación más racional de fármacos, que tendría como objetivo eliminar la población de CSC en los tumores de CPNM. Los objetivos de esta tesis doctoral han sido el aislamiento y caracterización de CSC derivadas de tumores de pacientes con CPNM, y de líneas de cultivo establecidas; la caracterización de proteínas involucradas en la transición epitelial mesenquimal (EMT) en CPNM que pueden ser relevantes para la adquisición y el mantenimiento de características de las células madre y para la progresión de la enfermedad; y el desarrollo de modelos experimentales de ratón a partir de xenoinjertos derivados de tumores de pacientes con CPNM (PDX) para la identificación de nuevos biomarcadores y para estudiar el fenotipo y evolución de los tumores de pacientes. En este trabajo se han optimizado los protocolos para la obtención de tumoresferas (ESF) con propiedades de células madre a partir de tejido tumoral de pacientes con CPNM y de líneas células de CPNM establecidas. Se ha confirmado el fenotipo característico de célula madre en las ESF mediante el análisis de la expresión de marcadores de superficie de CSC como CD326, CD166, CD44 y CD133, su capacidad de autorrenovación y diferenciación, así como la capacidad de iniciar tumores en ratones inmunodeprimidos. Se ha observado además que la señalización mediada por TGF-ß1 podría estar contribuyendo a un aumento de la población CSC, y que habría una relación entre el proceso de promoción de la EMT inducida por TGF-ß1 y las propiedades de CSC. El análisis de genes involucrados en la EMT y CSC en las ESF mostró que la expresión de CDKN1A, NOTCH3, CD44, NANOG, SNAI1 e ITGA6 es característica de las ESF, y por tanto la expresión combinada de estos genes podría identificar la subpoblación de CSC. Al correlacionar la expresión de estos genes con la supervivencia de los pacientes, se obtuvo una firma con valor pronóstico en ADC basada en la expresión de los genes CDKN1A, SNAI1 e ITGA6. Se ha estudiado además el papel de proteínas involucradas en la EMT cuya expresión podría promover la migración e invasión celular en CPNM. De esta manera se ha identificado que el factor de transcripción JunB y el factor de traducción eIF5A2 están involucrados en la iniciación de la EMT mediada por TGF-ß1. Finalmente, se han establecido 9 modelos de xenoinjertos derivados de tumores de pacientes con CPNM (PDX). La correlación del éxito de implantación del tumor en ratón con variables clínico-patológicas de los pacientes mostró que los tumores primarios que generaron PDX derivaban de pacientes con peor pronóstico. También se observó que la elevada expresión de Vimentina, Ezrina y Ki67 en tumores sugiere una mayor agresividad y, por tanto, estudiar su expresión podría utilizarse en / [CA] El càncer de pulmó és el tumor més frequent i també el que presenta major mortalitat en termes absoluts, suposant fins més del 18% de les defuncions per càncer en el món a l'any. El càncer de pulmó no microcític (CPNM) representa quasi el 85% de tots els tumors de pulmó. Tant les alteracions genètiques com l'heterogeneïtat i el microambient tumoral influeixen en l'agressivitat dels tumors de CPNM. Un factor que contribueix a l'heterogeneïtat tumoral és la presència de cèl·lules mare tumorals (CSC, Cancer Stem Cells). La metàstasi i recurrència tumoral després del tractament han sigut atribuïdes al creixement i supervivència d'aquesta subpoblació cel·lular. La falta de marcadors específics de CSC de pulmó representa una dificultat per a identificar-les, i els marcadors de superfície coneguts fins al moment no són vàlids per a separar poblacions de CSC, per la qual cosa es fa necessària la generació de nous assajos experimentals per a aïllar CSC de manera més robusta. La identificació de CSC podria ser la base per al disseny de noves estratègies terapèutiques personalitzades, basades en la selecció d'una combinació més racional de fàrmacs, que tindria com a objectiu eliminar la població de CSC en els tumors de CPNM. Els objectius d'aquesta tesi doctoral han sigut l'aïllament i caracterització de CSC derivades de tumors de pacients amb CPNM, i de línies de cultiu establides de CPNM; la caracterització de proteïnes involucrades en la transició epitelial mesenquimal (EMT) en CPNM que poden ser rellevants per a l'adquisició i el manteniment de característiques de les cèl·lules mare i per a la progressió de la malaltia; i el desenvolupament de models experimentals de ratolí a partir de xenotrasplantaments derivats de tumors de pacients amb CPNM (PDX) per a la identificació de nous biomarcadors i per a estudiar el fenotip i evolució dels tumors de pacients. En aquest treball s'han optimitzat els protocols per a l'obtenció de tumoresferes (ESF) amb propietats de cèl·lules mare a partir de teixit tumoral de pacients amb CPNM i de línies cel·lulars de CPNM establides. S'ha confirmat el fenotip característic de cèl·lula mare en les ESF mitjançant l'anàlisi de l'expressió de marcadors de superfície de CSC com CD326, CD166, CD44 i CD133, la seua capacitat d'autorenovació i diferenciació, així com la capacitat d'iniciar tumors en ratolins immunodeprimits. S'ha observat a més que la senyalització mediada per TGF-ß1 podria estar contribuint a un augment de la població CSC, i que hi hauria una relació entre el procés de promoció de l'EMT induïda per TGF-ß1 i les propietats de CSC. L'anàlisi de gens involucrats en l'EMT i CSC en les ESF va mostrar que l'expressió de CDKN1A, NOTCH3, CD44, NANOG, SNAI1 i ITGA6 és característica de les ESF, i per tant l'expressió combinada d'aquests gens podria identificar la subpoblació de CSC. En correlacionar l'expressió d'aquests gens amb la supervivència dels pacients, es va obtindre una signatura amb valor pronòstic en ADC basada en l'expressió dels gens CDKN1A, SNAI1 i ITGA6. S'ha estudiat a més el paper de proteïnes involucrades en l'EMT que la seua expressió podria promoure la migració i invasió cel·lular en CPNM. D'aquesta manera s'ha identificat que el factor de transcripció JunB i el factor de traducció eIF5A2 estan involucrats en la iniciació de l'EMT mediada per TGF-ß1. Finalment, s'han establit 9 models de xenotrasplantaments derivats de tumors de pacients amb CPNM (PDX). La correlació de l'èxit d'implantació del tumor en ratolí amb variables clinicopatològiques dels pacients va mostrar que els tumors primaris que van generar PDX derivaven de pacients amb pitjor pronòstic. També es va observar que l'elevada expressió de Vimentina, Ezrina i Ki67 en tumors suggereix una major agressivitat i, per tant, l'avaluació de la seua expressió podria utilitzar-se en combinació com a marcador de pr / [EN] Lung cancer is the most frequent and the most mortal tumor in absolute terms, accounting for up to more than 18% of cancer deaths worldwide per year. Non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for almost 85% of all lung tumors. Apart from genetic alterations, both tumor heterogeneity and tumor microenvironment influence the aggressiveness of NSCLC tumors. A factor that contributes to tumor heterogeneity is the presence of cancer stem cells (CSC). Tumor metastasis and recurrence after treatment have been attributed to the growth and survival of this cell subpopulation. The lack of specific markers for lung CSC represents a drawback for their identification, and the surface markers known to date are not valid for separating CSC subpopulations, so it is necessary to generate new experimental assays to isolate CSC in a more robust way. The identification of CSC could be the basis for the design of new personalized therapeutic strategies, based on the selection of a more rational combination of drugs, which would aim to eliminate the CSC population in NSCLC tumors. The objectives of this doctoral thesis have been the isolation and characterization of CSC derived from tumors of patients with NSCLC, and from established NSCLC cell lines; the characterization of proteins involved in the epithelial-mesenchymal transition (EMT) in NSCLC that may be relevant for the acquisition and maintenance of stem cell characteristics and for disease progression; and the development of experimental mouse models from patient-derived xenografts (PDX) of NSCLC for the identification of new biomarkers and to study the phenotype and evolution of patient tumors. In this work, the protocols for obtaining tumorspheres (SPH) with stem cell properties from tumor tissue of NSCLC patients and from established NSCLC cell lines have been optimized. The characteristic stem cell phenotype in SPH has been confirmed by analyzing the expression of CSC surface markers such as CD326, CD166, CD44 and CD133, their capacity for self-renewal and differentiation, as well as the ability to initiate tumors in immunosuppressed mice. It has also been observed that TGF-ß1-mediated signaling could be contributing to an increase in CSC population, and that there would be a relationship between the process of promoting TGF-ß1-induced EMT and CSC features. The analysis of genes involved in EMT and CSC in the SPH showed that the expression of CDKN1A, NOTCH3, CD44, NANOG, SNAI1 and ITGA6 is characteristic of the SPH, and therefore the combined expression of these genes could identify the CSC subpopulation in NSCLC tumors. By correlating the expression of these genes with the survival of the patients, a signature with prognostic value in ADC was obtained based on the expression of CDKN1A, SNAI1 and ITGA6. The role of proteins involved in EMT whose expression could promote cell migration and invasion in NSCLC has also been studied. Thus, it has been identified that the JunB transcription factor and the eIF5A2 translation factor are involved in the initiation of EMT mediated by TGF-ß1. Finally, 9 PDX models from tumors of NSCLC patients have been established. The correlation of implantation success of the tumor in mice with the clinical-pathological variables of the patients showed that primary tumors that generated PDX were derived from patients with bad prognosis. It was also observed that higher expression of Vimentin, Ezrin and Ki67 in tumors suggests higher aggressiveness and, therefore, the study of their expression could be used in combination as a prognostic marker to evaluate the progression of the disease. / Pardo Sánchez, JM. (2021). Aproximaciones moleculares para la identificación de nuevos biomarcadores y dianas terapéuticas del cáncer de pulmón no microcítico: células madre tumorales, transición epitelial-mesenquimal y modelos de xenoinjertos derivados de pacientes [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/172736

[ES] Los síndromes mielodisplásicos (SMD) constituyen un grupo heterogéneo de enfermedades de naturaleza clonal caracterizadas por presentar una hematopoyesis ineficaz, citopenias y riesgo variable de evolución a leucemia mieloide aguda (LMA) secundaria. En la última década, las nuevas tecnologías de secuenciación masiva han revelado que más del 80 % de pacientes con SMD presenta mutaciones somáticas y que éstas pueden agruparse en diversas categorías en función de las rutas biológicas que se vean alteradas. Además, se ha visto que existen patrones de concurrencia y exclusión entre estas categorías de mutaciones. La adquisición secuencial y la concurrencia entre estas mutaciones desencadenan, en parte, el desarrollo de la enfermedad y genera la heterogeneidad clínica característica de los SMD. Las mutaciones en factores de splicing aparecen a menudo simultáneamente con mutaciones en reguladores epigenéticos como es el caso de los genes U2 Small Nuclear RNA Auxiliary Factor 1 (U2AF1) y Ten-eleven translocation 2 (TET2) que se encuentran co-mutados en un 13 % de los casos. A pesar de su prevalencia, los efectos de la concurrencia en las mutaciones en U2AF1 y TET2 no han sido estudiados. Por ello, en esta tesis nos propusimos estudiar esta cooperación cruzando, en primer lugar, dos líneas mutantes de ratón generadas mediante el sistema de edición genética CRISPR/Cas9. El efecto de estas alteraciones sobre la hematopoyesis de las tres líneas mutantes, U2af1mut/+, Tet2-/- y U2af1mut/+ Tet2-/-, fue examinado mediante el hemograma, citometría de flujo (CF), análisis morfológicos, ensayos de Unidades Formadoras de Colonias (CFU) y estudios funcionales como el trasplante hematopoyético. Para finalizar, se realizó un análisis transcriptómico mediante secuenciación de ARN (ARN-seq) para detectar los posibles cambios en el patrón de splicing entre las líneas mutantes y los controles. La línea mutante U2af1mut/+ no presentó ninguna alteración destacable de la hematopoyesis ni en ratones jóvenes (12-13 semanas) ni envejecidos (2 años). Sin embargo, sus células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) fueron incapaces de injertar en la médula ósea de ratones trasplantados. En el caso de los ratones mutantes Tet2-/-, observamos un incremento de células mieloides, esplenomegalia, aumento del compartimento LSK (HSPC con inmunofenotipo Linaje- Sca-1+ c-kit+) y, en los experimentos de trasplante, una capacidad de reconstitución hematopoyética superior a la de los controles. Por último, la cooperación de ambas alteraciones en la línea doble mutante U2af1mut/+ Tet2-/-, no mostró un efecto sinérgico entre ellas. Así pues, se detectaron variaciones en los progenitores mieloeritroides y un aumento significativo de células mieloides y LSK. No obstante, igual que ocurría con la línea U2af1mut/+, las HSPC no producían prendimiento en los ratones trasplantados. A pesar de las alteraciones observadas, ninguna de las tres líneas mutantes desarrollaba SMD ni fallecía antes que los controles. Respecto al análisis transcriptómico, el salto de exón fue el evento de splicing alternativo observado con mayor frecuencia en las líneas U2af1mut/+, Tet2-/- y U2af1mut/+ Tet2-/-. Únicamente un 6.6 % del total de genes que presentaba eventos de splicing alternativo fueron coincidentes en las tres líneas mutantes. A pesar de que en el análisis bioinformático se detectaron alteraciones en las rutas biológicas relacionadas con el ciclo celular, en los ratones U2af1mut/+, y el daño al ADN, en las líneas U2af1mut/+ y U2af1mut/+ Tet2-/-, en la validación mediante CF no se encontraron variaciones respecto a los controles. Para concluir, nuestros datos sugieren que, a pesar de producirse alteraciones en la hematopoyesis, la cooperación entre la mutación en U2af1 y la pérdida de Tet2 es insuficiente para iniciar SMD en ratón. / [CA] Les síndromes mielodisplàstiques (SMD) constituïxen un grup heterogeni de malalties de naturalesa clonal caracteritzades per presentar una hematopoesi ineficaç, citopènies i risc variable d'evolució a leucèmia mieloide aguda (LMA) secundària. En l'última dècada, les noves tecnologies de seqüenciació massiva han revelat que més del 80 % de pacients amb SMD presenta mutacions somàtiques i que aquestes poden agrupar-se en diverses categories en funció de les rutes biològiques que es vegen alterades. A més, s'ha vist que hi ha patrons de concurrència i exclusió entre aquestes categories de mutacions. L'adquisició seqüencial i la concurrència entre aquestes mutacions desencadenen, en part, el desenvolupament de la malaltia i genera l'heterogeneïtat clínica característica de les SMD. Les mutacions en factors de splicing apareixen sovint simultàniament amb mutacions en reguladors epigenètics com és el cas dels gens U2 Small Nuclear RNA Auxiliary Factor 1 (U2AF1) i Ten-eleven translocation 2 (TET2) que es troben co-mutats en un 13 % dels casos. A pesar de la seua prevalença, els efectes de la concurrència en les mutacions en U2AF1 i TET2 no han sigut estudiats. Per això, en aquesta tesi ens vam proposar estudiar aquesta cooperació creuant, en primer lloc, dos línies mutants de ratolí generades per mitjà del sistema d'edició genètica CRISPR/Cas9. L'efecte d'aquestes alteracions sobre l'hematopoesi de les tres línies mutants, U2af1mut/+, Tet2-/- i U2af1mut/+ Tet2-/-, va ser examinat per mitjà de l'hemograma, citometría de flux (CF), anàlisis morfològiques, assajos d'Unitats Formadores de Colònies (CFU) i estudis funcionals com el trasplantament hematopoètic. Per últim, es va realitzar l'anàlisi transcriptòmic per mitjà de seqüenciació d'ARN (ARN-seq) per a detectar els possibles canvis en el patró de splicing entre les línies mutants i els controls. La línia mutant U2af1mut/+ no va presentar cap alteració destacable de l'hematopoesi ni en ratolins jóvens (12-13 setmanes) ni envellits (2 anys). No obstant això, les seues cèl·lules mare i progenitores hematopoetiques (HSPC) van ser incapaços d'empeltar en la medul·la òssia de ratolins trasplantats. En el cas dels ratolins mutants Tet2-/-, observarem un increment de cèl·lules mieloides, esplenomegàlia, augment del compartiment LSK (cèl·lules mare amb inmunofenotip Llinatge- Sca-1+ c-kit+) i, en els experiments de trasplantament, una capacitat de reconstitució hematopoética superior a la dels controls. Finalment, la cooperació d'ambdues alteracions en la línia doble mutant U2af1mut/+ Tet2-/-, no va mostrar un efecte sinèrgic entre elles. Així, doncs, es van detectar variacions en els progenitors mieloeritroids i un augment significatiu de cèl·lules mieloides i LSK. No obstant això, igual que ocorria amb la línia U2af1mut/+, les HSPC no produïen empelt en els ratolins trasplantats. A pesar de les alteracions observades, cap de les tres línies mutants desenvolupava SMD ni moria abans que els controls. Respecte a l'anàlisi transcriptòmic, el salt d'exó va ser l'esdeveniment de splicing alternatiu observat amb major freqüència en les línies U2af1mut/+, Tet2-/- i U2af1mut/+ Tet2-/-. Únicament un 6.6 % del total de gens que presentava esdeveniments de splicing alternatiu van ser coincidents en les tres línies mutants. Encara que en l'anàlisi bioinformàtica es van detectar alteracions en les rutes biològiques relacionades amb el cicle cel·lular, en els ratolins U2af1mut/+, i el dany a l'ADN, en les línies U2af1mut/+ i U2af1mut/+ Tet2-/-, en la validació per mitjà de CF no es van trobar variacions respecte als controls. Per a concloure, les nostres dades suggerixen que, a pesar de produir-se alteracions en l'hematopoesi, la cooperació entre la mutació en U2af1 i la pèrdua de Tet2 és insuficient per a iniciar SMD en ratolí. / [EN] Myelodysplastic syndromes (MDS) comprise a heterogeneous group of clonal malignancies characterized by ineffective hematopoiesis, cytopenia and a variable risk of progression to secondary acute myeloid leukemia (AML). In the last decade, next-generation sequencing technologies have deciphered that more than 80 % of MDS patients have somatic mutations and that those can be grouped into several categories depending on which biological routes have been altered. Furthermore, it has been observed that there are concurrency and exclusion patterns among these mutation categories. The sequential acquisition and the concurrency between these driver mutations trigger, in part, the development of the disease and generate the clinical heterogeneity characteristic of MDS. The splicing factor mutations often occur simultaneously with mutations in epigenetic regulators such as the U2 Small Nuclear RNA Auxiliary Factor 1 (U2AF1) and Ten-eleven translocation 2 (TET2) genes, which are found co-mutated in 13 % of cases. Despite their prevalence, the effects of concurrence in mutations in U2AF1 and TET2 have not been studied. Consequently, in this thesis we aim to study this cooperation. Firstly, we crossed two mutant mouse lines that were previously generated using the CRISPR/Cas9 gene editing system. The effects of these alterations on hematopoiesis in the three mutant lines, U2af1mut/+, Tet2-/- y U2af1mut/+ Tet2-/-, was examinated by the blood counts, flow cytometry (FC), morphological analysis, Colony Forming Units assays (CFU) and functional studies such as the hematopoietic transplantation. Finally, transcriptomic analysis was peformed by RNA sequencing (RNA-seq) to detect possible splicing pattern changes between mutant lines and control samples. U2af1mut/+ mutant line did not present any remarkable alteration of hematopoiesis in either in young (12-13 weeks) or aged (2 years) mice. However, their hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) were unable to engraft into the bone marrow of transplanted mice. In the case of Tet2-/- mutant mice, we observed an increase of myeloid cells, splenomegaly, an increased LSK compartment (HSPC: Lineage- Sca-1+ c-kit+) and an enhanced ability, relative to wild-type, to reconstitute hematopoiesis in transplantation assays. Finally, the cooperation of both alterations in U2af1mut/+ Tet2-/- double mutant line did not show a synergistic effect between them. Nonetheless, the myeloerythroid progenitors were altered and also myeloid and LSK cells were increased. However, as in the U2af1mut/+ line, HSPC did not produce any engraftment in transplanted mice. Despite the observed alterations, none of the three mutant lines developed MDS or die earlier than control mice. Regarding the transcriptomic analysis, exon skipping was the most frequently observed alternative splicing event in the U2af1mut/+, Tet2-/- y U2af1mut/+ Tet2-/- lines. Only 6.6 % of the total number of genes showing alternative splicing events were coincident in the three mutant lines. Although the bioinformatic analysis revealed alterations in biological pathways related to the cell cycle in the U2af1mut/+ mice and DNA damage in the U2af1mut/+ and U2af1mut/+ Tet2-/- lines, the validation by CF found no variations with respect to the controls. In conclusion, our data suggest that, despite alterations in hematopoiesis, the cooperation between U2af1 mutation and Tet2 loss is insufficient to initiate MDS in mice. / Martínez Valiente, C. (2022). Desarrollo y caracterización de un modelo de ratón doble mutante en U2af1 y Tet2 para el estudio de los Síndromes Mielodisplásicos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/187749

Tesis por compendio / [ES] El aumento de la esperanza de vida conlleva la aparición de problemas muscoloesqueléticos afectando a la calidad de vida de los pacientes. Las nuevas terapias regenerativas óseas se centran en el uso de las células madre mesenquimales, MSCs, encargadas de la regeneración del tejido in vivo. La inducción de un fenotipo osteogénico prediferenciado in vitro, previo a la implantación de las MSCs, resulta en una mejor capacidad de regeneración del tejido óseo. Habitualmente se han empleado medios de diferenciación osteogénica que contienen dexametasona. Estos métodos son poco eficientes, por lo que el uso de métodos físicos está adquiriendo relevancia. El hueso es un tejido con propiedades piezoeléctricas debido a las fibras de colágeno que forman parte de su matriz extracelular. Este estímulo ha sido relacionado con su capacidad de responder al estrés mecánico y autoregenerarse, donde juegan un papel importante las MSCs. Éstas se encuentran en un entorno electroactivo, y son precisamente estas señales físicas las que pueden influir en su proceso de diferenciación osteogénica pudiendo ser empleadas para su prediferenciación in vitro de forma efectiva. Para comprobar esta hipótesis, en la presente Tesis Doctoral se han diseñado soportes de cultivo piezoeléctricos en 2 y 3 dimensiones basados en el uso del polímero piezoeléctrico polifluoruro de vinilideno (PVDF) combinados con partículas magnetostrictivas de ferrita de cobalto (CFO). Esta combinación permite la estimulación de los soportes de cultivo aplicando un campo magnético con un biorreactor. Este campo magnético genera la deformación del componente magnetostrictivo, que es transmitida a la matriz polimérica, deformándola y generando un campo eléctrico. Ésta última es transmitida a las células cultivadas en estos soportes para estudiar su efecto sobre la diferenciación osteogénica. En el primer capítulo se desarrollaron y caracterizaron membranas electroactivas de PVDF fabricadas por el método de separación de fases inducida por no-solventes. Se empleó etanol como no-solvente, dando lugar a membranas homogéneas altamente porosas. Estas cristalizan en fase g. Se optimizó un recubrimiento basado en la técnica capa a capa (LbL), empleando recombinámeros similares a la elastina (ELRs) que contenían secuencias de adhesión celular RGD. Se estudió la respuesta celular inicial de las MSCs y se comparó con los mismos soportes recubiertos únicamente con fibronectina adsorbida. La presencia de los ELRs es necesaria para promover la adhesión inicial de las MSCs en este tipo de soportes. En el segundo capítulo se combinó el PVDF con CFO, usando agua como no-solvente. Las membranas eran no simétricas, con una superficie lisa, que fue empleada para cultivo celular, con una mayoría en fase b, la más electroactiva. Se recubrieron y caracterizaron las membranas mediante LbL con colágeno tipo I y heparina. Se estudió el comportamiento de las MSCs sobre el LbL, resultando esencial para la proliferación celular en el caso de las membranas PVDF-CFO. En el capítulo tres se desarrollaron films de PVDF y PVDF-CFO cristalizados en presencia del líquido iónico [Bmim][Cl]. La presencia de éste indujo la nucleación del PVDF en fase b. Las MSCs eran capaces de adherirse y proliferar. Se realizaron ensayos de estimulación piezoeléctrica empleando un biorreactor magnético. Las MSCs respondieron a la estimulación incrementado la longitud de sus adhesiones focales, así como reduciendo la vimentina en el citoplasma. Finalmente, se diseñaron soportes de cultivo piezoeléctricos en 3D. Para ello se desarrollaron microesferas de PVDF y PVDF-CFO mediante la técnica de electropulverizado. Las microesferas se encapsularon en hidrogeles de gelatina junto con las MSCs. Se estimularon y tras 7 días, se observó un incremento en la expresión del factor de transcripción RUNX2 en las muestras estimuladas demostrando que la estimulación piezoeléctrica es capaz de activar en mayor medida la diferenciación de las MSCs. / [CA] L'augment de l'esperança de vida comporta l'aparició de problemes muscoloesquelètics afectant la qualitat de vida dels pacients. Les noves teràpies regeneratives òssies es centren en l'ús de les cèl·lules mare mesenquimals, MSCs, encarregades de la regeneració del teixit in vivo. La inducció d'un fenotip osteogènic prediferenciat in vitro, previ a la implantació de les MSCs, resulta en una millor capacitat de regeneració del teixit ossi. Habitualment s'han fet servir mitjans de diferenciació osteogènica que contenen dexametasona. Aquests mètodes són poc eficients, per la qual cosa l'ús de mètodes físics està adquirint rellevància. L'os és un teixit amb propietats piezoelèctriques a causa de les fibres de col·lagen que formen part de la seva matriu extracel·lular. Aquest estímul ha estat relacionat amb la capacitat de respondre a l'estrès mecànic i autoregenerar-se, on juguen un paper important les MSCs. Aquestes es troben en un entorn electroactiu, i són precisament aquests senyals físics els que poden influir en el seu procés de diferenciació osteogènica podent ser emprats per a la seva prediferenciació in vitro de manera efectiva. Per comprovar aquesta hipòtesi, a la present tesi doctoral s'han dissenyat suports de cultiu piezoelèctrics en 2 i 3 dimensions basats en l'ús del polímer piezoelèctric polifluorur de vinilidè (PVDF) combinats amb partícules magnetostrictives de ferrita de cobalt (CFO). Aquesta combinació permet l'estimulació dels suports de cultiu aplicant un camp magnètic amb un bioreactor. Aquest camp magnètic genera la deformació del component magnetostrictiu, que és transmesa a la matriu polimèrica, deformant-la i generant un camp elèctric. Aquesta última és transmesa a les cèl·lules cultivades en aquests suports per estudiar-ne l'efecte sobre la diferenciació osteogènica. En el primer capítol es van desenvolupar i caracteritzar membranes electroactives de PVDF fabricades pel mètode de separació de fases induïda per no solvents. Es va emprar etanol com a no-solvent, donant lloc a membranes homogènies altament poroses. Aquestes cristal·litzen en fase g. S'optimitzà un recobriment basat en la tècnica capa a capa (LbL), emprant recombinàmers similars a l'elastina (ELRs) que contenien seqüències d'adhesió cel·lular RGD. Es va estudiar la resposta cel·lular inicial de les MSCs i es va comparar amb els mateixos suports recoberts únicament amb fibronectina adsorbida. La presència dels ELR és necessària per promoure l'adhesió inicial de les MSCs en aquest tipus de suports. En el segon capítol es va combinar el PVDF amb CFO, usant aigua com a no-solvent. Les membranes eren no simètriques, amb una superfície llisa, que va ser emprada per a cultiu cel·lular, amb una majoria en fase b, la més electroactiva. Es van recobrir i caracteritzar les membranes mitjançant LbL amb col·lagen tipus I i heparina. Es va estudiar el comportament de les MSCs sobre el LbL, resultant essencial per a la proliferació cel·lular en el cas de les membranes PVDF-CFO. Al capítol tres es van desenvolupar films de PVDF i PVDF-CFO cristal·litzats en presència del líquid iònic [Bmim][Cl]. La seva presència va induir la nucleació del PVDF en fase b. Les MSCs eren capaces d'adherir-se i proliferar. Es van realitzar assajos d'estimulació piezoelèctrica emprant un bioreactor magnètic. Les MSCs van respondre a l'estimulació incrementant la longitud de les seves adhesions focals, així com reduint la vimentina al citoplasma. Finalment, es van dissenyar suports de cultiu piezoelèctrics en 3D. Per això es van desenvolupar microesferes de PVDF i PVDF-CFO mitjançant la tècnica d'electropolveritzat. Les microesferes es van encapsular en hidrogels de gelatina juntament amb les MSCs. Es van estimular i després de 7 dies, es va observar un increment en l'expressió del factor de transcripció RUNX2 a les mostres estimulades demostrant que l'estimulació piezoelèctrica és capaç d'activar més la diferenciació de les MSCs. / [EN] Life expectancy increase entails the presence of musculoskeletal disorders producing a substantial impact on patient's quality of life. New bone regenerative therapies are focused on the use of mesenchymal stem cells (MSCs), the main effectors of bone regeneration in vivo. Over the years, it has been demonstrated that the induction of a pre-differentiated phenotype in vitro, before MSCs implantation, results in a better capacity for bone tissue regeneration. For this purpose, biochemical approaches based on the use of osteogenic differentiation medium containing dexamethasone have traditionally been used. These methods are not efficient, which has favoured the use of physical methods as an alternative. Bone is a piezoelectric tissue due to the collagen fibres that conform its extracellular matrix. This stimulus has been related to its ability to respond to mechanical stress and self-regenerate, a process in which MSCs play a key role. MSCs are subjected to an electroactive environment. It is hypothesised that these physical signals may influence their osteogenic differentiation process and be used to effectively pre-differentiate them in vitro. To test this hypothesis, along this Doctoral Thesis, piezoelectric cell culture supports have been designed in 2 and 3 dimensions based on the use of the piezoelectric polymer poly(vinylidene) fluoride (PVDF) combined with magnetostrictive cobalt ferrite oxide (CFO) nanoparticles. This combination allows the stimulation of culture supports by applying a magnetic field with a bioreactor. This magnetic field induces the deformation of the magnetostrictive component, which is transmitted to the polymeric matrix, generating a deformation and producing an electric field, which is transmitted to the MSCs to study its effect on their osteogenic differentiation. In the first chapter, electroactive PVDF membranes manufactured by the non-solvent induced phase separation technique were developed and characterised. Ethanol was used as a non-solvent, which gave rise to highly porous homogeneous membranes crystallised in the g phase. A coating protocol based on the layer-by-layer (LbL) technique, using elastin-like recombinamers (ELRs) containing RGD cell adhesion sequences, was optimised. MSCs' initial cellular response was studied and compared with the membranes coated with adsorbed fibronectin. The presence of the ELRs was necessary to promote MSCs' initial adhesion in this type of support. In the second chapter, PVDF was combined with CFO, using water as a non-solvent. The membranes were not symmetrical, with a smooth surface used for cell culture, with a majority in phase b, the most electroactive. Membranes were coated and characterised by LbL with type I collagen and heparin. The behaviour of MSCs on LbL was studied, essential for cell proliferation in the case of PVDF-CFO membranes. In chapter three, PVDF and PVDF-CFO films crystallised in the presence of the ionic liquid [Bmim][Cl] were developed. The presence of ionic liquid induced PVDF nucleation in the b phase. MSCs were able to adhere and proliferate. Piezoelectric stimulation tests were performed using a magnetic bioreactor. MSCs responded to stimulation by increasing the length of their focal adhesions and reducing vimentin in the cytoplasm. Finally, 3D piezoelectric culture supports were designed. For this, PVDF and PVDF-CFO microspheres were developed using the electrospray technique. The microspheres were encapsulated in gelatin hydrogels together with the MSCs. They were stimulated, and after 7 days, an increase in the expression of the transcription factor RUNX2 was observed in the stimulated samples, demonstrating that piezoelectric stimulation is capable of activating the differentiation of MSCs to a greater extent. / La presente tesis doctoral no podría haberse realizado sin la financiación del Ministerio de Economía y Competitividad a través de la beca para formación de personal investigador BES-2017-080398 y a la Agencia Estatal de Investigación a través de los proyectos PID2019-106000RB-C21 / AEI / 10.13039/501100011033, PID2019-106099RB- C41 y –C43 / AEI / 10.13039/501100011033. / Guillot Ferriols, MT. (2022). Electroactive Environments for Mesenchymal Stem Cells Osteogenic Differentiation [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/191003 / Compendio

[ES] La cardiopatía isquémica, caracterizada por la falta de suministro adecuado de oxígeno al tejido cardíaco, es una afección grave que puede desencadenar un infarto agudo de miocardio y contribuir al desarrollo de la insuficiencia cardíaca (IC). A pesar de las terapias actuales, la IC sigue siendo una enfermedad con alta morbilidad y mortalidad, lo que destaca la necesidad de estrategias terapéuticas más efectivas. En este contexto, las células madre mesenquimales (MSCs) y, en especial sus vesículas extracelulares (EVs), han surgido como opciones prometedoras por sus propiedades regenerativas, pro-angiogénicas e inmunomoduladoras. Sin embargo, el reto actual se centra en mejorar la eficacia terapéutica de las EVs, ya sea mejorando su biodisponibilidad en el tejido cardíaco o potenciando sus capacidades intrínsecas, con el fin de hacer viable una terapia basada en las mismas. En este trabajo, nos hemos centrado en la mejora de las EVs mediante la modificación genética de las MSCs. Hemos seguido dos enfoques: la carga de oncostatina M (OSM) en la superficie de las EVs y la sobreexpresión inducible del dominio intracelular de Notch1 (N1ICD) junto con el factor inducible por hipoxia 1-alfa (HIF1A) en MSCs para enriquecer las EVs con factores terapéuticos, con la expectativa de mejorar su eficacia en el contexto de la isquemia cardíaca. Los resultados obtenidos muestran que las EVs cargadas con OSM poseen propiedades antifibroticas superiores a las EVs nativas, además de reducir el daño cardíaco provocado por la infusión de isoproterenol in vivo. Por otro lado, la sobreexpresión de N1ICD y HIF1A actúa a modo de precondicionamiento genético favoreciendo la carga de diferentes moléculas terapéuticas en las EVs. Estas EVs han demostrado ejercer efectos beneficiosos in vitro como la reducción de la fibrosis, la protección de los cardiomiocitos y reducción de la hipertrofia, la disminución de especies reactivas de oxígeno, y el aumento de la angiogénesis. En el estudio in vivo estas EVs redujeron el daño provocado por la infusión de isoproterenol. En conclusión, hemos generado dos tipos de EVs con un potencial terapéutico superior a las EVs nativas en el contexto de la patología cardíaca. Este trabajo abre la puerta al diseño de nuevas estrategias terapéuticas basadas en EVs, abordando de manera integral los diversos aspectos de la enfermedad cardíaca. / [CA] La cardiopatia isquèmica, caracteritzada per la falta de subministrament adequat d'oxigen al teixit cardíac, és una afecció greu que pot desencadenar un infart agut de miocardi i contribuir al desenvolupament de la insuficiència cardíaca (IC). Malgrat les teràpies actuals, la IC continua sent una malaltia amb alta morbiditat i mortalitat, la qual cosa destaca la necessitat d'estratègies terapèutiques més efectives. En este context, les cèl·lules mare mesenquimals (MSCs) i, especialment les seues vesícules extracelul·lars (EVs), han sorgit com a opcions prometedores per les seues propietats regeneratives, pro-angiogèniques i inmunomoduladores. No obstant això, el repte actual se centra en millorar l'eficàcia terapèutica de les EVs, ja siga millorant la seua biodisponibilitat en el teixit cardíac o potenciant les seues capacitats intrínseques, amb la finalitat de fer viable una teràpia basada en estes. En este treball, ens hem centrat en la millora de les EVs mitjançant la modificació genètica de les MSCs. Hem seguit dos enfocaments: la càrrega d'oncostatina M (OSM) en la superfície de les EVs i la sobreexpressió induïble del domini intracel·lular de Notch1 (N1ICD) juntament amb el factor induïble per hipòxia 1-alfa (HIF1A) en MSCs per a enriquir les EVs amb factors terapèutics, amb l'expectativa de millorar la seua eficàcia en el context de la isquèmia cardíaca. Els resultats obtinguts mostren que les EVs carregades amb OSM posseeixen propietats antifibròtiques superiors a les EVs natives, a més de reduir el dany cardíac provocat per la infusió d'isoproterenol in vivo. D'altra banda, la sobreexpressió de N1ICD i HIF1A actua a mode de precondicionament genètic afavorint la càrrega de diferents molècules terapèutiques en les EVs. Estes EVs han demostrat exercir efectes beneficiosos in vitro com la reducció de la fibrosi, la protecció dels cardiomiòcits i reducció de la hipertròfia, la disminució d'espècies reactives d'oxigen, i l'augment de l'angiogènesis. En l'estudi in vivo estes EVs van reduir el dany provocat per la infusió d'isoproterenol. En conclusió, hem generat dos tipus de EVs amb un potencial terapèutic superior a les EVs nadiues en el context de la patologia cardíaca. Este treball obri la porta al disseny de noves estratègies terapèutiques basades en EVs, abordant de manera integral els diversos aspectes de la malaltia cardíaca. / [EN] Ischemic heart disease, characterized by a lack of adequate oxygen delivery to the heart tissue, is a serious condition that can trigger acute myocardial infarction and contribute to the development of heart failure (HF). Despite current therapies, HF remains a disease with high morbidity and mortality, highlighting the need for more effective therapeutic strategies. In this context, mesenchymal stem cells (MSCs) and, especially their extracellular vesicles (EVs), have emerged as promising options due to their regenerative, pro-angiogenic and immunomodulatory properties. However, the current challenge focuses on improving the therapeutic efficacy of EVs, either by improving their bioavailability in cardiac tissue or by enhancing their intrinsic capabilities, in order to make a therapy based on them viable. In this work, we have focused on the improvement of EVs through genetic modification of MSCs. We have followed two approaches: loading of oncostatin M (OSM) on the surface of EVs and inducible overexpression of Notch1 intracellular domain (N1ICD) together with hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF1A) in MSCs to enrich EVs with therapeutic factors, with the expectation of improving its effectiveness in the context of cardiac ischemia. The results obtained show that OSM-loaded EVs have superior antifibrotic properties than native EVs, in addition to reducing cardiac damage caused by isoproterenol infusion in vivo. On the other hand, the overexpression of N1ICD and HIF1A acts as genetic preconditioning, favouring the loading of different therapeutic molecules in EVs. These EVs have been shown to exert beneficial effects in vitro such as reducing fibrosis, protecting cardiomyocytes and reducing hypertrophy, decreasing reactive oxygen species, and increasing angiogenesis. In the in vivo study, these EVs reduced the isoproterenol-induced myocardial damage. In conclusion, we have generated two types of EVs with a therapeutic potential superior to native EVs in the context of cardiac pathology. This work opens the door to the design of new therapeutic strategies based on EVs, comprehensively addressing the various aspects of heart disease. / Buigues Caravaca, M. (2024). Modificación genética de células estromales mesenquimales para potenciar la eficacia de las vesículas extracelulares en el ámbito de la terapia cardíaca [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/204408

A pesar de la abundancia de estudios realizados sobre el papel de las células acinares en las patologías exocrinas del páncreas (i.e. pancreatitis y cáncer), el estudio de las modificaciones producidas durante la diferenciación acinar en dichas patologías, se ha visto limitado por la escasez de modelos celulares no tumorales. Resultados previos de nuestro laboratorio, muestran que las células mES (células madre embrionarias de ratón )- pluripotentes y con la capacidad para generar tipos celulares especializados- pueden desarrollar un fenotipo acinar in vitro. Los objetivos de esta tesis han sido aumentar el contenido de enzimas digestivos así como las propiedades funcionales de las células generadas. Para ello se sobreexpresaron de forma estable p48, RBPJL y Mist1en células madre por transducción lentiviral de estos genes. Obtuvimos, gracias a una estrategia de infección en múltiples etapas, líneas celulares transgénicas mES que expresaban de forma constitutiva RBPJL y/o Mist1. La superimposición de la expresión de p48 por infección lentiviral en células en proceso de diferenciación dio lugar a una fuerte expresión de enzimas digestivos, con un patrón de regulación similar al que acontece in vivo durante el desarrollo pancreático. En esta inducción, tanto p48 como RPBJL son indispensables. Por otro lado, hemos mostrado un aumento elevado en la producción de varios componentes de la maquinaria secretota dependiente de Mist1. Además, hay que hacer notar ,que las células p48/RBPJL/Mist1 exhiben una regulada-secreción en respuesta a los secretagogos acinares y una mejor actividad de que la línea celular acinar 266-6. La expresión combinada de genes clave implicados en el desarrollo pancreático en células ES es un prometedor abordaje que nos llevará a una comprensión de los sutiles procesos del desarrollo exocrino pancreático. / Despite known involvement of acinar cells in pancreatic exocrine pathologies (i.e pancreatitis and pancreatic cancer), the lack of normal cell-based models has limited the study of the alterations that occur in the acinar differentiation program. Our previous data showed that mES (murine embryonic stem) cells, which are pluripotent and have the ability to generate specialized cell types, can acquire an acinar phenotype in vitro. The aim of this work was to increase the digestive enzyme content of the generated cells as well as their functional properties based on stable overexpression of p48, RBPJL and Mist1 by lentiviral gene transduction. Thus, we engineered transgenic mES cell lines constitutively expressing RBPJL and/or Mist1 using a multi-step infection strategy. The superimposition of p48 expression by lentiviral infection of differentiating cells resulted in a strong expression of digestive enzymes, with a pattern of regulation similar to what occurs in vivo during pancreatic development. In this induction, both p48 and RPBJL are indispensable. On the other hand, we showed a high increase in the production of several components of the secretory machinery which was dependent of Mist1. Importantly, p48/RBPJL/Mist1 cells exhibited a regulated-secretory in response to acinar secretagogues and a better secretion activity than the 266-6 acinar cell line. Combined expression of key genes involved in pancreatic development in ES cells may be a promising approach to better understand subtle steps of pancreatic exocrine development.