Submitted by Pós Imunologia (ppgimicsufba@gmail.com) on 2017-02-07T17:52:23Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO CANDACE.pdf: 704424 bytes, checksum: f22bcf625694ce2a558b1c47f749c351 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-02-08T16:02:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO CANDACE.pdf: 704424 bytes, checksum: f22bcf625694ce2a558b1c47f749c351 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-08T16:02:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO CANDACE.pdf: 704424 bytes, checksum: f22bcf625694ce2a558b1c47f749c351 (MD5) / CAPES / As leishmanioses se constituem um complexo de doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania spp. Esses parasitos infectam preferencialmente os macrófagos, podendo infectar também células dendríticas e neutrófilos. Macrófagos infectados por microrganismos intracelulares produzem vesículas extracelulares (VEs), que podem modular respostas imunes tanto in vitro quanto in vivo. Essas VEs são consideradas uma das principais vias de comunicação intercelulares, em conjunto com fatores de crescimento, citocinas, nucleotídeos, lipídios, óxido nítrico e moléculas de adesão. Foi demonstrado pelo nosso grupo que vesículas extracelulares secretadas por macrófagos infectados por L. amazonensis são capazes de estimular a produção de IL-12, IL-1β e TNF-α por macrófagos naive. Sendo assim, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito dessas vesículas sobre a infecção leishmaniótica tanto in vitro quanto in vivo. Para isso, as vesículas extracelulares foram geradas a partir de macrófagos originados de medula óssea de camundongos BALB/c superinfectados com L. amazonensis, a confirmação da produção dessas vesículas foi obtida pela visualização das mesmas pela técnica de rastreamento de nanopartículas (NTA, do inglês). As vesículas não foram capazes de interferir na infecção por L. amazonensis in vitro, não houve diferença estatisticamente significativa no percentual de macrófagos infectados e nem no número de parasitos por célula. Em modelo murino, a utilização dessas vesículas ocasionou aumento significativo da carga parasitária em relação ao grupo controle salina sem interferir no tamanho de lesão e na produção de anticorpos anti- Leishmania. É possível que essas vesículas exerçam importante papel no processo biológico da doença, sendo responsáveis pelo agravamento da infecção. / Leishmaniases are a complex of diseases caused by parasites of the genus Leishmania spp. These parasites preferentially infect macrophages, which can also infect dendritic cells and neutrophils. Macrophages infected by intracellular microorganisms release extracellular vesicles (EVs), which can modulate immune responses in vitro and in vivo. These EVs have an important part to play in intercellular communication, together with growth factors, cytokines, nucleotides, lipids, nitric oxide and adhesion molecules. Our group showed that extracellular vesicles secreted by macrophages infected with L. amazonensis are able to induces the production of IL-12, IL-1β and TNF-α by macrophages naive. The aim of this study was to evaluate the role of these vesicles on Leishmania amazonensis infection both in vitro and in vivo. For this, the extracellular vesicles were generated from macrophages derived from bone marrow of BALB/c superinfected with L. amazonensis, confirmation of production of vesicles was obtained by nanoparticle tracking analysis. The vesicles were not able to interfere with infection by L. amazonensis in vitro, there was no statistically significant difference in the percentage of infected macrophages and in the number of parasites per cell. In a murine model, the vesicles caused a significant increase in parasite burden compared to the saline control group without interfering with the lesion size and production of anti-Leishmania antibodies. It is possible that these vesicles carry important role in the biological process of the disease, being responsible for the worsening the infection.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2017. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-03-08T19:25:00Z No. of bitstreams: 1 2017_VítorYamashiroRochaSoares.pdf: 15000041 bytes, checksum: edeff738495916aac284e7f7815f27cf (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-04-04T22:23:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_VítorYamashiroRochaSoares.pdf: 15000041 bytes, checksum: edeff738495916aac284e7f7815f27cf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T22:23:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_VítorYamashiroRochaSoares.pdf: 15000041 bytes, checksum: edeff738495916aac284e7f7815f27cf (MD5) / Introdução: Apesar do schwannoma vestibular (SV) ser um tumor do nervo vestibular, a perda auditiva (PA) é o sintoma mais comum, presente em 95% dos pacientes. Entretanto, a fisiopatologia dessa PA ainda é desconhecida. A compressão do nervo coclear pelo tumor não é capaz de elucidar completamente sua fisiopatologia e levanta a hipótese que a PA provocada pelo SV pode estar relacionada às substâncias secretadas pelo tumor presentes no líquido que banha a cóclea. Objetivo: Este trabalho identifica se as vesículas extracelulares (VE) derivadas do SV são mediadores no dano de células cocleares. Métodos: VEs foram isoladas de cultura de linhagem celular (células HEI-193) e de cultura de células primárias de SV de pacientes com boa audição (BA) e de pacientes com PA. As VEs foram caracterizadas usando o Nanosight e microscopia eletrônica de transmissão. O conteúdo de RNA das VEs foi extraído. O efeito das VEs sobre cultura de neurônios do gânglio espiral e sobre cultura ex-vivo de cócleas de camundongos foi estudado usando um sistema de cultura duplo e pela marcação das VEs com PKH-67. Mudanças provocadas pelas VEs nas células cocleares foram quantificadas utilizando imunohistoquímica e microscopia confocal. Transfecção da linhagem celular de SV com plasmídeo contendo GFP (proteína fluorescente verde) foi confirmada com reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR). Resultados: Células tumorais humanas de pacientes com PA produzem VEs que podem causar danos em neurônios do gânglio espiral. Em contraste, VEs de células tumorais associados com BA não foram capazes de provocar danos as células cocleares. Conclusão: Este é o primeiro relato de VEs derivadas de SV. Essas VEs quando originadas de SV associados a PA eram capazes de causar danos seletivos nas células cocleares, identificando assim um novo e potencial mecanismo de perda auditiva neurossensorial em pacientes com SV. / Introduction: Although vestibular schwannoma (VS) is a tumor of the vestibular nerve, hearing loss (HL) is the most frequent symptom, presenting in 95% of the patients. However, the pathophysiology of HL is not well understood. The compression of coclear nerve by the tumor is not able to explain the cause of hearing loss perfectly and raise the hypothesis that HL may be related to tumor secretome that reach the cochlea. Objective: This research explores the role of VS-secreted extracellular vesicles (EVs) as a major contributing factor in cochlear cells damage. Methods: EVs were isolated from VS cell line HEI-193 and primary cultured human VS cells from patients with good hearing or poor hearing. The EVs were characterized using a Nanosight device and transmission electron microscopy and by extracting their RNA content. The EVs’ effects on cultured murine spiral ganglion cells and organotypic cochlear cultures were studied using a transwell dual-culture system and by direct labeling of EVs with PKH-67 dye. EV-induced changes in cochlear cells were quantified using confocal immunohistochemistry. Transfection of VS cells with a green fluorescent protein–containing plasmid was confirmed with reverse transcription PCR. Results: Human VS cells, from patients with poor hearing, produced EVs that could damage spiral ganglion neurons. In contrast, EVs derived from VS cells from patients with good hearing did not damage the cultured cochlear cells. Conclusion: This is the first report on EVs derived from VSs and on the capacity of EVs from VSs from patients with hearing loss to selectively damage cochlear cells, thereby identifying a potential novel mechanism of VS-associated sensorineural hearing loss.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctora en Bioquímica / El cáncer de mama corresponde a una de las neoplasias malignas que más se asocia a mortalidad en el género femenino a nivel mundial. Aunque su incidencia ha disminuido gracias a la implementación de mamografías de exploración y aplicación de terapias adyuvantes, esta disminución no parece ser suficiente, ya que el desarrollo de metástasis aún sigue siendo responsable de más del 90% de las muertes asociadas a cáncer de mama, entre otros tipos de cáncer. La progresión de células tumorales hacia un estado metastásico implica la adquisición de características, tales como resistencia a apoptosis, migración e invasividad elevada etc. Teniendo en cuenta esto último, se ha descrito que muchas de estas características son potenciadas por la expresión de Caveolina-1 (CAV1), involucrando a esta proteína de la membrana en la progresión del cáncer. Específicamente en cáncer de mama avanzado se ha observado que una elevada expresión de CAV1 se asocia a una menor sobrevida del paciente. Por otro lado, estudios in vitro realizados en nuestro laboratorio en la línea celular de cáncer de mama metastásico humano, MDA-MB-231, han indicado que el silenciamiento de CAV1 conduce a una disminución en la migración, polarización y recambio de adhesiones focales en comparación con células MDA-MB-231 control. La pregunta que surge ahora es de qué manera CAV1 es capaz de promover migración e invasión, favoreciendo metástasis, considerando que este proceso en sí es ineficiente debido a que menos del 0,1% de las células diseminadas están implicadas en iniciar este proceso. Una de las respuestas puede deberse a que se genera el transporte de CAV1 junto a otras moléculas a través de vesículas xiii extracelulares (EVs), las cuales serían capaces de llevar a esta proteína como mensaje a células contiguas dentro del mismo microambiente tumoral o a células pertenecientes a tejidos distantes idóneos para la formación de un nicho pre-metastásico. En este contexto, se tienen registros de que vesículas de células de la línea celular MDA-MB-231 que contiene niveles endógenos elevados de CAV1 son capaces de promover migración en células de cáncer de mama humano carentes de CAV1, como MCF-7 de carácter no metastásico, pero se desconoce el contenido y su rol en este proceso. Estos antecedentes nos llevaron a plantear la hipótesis que: CAV1 en vesículas extracelulares aumenta el potencial migratorio e invasivo in vitro en células de cáncer de mama y metastásis in vivo en un modelo de xenotrasplante de cáncer de mama. Por consiguiente el objetivo principal de esta tesis fue evaluar la capacidad migratoria e invasora de células de cáncer de mama in vitro y el desarrollo de metástasis in vivo en un modelo de xenotrasplante mamario expuesto a EVs que contienen CAV1. Para abordar la hipótesis de trabajo se plantearon los siguientes objetivos específicos: (1) Purificar y caracterizar vesículas extracelulares de las líneas celulares humanas de cáncer de mama metastásico y no metastásico; (2) Estudiar del efecto de EVs con CAV1 en las propiedades de migración e invasión in vitro en líneas celulares de cáncer de mama humano; (3) Evaluar el perfil proteómico de EVs de las sublíneas de cáncer de mama MDA-MB-231 WT, shC y shCAV1 y por último (4) Evaluar la capacidad metastásica en un modelo murino de xenotrasplante inoculado por la vía intraperitoneal con EVs que contienen CAV1. Los resultados mostraron la obtención de EVs enriquecidos en vesículas del tamaño de exosomas de <200 nm de diámetro a partir de medios condicionados de las líneas xiv celulares de cáncer de mama metástasico humano, MDA-MB-231 WT y MDA-MB-231(shC) que expresan niveles endógenos elevados de CAV1 y en células carentes de CAV1 como MDA-MB-231(shCAV1). Esta caracterización se complementó con imágenes obtenidas mediante microscopía electrónica de transmisión de las vesículas aisladas que mostró tamaños de vesículas de alrededor de 100 nm de diámetro en general y con el hallazgo de CAV1 en vesículas provenientes de MDA-MB-231 WT y shC y no así en vesículas de MDA-MB-231(shCAV1). Cabe añadir que se detectaron marcadores de EVs en todas las muestras mediante Western blot. Para evaluar el efecto biológico de vesículas que contienen o no CAV1 en células de cáncer de mama de carácter metastásico o no metastásico, se evaluaron parámetros de migración e invasión de estas células una vez expuestas a EVs. Los resultados indicaron que independiente del tipo celular utilizado como célula recipiente de EVs, aquellas células que son tratadas con EVs que contienen CAV1 aumentan su potencial migratorio e invasivo en comparación con células no tratadas o tratadas con EVs que no contienen CAV1. El análisis por espectrometría de masas reveló la presencia de proteínas específicas relacionadas con la adhesión celular, como Cyr61, tenascina (TNC) y S100A9 sólo en EVs de MDA-MB-231 WT y shC y no en EVs de MDA-MB-231 carentes de CAV1. De manera de evaluar el rol pro-metastásico de CAV1 en EVs en un modelo animal, se inyectaron estas vesículas junto con células de cáncer de mama metastásico o no metastásico por la vía intraperitoneal en un modelo murino denominado Carcinomatosis intraperitoneal. Los resultados indicaron que animales inoculados con células más EVs que contienen CAV1 presentaron un aumento en el número de células tumorales en el líquido ascítico hallado en la cavidad peritoneal junto con un aumento en la masa tumoral en bazo/páncreas y xv mesenterio en comparación con aquellos animales que no fueron tratados o tratados sólo con células o tratados con células más EVs que no contienen CAV1. Cabe recalcar que nuevamente el efecto de las EVs con CAV1 se dio independiente a que se inoculara junto con células de cáncer de mama que contenían o no CAV1 en el modelo murino. Esto nos lleva a sugerir que la importancia del efecto biológico de estas vesículas en la célula recipiente no sólo recae en la presencia de CAV1, sino que en el tipo de cargo molecular que puedan traer consigo CAV1 en estas vesículas / Breast cancer is the leading cause of cancer-related deaths in women. Although the incidence of this disease has decreased thanks to the implementation of screening mammograms and application of adjuvant therapies, this decrease does not seem to be enough, since the development of metastasis is still responsible for more than 90% of deaths associated with breast cancer, among other types of cancer. The progression of tumor cells towards a metastatic state implies the acquisition of characteristics, such as resistance to apoptosis, migration and high invasiveness, etc. Taking into account the latter, it has been described that many of these characteristics are enhanced by the expression of Caveolin-1 (CAV1), thereby implicating this membrane protein in the progression of cancer. Specifically in advanced breast cancer it has been observed that a high expression of CAV1 is associated with a shorter survival of the patient. On the other hand, in vitro studies conducted in our laboratory using the human metastatic breast cancer cell line, MDA-MB-231, have indicated that the silencing of CAV1 leads to a decrease in migration, polarization and focal adhesion turnover in comparison with control MDA-MB-231 cells. The question that arises is how CAV1 may promote migration, invasion and metastasis, considering that this process is very inefficient because less than 0.1% of the disseminated cells successfully establish a metastatic nodule. One possibility may be that CAV1 is present together with other molecules in extracellular vesicles (EVs), which serve as vectors to transport these components to adjacent cells within the same tumor microenvironment and/or to distant sites where they may condition xvii the pre-metastatic niche. Here, it should be noted that EVs from MDA-MB-231 cells reportedly promote migration of non-metastatic MCF-7 human breast cancer cells, but the precise content of these EVs and their role in this process were not defined. This led us to propose the following hypothesis: CAV1 in extracellular vesicles increases the migratory and invasive potential of breast cancer cells in vitro and in a breast cancer xenotransplant model in vivo. Therefore, the main goal of this thesis was to evaluate the migratory and invasive capacity in vitro and metastatic breast cancer cells in vivo in a xenotransplant model exposed to EVs containing CAV1. To address the working hypothesis, the following specific objectives were proposed: (1) To purify and characterize extracellular vesicles from human metastatic and non-metastatic breast cancer cell lines; (2) To study the effect of CAV1-containing EVs on migration and invasion in vitro of human breast cancer cell lines; (3) To evaluate the protein content by mass spectrometry of EVs from the three breast cancer sub lines MDA-MB-231 WT, shC and shCAV1; and finally (4) To evaluate the metastatic potential in vivo in a murine xenotransplant model inoculated intraperitoneally with EVs containing or not CAV1. The results showed that we were able to isolate an EV preparation enriched in vesicles of <200 nm in diameter, which is characteristic of exosomes. The EVs were purified from conditioned media of the human metastatic breast cancer cell lines, MDA-MB-231 and MDA-MB-231(shC), both expressing elevated endogenous levels of CAV1, as well as from cells lacking CAV1, such as MDA-MB-231(shCAV1) cells. This characterization was complemented by transmission electron microscopy of the isolated vesicles, which revealed that vesicles were around 100 nm in diameter. Finally, by western blotting, CAV1 was detected xviii together with exosome markers in vesicles from MDA-MB-231 WT and shC but not in MDA-MB-231(shCAV1) EVs. To evaluate the biological effects of vesicles with or without CAV1 on metastatic or non-metastatic breast cancer cells, migration and invasion parameters of these cells were evaluated following exposure to EVs. Regardless of the cell type that was used as a recipient cell, those cells that were treated with EVs containing CAV1 increased their migratory and invasive potential in comparison with cells that were either not treated or treated with EVs lacking CAV1. Analysis by mass spectrometry revealed the presence of specific proteins related to cell adhesion, such as Cyr61, tenascin (TNC) and S100A9 only in MDA-MB-231 WT and shC EVs but not in EVs from MDA-MB-231 lacking of CAV1. These results were confirmed by western blotting analysis. In order to evaluate the role of CAV1 in EVs in a murine carcinoma model, these vesicles were injected intraperitoneally together with metastatic or non-metastatic breast cancer cells into recipient mice. For animals inoculated with cells plus EVs containing CAV1, the number of tumor cells found in the ascitic fluid generated within the peritoneal cavity was dramatically increased. Also, a substantial increase in the tumor mass in spleen/pancreas and mesentery was observed in these mice compared to those animals that were either not treated, treated only with cells or treated with cells plus EVs that did not contain CAV1. It should be noted that again these effects of CAV1-containing EVs were observed regardless of whether the reciepient breast cancer cell type employed in these experiments expressed CAV1 or not. Thus, the biological effects of these vesicles in the recipient cell xix appear not to be attributable to CAV1 per se, but rather to depend on differences in the molecular cargos that are incorporated into EVs in the presence of CAV1

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-07-27T16:14:54Z No. of bitstreams: 1 2017_NataliaGurgeldoCarmo.pdf: 2103011 bytes, checksum: 717c638c359f77a76fc1856d6eb60f1a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-08-31T19:05:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_NataliaGurgeldoCarmo.pdf: 2103011 bytes, checksum: 717c638c359f77a76fc1856d6eb60f1a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-31T19:05:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_NataliaGurgeldoCarmo.pdf: 2103011 bytes, checksum: 717c638c359f77a76fc1856d6eb60f1a (MD5) Previous issue date: 2017-08-31 / Exossomos e microvesículas fazem parte das vesículas extracelulares. Estas são produzidas e liberadas por uma variedade de tipos celulares, inclusive em sobrenadante do meio celular, e estão presentes em diferentes fluidos biológicos. Elas podem carregar mRNA e miRNA, dentre outras moléculas. No câncer, os miRNA associados às vesículas extracelulares estão relacionados com a comunicação entre as células tumorais e o microambiente tumoral. Este estudo avaliou a presença das proteínas relacionadas com a maquinaria de processamento de miRNA, nas vesículas extracelulares secretadas pelas linhagens celulares MDA-MB231 (câncer de mama humano) e fibroblasto humano no tempo de crescimento celular de 72 horas. Para purificar estas partículas foi utilizado o método de centrifugação diferencial e ultracentrifugação. Após isto, caracterizou-se as vesículas pelo seu tamanho e distribuição de partículas utilizando a resistência de pulso, pelo sistema qNANO. Para a detecção de proteínas, a técnica de western blot foi realizada a fim de se identificar a presença das proteínas de interesse. Como resultado, as vesículas extracelulares provenientes dos sobrenadantes das linhagens celulares foram purificadas e caracterizadas pelo seu tamanho adequadamente. Observou-se também que a quantidade de partículas de vesículas extracelulares da linhagem tumoral obtida pelo sistema qNANO, foi superior quando comparada à amostra não-tumoral. Os resultados da detecção de proteínas por western blot demonstram que as proteínas Dicer, Ago2 e TRBP2 estão presentes na amostra proveniente da linhagem tumoral MDA-MB231. Confirmou-se a presença de proteínas TSG101, Alix, CD63 - marcadoras moleculares de vesículas extracelulares. Confirmou-se também ausência nas amostras, da proteína Calnexina, a qual é controle negativo e é indicativo de contaminação nas vesículas extracelulares. Por fim, foram identificadas em ambas as amostras as proteínas ApoA-IV, AQP2 e IL-6, as quais estão associadas ao microambiente tumoral na sinalização do miRNA. Conclui-se que as proteínas Dicer, Ago2 e TRBP2, pertencentes a maquinaria de processamento de miRNA, bem como proteínas ainda não discutidas pela literatura em vesículas extracelulares na linhagem tumoral estudada, estão presentes no sobrenadante da linhagem tumoral MDA-MB231, sugerindo um papel para essas moléculas na biologia tumoral. / Exossomes and microvesicles are part of the extracellular vesicles. There are produced and released by a variety of cell types, including cell media supernatant, and be present in different biological fluids. They can carry mRNA and miRNA, among other molecules. In cancer, miRNAs associated with extracellular vesicles are related to the communication between tumor cells and the tumor microenvironment. This study evaluated the presence of proteins related to the miRNA processing machinery in the extracellular vesicles secreted by cell lines MDA-MB231 (human breast cancer) and human fibroblast at cell growth time of 72 hours. Purification of the culture medium supernatant was carried out by the differential ultracentrifugation method. After this, the vesicles were characterized by their size and particle distribution using the pulse resistance by qNANO system. For the detection of proteins, the western blot technique was performed to identify the presence of the proteins of interest. As a result, extracellular vesicles from cell line supernatants were purified and characterized by their size appropriately. It was also observed that the number of extracellular vesicles particles of the tumor lineage obtained by qNANO system was superior when compared to the nontumor sample. The results of western blot detection of proteins demonstrate that Dicer, Ago2 and TRBP2 proteins, related to miRNA processing machinery, are present in the sample from the MDA-MB231 tumor line. We confirmed the presence of TSG101, Alix, CD9 – which are extracellular vesicle molecular marker proteins. Also, we confirmed in both samples the absence of Calnexin, which is a negative control, it is indicative of contamination in the extracellular vesicles. Lastly, we identified in both samples ApoAIV, AQP2 and IL-6 proteins which are associated with tumor microenvironment in miRNA signaling. In conclusion, Dicer, Ago2 and TRBP2 proteins belonging to miRNA processing machinery, as well as proteins not yet discussed in the literature in extracellular vesicles from tumor cell, were present in the supernatant of the MDAMB231 tumor cell, suggesting a role for these molecules in tumor biology.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-03-03T16:06:57Z No. of bitstreams: 1 2016_GetúlioPereiradeOliveiraJúnior.pdf: 6476902 bytes, checksum: a3f2f0389f08e205c0d33fb86fb3bbd4 (MD5) / Approved for entry into archive by Ruthléa Nascimento(ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2017-03-28T15:23:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_GetúlioPereiradeOliveiraJúnior.pdf: 6476902 bytes, checksum: a3f2f0389f08e205c0d33fb86fb3bbd4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-28T15:23:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_GetúlioPereiradeOliveiraJúnior.pdf: 6476902 bytes, checksum: a3f2f0389f08e205c0d33fb86fb3bbd4 (MD5) / As vesículas extracelulares (VEs) são liberadas pelas células e circulam em fluidos biológicos. Elas carregam e entregam proteínas, lipídeos e ácidos nucleicos que participam da regulação da expressão gênica na célula receptora. Entre os ácidos nucleicos transportados por VEs estão os microRNAs (miRNA). As VEs participam de diferentes estados de saúde e doença, por exemplo, durante uma prática esportiva e injúria traumática cerebral (ITC). O exercício físico é importante componente no tratamento de doenças metabólicas. Já a ITC é uma grande causa de morte no mundo, devido a quedas, acidentes de carros e na prática de esportes como futebol americano e boxe. Este trabalho tem como objetivo caracterizar os miRNAs associados a VEs presentes no soro de ratos e plasma de cavalos submetidos a exercício físico aeróbio agudo. Além disso, tem como objetivo caracterizar VEs após ITC em camundongos e na morte celular por necroptose, um dos componentes da ITC, em macrófagos. Ratos foram exercitados em esteira em intensidades leve, moderada e intensa e cavalos foram submetidos a prova oficial de enduro equestre e amostras de sangue foram coletadas antes da prova, após 66km, após o final da prova (130km), 2h após o final da prova e 15h após o final da prova. A caracterização de VEs foi feita, os pequenos RNAs foram extraídos de VEs e sequenciados. A caracterização biofísica das partículas mostrou aumento na concentração de VEs tanto no soro de ratos exercitados quanto no plasma de cavalos após a prova de enduro. Entre os miRNAs diferencialmente expressos após o exercício em ratos são rno-miR-128-3p, rno-miR-25-3p, rno-miR-148a-3p, rno-miR-191a-5p, rno-miR-22-3p, rno-miR- 27a-3p e em cavalos eca-miR-30d, eca-miR-25, eca-miR-30e, eca-miR-423-5p, eca-miR-92a e eca-miR-140-3p. Camundongos foram submetidos à ITC em laboratório e as VEs foram purificadas diretamente do cérebro, quantificadas e a presença de IL-1β analisadas nessas VEs. A via de morte por necroptose foi ativada em macrófagos derivados da medula óssea (MDMO) após tratamento com LPS+ZVAD e as VEs foram analisadas. A ITC não aumentou a concentração de VEs no cérebro de camundongos mas mostrou um aumento na concentração de IL-1β em VEs de camundongos lesionados. A morte por necroptose em MDMO induziu um aumento na concentração de VEs, tendo as proteínas RIPK1 e RIPK3 papel na liberação e carregamento proteico de VEs. As VEs purificadas de MDMO necroptoticos podem causar morte celular em linhagem de célula neuronal receptora. Este estudo pode servir como base para outros estudos e também ajudar no entendimento do papel de VEs na atividade física e na ITC. / As vesículas extracelulares (VEs) são liberadas pelas células e circulam em fluidos biológicos. Elas carregam e entregam proteínas, lipídeos e ácidos nucleicos que participam da regulação da expressão gênica na célula receptora. Entre os ácidos nucleicos transportados por VEs estão os microRNAs (miRNA). As VEs participam de diferentes estados de saúde e doença, por exemplo, durante uma prática esportiva e injúria traumática cerebral (ITC). O exercício físico é importante componente no tratamento de doenças metabólicas. Já a ITC é uma grande causa de morte no mundo, devido a quedas, acidentes de carros e na prática de esportes como futebol americano e boxe. Este trabalho tem como objetivo caracterizar os miRNAs associados a VEs presentes no soro de ratos e plasma de cavalos submetidos a exercício físico aeróbio agudo. Além disso, tem como objetivo caracterizar VEs após ITC em camundongos e na morte celular por necroptose, um dos componentes da ITC, em macrófagos. Ratos foram exercitados em esteira em intensidades leve, moderada e intensa e cavalos foram submetidos a prova oficial de enduro equestre e amostras de sangue foram coletadas antes da prova, após 66km, após o final da prova (130km), 2h após o final da prova e 15h após o final da prova. A caracterização de VEs foi feita, os pequenos RNAs foram extraídos de VEs e sequenciados. A caracterização biofísica das partículas mostrou aumento na concentração de VEs tanto no soro de ratos exercitados quanto no plasma de cavalos após a prova de enduro. Entre os miRNAs diferencialmente expressos após o exercício em ratos são rno-miR-128-3p, rno-miR-25-3p, rno-miR-148a-3p, rno-miR-191a-5p, rno-miR-22-3p, rno-miR- 27a-3p e em cavalos eca-miR-30d, eca-miR-25, eca-miR-30e, eca-miR-423-5p, eca-miR-92a e eca-miR-140-3p. Camundongos foram submetidos à ITC em laboratório e as VEs foram purificadas diretamente do cérebro, quantificadas e a presença de IL-1β analisadas nessas VEs. A via de morte por necroptose foi ativada em macrófagos derivados da medula óssea (MDMO) após tratamento com LPS+ZVAD e as VEs foram analisadas. A ITC não aumentou a concentração de VEs no cérebro de camundongos mas mostrou um aumento na concentração de IL-1β em VEs de camundongos lesionados. A morte por necroptose em MDMO induziu um aumento na concentração de VEs, tendo as proteínas RIPK1 e RIPK3 papel na liberação e carregamento proteico de VEs. As VEs purificadas de MDMO necroptoticos podem causar morte celular em linhagem de célula neuronal receptora. Este estudo pode servir como base para outros estudos e também ajudar no entendimento do papel de VEs na atividade física e na ITC.

As células-tronco processam e são sensíveis a múltiplos sinais dentro de seu microambiente, os quais podem exercer influências que regulam seu destino e sua função de forma espaço temporal. Neste contexto, células podem exercer seu papel biológico por transferir informação genética e alterar expressão gênica de alvos celulares através de vesículas extracelulares (VEs). MicroRNAs (miRNAs), uma classe de pequenos RNAs não codificantes, podem ser encontrados nestas vesículas e são considerados moléculas efetivas no controle do neurodesenvolvimento por regular genes chaves em tempo controlado. Pouco se sabe sobre como a diferenciação influencia o conteúdo de miRNAs liberados via VEs revelando o papel dos mesmos no microambiente de cada etapa do comprometimento neural. Assim, a proposta deste estudo foi analisar o perfil de miRNAs intracelulares e presentes em VEs envolvidos na diferenciação neural dopaminérgica de células-tronco pluripotentes e identificar os possíveis alvos regulados pelos mesmos como mecanismo de estabelecimento de um destino neural específico. / Stem cells sense and process multiple signals in their microenvironment, which can exert influences that regulate cell fate and function in a time spatial manner. In this context, the stem cells can exert their biological role transferring genetic information and altering the genetic expression of target cells through extracellular vesicles (EVs). MicroRNAs (miRNAs), a class of small non coding RNAs, can be found in those EVs and are considered effective molecules in the control of neurodevelopment and differentiation by regulating key genes in a time specific manner. However, little is known about how the cell differentiation influences the miRNAs content released through EVs, and how these molecules function in the microenvironment of each phase of neural commitment. Thus, the purpose of this study was to analyze the intracellular and EVs miRNAs profiles involved in the dopaminergic differentiation of pluripotent stem cells in attempt to identify possible targets regulated by miRNAs as a mechanism of specific neural fate decision.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-08-17T21:38:06Z No. of bitstreams: 1 2018_LeidyJohanaNogueraGaviria.pdf: 1783345 bytes, checksum: 74ef4b3f16d49d4cf2407d7ceac193b3 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-08-27T21:09:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_LeidyJohanaNogueraGaviria.pdf: 1783345 bytes, checksum: 74ef4b3f16d49d4cf2407d7ceac193b3 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-27T21:09:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_LeidyJohanaNogueraGaviria.pdf: 1783345 bytes, checksum: 74ef4b3f16d49d4cf2407d7ceac193b3 (MD5) Previous issue date: 2018-08-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / A doença renal crônica (DRC) é considerada um dano renal que induz a perda progressiva da função dos rins, a qual não pode ser revertida. Os pacientes portadores de DRC necessitam da hemodiálise como terapia de substituição renal. A hemodiálise melhora a qualidade de vida do paciente, mas também tem consequências negativas, como o desencadeamento de um estado de inflamação crônica no paciente, que por sua vez se associa com um alto risco cardiovascular. Este trabalho teve como objetivo investigar se a hemodiálise em pacientes com doença renal crônica altera a população e a função de vesículas extracelulares (EVs) (exossomos e microvesículas). Amostras de sangue de 7 (sete) indivíduos portadores de DRC ativos em programa de hemodiálise foram coletadas. As amostras de soro obtidas a partir das amostras de sangue coletados antes e após a realização da hemodiálise foram utilizadas para realização de testes Proteína C Reativa - PCR LÁTEX e técnicas de purificação e caraterização de EVs. As EVs foram avaliadas quanto a quantidade e distribuição do tamanho pelo método de pulso resistivo (do inglês, Tunable Resistive Pulse Sensing). A estrutura das EVs foi avaliada por microscopia eletrônica. A detecção de proteínas marcadoras de exossomos por Western Blot foi utilizada para reforçar a presença de EVs. O potencial inflamatório das EVs foi testado pelo ensaio de ativação celular com células mononucleares de sangue periférico (CMSP) avaliado por citometria de fluxo. Os pacientes estudados apresentam um processo inflamatório avaliado pela PCR. As amostras coletadas após o procedimento de hemodiálise apresentaram aumento na contagem de EVS. Exceção feita a um paciente que interessantemente tinha o maior valor de PCR. Os resultados de proliferação celular induzidos por EVs não permitiu uma conclusão sobre o potencial anti ou pró inflamatório das EVs após a hemodiálise. A observação de que há um aumento na população de EVs após o procedimento de hemodiálise abre o caminho para que se possa investigar com maior detalhamento o papel destas EVs no risco para o desenvolvimento da doença cardio renal. / Chronic kidney disease (CKD) is a progressive and irreversible loss of function from the kidney. The CKD patients require hemodialysis as renal replacement therapy. Hemodialysis is mandatory to improve the quality of life of CKD patients. However, it also has negative consequences, such as the increased risk of cardiovascular disease, what is believed to be triggered by an inflammatory state in the hemodialysis patient. This study aimed to investigate whether CKD patients under hemodialysis show changes in the quantity and function of EVs (exosomes and microvesicles) prior and after the hemodialysis procedure. Seven blood samples from CKD patients under hemodialysis therapy were collected. Serum samples obtained from blood samples collected before and after the completion of hemodialysis were used for CRP (C Reative Protein) testing using the CRP latex technique. Tunable Resistive Pulse Sensing technique was used to evaluate EVs concentration and size distribution. Electron microscopy was used to investigate the EVs structure. Exosome-associated proteins were assayed using Western blotting. Flow cytometry was used to evaluate peripheral blood mononuclear cells (PBMC) proliferation under the presence of EVs purified prior or after the hemodialysis. CRP test showed that all patients are in an inflammatory state both prior and after the hemodialysis. Based on the data of the seven patients the EVs concentration showed to be increased after the hemodialysis procedure. Cell proliferation induced by EVs purified prior and after the hemodialysis did not allow a conclusion about the inflammatory potential of the EVS after hemodialysis. The observation that there is an increase in the population of EVs after the hemodialysis procedure opens the way so that we can investigate in more detail the role of these EVs in CKD patients under hemodialysis.

[ES] El infarto agudo de miocardio (IAM) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en los países desarrollados. A lo largo de los últimos años se ha visto que la respuesta inflamatoria que ocurre tras desencadenarse el IAM es muy importante en el desarrollo clínico de esta patología. Si se produce una respuesta inflamatoria exacerbada aumenta el riesgo de remodelado cardiaco adverso y fallo cardiaco, pero el hecho de que no se desencadene la respuesta inflamatoria también tiene consecuencias negativas. Debido a la importancia de la respuesta inflamatoria en el IAM, recientemente se han intentado desarrollar terapias dirigidas frente componentes celulares o moleculares que participan en esta respuesta. Dentro de estas terapias, la terapia celular con células mesenquimales estromales (MSC) se ha postulado como un buen candidato. Las MSC se caracterizan fundamentalmente por su capacidad inmunomoduladora, lo que ha conducido a su empleo como agentes terapéuticos en diferentes enfermedades que cursan con procesos inflamatorios. Sin embargo, a lo largo de los últimos años, numerosos estudios han mostrado que el efecto terapéutico de las MSC está mediado fundamentalmente por las vesículas extracelulares (EVs) que liberan. Estas EVs recapitulan los efectos terapéuticos de las células de origen, por lo que también presentan efectos inmunomoduladores. El empleo de las EVs de MSC como agentes terapéuticos presenta ventajas respecto al uso de las MSC como, por ejemplo, una mayor bioseguridad. No obstante, el uso clínico de las EVs todavía tiene que hacer frente a retos como la obtención de grandes cantidades de EVs que constituyan un producto clínico estable y homogéneo. En este trabajo se ha querido evaluar, por un lado, si las EVs obtenidas de diferentes biopsias de la misma fuente tisular de MSC pueden constituir un producto biológico homogéneo que presente las mismas características y funcionalidad. Por otro lado, se ha evaluado si estas EVs se pueden emplear como agente terapéutico frente a la respuesta inflamatoria que se desencadena tras el IAM. Para ello se ha estudiado el efecto inmunomodulador de las EVs sobre células del sistema inmune, fundamentalmente macrófagos, in vitro y en un modelo in vivo de IAM en ratas. Los resultados mostraron que las EVs favorecen la diferenciación de los macrófagos M1 proinflamatorios hacia un fenotipo similar al M2, aumentando la expresión de marcadores M2 y reduciendo la secreción de citocinas proinflamatorias. Además, las EVs promovieron la activación de neutrófilos in vitro y la reducción de su estrés oxidativo. La administración de EVs en ratas sometidas a IAM amortiguó la caída de la función cardiaca y limitó la extensión de la zona infartada a los 7 y 21 días postinfarto. Las EVs también redujeron el número de macrófagos y neutrófilos proinflamatorios dentro de la zona infartada, favoreciendo la resolución de la inflamación. En conclusión, las EVs empleadas en este trabajo han demostrado ser un producto biológico estable con independencia de la biopsia de la que proceden, y han demostrado ser capaces de ejercer respuestas pro-resolutivas eficaces en un modelo de isquemia miocárdica, lo que las convierte en potenciales agentes terapéuticos para tratar la inflamación en el IAM. / [CA] L'infart agut de miocardi (IAM) és una de les principals causes de morbiditat i mortalitat als països desenvolupats. Al llarg dels darrers anys s'ha vist que la resposta inflamatòria que passa després de desencadenar-se l'IAM és molt important en el desenvolupament clínic d'aquesta patologia. Si es produeix una resposta inflamatòria exacerbada augmenta el risc de remodelat cardíac advers i fallada cardíaca, però el fet que no es desencadeni la resposta inflamatòria també té conseqüències negatives. A causa de la importància de la resposta inflamatòria a l'IAM, recentment s'han intentat desenvolupar teràpies dirigides davant de components cel·lulars o moleculars que participen en aquesta resposta. Dins aquestes teràpies, la teràpia cel·lular amb cèl·lules mesenquimals estromals (MSC) s'ha postulat com un bon candidat. Les MSC es caracteritzen fonamentalment per la seva capacitat immunomoduladora, cosa que ha conduït a la seva ocupació com a agents terapèutics en diferents malalties que cursen amb processos inflamatoris. Tot i això, al llarg dels últims anys, nombrosos estudis han mostrat que l'efecte terapèutic de les MSC està intervingut fonamentalment per les vesícules extracel·lulars (EVs) que alliberen. Aquestes EVs recapitulen els efectes terapèutics de les cèl·lules dorigen, per la qual cosa també presenten efectes immunomoduladors. L'ús de les EVs de MSC com a agents terapèutics presenta avantatges respecte a l'ús de les MSC com, per exemple, una bioseguretat més gran. Tot i això, l'ús clínic de les EVs encara ha de fer front a reptes com l'obtenció de grans quantitats d'EVs que constitueixin un producte clínic estable i homogeni. En aquest treball s'ha volgut avaluar, d'una banda, si les EV obtingudes de diferents biòpsies de la mateixa font tissular de MSC poden constituir un producte biològic homogeni que presenti les mateixes característiques i funcionalitat. D'altra banda, s'ha avaluat si aquestes EVs es poden fer servir com a agent terapèutic davant de la resposta inflamatòria que es desencadena després de l'IAM. Per això s'ha estudiat l'efecte immunomodulador de les EV sobre cèl·lules del sistema immune, fonamentalment macròfags, in vitro i en un model in vivo d'IAM en rates. Els resultats van mostrar que les EVs afavoreixen la diferenciació dels macròfags M1 proinflamatoris cap a un fenotip similar al M2, augmentant l'expressió de marcadors M2 i reduint la secreció de citocines proinflamatòries. A més, les VE van promoure l'activació de neutròfils in vitro i la reducció del seu estrès oxidatiu. L'administració d'EVs en rates sotmeses a IAM va esmorteir la caiguda de la funció cardíaca i va limitar l'extensió de la zona infartada als 7 i 21 dies postinfart. Les EVs també van reduir el nombre de macròfags i neutròfils proinflamatoris dins de la zona infartada, afavorint la resolució de la inflamació. En conclusió, les EVs emprades en aquest treball han demostrat ser un producte biològic estable amb independència de la biòpsia de què procedeixen, i han demostrat ser capaços d'exercir respostes pro-resolutives eficaces en un model d'isquèmia miocàrdica, cosa que les converteix en agents terapèutics potencials per tractar la inflamació a l'IAM. / [EN] Acute myocardial infarction (AMI) is one of the main causes of morbidity and mortality in developed countries. Over the last few years, it has been shown that the inflammatory response that occurs after AMI is triggered is very important in the clinical development of this pathology. If an exacerbated inflammatory response occurs, the risk of adverse cardiac remodeling and heart failure increases, but failure to trigger the inflammatory response also has negative consequences. Because of the importance of the inflammatory response in AMI, recent attempts have been made to develop therapies that target cellular or molecular components involved in this response. Within these therapies, cell therapy with mesenchymal stromal cells (MSC) has been postulated as a good candidate. MSC are mainly characterized by their immunomodulatory capacity, which has led to their use as therapeutic agents in different diseases involving inflammatory processes. However, in recent years, numerous studies have shown that the therapeutic effect of MSCs is mainly mediated by the extracellular vesicles (EVs) they release. These EVs recapitulate the therapeutic effects of the cells of origin and therefore also have immunomodulatory effects. The use of MSC-EVs as therapeutic agents has advantages over the use of MSC, such as increased biosafety. However, the clinical use of EVs still faces challenges such as obtaining large quantities of EVs that constitute a stable and homogeneous clinical product. The aim of this study was to evaluate, on the one hand, whether EVs obtained from different biopsies of the same MSC tissue source can constitute a homogeneous biological product with the same characteristics and functionality. On the other hand, we have evaluated whether these EVs can be used as a therapeutic agent against the inflammatory response triggered after AMI. To this end, the immunomodulatory effect of EVs on immune system cells, mainly macrophages, was studied in vitro and in an in vivo model of AMI in rats. The results showed that EVs favored the differentiation of proinflammatory M1 macrophages towards an M2-like phenotype, increasing the expression of M2 markers and reducing the secretion of proinflammatory cytokines. In addition, EVs promoted the activation of neutrophils in vitro and the reduction of their oxidative stress. The administration of EVs in rats subjected to AMI blunted the decline in cardiac function and limited the extent of the infarct zone at 7- and 21-days post-infarction. EVs also reduced the number of proinflammatory macrophages and neutrophils within the infarct zone, favoring the resolution of inflammation. In conclusion, the EVs used in this work have been shown to be a stable biological product regardless of the biopsy from which they are derived and have been shown to be able to exert effective pro-resolving responses in a model of myocardial ischemia, making them potential therapeutic agents to treat inflammation in AMI. / Amaro Prellezo, E. (2024). Las vesículas extracelulares derivadas de células mesenquimales estromales de pulpa dental como producto terapéutico frente a la respuesta inmune que se desencadena tras el infarto agudo de miocardio [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/202973

O Melanoma é um tipo de neoplasia que se origina de melanócitos normalmente presentes na epiderme. Uma das características do melanoma é a capacidade de adquirir resistência a terapias. As células de melanoma podem aumentar a liberação de vesículas extracelulares (VEs) em resposta ao tratamento com quimioterápicos. A cisplatina (CDDP) e a temozolomida (TMZ) são drogas utilizadas para o tratamento de tumores. Ambas as drogas formam adutos no DNA, mas as vias de sinalização que deflagram a morte celular são distintas. O objetivo desse estudo é investigar a morte celular da linhagem B16-F10 na presença de VEs oriundas de células B16-F10 tratadas com cisplatina CDDP ou TMZ. Inicialmente as VEs oriundas de células de melanoma murino, B16-F10, tratadas com CDDP ou TMZ e seus controles, foram isoladas por ultracentrifugações sucessivas. Para os experimentos in vitro, as células foram tratadas com as drogas em combinação com as respectivas VEs. As amostras foram realizados avaliações de ciclo celular e de morte e ensaio clonogênico. Para os experimentos in vivo, as células B16-F10 foram pré-tratadas com VEs, e posteriormente, as células foram inoculadas via subcutânea em camundongos C57BL/6 e os tumores foram mensurados diariamente. Em nosso estudo concluimos que a metodologia do isolamento de VEs é eficiente. Além disso, observamos que o tratamento com CDDP ou TMZ aumenta a liberação de VEs por células tumorais. Apesar do resultado contraditorio, as VEs liberadas por células tumorais tratadas com quimioterápicos aumentam a capacidade de sobrevivência das células de melanoma in vitro. VEs oriundas de células de melanoma não participam inicialmente da sensibilização à morte de células tumorais causada pelas mesmas drogas, mas a longo prazo, as VEs oriundas de células tratadas com a TMZ podem conferir uma resposta celular de sobrevivência às células tumorais in vitro. In vivo, o resultado é inconclusivo, uma vez que para confirmar se as VEs fazem parte da adaptação tumoral conferindo fenômenos de sobrevivência celular in vivo, é necessário avaliar em outros modelos celulares e animais / Melanoma is a neoplasm derived from melanocytes normally present in the skin specifically in the epidermis. One of the malignancies of melanoma is the ability to acquire chemoresistance. Cisplatin (CDDP) and temozolomide (TMZ) are drugs used for the treatment of tumors. Both drugs can form alkylating adducts in DNA, however, the pathways that trigger cell death are distinct. Tumor cells, including melanoma, may increase the release of extracellular vesicles (EVs) in response to chemotherapeutic treatment. The aim of this study is to investigate the cell death phenomenon in B16-F10 cell line in presence of EVs derived from chemotherapeutic-treated B16-F10 cells. For in vitro experiments, the cells were treated with CDDP or TMZ in combination with EVs from chemotherapictreated samples. For in vivo experiments, B16-F10 cells were exposed to EVs and inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. The growth was measured daily. In this work, we established and characterized VEs released by melanoma cells treated with chemotherapics and we established chemotherapics treatments to isolate EVs for next EVs isolation. Our results showed that CDDP or TMZ treatment increase the release of EVs by tumor cells. The EVs released by melanoma cells after CDDP or TMZ treatment seem to increase the survival capacity of melanoma cells. Thus, we concluded that EVs derived from melanoma cells do not participate in the cell death sensitization induced by CDDP or TMZ. However, EVs derived from TMZ treated cells may offer a survival effect to tumor cells in vitro a long term. In vivo, The result is inconclusive since to confirm how VEs are part of the tumor adaptation conferring cellular survival phenomena in vivo, it is necessary to evaluate in other cellular and animal models

As células que compõem o tumor podem interagir entre si, através da liberação e incorporação de vesículas extracelulares, muitas vezes contribuindo para a progressão tumoral. Dessa maneira, o presente trabalho teve como objetivo observar se as vesículas extracelulares , como as microvesículas e os exossomas liberados pelas células cancerosas em condições de estresse celular, após quimioterapia e indução de hipóxia conferem alguma vantagem adaptativa às células tumorais. Nossos resultados mostram que vesículas liberadas por células de melanoma humano em hipóxia ou normóxia apresentam tamanho médio característico de exossomos e microvesículas e não modulam os processos de proliferação, morte e migração celular. As vesículas liberadas pelas células após tratamento com o quimioterápico temozolamida também apresentam tamanho característico de exossomos e microvesículas; em adição, o tratamento com a temozolamida induziu um aumento na secreção dessas vesículas pelas células de melanoma. A incubação das células tumorais com vesículas oriundas da terapêutica com a temozolamida aumentou a proliferação celular, conferindo vantagem proliferativa às células de melanoma humano / Tumor cells can interact with each other by releasing and incorporating extracellular vesicles, contributing to tumor progression. Therefore, the aim of this study was to evaluate if extracellular vesicles, such as microvesicles and exossomes, released by cancer cells under cell stress conditions like chemotherapy and hypoxia, induce an adaptive advantage to tumor cells. Our results show that vesicles shed by human melanoma cells under hypoxia, or normoxia exhibit the characteristic size of exossomes and microvesicles and do not modulate cell proliferation, death or migration. The vesicles released by melanoma cells after temozolomide treatment also showed the average size of exossomes and microvesicles; moreover, temozolomide treatment induced an increase in extracellular vesicles shedding by tumor cells. Incubation of tumor cells with vesicles released under temozolamide therapeutics caused an increase in cell proliferation, providing a proliferative advantage to human melanoma cells