Neste trabalho foram preparadas membranas de poli(indeno) sulfonado (PIndS) com poli(álcool vinílico) (PVA), na forma de rede de polímeros semi-interpenetrantes (semi-IPN), para uso em células a combustível como eletrólito polimérico (PEMFC). Para tal, foram sintetizados polímeros hidrocarbônicos a base de indeno, estireno, limoneno e 5-etilideno-2-norborneno, via mecanismo catiônico, utilizando AlCl3 como catalisador visando à obtenção de um polímero precursor para uso como polímero eletrólito na preparação das membranas. O poli(indeno), (PInd) de maior massa molar foi sulfonado com ácido clorosulfônico com produção de PIndS com grau de sulfonação de 20%, 50% e 100%, que apresentam maior ou menor solubilidade em função do grau de sulfonação. PIndS com grau de sulfonação igual 100% é totalmente solúvel em água. As membranas tipo semi-IPN foram preparadas variando-se o grau de sulfonação do PIndS, o tipo e quantidade do agente de reticulação e a temperatura de cura, ou tratamento térmico destas. Os polímeros e membranas eletrólitos foram caracterizados por RMN de C13 e H1, FTIR, DSC e TGA. As membranas semi-IPNs PIndS/PVA foram avaliadas quanto à absorção de água, capacidade de troca iônica, condutividade, permeabilidade ao etanol, e comportamento viscoelástico por DMA. Foram obtidas membranas com o grau de inchamento inferior a 50%. A condutividade de algumas membranas, nas condições de ensaio avaliadas, foi a mesma ordem de grandeza daquela observada para a membrana comercial Nafion, na faixa de 4,19 x 10-2 S cm-1 a 5,78 x 10-2 S cm-1. Apesar de não terem sido avaliadas em protótipo de célula a combustível, as membranas obtidas demonstraram ter potencial de aplicação como eletrólito polimérico. / In this work were prepared semi-interpenetrating polymer (semi-IPN) membranes from polyindene sulfonate (PIndS) and poly(vinyl alcohol) (PVA) to use in fuel cells as a polymer electrolyte. Hydrocarbon polymers based on indene, styrene, limonene and 5-ethylidene-2-norbornene, were synthesized, via cationic mechanism using AlCl3 as catalyst, in order to obtain a polymer for use as a polymer electrolyte. Polyindene (PInd) of high molecular weight was sulfonated with chlorosulphonic acid to produce PIndS with degree of sulfonation (DS) of 20%, 50% and 100%. The PIndS solubility was dependent on the degree of sulfonation, and PIndS with DS of 100% was completely soluble in water. The semi-IPN membranes were prepared by varying the DS and amount of PIndS, the type and amount of crosslinking agent and PVA curing temperature. The electrolyte polymer and membranes were characterized by C13 and H1 NMR, FTIR, DSC and TGA. The semi-IPNs PIndS/PVA membranes were evaluated by their water absorption, ion exchange capacity, conductivity, ethanol permeability, and viscoelastic behavior by DMA. The membranes water uptake was lower than 50%. The conductivity of some membranes, under the test conditions, was the same order of magnitude than Nafion membrane in the range of 4,19 x 10-3 S cm-1 to 5,78 x 10-3 S cm-1. Despite not being evaluated in a fuel cell prototype, the membranes developed showed have potential application as polymer electrolyte.

Introdução: A epitestosterona é um epímero α da testosterona. Esse esteroide possui uma atividade antiandrogênica, assim como um efeito neuroprotetor. No entanto, o mecanismo de ação da epitestosterona ainda não foi elucidado. Objetivos: O objetivo desse trabalho é investigar o efeito não clássico da epitestosterona sobre o potencial de membrana de células de Sertoli de testículos de ratos de 15, 21 e 35 dias de idade e sobre a captação de 45Ca2+ no tecido testicular de ratos de 12 dias de idade. Materiais e métodos: O potencial e a resistência de membrana das células de Sertoli foram registrados através da técnica eletrofisiológica de registro intracelular. Foi realizada a aplicação de epitestosterona (0,5, 1 e 2μM) ou de testosterona (1μM), com ou sem a perfusão com flutamida (1μM), verapamil (100μM) ou U73122 (2μM). Os testículos de ratos de 12 dias de idade foram pré-incubados com 45Ca2+, com ou sem flutamida (1μM), e incubados com epitestosterona (1μM) ou testosterona (1μM). Análise estatística: Teste t de Student ou ANOVA para medidas repetidas seguido do pós-teste de Bonferroni. Resultados: A epitestosterona produziu uma resposta de despolarização do potencial de membrana, assim como um aumento na resistência de membrana em células de Sertoli de ratos de 15, 21 e 35 dias de idade. Esse esteroide apresentou uma resposta semelhante à apresentada pela testosterona. Os efeitos da epitestosterona não foram modificados após a perfusão com flutamida, um inibidor do receptor androgênico intracelular. A epitestosterona promoveu um aumento na captação de 45Ca2+ após 5 minutos de incubação, e esse efeito não foi bloqueado pela flutamida. O efeito despolarizante desse esteroide foi parcialmente inibido pelo fármaco verapamil, um bloqueador dos canais de cálcio tipo L, e pelo U73122, um inibidor da enzima fosfolipase C. Conclusão: Esses resultados indicam uma atuação da epitestosterona em células de Sertoli através de uma ação não clássica; esses efeitos são semelhantes aos encontrados para a testosterona em células de Sertoli de testículos de ratos. / Introduction: Epitestosterone is the 17α-epimer of testosterone. It seems to possess an antiandrogenic activity, as well as a neuroprotective effect. The mechanism of action of epitestosterone has not been elucidated. Objective: The aim of this work is to investigate the non-classical effect of epitestosterone on the membrane of Sertoli cells from testis of 12-, 15-, 21- and 35-day-old rats. Materials and Methods: The membrane potential and the membrane input resistance of Sertoli cells was recorded using a standard single microelectrode technique. Application of epitestosterone (0.5, 1 and 2μM) or testosterone (1μM) alone and after infusion with flutamide (1μM), verapamil (100μM) or U73122 (2μM) was made. The testes from 12-day-old rats were pre-incubated with 45Ca2+ with or without flutamide (1μM) and incubated with epitestosterone (1μM) or testosterone (1μM). Student's t-test or ANOVA for repeated measures with Bonferroni post-test was used. Results: Epitestosterone produced a depolarization in the membrane potential and increased the input membrane resistance on Sertoli cells from 15-, 21- and 35-day-old rats. This steroid showed a similar response to testosterone. The effect of epitestosterone was not changed after perfusion with flutamide, an intracellular androgen receptor inhibitor. Epitestosterone increased 45Ca2+ uptake within 5 minutes and this effect was also not inhibited by flutamide. The depolarizing effect was slightly inhibited by verapamil, a voltage-dependent calcium channel blocker, and by U73122, a PLC inhibitor. Conclusion: These results indicate that epitestosterone acts on the Sertoli cells via a non-classical signaling pathway; the effects are similar to that of testosterone in Sertoli cells in whole seminiferous tubules from rat testes.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-10-07T13:04:23Z No. of bitstreams: 1 2014_TatianaMariaGiraldoJaramillo.pdf: 3709622 bytes, checksum: febfca93298a6da4512196ad16ff3e02 (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2014-10-15T14:05:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_TatianaMariaGiraldoJaramillo.pdf: 3709622 bytes, checksum: febfca93298a6da4512196ad16ff3e02 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-15T14:05:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_TatianaMariaGiraldoJaramillo.pdf: 3709622 bytes, checksum: febfca93298a6da4512196ad16ff3e02 (MD5) / A infecção por Leishmania (Viannia) braziliensis tem um amplo espectro de manifestações clínicas e imunológicas. Uma variedade de células estão envolvidas na defesa do hospedeiro contra o parasito. Entre elas, as células dendríticas (DCs) são elementos chaves para o sistema imune, pois atuam como sentinelas na periferia e alertam os linfócitos T do tipo do antígeno invasor, direcionando sua polarização e inicializando uma resposta imune. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar a interação de células dendríticas humanas com L. braziliensis, já que, esse contato desencadeia estímulos para a produção de citocinas e moléculas co-estimulatórias envolvidas na resposta inflamatória, contribuindo para o desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa protetora. Assim, monócitos humanos foram isolados a partir de células mononucleares de sangue periférico, purificados por separação magnética e colocados em cultura com IL-4 e GM-CSF para gerar DCs imaturas, as quais foram infectadas com promastigotas de L. braziliensis durante 12 e 24 h. As células foram caracterizadas por citometria de fluxo, usando os marcadores de superfície CD1a, HLA-DR, CD86 (B7-2)e DC-SIGN (CD209). Foi observada uma taxa de infecção de 46±3.5% com 7,2±0.6 amastigotas/DCs e 52.5± 2.4% com 6,1±1.6 amastigotas/DCs após 12 e 24 h de cultura, respectivamente. Os marcadores de superfície revelaram uma porcentagem de expressão de 70,5% (CD1a), 87,9% (HLA-DR), 94% (CD86) e 97,5% (DC-SIGN) nas células não infectadas; e 71% (CD1a), 89,9% (HLA-DR), 98,3% (CD86) e 97% (DC-SIGN) para células infectadas após 24 h. Após 12 h de infecção não detectamos alterações no padrão de expressão de moléculas de superfície. A inibição da apoptose pode tanto favorecer a apresentação dos antígenos quanto a disseminação do parasito. Além disso, foram encontradas principalmente as citocinas IL-12p40 e TNF-α nos sobrenadantes das culturas, enquanto não detectamos as citocinas IL-10, IL-6, IL-1β e TGF-β. __________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmania (Viannia) braziliensis infection leads to a broad spectrum of clinical and immunological manifestations. A great variety of cells is involved in host defense against the parasite. Among those, dendritic cells (DCs) are key elements of the immune system, which acts as sentinels in the periphery and alert T lymphocytes about the type of invading antigen, addressing their polarization and initiating an early immune response. The aim of this work was study the interaction of human dendritic cells with L. braziliensis, this contact triggers stimuli for the production of cytokine and co-stimulatory molecules involved in the inflammatory response, contributing to the development of protective adaptive immune response. Thereby, monocytes were isolated from peripheral blood mononuclear cells, subsequently purified by magnetic separation, and cultured with IL-4 and GM-CSF to generate immature DCs, which were infected with L. braziliensis promastigotes during 12 e 24 h. The cells where characterized by flow cytometry using surface markers CD1a, HLA-DR, CD86 and DC-SIGN. It was observed an infection rate of 46±3.5% with 7,140±0.6 amastigotes/DC and 52.50± 2.4% with 6,1±1.6 amastigotes/DC 12 and 24 h post infection, respectively. The surface markers showed a percentage of expression of 70.5% (CD1a), 87.9% (HLA-DR), 94% (CD86) and 97.5% (DC-SIGN) in non-infected cells; and 71% (CD1a), 89.9% (HLA-DR), 98.3% (CD86) and 97% (DC-SIGN) in infected cells after 24 h infection. After 12 h of infection, we not detected differences of surface molecules expression. Moreover, cell death delay can either stimulate antigen- presentation or favor parasite dissemination. Additionally, the cytokines IL-12p40 and TNF- α were detected in the culture supernatants, whereas IL-10, IL-6, IL-1β and TGF-β were not detected.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2014-11-17T15:02:59Z No. of bitstreams: 1 2014_BrunaCandidoGuido_Parcial.pdf: 30888972 bytes, checksum: 3e26fd31843f64612d4e7cf4ff0b12a2 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-11-17T15:16:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_BrunaCandidoGuido_Parcial.pdf: 30888972 bytes, checksum: 3e26fd31843f64612d4e7cf4ff0b12a2 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-17T15:16:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_BrunaCandidoGuido_Parcial.pdf: 30888972 bytes, checksum: 3e26fd31843f64612d4e7cf4ff0b12a2 (MD5) / O câncer é uma doença caracterizada pelo crescimento celular desordenado e por alterações na fisiologia das células. É considerado uma das principais causas de morte em todo o mundo representando uma ameaça de saúde global com consequências econômicas consideráveis. O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais comum no mundo e o mais comum entre as mulheres também sendo o tipo que mais gera óbitos neste gênero. Este fato gera uma grande demanda por novos tratamentos e novas metodologias para enfrentamento da doença que permitam não só uma melhora na qualidade, mas também, um aumento do tempo de vida dos pacientes portadores desse tipo de câncer. Neste cenário, os derivados da dihidropirimidinona (DHPMs) foram identificados como potenciais agentes antitumorais uma vez que eles se ligam de forma específica e reversível à cinesina Eg5 tendo como consequência a disrupção do fuso mitótico e a prevenção da progressão do ciclo celular durante a mitose apresentando notável atividade antitumoral contra diversas linhagens tumorais. Por meio de um screening, in vitro, nós identificamos 5 DHPMs com potente atividade antitumoral contras as linhagens MCF-7 e MDA-MB-231. Dados de dinâmica Molecular e ensaios de inibição in vitro da cinesina Eg5 mostraram que alguns compostos são realmente potentes inibidores desta proteína motora, causando uma importante diminuição em suas funções dependentes da motilidade. Os DPHMs interferem com a correta formação do fuso mitótico durante a divisão celular prejudicando a conclusão do ciclo celular nas células tumorais de mama e mostraram ser seletivos para células tumorais. Além disso, alguns destes compostos possuem uma interessante propriedade de modulação do fenótipo CD44+/CD44-, levando a uma diminuição na população de células-tronco tumorais (CTT) nas células MDA-MB-231, um efeito importante já que as CTTs são resistentes à muitas terapias antitumorais convencionais e desempenham um papel central na iniciação e manutenção do tumor. Estas observações corroboram com os resultados de que as células tratadas com os DHPMs têm capacidade proliferativa e angiogênica prejudicadas e são finalmente conduzidas à morte por apoptose, um dos mais almejados objetivos no desenvolvimento de fármacos. Juntos, estes resultados fornecem a compreensão de como os derivados de DHPM podem eliminar as células tumorais de mama e ainda abrem um horizonte para estudos adicionais destas arquiteturas moleculares como promissores compostos para uso no tratamento do câncer de mama. / Cancer is a disease characterized by uncontrolled cell growth and severe alterations in cells physiology. It is considered a major cause of death throughout the world representing a threat to global health with considerable economic consequences. The breast cancer is the second most common cancer worldwide and the most common among women also being the type that generates more deaths in this gender. In addressing the need of treatments for this life-threatening illness allowing not only an improvement in quality, but also an increase in the patient’s life expectancy with this cancer, we study 3,4-dihydropryrimidinone derivatives (DHPMs), a class of inhibitor molecules of motor spindle protein Eg5 that shows pronounced antitumor activity against several cancer cell lines. Using an in vitro screening, we identified five DHPMs with potent antitumor effects on MCF-7 and MDA-MB-231 cells. Molecular dynamics and in vitro Eg5 inhibition assays by DHPMs show that some compounds are really effective inhibitors of this motor protein causing an important decreasing in its major mobility-depended functions. DHPM activity interferes with the proper mitotic spindle formation during cell division impairing the correct conclusion of cell cycle of the breast cancer cells and showed to be selective for tumor cells. Moreover, they modulate the CD44+/CD24- phenotype leading to a decrease in the cancer stem cell (CSC) population in MDA-MB-231 cells, an important effect since CSCs are resistant to many conventional cancer therapies and play a pivotal role on initiation and maintenance of a tumor. This observation corroborates with the results that DHPM treated cells showed impaired able of proliferation and angiogenesis and are finally conducted to death by apoptosis, one of the most pursued goal in drug development. Together, our results provide insights into how DHPMs derivatives can eliminate breast tumor cells and also open a possible window for further studies of theses molecular architectures as promising compounds to cancer treatment.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2015-05-13T12:59:41Z No. of bitstreams: 1 2015_MarianaColacoPereiraCarneiroCunha.pdf: 3549603 bytes, checksum: fe2aa1e1f50b479df5b03e88d0835d20 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-13T13:41:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_MarianaColacoPereiraCarneiroCunha.pdf: 3549603 bytes, checksum: fe2aa1e1f50b479df5b03e88d0835d20 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-13T13:41:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_MarianaColacoPereiraCarneiroCunha.pdf: 3549603 bytes, checksum: fe2aa1e1f50b479df5b03e88d0835d20 (MD5) / Introdução: Diversos estudos discutem a segurança do uso de nanopartículas já que estas são capazes de promover alterações na expressão gênica, padrão epigenético, homeostase do ferro e estresse oxidativo em ensaios in vitro. Uma gama de estudos aponta diferentes comportamentos celulares em resposta à exposição a nanopartículas, mas ainda não existe um consenso sobre os reais benefícios e riscos que estes nanomateriais podem apresentar em um sistema biológico complexo. Portanto, torna-se necessário estudar estes riscos a fim de contribuir com o desenvolvimento de nanopartículas mais adequadas para aplicações biológicas. Objetivo: Avaliar e caracterizar os possíveis efeitos citotóxicos e epigenéticos em células de carcinoma de glândula submandibular humana (HSG) submetidas a exposição de nanopartículas de maghemita funcionalizadas com cobertura de citrato (NPs). Analisar possíveis alterações na expressão gênica mediante a quantificação do número de transcritos para determinados genes alvo comprometidos com a regulação epigenética e estresse oxidativo. Materiais e métodos: As NPM-citrato foram sintetizadas pelo método de coprecipitação de Fe (II) e Fe (III) e adição direta de ácido cítrico. Os ensaios de citotoxicidade foram realizados por detecção da lactato desidrogenase (LDH) e ensaio de MTT. A morfologia celular foi analisada por coloração panótica InstaProv em microscópio de luz. A detecção de ferro intracelular foi realizada pelo ensaio do Azul da Prússia. As quantificações de metilação global de DNA e de acetilação das histonas H3 e H4 foram realizados por ensaio colorimétrico. A expressão dos genes FERRH, FERRL, DNMT1, DNMT3a, HDAC1, HDAC2 e COX-2 foi realizada por qRT-PCR. Para análise da produção de espécies reativas de oxigênio foi utilizado protocolo de H2DCFA. Resultados: As NPM-citrato nas concentrações testadas de 0,5 mgFe/mL e 3,0 mgFe/mL não apresentaram efeito citotóxico pela metodologia empregadas. Contudo, foram observadas alterações na morfologia celular, como vacuolização citoplasmática nas células expostas a nanopartículas por 24h e 48h, presença de ferro intracelular mesmo após a retirada do tratamento, intensa produção de espécies reativas de oxigênio dose e tempo dependentes, diminuição no perfil global de metilação de DNA e acetilação das histonas H3 e H4: a acetilação da H3 diminui para 38% e 62% após os tratamentos com 0,5 mgFe/mL e 3,0 mgFe/mL, respectivamente. Para a H4 a hipoacetilação foi mais acentuada, diminuindo de 82% para 4% e 10% após os tratamentos com 0,5 mgFe/mL e 3,0 mgFe/mL, respectivamente. Diferenças entre o acúmulo de transcritos dos genes estudados também foram observadas: transcritos referentes aos genes de COX-2, FERRL, e FERRH encontraram-se aumentados, enquanto que DNMT3a sofreu uma diminuição no número de transcritos. Conclusão: Concluímos que as nanopartículas de maghemita recobertas com citrato são capazes de induzir vacuolização citoplasmática, acúmulo de ROS, diminuição do padrão de metilação global e de acetilação de H3 e H4, alteração do acúmulo dos transcritos COX-2, FERRH, FERRL, DNMT3a e HDAC1 sem comprometer a viabilidade das células HSG. Esse é o primeiro relato sobre os efeitos genéticos e epigenéticos das NPM-citrato sobre células HSG. / Introduction: A plethora of studies debate about the safety of the use of nanoparticles due to their ability to promote alterations in gene expression, epigenetic patterns, iron homeostasis, and oxidative stress in vitro. Several papers report these different cell behaviours to different nanoparticles, but there is still no consensus on the real benefits and risks associated to nanoparticle exposure on a complex biological system. Hence, it is necessary to elucidate these risks in order to contribute with adequate therapy development and biological applications. Objective: To evaluate and distinguish possible cytotoxic and epigenetic effects on human submandibular gland (HSG) cancer cells exposed to maghemite nanoparticles functionalised with citric acid. Methodology: The NPM-citrate were synthesized by coprecipitation of Fe (II) and Fe (III) method and direct addition of citric acid. LDH and MTT were performed in order to evaluate cytotoxicity. Cell morphology was analysed by panoptic staining. Intracellular iron detection was assayed by the Prussian Blue. Methylation of DNA and Histone acetylation quantifications were performed by colorimetric assays. Gene expression of FERRH, FERRL, DNMT1, DNMT3a, HDAC1, HDAC2 e COX-2 was performed by qRT-PCR. For ROS production assay protocol for H2DCFA was performed. Results: No cytotoxic effects were observed on cells exposed to the tested concentrations of 0.5 mgFe/mL and 3.0 mgFe/mL. Although, cell morphology was found altered by both concentrations after 24h and 48h of exposure. Intracellular iron presence was also observed even after cease of exposure as well as intense generation of ROS. Furthermore, global DNA methylation and acetylation of histones H3 and H4 were also found to be altered. Histone 3 acetylation decreased to 38% and 62% after treatments with 0.5 mgFe/mL and 3.0 mgFe/mL, respectively. Hipoacetylation for H4 was even more accentuated and decreased from 82% to 4% and 10% after treatments of 0.5 mgFe/mL e 3.0 mgFe/mL, respectively. Differences between the gene transcripts accumulation were also reported: COX-2, FERRL and FERRH were found to be overexpresses, while DNMT3a decreased its transcript accumulation. Conclusion: We conclude that maghemite nanoparticles functionalized with citric acid were able to promote cytoplasmatic vacuolization, ROS generation, decreasing of global methylation pattern and acetylation of H3 and H4 and alteration on transcript accumulation of COX-2, FERRH, FERRL, DNMT3a and HDAC1 without impairment of HSG cells viability. This is the first report on the genetic and epigenetic effects of maghemite nanoparticles functionalized with citric acid on HSG cells.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-06-24T13:46:04Z No. of bitstreams: 1 2013_NataliaLemosChaves.pdf: 1364299 bytes, checksum: efcf646591435abc204b5dcaad6d4495 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-06-24T14:00:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_NataliaLemosChaves.pdf: 1364299 bytes, checksum: efcf646591435abc204b5dcaad6d4495 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-24T14:00:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_NataliaLemosChaves.pdf: 1364299 bytes, checksum: efcf646591435abc204b5dcaad6d4495 (MD5) / O câncer de mama é um dos mais frequente entre as mulheres em todo o mundo. Em busca de drogas mais eficientes para o tratamento de câncer, complexos metálicos estão sendo amplamente estudados. A intercalação destes complexos em bases de DNA pode inibir eventos como transcrição e replicação, causando morte celular. No entanto, a utilização destes compostos é limitada devido à sua toxicidade sistêmica. Nesse contexto, o uso de citrato de ródio [Rh2 (H2cit)4] associado com nanopartículas magnéticas (NPs) pode reduzir a toxicidade sistêmica no tratamento do câncer. Neste estudo, foram comparados os efeitos do citrato de ródio livre [Rh2 (H2cit)4], [Rh2(H2cit)4] carreado por nanopartículas (NPs) [Magh-Rh2(H2cit)4] e NPs de maguemita funcionalizadas com ácido-cítrico (Magh-cit) em células MCF-7 de câncer de mama e células epiteliais de mama não tumorais (MCF-10A). Foram também realizados estudos para verificar a indução de apoptose por esses fármacos, em células MCF-7. As concentrações estudadas de citrato de ródio livre foram menos citotóxicas do que as outras formulações do fármaco avaliadas em ambas as linhagens celular. Além disso, os resultados obtidos por citometria de fluxo, mostraram aumento estatisticamente significativo de fragmentação de DNA em 36 horas de tratamento com Magh-Rh2(H2cit)4 NPs (300 µM) e com a mesma concentração de ferro de Magh-cit NPs. Os mesmos tratamentos analisados por imagens confocais mostraram a fragmentação nuclear, em células MCF-7 depois de (48 horas). Após 24 horas, os tratamentos induziram translocação de citocromo C das mitocôndrias. Após pelo menos 12 horas de tratamento com as nanopartículas, foi possível identificar caspases efetoras ativas. Portanto, foi demonstrado que o citrato de ródio associado com nanopartículas de maguemita e nanopartículas de maghemita ligada ao citrato induziram citotoxicidade em células tumorais e podem representar uma alternativa para o tratamento do câncer de mama. Também foi demonstrado que as nanopartículas podem induzir, em células MCF-7, alterações celulares características de morte celular por apoptose, mesmo na ausência de caspases 3. ______________________________________________________________________________ SUMMARY / Breast cancer is a of the most frequent cancer among women worldwide. In search of more efficient drugs against cancer, metal complexes are being widely studied. The intercalation of these compounds in DNA bases impairs transcription and replication events causing cell death. Nevertheless, the use of these compounds is limited because of their systemic toxicity. In this regard, the use of dirhodium citrate [Rh2(H2cit)4] associated with magnetic nanoparticles (NPs), should work reducing systemic toxicity in cancer treatment. In this study, we compared the effects of Rh2(H2cit)4, Rh2(H2cit)4-loaded maghemite NPs [Magh-Rh2(H2cit)4] and citrate-loaded maghemite NPs (Magh-cit) on MCF-7 breast cancer cells and MCF-10A non-tumor and nontumorigenic epithelial breast cells. Events of apoptosis stimulated by nanoparticles were also checked. The concentrations rhodium citrate was less cytotoxic than other forms of drugs evaluated. Moreover, the results obtained by flow cytometry showed statistically significant increase in DNA fragmentation 36 hours of treatment with Magh-Rh2(H2cit)4 NPs (300 µM) and with the same iron concentration of Magh-cit NPs. The same treatments analyzed by confocal images showed nuclear fragmentation in MCF-7 cells after (48 hours). Treatment with 300 µM rhodium citrate Magh-Rh2(H2cit)4 NPs and Magh-cit NPs after 24 hours, caused release of cytochrome c from mitochondria, indicading alteration of mitochondrial membrane permeability. After at least 12 hours of treatment with nanoparticles, it was possible to identify active effector caspases. We showed that dirhodium citrate associated with maghemite nanoparticles and citrate-loaded maghemite NPs induced cytotoxicity in tumor cells and should represent a great alternative for breast cancer treatment. It has been shown that nanoparticles can induce changes that characterize apoptotic cell death in MCF-7 cells, even in the absence of caspase 3.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2013. / Submitted by Luiza Silva Almeida (luizaalmeida@bce.unb.br) on 2013-07-17T19:09:59Z No. of bitstreams: 1 2013_CarolinaGonzalesdaSilva.pdf: 1871143 bytes, checksum: 939e8e78e70378e8fbfbf273f00b5582 (MD5) / Approved for entry into archive by Leandro Silva Borges(leandroborges@bce.unb.br) on 2013-07-17T19:53:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_CarolinaGonzalesdaSilva.pdf: 1871143 bytes, checksum: 939e8e78e70378e8fbfbf273f00b5582 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-17T19:53:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_CarolinaGonzalesdaSilva.pdf: 1871143 bytes, checksum: 939e8e78e70378e8fbfbf273f00b5582 (MD5) / A clonagem por transferência nuclear (TN) ainda é uma técnica com baixa eficiência em bovinos. Um dos fatores que deve ser melhorado é a fonte de células doadoras de núcleo. Quanto menos diferenciadas forem estas células, mais facilmente elas serão reprogramadas pelo citoplasma receptor, a fim de originarem embriões e bezerros a termo de uma forma saudável. Células do fluido amniótico (CFA), da geleia de Wharton do cordão umbilical (CGW) e do tecido adiposo (CTA) são fontes de células multipotentes com potencial para uma melhor reprogramação e que ainda não haviam sido testadas para a produção de embriões bovinos por meio de TN. O objetivo deste trabalho foi isolar, cultivar, criopreservar e utilizar no procedimento de TN as CFA, CGW e CTA de bovinos. Primeiramente, foram isoladas CFA de úteros de abatedouro para testar o melhor meio de cultivo (DMEM vs Amniomax Complete II), e o melhor agente crioprotetor (glicerol vs DMSO vs DMF) quanto a preservação de viabilidade celular avaliada por azul de Trypan 0,4%. Posteriormente, testou-se a possibilidade de isolamento in vivo dos tipos celulares. O cultivo foi feito por centrifugação das CFA e explante das CGW e CTA. Para comparação morfológica foi realizada a Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) das células em cultivo. Para avaliação de integridade de DNA realizou-se a metodologia de TUNEL. Para a análise estatística foi realizada ANOVA seguida de teste de Tukey (p<0,05). O meio Amniomax Complete II apresentou crescimento e confluência das CFA em todos os materiais isolados de quatro animais. O DMSO e o glicerol preservaram uma maior porcentagem de células (84,50±9,53% e 63,00±18,18%, respectivamente), e foram superiores ao meio com DMF (42,00±13,92%). Obteve-se êxito no isolamento in vivo dos tipos celulares, por meio de aspiração intravaginal guiada por ultrassom no caso das CFA, coleta do cordão umbilical no momento do parto para as CGW e coleta de biópsia de animal jovem para as CTA. A avaliação de TUNEL revelou 100% de células com DNA íntegro para os três tipos celulares em primeira passagem. As micrografias em MEV revelaram CTA em padrão fusiforme de crescimento e CFA e CGW sem forma definida sob cultivo. Houve diferença significativa nas taxas de eletrofusão, com resultados superiores para CFA e CGW (85,89±9,93% e 69,64±11,72%, respectivamente), em relação às CTA (50,07±10,64%). A produção embrionária não diferiu estatisticamente entre os três tipos celulares (46,47±7,92%, 45,46±13,03% e 62,67±15,15%, para CTA, CFA e CGW, respectivamente), entretanto observou-se uma superioridade de aproximadamente 17% na produção de blastocistos para CGW em relação a CTA e CFA. Foram obtidas gestações de todos os tipos celulares, mas somente uma gestação veio a termo, proveniente de TN com CFA, e uma gestação encontra-se aos 200 dias, proveniente de CTA. O animal nascido por secção cesariana veio a óbito logo após o parto por insuficiência respiratória. Demonstrou-se ser possível isolar, cultivar e criopreservar CFA, CGW e CTA de bovinos vivos sem prejudicá-los e produzir embriões por meio de TN com eficiência utilizando esses tipos celulares. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cloning by nuclear transfer (NT) is still a technique with low efficiency in cattle. One of the factors that should be improved is the source of nucleus donor cells. The less differentiated are the cells, the easier is to reprogram their nuclei by cytoplasm receiver in order to originate healthy embryos and calves. Cells from amniotic fluid (CAF), Wharton's jelly of the umbilical cord (CWJ) and adipose tissue (CAT) are sources of multipotent cells with potential for improve reprogramming and that had not been tested for the production of bovine embryos by NT. The aim of this study was to isolate, cultivate, cryopreserve and utilize in the NT procedure, the CAF, CWJ and CAT of bovine. Firstly, CAF of uteri obtained from slaughterhouse were isolated to test what is the best medium for in vitro culture (DMEM vs Amniomax Complete II), and the best cryoprotectant agent (glycerol vs DMSO vs DMF), as the preservation of the cell viability assessed by Trypan Blue 0,4%. Subsequently, the possibility of isolating in vivo the described cell types was tested. The culture was done by centrifugation of CAF and explantation of CWJ and CAT. For morphological comparison, scanning electron microscopy (SEM) of the cells in culture was performed. For evaluating DNA integrity, the TUNEL method was carried out. For the statistical analysis was performed ANOVA followed by Tukey test (p<0,05). The medium Amniomax Complete II presented growth and confluence of the CAF in all material isolated from four animals. The DMSO and glycerol preserved a higher percentage of cells (84.50±9.53% and 63.00±18.18%, respectively), and were superior to medium with DMF (42.00±13.92%). Success was obtained in the isolation of cell types in vivo through use intravaginal ultrasound- guided aspiration for CAF, collection from the umbilical cord at birth for CWJ and by collecting biopsy from young animal for CAT. The evaluation of TUNEL revealed 100% of cells with intact DNA for the three cell types in the first passage. The SEM micrographs revealed a fusiform growth of CAT, and CAF and CGW without defined form under culture. There were significant differences in the rates of electrofusion, with results superior for CAF and CWJ (85.89±9.93% and 69.64±11.72%, respectively), relative to CAT (50.07±10.64%). The embryo production did not differ significantly among the three cell types (46.47±7.92%, 45.46±13.03% and 62.67±15.15% for CAT, CAF and CWJ, respectively), however a superiority of 17% in blastocyst production of CWJ in relation to the CAT and CAF was observed. Pregnancies were obtained for all cell types, but only one pregnancy has come to term, from TN with CAF and one gestation is on day 200 from the CAT. The born calf died soon after birth by cesarean section, due respiratory insufficiency. This study proved it is possible to isolate, cultivate and cryopreserve CAF, CAT and CWJ from live animals without harming them and to produce bovine embryos by TN efficiently using these cell types.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-11-24T21:07:45Z No. of bitstreams: 1 Tese de doutorado TULIO CESAR FERREIRA.pdf: 2124486 bytes, checksum: 5d88203c3a807e8558cc3f19e1451b12 (MD5) / Approved for entry into archive by Joanita Pereira(joanita) on 2009-11-26T14:58:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese de doutorado TULIO CESAR FERREIRA.pdf: 2124486 bytes, checksum: 5d88203c3a807e8558cc3f19e1451b12 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-26T14:58:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese de doutorado TULIO CESAR FERREIRA.pdf: 2124486 bytes, checksum: 5d88203c3a807e8558cc3f19e1451b12 (MD5) Previous issue date: 2006 / O fator 1 induzível por hipóxia (HIF-1) é um regulador central da resposta à mudanças na concentração de oxigênio e tem um papel importante nos processos fisiológicos e patológicos em humanos. Este fator de transcrição é expresso quando as células de mamíferos são submetidas à condições de hipóxia e ativa cerca de 70 genes alvos regulados por oxigênio. HIF-1 é uma proteína heterodimérica composta por dois membros da família de proteínas contendo o domínio basic helix-loop-helix (bHLH)-PER-ARNT-SIM (PAS), HIF-1α (atua unicamente na resposta à hipóxia) e o HIF-1β (também conhecido como translocador nuclear do receptor de aril hidrocarbono, ARNT, que é constitutivamente expresso). A estabilidade e a atividade do HIF-1α são reguladas por modificações pós-traducionais, tais como fosforilação, hidroxilação, nitrosilação e acetilação. Sob normóxia, HIF-1α é constitutivamente expresso e subsequentemente hidroxilado pela HIF prolil hidroxilase (HPH) levandoo a ser rapidamente marcado para a degradação mediada pelo proteasoma. A seqüência de eventos que leva a ativação do HIF-1α e os efeitos paradoxais do HIF- 1 (efeitos pro- e anti-apoptóticos) não são completamente entendidos. Também não estão claros como os mecanismos dependentes e independentes de oxigênio que contribuem para as modificações pós-traducionais do HIF-1α, translocação nuclear, heterodimerização com o ARNT, ligação ao DNA em regiões regulatórias cis de genes alvos e recrutamento de cofatores. Portanto, as proteínas que interagem com o HIF-1α e as modificações pós-traducionais precisam ser melhor entendidas. Células de leveduras compartilham vários aspectos de sua bioquímica com os organismos multicelulares tais como, respostas transcricionais e celulares e mecanismos de modificações pós-traducionais de proteínas. Além disso, elas são fáceis de manipular sob diferentes condições de laboratório. Este trabalho visou avaliar a viabilidade da expressão do HIF-1 na levedura Saccharomyces cerevisiae como um modelo alternativo de expressão. Em células de leveduras, HIF-1 não é alvo de degradação sob condições de normóxia, já que esse microorganismo não possui a via de degradação mediada pelo von Hippel Lindau (proteína supressora de tumor). Pretendemos usar esse modelo de expressão para estudar as modificações pós-traducionais do HIF-1α e sua interação com outras proteínas que possam afetar sua dimerização/co-ativação, sob diversas condições. Estabelecemos então uma linhagem de levedura que expressa o HIF-1α e o ARNT constitutivamente sob condições normais de oxigênio. Também mostramos que o HIF-1α recombinante humano foi capaz de formar o heterodímero com o ARNT e se ligar ao elemento responsivo a hipóxia (HRE) da eritropoietina humana. Além disso, nós descrevemos a presença desse motivo no genoma de levedura e mostramos que esse organismo pode conter motivos HRE funcionais. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) is a central regulator in the response to changes in oxygen concentration and plays an important role in physiological and pathological processes in humans. This transcription factor is expressed when mammalian cells are subjected to hypoxia and activates transcription of over 70 oxygen-regulated target genes. HIF-1 is a heterodimeric protein composed of two members of the basic helix-loop-helix (bHLH)-containing PER-ARNT-SIM (PAS) domain family, HIF-1α (unique to the hypoxia response) and HIF-1β (also known as the aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator, ARNT, which is constitutively expressed). HIF-1α stability and activity are regulated by post-translational modifications such as phosphorylation, hydroxylation, nitrosation and acetylation. Under normoxia, HIF-1α is constitutively expressed and subsequently hydroxylated by a HIF prolyl hydroxylase (HPH) causing it to be rapidly targeted for proteasomemediated degradation. The sequence of events that leads to the full activation of HIF- 1α and the paradoxical effects of HIF-1 (pro- and anti-apoptotic effects) are not completely understood. Neither is clear how oxygen-dependent nor oxygenindependent mechanisms contribute to the post-translational modifications of HIF-1α, nuclear translocation, heterodimerization with ARNT, DNA binding to the cisregulatory region of target genes and recruitment of cofactors. Therefore, HIF-1α interacting partners and the pos-translational modifications need to be better elucidated. Yeast cells share several aspects of its biochemistry with multicellular organism such as, transcriptional and cellular responses and mechanisms of protein post-transcriptional modifications. In addition they are easy to manipulate under different laboratory conditions. This work aimed to evaluate the viability of HIF-1 expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae as an alternative expression model. In yeast cells, HIF-1 may not be targeted to degradation under normoxic conditions, since this microorganism lacks the pathway mediated by the von Hippel Lindau-VHL (a tumor suppressor protein). We intend to used this expression model to study the post-translational modifications and its interaction with other proteins that may affect its dimerization/co-activation. We established a yeast strain overexpressing HIF-1α and ARNT in a constitutive manner under normal conditions of oxygen. We also showed that recombinant HIF-1α was able to form a heterodimer with ARNT and bind to human erythropoietin hypoxia responsive element (HRE) motif. Additionally, we described the presence of this motif in the yeast genome and showed that this organism may harbor HRE motifs.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-03-17T13:48:49Z No. of bitstreams: 1 2009_ArnubioValenciaJimenez.pdf: 1332526 bytes, checksum: 5d99a28ecacddcd233c64d4de0727188 (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2010-03-24T12:05:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_ArnubioValenciaJimenez.pdf: 1332526 bytes, checksum: 5d99a28ecacddcd233c64d4de0727188 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-03-24T12:05:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_ArnubioValenciaJimenez.pdf: 1332526 bytes, checksum: 5d99a28ecacddcd233c64d4de0727188 (MD5) Previous issue date: 2009-04 / Sementes do feijão (Phaseolus coccineus) foram analisadas pela presença e atividade do inibidor de amilase (-AI). Por meio do uso de anticorpos policlonais gerados contra o inibidor -AI-1 do feijão comum (P. vulgaris), foi possível detectar polipeptídios típicos deste inibidor (Mr. 14 18 kDa), além do polipeptídeo de 32 kDa. Os resultados encontrados nos testes de inibição permitem sugerir que o inibidor presente nas sementes de P. coccineus 35590 seria o melhor candidato para a transformação genética do café visando à geração de plantas com resistência a larvas da broca-do-café. A digestão proteolítica in vitro do inibidor puro causou uma perda rápida da sua atividade inibitória, afetando seriamente sua capacidade natural de interagir com as -amilases. Também, neste trabalho foram estudadas as propriedades das -amilases presentes no trato digestivo de larvas de Tecia solanivora, um inseto-praga que gera um dano importante à batata (Solanum tuberosum). O inseto tem no mínimo três isoformas principais de -amilases digestivas, as quais apresentaram pontos isoelétricos de 5.30, 5.70 e 5.98. A atividade da -amilase digestiva tem um pH ótimo entre 7.0 e 10.0, com um pico de atividade em pH 9.0. A enzima foi inibida por inibidores de natureza protéica presentes nas sementes de P. coccineus (70% de inibição) e de P. vulgaris cv Radical (87% de inibição) em pH 6.0. Os resultados mostram também que o inibidor de - amilase de amaranto pode ser o melhor candidato para gerar batatas modificadas geneticamente resistentes a este inseto-praga. Futuras pesquisas precisam ser desenvolvidas para esclarecer se estes inibidores de -amilase são resistentes às proteases presentes no trato digestivo da lagarta de batata, T. solanivora. Em um ensaio subseqüente, foi desenvolvido e testado um novo e sensível método espectrofotométrico para a detecção da atividada leucine aminopeptidase (-aminoacyl-peptide hydrolase, EC 3.4.11.1) proveniente do trato digestivo de larvas de Telchin licus (Lepidoptera: Castniidae), fazendo uso do substrato L-leucyl-2- naphthylamide. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Seeds of scarlet runner bean (Phaseolus coccineus L.) were analyzed for -amylase inhibitor (-AI) activity. By using polyclonal antibodies raised against pure a−AI-1 from common bean (Phaseolus vulgaris L.) it was possible to detect the typical -AI polypeptides (Mr 14 -18 kDa) as well as a large polypeptide of Mr 32,000 Da. Differential inhibition curves lead us to suggest that the gene encoding one of the inhibitors in P. coccineus (in accession G35590) would be a good candidate for genetic engineering of coffee resistance towards the coffee berry borer Hypothenemus hampei Ferrari (Coleoptera: Scolytidae). An in vitro proteolytic digestion treatment of pure a−AI−1, resulted in a rapid loss of the inhibitory activity, seriously affecting its natural capacity to interact with mammalian -amylases. In addition, the properties of the digestive -amylase from T. solanivora larvae, an important insect pest of potato (Solanum tuberosum), were studied. This insect has three major digestive -amylases with isoelectric points 5.30; 5.70 and 5.98 respectively, which were separated using native and isoelectric focusing gels. The -amylase activity has an optimum pH between 7.0 and 10.0 with a peak at pH 9.0. The enzyme was inhibited by proteinaceous inhibitors from P. coccineus (70% inhibition) and P. vulgaris cv. Radical (87% inhibition) at pH 6.0. The results show that the -amylase inhibitor from Amaranthus may be a better candidate to make genetically modified potatoes resistant to this insect. However, it is necessary to know if these -amylase inhibitors are resistant to the gut proteases from T. solanivora. On the other hand, a simple and sensitive spectrophotometric assay to determine the activity of leucine aminopeptidase (-aminoacyl-peptide hydrolase, EC 3.4.11.1) from insect intestinal tracts of Telchin licus (Lepidoptera: Castniidae), using L-leucyl-2- naphthylamide as substrate, was developed.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2010-03-29T13:47:46Z No. of bitstreams: 1 2009_GlauciaManoelladeSouzaLima.pdf: 6424079 bytes, checksum: ebb433df2157258c4cb5131712e0b77e (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-12T14:10:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_GlauciaManoelladeSouzaLima.pdf: 6424079 bytes, checksum: ebb433df2157258c4cb5131712e0b77e (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-12T14:10:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_GlauciaManoelladeSouzaLima.pdf: 6424079 bytes, checksum: ebb433df2157258c4cb5131712e0b77e (MD5) Previous issue date: 2009 / Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria Gram-positiva, entomopatogênica, que se caracteriza pela presença de inclusões cristalinas denominadas de #-endotoxinas ou proteínas Cry. Essas proteínas podem ser altamente tóxicas para insetos suscetíveis, não apresentando atividade para outros organismos. Alguns sistemas de expressão vêm sendo utilizados para expressar proteínas Cry com a finalidade de aumentar a sua toxicidade para diversas ordens de insetos. Os baculovírus são vírus de insetos que têm sido muito utilizados como vetores de expressão de genes heterólogos em células de insetos, devido principalmente à presença de promotores fortes que permitem altos níveis da proteína heteróloga na fase tardia da infecção. Neste trabalho, foram clonados genes cry (cry2Aa e cry11A) isolados das estirpes de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki S447 e subsp. israelensis S1806, respectivamente, no genoma do baculovírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), por transposição sítio-específica, gerando os vírus vAcCry2Aa e vAcCry11A. A avaliação da expressão bem como a presença do transcrito foi realizada por RT-PCR. As proteínas heterólogas Cry2Aa e Cry11A foram analisadas em gel SDS-PAGE 12%, revelando a presença de bandas de aproximadamente 65 kDa e 70 kDa, respectivamente. A toxicidade das proteínas heterólogas foi testada para larvas de inseto das ordens Lepidoptera e Diptera. A proteína heteróloga Cry2Aa apresentou uma CL50 1,036 $g/mL para larvas de segundo instar de Anticarsia gemmatalis , enquanto Cry11A mostrou ser bastante tóxica para larvas de segundo instar de Aedes aegypti com CL50 de 53,3 ng/mL. A presença de cristais derivados da proteínas heteróloga Cry2Aa só foi evidenciada nos extratos de lagartas infectadas com os vírus recombinantes. A análise ultraestrutural da proteína heteróloga Cry2Aa purificada a partir dos extratos das larvas de terceiro instar infectadas com o vírus recombinante vAcCry2Aa mostrou a presença de grandes cristais na forma cubóide Neste trabalho foi possível avaliar que o baculovírus é um bom vetor de expressão de proteínas Cry. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Bacillus thuringiensis (Bt) is a Gram positive, entomopathogenic bacteria that produces crystalline inclusions called -endotoxins or Cry proteins. These proteins are highly toxic to susceptible insects, not showing activity against others organisms. Some expression systems have been used to express crystal proteins with the aim to increase their toxicity for several insect orders. Baculoviruses are insect viruses that have been widely used as expression vectors of heterologous proteins in insect cells, mainly due to the presence of strong promoters that allow high levels of expression of the heterologous protein during the late phase of virus infection. In this work, cry genes (cry2Aa and cry11A) from B. thuringiensis subsp. Kursaki S447 and subsp. israelensis S1806, respectively, were introduced into the genome of the baculovirus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), by site-specific transposition, generating the recombinant viruses vAcCry2Aa and vAcCry11A. Transcription of the heterologous genes were confirmed using mRNA from recombinant viruses infectedinsect cells (72 h p.i) by RT-PCR . The heterologous Total extracts from Spodoptera frugiperda infected with the recombinant viruses (vAcCry2Aa and vAcCry11A) were analyzed by SDS-PAGE, which detected the presence of polypeptides around 65 kDa and 70 kDa, respectively. Bioassays, using the heterologous proteins showed that Cry2Aa had toxicity to second instar Anticarsia gemmatalis larvae with a LC50 of 1.03 $g/mL and that Cry11A had toxicity to second instar Aedes aegypti larvae (Cry11A) with a LC50 of 53.3 ng/mL. Cuboid-shaped protein crystals (Cry2Aa) were observed only in vAcCry2Aa S. frugiperda infected-extracts by light and scanning electron microscopy. This work confirms the utility of the baculovirus expression system for the efficient expressionof Cry proteins.