La fosfatidilcolina (PtdCho) és el fosfolípid majoritari de les membranes cel·lulars. La inhibició de la seva síntesi ha estat relacionada amb la mort cel·lular apoptòtica, que ha estat estudiada principalment mitjançant inhibidors farmacòlogics. La manca d'especificitat dels inhibidors utilitzats ha posat de relleu la necessitat d'utilitzar un model cel·lular on només la via de síntesi de PtdCho estigui afectada. La línia cel·lular CHO-MT58 presenta una mutació termosensible en l'enzim CTP:fosfocolina citi¬dililtransferasa (CCT), enzim regulador de la síntesi de PtdCho.Quan es cultiven les cèl·lules CHO-MT58 a 40ºC, observem una ràpida inhibició de la síntesi de PtdCho, un descens del contingut cel·lular de PtdCho i la pèrdua de viabilitat cel·lular en una seqüència temporal definida. La mort cel·lular produïda per la inhibició de la síntesi de PtdCho en cèl·lules CHO-MT58 genera poca condensació de la cromatina i fragmentació del DNA i no hi ha activació de caspasa-3 si es compara amb la mort apoptòtica induïda pel tractament amb Actinomicina D (ActD). A més, en la inhibició de la síntesi de PtdCho en cèl·lules CHO-MT58 es produeix en paral·lel un increment de la catepsina D i l'aparició de vesícules autofàgiques identificades en el microscopi electrònic de transmissió. Quan seguim el procés de l'autofàgia amb el marcador LC3 podem observar que l'aparició del fragment LC3-II, indicatiu de la presència d'autofagosomes, no disminueix al llarg dels temps a 40ºC suggerint un bloqueig de l'autofàgia causat per la inhibició de la síntesi de PtdCho en cèl·lules CHO-MT58.Per tant, la inhibició de la síntesi de PtdCho en cèl·lules CHO-MT58 a 40ºC provoca mort cel·lular no apoptòtica tot aturant l'autofàgia que actuaria com a mecanisme constitutiu de supervivència. Addicionalment, les catepsines actuarien com a possible mecanisme alternatiu de mort cel·lular.D'altra banda, actualment es sap que els astròcits tenen un paper importantíssim en la regulació de la transmissió sinàptica i en la plasticitat neuronal. Aquestes noves funcions dels astròcits són possibles perquè són cèl·lules excitables, tot i que la seva excitabilitat no es basa en potencials d'acció sinó en ones de Ca2+ intra- i intercel·lulars. Els mecanismes que controlen la senyalització via Ca2+ en astròcits, però, no es coneixen del tot. El nostre projecte ha demostrat que les vesícules acídiques de tipus lisosomals (VAL) són reservoris intracel·lulars de Ca2+ i el NAADP és un segon missatger capaç d'alliberar-ne el Ca2+ en astròcits corticals. Així hem determinat nivells endògens de NAADP i que aquests s'incrementen després d'estimulació amb diferents agonistes. Per altra banda, el NAADP-AM, un anàleg del NAADP permeable a la membrana plasmàtica, és capaç d'induir respostes de Ca2+ a diferents concentracions a través de l'alliberament de Ca2+ de les VAL en forma de campana (inhibició a altes concentracions de NAADP-AM). A més, hem demostrat l'expressió del receptor de NAADP en vesícules acídiques de tipus lisosomal. Per altra banda, la inhibició dels receptors de NAADP amb Ned-19 i la destrucció de les VAL amb GPN inhibeixen en part les respostes de calci induïdes per ATP, Endotelina-1 (ET-1) i Acetilcolina (Ach) però no per Bradiquinina. Finalment, el NAADP i les VAL també tenen un paper en l'excitabilitat astrocitària en la modulació de la magnitud de les ones de Ca2+ entre astròcits induïdes per estrès mecànic. Per tant, podem concloure com l'excitabilitat i senyalització via Ca2+ dels astròcits és un fenomen complex en el qual participen rutes de senyalització clàssiques (IP3 i ER; cADPR i RyR) però també nous segons missatgers i reservoris intracel·lulars de calci com ara el NAADP i les VAL. / Phosphatidylcholine (PtdCho) is the major phospholipid of the cell membrane. Inhibition of their synthesis has been linked to apoptotic cell death, when it has been studied primarily using pharmacological inhibitors. The lack of specificity of these inhibitors has highlighted the need to use a cell line where the only PtdCho synthesis is affected. The cell line CHO-MT58 has a termosensitive mutation in the enzyme Thermal CTP:phosphocholine cytidyltransferase (CCT), the regulatory enzyme of PtdCho synthesis.When CHO MT58 cells are grown at 40°C, we observed a rapid inhibition of PtdCho synthesis, a decrease in cellular mass of PtdCho and loss of cell viability in a defined temporal sequence. The cell death caused by inhibition of PtdCho synthesis in CHO-MT58 cells generates little chromatin condensation and late DNA fragmentation without activation of caspase-3 when compared with the apoptotic death induced by treatment with Actinomycin D (ActD). In addition, CHO-MT58 cells at 40ºC induce an increase of cathepsin D and the emergence of autophagic vesicles identified in transmission electron microscopy. When we follow the autophagic process using LC3 as marker, we show the appearance of LC3-II fragment, indicative of the presence of autofagosomes and LC3-II form do not decrease over time at 40ºC, suggesting a blockade of autophagy caused by inhibition of PtdCho synthesis in CHO-MT58 cells. Therefore, inhibition of PtdCho synthesis in CHO MT58 cells at 40ºC causes non apoptotic cell death stopping the autophagy that acts as a constitutive survival mechanism. In addition, cathepsin acts as a possible alternative mechanism of cell death.Moreover, it is currently known that astrocytes play a huge role in the regulation of synaptic transmission and neuronal plasticity. These new features are possible because astrocytes are excitable cells, although their excitability is not based on action potentials, but in Ca2+ waves intra- and intercellularly. The mechanisms that control Ca2+ signalling in astrocytes are not completely known. Our project has shown that the lysosome-related vesicles are intracellular Ca2+ stores and NAADP is a second messenger able to release their Ca2+ in cortical astrocytes. Thus we determined endogenous NAADP levels and how they increase after stimulation with different agonists. Furthermore, the NAADP-AM, a cell permeable analog of NAADP, is able to induce Ca2+ responses at different concentrations by releasing Ca2+ from lysosome-related vesicles in a bell-shape manner (inhibition at high concentrations of NAADP-AM). In addition, we have demonstrated the expression of the NAADP receptor in lysosome-related vesicles. Furthermore, inhibition of NAADP receptors by Ned-19 and the destruction of lysosome-related vesicles with GPN partly inhibit Ca2+ responses induced by ATP, Endothelin-1 (ET-1) and Acetylcholine (Ach) but not Bradykinin. Finally, the Ca2+ signalling by NAADP and lysosome-related vesicles also play a role in the astrocitic excitability with a modulation of the magnitude of the Ca2+ waves between astrocytes induced by mechanical stress. Therefore, we concluded that the excitability and Ca2+ signalling of astroyctes is a complex phenomenon in which classical signalling pathways (ER and IP3, cADPR and RyR) as well as new Ca2+ stores and intracellular second Ca2+ messengers such as NAADP and lysosome-related vesicles.

1) INTRODUCCIONA lo largo de la última década se ha caracterizado un grupo de compuestos farmacológicos que comparten la propiedad biológica de disminuir la entrada de iones de calcio en varios tipos de células. Estas drogas han sido usadas extensamente en el tratamiento de desórdenes cardiovasculares y neurológicos.En los últimos años han aparecido trabajos basados en observaciones clínicas y datos experimentales que tratan de la existencia de una posible interferencia entre ciertos antagonistas de canales de calcio y la transmisión dopaminérgica.A pesar de varias inconsistencias, los datos revisados sugieren que los antagonistas de canales de calcio (AC) reducen la transmisión dopaminérgica. Sin embargo, ya que estos fármacos son un grupo muy heterogéneo de compuestos con estructuras moleculares diversas, la cuestión planteada es si los diversos efectos descritos son consecuencia de la inhibición del flujo transmembrana de calcio a través del canal de calcio o si algunos de ellos interfieren con la transmisión dopaminérgica por un mecanismo independiente del de la interacción con el transporte de calcio.Para intentar contestar a esta cuestión, se ha estudiado el posible efecto de la administración oral aguda y crónica de antagonistas de canales de calcio en el funcionalismo dopaminérgico en el cerebro de rata. Para ello se han estudiado los niveles de dopamina y sus metabolitos en muestras de tejido estriatal y límbico así como en líquido extracelular estriatal.2) MATERIALES Y METÓDOSTécnicas utilizadas: Obtención de muestras a partir de tejido cerebral y de diálisis intracerebral. El análisis de los niveles de dopamina y sus metabolitos se realizó mediante cromatografía liquida de alta eficacia con detección electroquímica. La actividad del enzima tirosina hidroxilasa se observó midiendo la velocidad de síntesis de la dopamina tras la administración de un inhibidor del enzima L-aminoácido decarboxilasa.Animales: Se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley de un peso entre 190 y 220 gr. Se mantuvieron en un ciclo estándar de luz y oscuridad y se les permitió acceso libre a comida y agua.Anestesia: En los experimentos de estandarización de la técnica de diálisis se utilizó el tiopental® (42mg/Kg/ip). En el resto de los experimentos, hidrato de cloral (440mg/Kg/ip).Implantación estereotáxica: Las ratas anestesiadas se colocaron en un aparato David Kopf 1404. Se introdujo una fibra de diálisis en un estriado y se permitió la recuperación de la anestesia.Procedimiento de diálisis intracerebral: En los experimentos de estandarización del método se dejó pasar, al menos, un tiempo de 24 h entre la implantación quirúrgica y la diálisis. Luego los animales fueron conectados a una bomba Harvard y dializados con una solución de Ringer. En el resto de los experimentos los animales fueron conectados a una bomba CMA/100 a las 48 h de la intervención y perfundidos con liquido cefalorraquídeo artificial.Tratamientos: Se administraron AC (flunaricina, cinaricina, verapamil, nicardipina y nifedipina) por vía oral. En una primera etapa se utilizaron dosis elevadas en una única o en repetidas administraciones (10 días). Se midieron los niveles de dopamina (DA) y sus metabolitos en tejido estriatal y límbico así como la actividad estriatal del enzima tirosina hidroxilasa. En una segunda etapa las dosis fueron menores y se añadió el haloperidol con el fin de comparar efectos. La administración fue única o repetida (l8 días). En un grupo de animales se midieron los niveles de DA y sus metabolitos en tejido estriatal y límbico y en otro, en el liquido extracelular estriatal. En este grupo se observó, además, la respuesta a la despolarización con potasio y al estimulo agudo con haloperidol después del tratamiento crónico con todos los fármacos en estudio.3) RESULTADOS Y CONCLUSIONESEl método de diálisis intracerebral es adecuado para el estudio de los cambios en la DA y sus metabolitos en el espacio cxtracelular siempre que se utilice pasadas las 24 h de la implantación y antes de los 4 días de la misma. Permite estudiar la actividad de las terminales dopaminérgicas en su propio medio así como su comportamiento en el tiempo tras la administración de diversos fármacos.Los AC que poseen un radical fenilalquilamina en su molécula presentan un mecanismo de acción similar al de los neurolépticos.El aumento en los niveles extracelulares de DA o sus metabolitos tras la administración crónica de varios de los fármacos empleados, que en algunos de los casos resulta potenciado por la despolarización, sugiere una dificultad en el mecanismo de recaptación de DA causada por los AC. El bloqueo de los canales de calcio de tipo L por el tratamiento crónico con los AC no disminuye la respuesta a la despolarización con potasio lo que apoya la idea de que este tipo de canales no participa en la entrada de calcio necesaria para la liberación de DA. El estimulo sobreañadido de haloperidol a una administración repetida de los diversos fármacos da lugar a una respuesta menor que la producida por una única dosis del mismo, lo que indica una disminución del encendido de las neuronas dopaminérgicas provocada por el tratamiento crónico con haloperidol o con AC.Por todo lo anterior se puede concluir que el tratamiento con fármacos antagonistas de los canales de calcio produce una afectación en el funcionalismo dopaminérgico. / Calcium antagonists (CA) are widely prescribed for cardiovascular and neurological disorders, but clinical and experimental observations suggest the possibility of a significant interference of CA with dopaminergic transmission. In line with this we have investigated the role of single and repeated oral administration of several CA (flunarizine, cinnarizine, verapamil, nifedipine and nicardipine) in dopaminergic functionalism in rat brain. The first part of the study consisted of establishing the standard conditions of intracerebral dialysis in rats awake and moving freely. Afterwards, animals were allocated to one of two experimental groups. In group 1 high doses of CA were used. After a single or repeated administration (10 days), levels of dopamine (DA) and metabolites were measured in striatal and limbic tissue. In group 2, smaller doses were administered and haloperidol was also added in order to compare effects. After a single or repeated (18 days) administration of CA or haloperidol, a group of animals were killed by decapitation and levels of DA and metabolites were measured in striatal and limbic tissue. Another group was dialysed and levels of DA and metabolites were measured in striatal extracellular fluid. We also studied the effect of depolarization as well as the effect produced by an acute challenge with haloperidol on extracellular levels of DA and metabolites after a chronic treatment with CA or haloperidol. The results indicate that the CA with a phenylalkylamine moiety has a neuroleptic-like mechanism of action. The increase in extracellular levels of DA and metabolites after the chronic administration of several of the drugs used, which in some cases is potentiated by depolarization, suggests a difficulty in DA reuptake due to CA. The inhibition of L channels owing to chronic treatment with CA does not decrease the response to depolarization so channels of this type do not participate in the entry of calcium ions necessary for DA liberation. The acute challenge of haloperidol after a chronic administration of CA or haloperidol produces a lower response than that produced by a single dose, indicating a decrease in firing of dopaminergic neurons. In conclusion, treatment with CA affects the dopaminergic functionalism in rat brain.

La red trabecular es una estructura situada en la cámara anterior del ojo cuya función es drenar el humor acuoso. Alteraciones en ella pueden producir aumentos de la presión intraocular (IOP) los cuales pueden provocar pérdidas en el campo visual y por lo tanto cegueras parciales o totales (glaucoma).El objetivo de esta tesis doctoral se basa en el estudio de la fisiología de la red trabecular con el fin de tener un mayor conocimiento de sus funciones y así poder entender mejor su papel regulador dentro de la evacuación del humor acuoso. Dado que el ATP y otros derivados purinérgicos se encuentran presentes en el humor acuoso, en la realización de este proyecto se han estudiado los receptores purinérgicos en la red trabecular y el papel del ATP y derivados dinucleósidos polifosfato en la modulación de la evacuación del humor acuoso.Se ha evaluado el efecto del ATP mediante el estudio de los incrementos de Ca2+ con el fluoróforo fura-2. Este nucleótido provoca incrementos rápidos del Ca2+ intracelular que disminuyen lentamente hasta los valores basales. El porcentaje de respuesta frente a éste y otros agonistas muestra un perfil de respuesta (ATP = UTP > ATP--S >> ADP = UDP) corresponde al receptor purinérgico P2Y2, el cual es sensible al antagonista suramina.El Ca2+ movilizado tras la estimulación de los receptores P2Y procede de los depósitos citoplasmáticos y las vías de señalización intracelular involucran una proteína Gq/11 que estimula la fosfolipasa C- y produce IP3 con la subsiguiente estimulación de receptores de IP3.Experimentos de inmunocitoquímica y western-blot confirman la existencia de un receptor P2Y2 además de la coexistencia con los subtipos P2Y1 y P2Y4.Se ha estudiado como el ATP extracelular modula corrientes de K+ mediadas por el canal de alta conductancia dependiente de calcio BKCa. La estimulación con ATP extracelular provoca un aumento significativo de la corriente de salida de K+ mediante la participación del receptor P2Y2 en la corriente y los aumentos de corriente dependen del Ca2+ intracelular para activarse.Por otro lado, Las células trabeculares poseen la capacidad de liberar ATP frente a estímulos hipotónicos y la cantidad de ATP liberado es proporcional a la hipotonicidad utilizada.Finalmente, se ha estudiado el ATP en la regulación de la facilidad de evacuación de humor acuoso(C). Para ello se utilizó la técnica de perfusión de segmentos anteriores oculares en condiciones de cultivo de órgano obteniéndose valores de C (l/min/mmHg). El ATP no muestra ningún efecto sobre la C. El análogo no hidrolizable del ATP, el ATP--S, el cual es resistente a la acción de las ectonucleotidasas tampoco varia la C, indicando que quizá la el ATP estimula diferentes tipos de receptor.En el segundo objetivo del trabajo de tesis se han estudiado los análogos estructurales del ATP dinucleósidos polifosfato ya que estos activan receptores purinérgicos y además se ha demostrado que varían la IOP.Los efectos de los dinucleótidos polifosfato son similares a los mostrados por el ADP. El dinucleótido Up4U muestra una dinámica semejante a la observada por el ATP con incrementos más sostenidos en el [Ca2+]i. Las concentraciones a las que se producen estos incrementos de Ca2+ son grandes y a concentraciones fisiológicas sus efectos son muy bajos. Los dinucleótidos Ap3A y Ap4A producen un aumento en la C y su efecto está mediado por la activación del receptor P2Y1. El aumento provocado por el Ap4A se previene al prefundir juntamente con el antagonista del receptor P2Y1. El agonista selectivo del P2Y1 aumenta la C y su efecto no se produce en presencia del antagonista del P2Y1. / SUBJECT: Functional involvement of purinergic activation in trabecular meshwork.TEXT: The understanding of the physiology of the trabecular meshwork has advanced in the last few years, however purinergic receptors have not been characterized in this tissue and their role have not been determined.In this work it is shown that trabecular meshwork express three diferent subtypes of purinergic receptors: P2Y1, P2Y2 and P2Y4. They are activated by different purinergic agonists and depending on the subtype their response on the intracellular calcium levels are diferent.The activation of P2Y2 and P2Y4 leads Ca2+ mobilisations greater than the P2Y1 activation and their stimulation does not produce changes in outflow facility.On the other hand, the stimulation of P2Y1 receptor by compounds selective for the receptor or some dinucleosides polyphosphate lead an increase in the outflow facility. The increments do not seem to involve calcium signalling and perhaps the intracellular mechanisms could involve second messengers like cAMP.

Un campo que despierta un interés creciente dentro del ámbito de los biomateriales para la regeneración osea es el de los cementos de fosfatos de calcio. Un cemento de fosfato de calcio consiste en una fase sólida formada por polvos de fosfatos de calcio, y una fase liquida, que al ser mezcladas fraguan a temperatura ambiente o fisiológica, dando lugar a un cuerpo sólido. Junto a la biocompatibilidad y bioactividad de las cerámicas de fosfatos de calcio, los cementos presentan una serie de ventajas especificas, derivadas de su proceso de obtención, como la moldeabilidad y la capacidad de fraguar "in situ", que pueden resolver los problemas de fijación y adaptación planteados por las cerámicas de fosfatos de calcio.En este trabajo se desarrolla y caracteriza un cemento basado en la hidrólisis del fosfato tricalcico alfa. El fraguado del cemento se produce a partir de la disolución de las partículas de fosfato tricalcico y la precipitación de hidroxiapatita deficiente en calcio de baja cristalinidad, similar a las biológicas, según la reacción:3ALFA-CA3(PO4)2+H2O-CA9(HPO4)(PO4)5(OH) existe una relación lineal directa entre la resistencia mecánica del cemento y el porcentaje de fosfato tricalcico que ha reaccionado. Los estudios microestructurales muestran que la resistencia a la comprensión se puede atribuir al entrelazamiento entre los cristales que precipitan.Existen distintas variables de procesado que afectan de forma significativa a las propiedades de fraguado y endurecimiento del cemento. Entre estas cabe destacar el tamaño de partícula del polvo del cemento, la adición de semillas, la utilización de soluciones de Na2HPO4, la relación liquido/polvo empleada y la temperatura. Tras estudiar el efecto de estas variables sobre algunos parámetros del cemento, como los tiempos de fraguado, el tiempo de cohesión, y la velocidad de endurecimiento se investigan los mecanismos a través de los cuales tienen lugar los efectos / Calcium phosphate cements have attracted much attention in recent years as bone regeneration materials. A calcium phosphate cement consists of a solid phase formed by calcium phosphate powders and a liquid phase, which after mixing are able to set at room or body temperature, producing a solid body Together with the biocompatibility and bioactivity of the calcium phosphate ceramics, calcium phosphate cements have specific advantages derived from their processing route, such as their mouldability, in situ setting ability, which can solve the fixation and adaptation problems inherent to calcium phosphate ceramics.This PhD Thesis is focused on the development and characterisation of a calcium phosphate cement based on the alpha-tricalcium phosphate (alfa-TCP) hydrolysis. The setting of the cement is produced by the dissolution of the alfa-TCP particles and the precipitation of a low crystallinity calcium deficient hydroxyapatite, similar to the biological hydroxyapatite, according to the following reaction: 3ALFA-CA3(PO4)2+H2O-CA9(HPO4)(PO4)5(OH) Both the degree of reaction and the compressive strength increase initially linearly with time, reaching subsequently a saturation level. A direct relation exists between the mechanical strength and the amount of reacted alfa-TCP. The microstructural analysis show that the cement hardening is caused by the entanglement between the precipitated crystals. The reaction mechanisms which control the reaction kinetics in the different stages of reaction are identified based on X-ray diffraction and electron microscopy studies.The contact of the cement with aqueous solutions which simulate body fluids does not affect its properties, and its setting and hardening behaviour at 37ºC fulfil the clinical requirements.Several processing parameters have been identified which affect significantly the setting and hardening properties of the cement. Among them, the particle size distribution of the starting powder, the addition of seed materials, the use Na2HPO4 solutions and the liquid to powder ratio used, are especially relevant. The effect of these parameters on several cement properties, such as the setting and cohesión times, the hardening rate, the maximum strength, the reaction kinetics and the final microstructure is analysed, and the underlying mechanisms are discussed.

No description available.

Los cementos de fosfato de calcio son biomateriales utilizados para la regeneración ósea. En esta tesis doctoral se estudia la influencia de la microestructura y la macroporosidad en el comportamiento biológico de un cemento de fosfato de calcio. En la primera parte, se caracterizaron las propiedades físico-químicas y superficiales de dos sustratos de apatita deficiente en calcio con diferente microestructura obtenidos a partir de un cemento de fosfato de calcio (CPC) cuyo principalmente componente es el fosfato tricálcico en fase $\alpha$. % con dos distribuciones de tamaño de partícula distintos. Se estudió la influencia de la microestructura en el comportamiento celular y la adsorción de proteínas como la albúmina, la fibronectina y la lisozima. El uso de dos agentes desorción (EDTA y SDS) permitió evidenciar la influencia de la morfología y tamaño de los cristales de apatita en la fuerza de adhesión de las proteínas estudiadas. Los cultivos celulares con la línea MG-63 mostraron el efecto de la microestructura y el intercambio iónico sobre la proliferación celular. Se observó asimismo una estimulación en la diferenciación celular en uno de los sustratos que fue atribuido a un efecto de la topografía. En la segunda parte, se desarrolló un cemento macroporoso inyectable para aplicaciones médicas, utilizando como agente espumante una solución proteica de albumen. Se optimizó la obtención de la macroporosidad a partir de variables como: la distribución del tamaño de partícula, la relación entre la fase sólida y la fase líquida, la cantidad de agente espumante y la adición de un agente de cohesión como el alginato de sodio para posibilitar su inyección directa en el lugar de implantación. Por último, se demostró mediante estudios \emph{in vivo} en fémur de conejos un mayor potencial de regeneración ósea por parte del cemento macroporoso en comparación con su homólogo microporoso, al obtenerse una mayor cantidad de tejido óseo y una mayor reabsorción en el cemento macroporoso.

TRPV4 is a non-selective cation channel with a wide expression and multiple cellular and systemic functions. Described initially as an osmosensor, it can also be activated by temperature and cell swelling. Due to this variety of activating stimuli it may have a promiscuous gating behavior which is mostly unknown. This Thesis research aims to get in-depth in the understanding of the molecular determinants of TRPV4 regulation. I provide evidences that the inositol trisphosphate receptor and its modulatory function on TRPV4 relies on its binding to the C-terminal tail of TRPV4. I discuss the role of the channels’ N-terminal tail in osmotransduction and show how a mutation that results in a channel with an impaired response to osmotic environments is associated to a pathophysiological condition such as hyponatremia. I also highlight the importance of this N-terminal tail and the binding to the regulatory protein PACSIN3 for the global conformation of the channel. / El TRPV4 és un canal catiònic no selectiu d’expressió generalitzada i funcions diverses. Tot i que inicialment es va descriure com un osmosensor sistèmic, avui sabem que també es pot activar per temperatura o per augments del volum cel•lular. Degut a la diversitat d’estímuls, el canal presenta diferents vies d’activació la major part de les quals són desconegudes. Aquesta Tesi pretén estudiar en detall els mecanismes moleculars que regulen l’activitat del canal. Aportem evidències del lloc d’unió a la cua C-terminal del receptor d’inositol trifosfat així com la seva modulació sobre l’activitat del TRPV4. També discutim el rol de la cua N-terminal en la osmotransducció i presentem una mutació, generadora d’un canal amb una resposta anòmala a estímuls hipotònics, que està associada a una condició fisiopatològica com la hiponatremia. També destaquem la importància de la cua N-terminal i de la unió de la proteïna reguladora PACSIN3 en la conformació global del canal.

Conceptualment el dismorfisme defineix una alteració morfològica, congènita o adquirida, d'una part o de la totalitat d'un aparell o d'un òrgan. Així l'engrandiment gingival és un dismorfisme per excés d'aquest teixit que s'ha relacionat amb diferents factors: inflamatoris, farmacològics, neoplàsics i d'altres.Clàssicament els fàrmacs que s'havien relacionat amb el sobrecreixement gingival eren els antiepilèptics, fonamentalment la fenitoïna. A partir de la dècada dels vuitanta aquesta alteració morfològica també s'ha relacionat amb l'administració d'altres fàrmacs com la ciclosporina A i els bloquejadors dels canals del calci: dihidropiridines, verapamil i diltiazem.L'engrandiment gingival induït per fàrmacs presenta unes característiques clíniques i anàtomo-patològiques similars, tot i tractar-se de fàrmacs amb una acció terapèutica molt diferent. Això ha fet pensar a molts autors de l'existència d'alguna característica comuna entre ells que expliqués la patogènia del sobrecreixement gingival. En la literatura existeixen nombroses hipòtesis que pretenen explicar aquest dismorfisme, y sembla ser que el mecanisme patogènic seria la combinació de diferents factors: placa bacteriana, presència de fibroblastes gingivals predeterminats genèticament "responder" i l'acció del propi fàrmac. Una característica farmacodinà.mica comuna dels fàrmacs reconeguts com inductors de l'engrandiment gingival és la d'alterar el flux de calci transmembrana, que alhora modificaria el metabolisme dels fibroblastes del teixit connectiu gingival, produint-se un increment dels components de la matriu extracel.lular: fibres de col.làgena i/o substància fonamental amorfa. És per això que el concepte que millor definiria aquesta alteració des d'una vessant clínica seria el d'engrandiment o sobrecreixement gingival, encara que el terme hiperplasia gingival hagi estat utilitzat en la majoria de publicacions científiques.El sobrecreixement gingival que habitualment s'inicia a la regió de la papil.la interdental, pot afavorir l'aparició de símptomes i signes clínics que inclouen: dolor, sagnat i friabilitat dels teixits, moviments anormals de les dents, alteracions estètiques, fonètiques i de l'oclusió, a més a més d'afavorir l'aparició de càries i d'altres disfuncions periodontals. Constatàrem que la majoria d'individus que presentaven engrandiment gingival aquest havia passat desapercebut tant pel pacient com pel clínic, encara que els afectats per un sobrecreixement més sever si que mañifestaren alguns d'aquests símptomes. L'engrandiment gingival induït per fàrmacs, i en el nostre cas pels calcioantagonistes, s'ha demostrat que pot ser reduït o previngut amb un bon control de la placa bacteriana dirigit a eliminar la inflamació gingival; i en els casos més severs la cirurgia periodontal resectiva és el mètode utilitzat per l'eliminació de l'excés de teixit.La majoria de publicacions referents a l'engrandiment gingival induït per calciantagonistes, són series de casos amb un nombre reduït de pacients que els realment necessaris en funció de la prevalença estimada per aquest dismorfisme; tampoc s'hi reflecteixen valors que indiquin el risc atribuïble al consum d'aquests fàrmacs, ni comparacions respecte a una població control.Desenvolupàrem un estudi clínic transversal en l'àmbit de l'atenció primària, CAP Rambla de Terrassa (Barcelona), on s'examinaren els pacients que de forma consecutiva eren visitats en les consultes de medicina general i cardiologia, per conèixer la prevalença, severitat i risc d'engrandiment gingival en la població tractada amb calciantagonistes, i que es comparà amb una població que no rebia cap dels fàrmacs reconeguts com inductors. En l'estudi s'inclogueren 265 pacients: 72 tractats amb dihidropiridines fonamentalment la nifedipina, 32 amb diltiazem, 14 amb verapamil i els 147 subjectes restants foren els controls de la mostra. Es valorà el grau de sobrecreixement gingival en un sentit àpico-coronari (vertical) amb l'índex d'Angelopoulos i Goaz modificat per Miller i Damm -GO-, i en un sentit àntero-posterior (horitzontal/nòdul-papil.lar) amb l'índex de Seymour modificat per Miranda i Brunet MB-. Es considerà que existia engrandiment gingival quan el valor d'algun dels dos índexs era >0 en qualsevol localització. També s'enregistraren: l'índex gingival, l'índex de placa i la profunditat de sondatge, així com les variables sòcio-demogràfiques i qualitatives de tots els individus. Estadísticament s'establiren les diferents comparacions de les variables analitzades amb la prova de Chi Quadrat i quan fou necessari s'utilitzà el Test exacte de Fischer. Es realitzà l'anàlisi bivariant dels factors que poguessin exercir alguna influència sobre els índexs de sobrecreixement gingival. S'evaluà mitjançant un anàlisi mu1tivariant de regressió logística l'Odds Ratio o risc atribuïble al calciantagonista ajustat per les variables de confusió. I finalment es determinà el test de concordança Kappa dels dos índexs utilitzats en la valoració de l'engrandiment gingival (GO i MB).La prevalença d'engrandiment gingival en la població control fou del 4.1% per l'índex GO i del 7.5% pel d'MB. La prevalença d'engrandiment pel grup casos -bloquejadors dels canals del calci- dels diferents subgrups farmacològics fou: per les dihidropiridines 33.3% (GO) i 51.4% (ME); pel diltiazem 31.3% (GO) i 50% (MB); i pel verapamil 21.4% (GO) - 35.7% (MB); siguent les localitzacions anteriors ínfero-vestibular i súpero-vestibular les més freqüents per ambdós registres. Degut a que l'inici del sobrecreixement habitualment es localitza a nivell de la papil.la interdental, i degut a que l'índex d'MB enregistra l'engrandiment en aquesta regió, això ens explicaria aquesta diferència de freqüències.En el subgrup de pacients tractats amb nifedipina (n=65) es relacionà la dosi acumulada d'aquest fàrmac amb el grau de sobrecreixement, i encara que a dosis acumulades altes existia una major prevalença d'engrandiment per ambdós índexs, aquest dismorfisme no el podem considerar dosi-depenent. L'edat i el sexe no semblen ser factors determinants en el desenvolupament d'aquest dismorfisme; tampoc per les altres variables qualitatives registrades. Pel que fa a la salut gingival els valors elevats de l'índex gingival (inflamació severa) condicionaren de forma significativa la presència d'engrandiment gingival. Respecte a l'acúmul de placa bacteriana, ambdós grups -casos i controls- presentaren uns índexs similars.Ja que l'engrandiment induït per fàrmacs és per tant un engrandiment combinat, explicable per la pròpia acció del fàrmac i a la inflamació gingival sobreafegida, és important determinar en quina proporció aquest engrandiment és provocat per un factor o un altre. D'aquesta manera en el grup tractat amb dihidropiridines, quan no es considera la dosi, el risc atribuible al fàrmac seria de 10.6-14.4 (GO-MB) i l'atribuïble a l'alteració de la salut gingival seria de 9.6 per ambdós índexs. En el subgrup tractat amb nifedipina a dosi acumulada alta, el risc atribuïble a aquest fàrmac fou superior, entre 17.4-23.6 (GO-MB) i el relacionat amb la salut gingival es mantingué .invariable per ambdós índexs (9.4). Respecte als altres calciantagonistes, diltiazem i verapamil, el risc fou més superior per l'alteració de la salut gingival que no pas per la presència del fàrmac inductor; aquest fet podria ser degut segurament a la reduïda grandària de la mostra d'aquests dos grups. Es varen detectar diferències de freqüencia d'engrandiment per ambdós índexs; l'índex MB detectava un sobrecreixement en les fases incipients de l'engrandiment que no diagnosticava l'índex GO, encara que després de determinar el grau de concordança o Kappa constàrem que ambdós índexs eren fiables.L'engrandiment gingival és un dismorfisme habitualment poc conegut pels clínics responsables d'aquests pacients; és per això important difondre valors de prevalença i risc de sobrecreixement gingival pel bon control de la salut periodontal en la població tractada amb bloquejadors dels canals del calci. En un futur caldrà analitzar mostres més àmplies de pacients tractats amb el diltiazem i sobretot amb el verapamil, per així poder determinar les freqüències de sobrecreixement gingival i valorar altres aspectes estudiats amb la nifedipina. Finalment és de suposar que el major consum de dihidropiridines diferents de la nifedipina, permetrà determinar si aquests també són fàrmacs inductors, tal com ja alguns autors estableixen en estudis experimentals i en casos clínics aïllats, i alhora establir en cada cas la seva prevalença. / Gingival enlargement is an abnormal growth of the gingival tissue. It is mainly associated with dental-plaque-related inflammation, some diseases and drug therapy. It has been reported with the use of phenytoin, cyclosporin, and calcium channel antagonist, including dihydropyridinederivatives, veraparnil and diltiazem. This research was designed to study the prevalence of gingival enlargement in general population and in patients taking calcium antagonists. Subjects (n=265) were selected using predefined inclusion-exclusion criteria. The non-treated-control group included 147 patients attended in a general practice center (none had been treated with calcium antagonists). The treated-group included 118 patients taking calcium antagonists (at inclusion time and at least during the last six months). It included 72 patients taking dihydropyridines (65 receiving nifedipine), 32 treated with diltiazem, and 14 with verapamil. Medical history and a complete oral and odontological exploration were done in all patients. It included plaque index, gingival index, probing depth and measures of gingival enlargement in the vertical (GO) and the horizontal (MB) directions. The prevalence of gingival enlargement in the non-treated-control group was 4.1-7.5% when measured by GO and MB, respectively. The patients receiving dihydropyridines had an enlargement prevalence of 33.3-51.4%. Those under diltiazem were 31.3-50% and in the case of verapamil 21.4-35.7%. The most frequents locations for both GO/MB indexes were the anterior lower and the upper-buccal jaw. In the case of nifedipine, the enlargement showed a dose/response relationship when total drog exposition was considered. High rates of gingival index (severe inflammation) produced significant differences in relation to gingival enlargement (p<0.01). No differences were observed in the plaque index. Age and gender did not seem to be determinant factors in the development of overgrowth, the same results were obtained for all other qualitative variables registered. Multivariate statistical analysis showed that the attributable risk (Odds Ratio, OR) of gingival overgrowth related to dihydropyridine treatment was 10.6-14.4 (OR for GO/MB), and the risk related to gingival inflammation was 9.6 for both GO/MB.

Tesis por compendio / [ES] El envejecimiento poblacional es un fenómeno sin parangón en la historia de la humanidad. Así, se espera que las personas mayores de 65 años, o población sénior, doblen por primera a la población infantil en 2050. Cumplir años implica una serie de cambios a nivel fisiológico que comprenden, entre otros, una pérdida de funcionalidad de los órganos implicados en el proceso digestivo. En este sentido, el estudio de la digestibilidad de nutrientes, principalmente proteínas, y la bioaccesibilidad de determinadas vitaminas y minerales de interés para la salud de la población sénior, son de especial interés. Solo a partir de evidencias científicas será posible establecer recomendaciones nutricionales de ámbito clínico, y diseñar alimentos funcionales orientados a las necesidades específicas de este grupo poblacional. Entre los nutrientes mayoritariamente afectados por las alteraciones digestivas típicas de personas sénior, las proteínas suponen el reto más importante. Se sabe que las alteraciones orales, gástricas e intestinales afectan su digestión y absorción, contribuyendo al declive del estado general de salud, dando lugar a una pérdida de masa muscular, incremento y cambio de distribución de masa lipídica, huesos y articulaciones más débiles, algunas enfermedades metabólicas y cardiovasculares, entre otros cambios de tipo psicológico y social. El objetivo principal de esta tesis doctoral ha sido evaluar el impacto de las diferentes alteraciones que aparecen con la edad a nivel oral, gástrico e intestinal en la digestibilidad de proteínas, grasas y carbohidratos, así como en la bioaccesibilidad de micronutrientes de interés. Concretamente, se han analizado en alimentos ricos en proteína cuyo consumo está recomendado para mayores de 65 años, y que difieren entre sí en el origen de la proteína (pescados, lácteos, huevo, carne, legumbres y cereales). Para alcanzar este objetivo, se recurrió a modelos digestión in vitro en estático los cuales permiten simular, en condiciones controladas de laboratorio, el proceso digestivo de diferentes grupos de población y muestrear de forma no invasiva. Los resultados más relevantes de esta tesis doctoral se presentan en cinco capítulos, abordando en cada grupo alimenticio, la respuesta digestiva derivada tanto de las alteraciones fisiológicas dados en población sénior, como de ciertos factores inherentes al alimento. En cuanto a las alteraciones digestivas propias de la edad, es posible afirmar que las insuficiencias pancreática y biliar fueron las principales encargadas de reducir de forma significativa la extensión de la proteólisis en casi la totalidad de alimentos estudiados. Los resultados indican una mayor digestibilidad proteica en pescados magros, el huevo duro y escalfado, quesos, carnes de pollo y de vacuno, así como legumbres en general. La digestibilidad de las grasas, en cambio, no resultó negativamente afectada. Por otro lado, los quesos, sardina, así como algunos granos de legumbres y cereales contribuirían satisfactoriamente al aporte de calcio bioaccesible en mayor medida que otras matrices alimentarias. En cuanto a las vitaminas liposolubles, la ingesta de salmón y de quesos fueron una excelente fuente tanto de vitamina A como D3 en su forma bioabsorbible; mientras que la bioaccesibilidad de ambas vitaminas en huevo, dependió del método de cocinado. Además, la carne de cerdo brinda el mayor efecto antihipertensivo, mientras que la de pavo ejerce mayor efecto como antioxidante. Por último, la relación aminoácidos esenciales/ no esenciales aumentó en condiciones alteradas al final de la digestión, en comparación con las condiciones estándar de adulto sano. Por lo que, aun con una digestibilidad de proteínas afectada, los digeridos tendrán efecto contra la sarcopenia. / [CA] L'envelliment poblacional és un fenomen sense parangó en la història de la humanitat. Així, s'espera que les persones majors de 65 anys, o població sènior, dobleguen per primera a la població infantil en 2050. Complir anys implica una sèrie de canvis a nivell fisiològic que comprenen, entre altres, una pèrdua de funcionalitat dels òrgans implicats en el procés digestiu. En aquest sentit, l'estudi de la digestibilitat de nutrients, principalment proteïnes, i la bioaccesibilitat de determinades vitamines i minerals d'interès per a la salut de la població sènior, són d'especial interès. Només a partir d'evidències científiques serà útil establir recomanacions nutricionals d'àmbit clínic, i dissenyar aliments funcionals orientats a les necessitats específiques d'aquest grup poblacional. Entre els nutrients majoritàriament afectats per les alteracions digestives típiques de persones sènior, les proteïnes suposen el repte mes important. Se sap que les alteracions orals, gàstriques i intestinals afecten la seua digestió i absorció, contribuint al declivi de l'estat general de salut, donant lloc a una perduda de massa muscular, increment i canvi de distribució de massa lipídica, ossos i articulacions més febles, algunes malalties metabòliques i cardiovasculars, entre altres canvis de tipus psicològic i social. L'objectiu principal d'aquesta tesi doctoral ha sigut avaluar l'impacte de les diferents alteracions que apareixen amb l'edat a nivell oral, gàstric i intestinal en la digestibilitat de proteïnes, greixos i carbohidrats, així com en la bioccesbilitat de micronutrients d'interès, en aliments rics en proteïna el consum de la qual està recomanat per a majors de 65 anys, i que difereixen entre si en l'origen d'aquest macronutrient (peixos, lactis, ou, carn, llegums i cereals). Per a aconseguir aquest objectiu, es va recórrer a models digestió in vitro en estàtic els quals permeten simular, en condicions controlades de laboratori, el procés digestiu de diferents grups de població i mostrejar de forma no invasiva. Els resultats més rellevants d'aquesta tesi doctoral es presenten en cinc capítols, abordant en cada grup alimentós, la resposta digestiva derivada tant de les alteracions fisiològiques donats en població sènior, com d'uns certs factors inherents a l'aliment. Quant a les alteracions digestives pròpies de l'edat, és possible afirmar que les insuficiències pancreàtica i biliar van ser les principals encarregades de reduir de manera significativa l'extensió de la proteòlisien quasi la totalitat d'aliments estudiats. Els resultats indiquen una major digestibilitat proteica en peixos magres, l'ou dur i escalfat, formatges, carns de pollastre i de boví, així com llegums en general. La digestibilitat dels greixos, en canvi, no va resultar negativament afectada. D'altra banda, els formatges, sardina, així com alguns grans de llegums i cereals contribuirien satisfactòriament a l'aportació de calci bioaccesible en major mesura que altres matrius alimentàries. Quant a les vitamines liposolubles, la ingesta de salmó i de formatges van ser una excel·lent font tant de vitamina A com D3 en la seua forma bioabsorbible; mentre que la bioaccesibilitat de totes dues vitamines en ou, va dependre del mètode de cuinat. A més, la carn de porc brinda el major efecte antihipertensiu, mentre que la de polit exerceix major efecte com a antioxidant. Finalment, la relació aminoàcids essencials/ no essencials va augmentar en condicions alterades al final de la digestió, en comparació amb les condicions estàndard d'adult sa. Pel que, fins i tot amb una digestibilitat de proteïnes afectada, els digerits tindran efecte contra la sarcopènia. / [EN] Population aging is a phenomenon unparalleled in human history. It is expected that people over 65 years, or the elderly, will double the child population for the first time by 2050. Turning 65 implies a series of physiological changes that include, among others, a loss of functionality of the organs involved in the digestive process. In this sense, the study of the digestibility of nutrients, mainly proteins, and the bioaccessibility of certain vitamins and minerals of interest for the health of the senior population, are of special interest. Only on the basis of scientific evidence will it be useful to establish nutritional recommendations at the clinical level, and to design functional foods oriented to the specific needs of this population group. Among the nutrients most affected by the common digestive disorders of the elderly, proteins represent the most important challenge. It is known that oral, gastric and intestinal disorders affect their digestion and absorption, contributing to the decline of general health status, resulting in a loss of muscle mass, increase and change of lipid mass distribution, weaker bones and joints, some metabolic and cardiovascular diseases, among other psychological and social changes. The main objective of this doctoral thesis has been to assess the impact of the different alterations appearing with age at oral, gastric and intestinal level on the digestibility of proteins, fats and carbohydrates, as well as on the bioaccessibility of micronutrients of interest, in protein-rich foods whose consumption is recommended for people over 65 years of age, and which differ from each other in the origin of this macronutrient (fish, dairy products, eggs, meat, legumes and cereals). To achieve this objective, in vitro static digestion models were used to simulate, under controlled laboratory conditions, the digestive process of different population groups and to sample in a non-invasive way. The most relevant results of this doctoral thesis are presented in five chapters, addressing in each food group, the digestive response derived both from physiological alterations in the senior population, as well as from certain factors inherent to the food. Regarding the digestive alterations associated with age, it is possible to affirm that pancreatic and biliary insufficiencies were the main responsible for the significant reduction in the proteolysis extent in almost all the studied foods. The results indicate a higher protein digestibility in lean fish, hard-boiled and poached eggs, cheeses, chicken and beef meats, as well as legumes in general. Fat digestibility, on the other hand, was not compromised. Moreover, cheeses, sardines, as well as some legume and cereal grains would contribute to a greater supply of bioaccessible calcium than other food matrices. For fat-soluble vitamins, the intake of salmon and cheeses resulted as excellent sources of both vitamin A and D3 in their bioabsorbable form, while the bioaccessibility of both vitamins in eggs depended on the cooking method. In addition, pork provided the greatest antihypertensive effect, while turkey meat exerted the greatest effect as antioxidant. Finally, the essential/non-essential amino acid ratio increased under altered conditions at the end of digestion, compared to standard healthy adult conditions. Thus, even with impaired protein digestibility, digests will have an effect against sarcopenia. / Hernández Olivas, E. (2021). Age-related digestive alterations and their impact on nutrients digestibility [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/175472 / Compendio