Knochen ist ein lebendes Material, das seine Struktur an die mechanische Umgebung anpasst. Zur strukturellen Anpassung muss der Knochen die mechanische Belastung erfassen. Allerdings sind Knochen mechanisch so steif, dass die lokalen Verformungen zu klein sind um von den Knochenzellen direkt detektiert zu werden. Osteozyten sind Knochenzellen, die ein Zellnetzwerk in der mineralisierten Matrix bilden. Ihre Zellkörper sind in Lakunen untergebracht und ihre Zellprozesse in engen Kanälchen, den Canaliculi. Die Hypothese des Flüssigkeitsflusses besagt, dass der lastinduzierte Flüssigkeitsfluss durch dieses Lakunen-Canaliculi-Netzwerk (LCN) einen Verstärkungsmechanismus bereitstellt, der es den Osteozyten ermöglicht, die dynamische Belastung des Knochens zu erfassen. Wir stellen die Hypothese auf, dass die Architektur des LCN eine wesentliche Rolle in Bezug auf die Mechanosensitivität spielt, da sie den Flüssigkeitsfluss beeinflusst. Das zentrale Ziel dieser Arbeit ist es, diese Hypothese an realen LCN-Architekturen mit einem Modell des lastinduzierten Flüssigkeitsflusses zu testen und den resultierenden Fluss mit der Mechanoreaktion des Knochens zu vergleichen. Wir haben das LCN mithilfe konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie untersucht. Wir haben dann die auf den Kirchhoffschen Gesetzen basierende Schaltungstheorie verwendet, um die Geschwindigkeiten der Flüssigkeit in allen abgebildeten Canaliculi zu modellieren und darzustellen wie sich die verdrängte Flüssigkeit über das LCN verteilen würde. Basierend auf diesen Geschwindigkeiten wurde die Mechanoreaktion des Knochens vorhergesagt. In meiner Studie wurden die Knochen von Mäusen verwendet, wodurch kontrollierte in vivo Belastungsexperimente und die Messung der Mechanoreaktion in Bezug auf gebildeten bzw. resorbierten Knochen unter Verwendung von in vivo µCT möglich waren. Die Flüssigkeitsströmungsmuster durch das LCN korrelierten mit der gemessenen Mechanoreaktion. Das heißt, Knochenbildung wurde in Bereichen nahe höherem Fluss beobachtet, während Knochenabbau in Bereichen nahe geringem Fluss beobachtet wurde. Die Vorhersage der Mechanoreaktion unter Berücksichtigung der Architektur des LCN war quantitativ besser als eine Vorhersage, die nur auf mechanischer Belastung basiert. Qualitativ haben wir festgestellt, dass Gefäßkanäle im Kortex als lokale Senken des Flüssigkeitsflusses fungieren und daher den Fluss an der nahegelegenen Knochenoberfläche reduzieren. Im Gegensatz dazu nahmen die Strömungsgeschwindigkeiten für konvergente Netzwerkstrukturen zu, bei denen die Zahl der Kanäle zur Knochenoberfläche hin abnimmt. In einem zweiten Projekt konzentrierten wir uns auf gesunden, menschlichen osteonalen Knochen. Osteone sind zylindrische Strukturen um Gefäßkanäle, die praktisch vom umgebenden Knochen abgeschottet sind. Wir analysierten acht gewöhnliche Osteone mit einem nahezu homogenen LCN und neun Osteon-in-Osteonen, die durch eine ringartige Zone mit geringer Netzwerkkonnektivität zwischen dem inneren und dem äußeren Teil dieser Osteone gekennzeichnet sind. In Canaliculi, die die beiden Teile des Osteons in Osteonen überbrücken, wurde ein wesentlich höherer lastinduzierter Flüssigkeitsfluss beobachtet als in anderen Canaliculi. Dies führte dazu, dass der durchschnittliche Fluss 2,3-mal höher war als bei normalen Osteonen. Es ist daher wahrscheinlich, dass Osteon-in-Osteon-Konstruktionen besonders zur Mechanosensitivität des kortikalen Knochens beitragen. Die Untersuchungen in dieser Doktorarbeit legen nahe, dass die LCN-Architektur neben der mechanischen Belastung als Schlüsselfaktor für die Knochenanpassung dient. / Bone is a living material, which adapts its structure in response to the mechanical environment. For structural adaptation bone need to sense the mechanical loading. However, bone is so stiff that the local strains are too small to be directly sensed by bone cells. Osteocytes are bone cells that form a cell network located within the mineralized matrix. Their cell bodies are housed in lacunae and their cell processes in narrow canals, the canaliculi. According to the fluid flow hypothesis, load induced fluid flow through this lacunocanalicular network (LCN) provides an amplification mechanism which allows osteocytes to sense dynamic loading of the bone. We hypothesize that the network architecture of the LCN plays an essential role in bone’s mechanosensitivity, as it influences the fluid flow. We aimed to test these hypotheses by using real LCN architectures in a model of load induced fluid flow, and compare the resulting flow with the mechanoresponse of bone. We imaged the LCN using confocal laser scanning microscopy (CLSM). Image processing was then used to describe the LCN as a mathematical network consisting of edges and nodes, representing the canaliculi and their connections respectively. We then employed circuit theory, based on Kirchhoff’s laws, to model the velocities of the fluid in all the imaged canaliculi. Based on these velocities, the mechanoresponse of bone was predicted. Mice were used in my study, as this allowed a controlled in vivo loading and a measurement of the mechanoresponse in terms of formed/resorbed bone using in vivo µCT. Fluid flow patterns through the LCN of mice correlated with the measured mechanoresponse, i.e., bone formation was observed near surfaces of higher flow, while resorption was observed near surfaces with low flow. The prediction of the mechanoresponse considering the architecture of the LCN was quantitatively better than a prediction based on strains only. Qualitatively, we identified that vascular canals in the cortex act as local sinks of fluid flow and, therefore, reduce the flow at the nearby bone surface. In contrast, flow velocities increased in convergent network structures, where the flow is channeled into fewer canaliculi nearby the surface. In a second project we focused on healthy human osteonal bone. Osteons are cylindrical structures around vascular canals, which are practically sealed off from the surrounding bone. We analyzed 8 ordinary osteons with a rather homogeneous LCN, and 9 osteon-in-osteons, which are characterized by a ring-like zone of low network connectivity between the inner and the outer parts of these osteons. A substantially higher load-induced fluid flow was observed in canaliculi that bridge the two parts of the osteon-in-osteons. This resulted in an average flow, which was 2.3 times higher compared to ordinary osteons. It is therefore likely that osteon-in-osteons particularly contribute to the mechanosensitivity of cortical bone. Based on both studies in this PhD thesis we conclude that LCN architecture should be considered as a key determinant of bone adaptation besides mechanical loading.

En conditions saines, le tissu osseux est constamment remodelé pour s’adapter aux différentes contraintes mécaniques, réparer les microfissures et maintenir l’homéostasie minérale. Ce remodelage est effectué par les ostéoblastes et les ostéoclastes, responsables de la formation et de la résorption du tissu osseux. Leurs activités sont orchestrées par les ostéocytes, cellules osseuses les plus abondantes, via la mechanotransduction. Dans cette thèse, nous avons utilisé la microtomographie par rayonnement synchrotron afin d’étudier la morphologie du réseau lacuno-canaliculaire (LCN), ainsi que la distribution 3D de la densité massique des tissus osseux minéralisés, sur des sujets sains ou atteints d’ostéonécrose de la mâchoire suite à un traitement par bisphosphonates (BP). Les BP sont utilisés pour le traitement de l’ostéoporose et des métastases osseuses, limitant la résorption osseuse par les ostéoclastes. Nous avons supposé que les patients ainsi traités présentaient un volume de lacunes ostéocytaires plus grand, dû à la résorption du tissu péri-lacunaire par ostéolyse ostéocytaire. Le sujet affecté par un manque de minéraux induit par la réduction du remodelage ostéoclastique, maintiendrait ainsi son homéostasie minérale. Cette hypothèse n’a pas été confirmée, mais nous avons toutefois remarqué que les lacunes larges étaient plus abondantes dans la mâchoire que dans le tibia et le fémur. Cela s’expliquerait par l’accumulation préférentielle des BP dans la mâchoire, au taux de remodelage élevé. De plus, si ces BP sont déposés dans les lacunes ostéocytaires pendant le processus de minéralisation, des concentrations toxiques pourraient être atteintes en cas d’infection, conduisant alors à une diminution du pH, et à la dissolution des minéraux. Nous avons également utilisé la nanotomographie par rayonnement synchrotron avec reconstruction de phase pour analyser la morphologie du LCN et les propriétés du tissu avoisinant, sur mâchoires de sujets sains et traités par BP. Nous supposons qu’une minéralisation secondaire a lieu via la diffusion des minéraux à travers l’interface fluide-matrice, à la surface des lacunaire et des canalicules. Cela devrait conduire à une variation de la densité massique en fonction de la distance par rapport au bord des porosités, que nous avons effectivement observé. Ainsi, l’échange minéral entre le fluide extracellulaire et la matrice minéralisée s’effectue à la frontière des lacunes et des canalicules. Nos données suggèrent que la capacité d’échange de minéraux entre le réseau poreux et la matrice osseuse augmenterait d’un ordre de grandeur si la surface canaliculaire était prise en compte. Le modèle de diffusion résultant de nos études devrait contribuer à une meilleure compréhension puis optimisation du traitement. Toutefois, des études complémentaires sur les modifications des propriétés du tissu pendant la minéralisation secondaire et les fluctuations des concentrations du minéral dans le sang sont nécessaires. / Under healthy conditions, human bone undergoes permanent remodeling to adjust to mechanical demands, to repair micro-cracks and to maintain mineral homeostasis. This process of remodeling is performed by osteoblasts and osteoclasts: bone-forming and bone-resorbing cells. The activity of osteoclasts and osteoblasts is triggered by osteocytes, the most frequently occurring type of bone cell, via mechanosensation processes. Bisphosphonates (BP) prescribed during treatment for osteoporosis or bone metastasis inhibit osteoclast activity and thus decrease the bone turnover. In this work, the distribution and morphology of osteocyte lacunae of human cortical jaw bone was investigated in 3D, and a comparison between healthy and BP-treated donors was performed using synchrotron radiation (SR) µCT. In a second approach, we used SR nano-CT with phase contrast to investigate the morphology of the canalicular network and the bone tissue properties in the vicinity of the lacuna-canalicular network of human jaw bone, originating from both healthy subjects and patients treated with BPs. We hypothesized that secondary mineralization takes place via a diffusion process through the fluid-matrix interface at both the lacunar and the canalicular surfaces. This should result in mass density gradients with respect to the distance to the pore boundary. Such mass density gradients were indeed observed at both lacunar and canalicular interfaces. We concluded that mineral exchange between extracellular fluid and mineralized matrix occurs at all bone surfaces, including the canaliculi. Our data suggested that the capacity of the pore network to exchange mineral with the bone matrix would increase by one order of magnitude if the canalicular surface is taken into account. However, more studies should be performed, targeting not only the changes of tissue properties during secondary mineralization, but also during fluctuations of mineral concentration in periods of high mineral demand.

No description available.

Cette thèse porte sur l'étude du réseau lacuno-canaliculaire (Lacuno-canalicular Network : LCN) osseux grâce à différentes techniques de microscopie optique. Le LCN correspond à l'empreinte dans la matrice osseuse du réseau ostéocytaire formé de cellules dendritiques (les ostéocytes) interconnectées. Bien qu'il joue un rôle majeur dans la formation, le remodelage et le maintien des propriétés biomécaniques de l'os, les informations sur ce réseau cellulaire dans sa globalité restent limitées. Cela provient notamment de la difficulté à caractériser ce réseau dense et complexeavec une résolution sub-micrométrique sur des échelles allant jusqu'à l'organe entier. Dans cetravail de thèse nous avons cherché à améliorer la caractérisation du LCN en utilisant deux approches : la mise en place d'une méthode d'analyse du LCN à grande échelle à partir dela microscopie confocale d'une part et l'évaluation du potentiel de la microscopienon linéaire pour l'étude du LCN d'autre part.Dans un premier temps nous avons mis au point un protocole allant de la préparation des échantillons jusqu'au traitement des images et à l'analyse des données afin d'optimiser l'imagerie confocale des tissus osseux dans le but d'obtenir une analyse quantitative du réseau à grande échelle. Les résultats préliminaires mettent en évidence une grande variabilité des paramètres du réseau à toutes les échelles révélant la complexité de celui-ci. Cette analyse a été mise en pratique afin d'étudier les variations du LCN à l'échelle d'un fémur entier de souris.Dans un second temps, nous avons évaluer le potentiel de la microscopie optique non linéaire et notamment de la génération de troisième harmonique (THG) pour l'imagerie et l'étude du LCN. Nous avons tout d'abord montré la possibilité de visualiser le LCN, sans marquage fluorescent, grâce à la microscopie THG. A partir de cette preuve de principe nous avons expliqué l'origine des contrastes observés dans l'os par microscopie THG : un signal provenant des porosités et permettant de visualiser le réseau et un signal de fond structuré provenant des interfaces entre les fibrilles de collagène. Nous avons également évaluer les possibilités de la combinaisons de signaux non linéaires, principalement ceux de la THG et de la SHG (génération de seconde harmonique) qui permettent de visualiser simultanément le réseau et la matrice de collagène respectivement. Une corrélation entre la structure du réseau et l'organisation du collagène a pu être établie grâce à la visualisation de ces deux signaux sur de grandes échelles. Enfin des résultats quantitatifs sur le LCN ont pu être obtenus à partir des images THG permettant une étude des effets de la micro-gravité sur la structure de ce réseau. / This thesis focuses on the study of bone lacuno-canalicular network (LCN) using different optical microscopy techniques. The LCN is the porosity network in the bone matrix where the cellular network lie. It is formed of dendritic cells: the osteocytes which are connected to each other. Although it plays a major role in the formation, remodeling and maintenance of biomechanical properties of bone, only little is known about this network as a whole. This can be explain by the difficult characterization of such a dense and complex network with sub-micron resolution and scales up to the entire organ. In this work we have sought to improve the characterization of the LCN using two approaches: the development of a method to analyse the network on large scale using confocal microscopy on one hand, and the assessment of the potential of non linear microscopy technique to study the LCN on the other hand.First, we have developed a protocol from sample preparation to image processing and data analysis to optimize confocal imaging of bone tissue in order to obtain a quantitative large scale analysis of the network. Preliminary results show a wide variation of network parameters at all scales revealing its complexity. This analysis was then used in order to assess changes in the LCN across an entire mice femur.Secondly, we study the potential of the non-linear optical microscopies especially the third harmonic generation (THG) microscopy for imaging and the study of the LCN. Initially, we demonstrated the ability to visualise the LCN without fluorescent labelling using THG microscopy. From this proof of concept we explained the origin of the different ThG microscopy contrasts observed in bone tissue: a signal from the porosities allowing to visualize the network and a structured background signal generated at the interfaces between collagen fibrils. We also assess the possibilities of combinations between different non-linear signals, mainly THG and SHG (second harmonic generation) that can simultaneously image the network and the collagen matrix respectively. A correlation between the network structure and collagen organization has been established using the visualization of these two signals over large scales. Finally quantitative parameters of the LCN were obtained from THG images and applied to study the effects of microgravity on the cellular network structure.

Le système ostéocytaire soulève un intérêt croissant depuis quelques années car il est joue un rôle important dans l'adaptation de l'os. Le système ostéocytaire est inclus dans un réseau poreux dénommé le réseau lacuno-canaliculaire (LCN). L’observation du système ostéocytaire est difficile car les ostéocytes sont profondément enfouies dans la matrice osseuse et difficilement accessible par les techniques optiques. Récemment l’équipe de Creatis a montré la faisabilité d’imager le LCN en 3D grâce à la micro tomographie par rayonnement synchrotron. Toutefois, il n’existe actuellement pas de méthodes d’analyse permettant de quantifier, de façon automatique, le réseau lacuno-canaliculaire en 3D. L’objectif de cette thèse était de développer des méthodes d’analyse d’images permettant d’extraire des paramètres quantitatifs sur le réseau lacuno-canaliculaire. La première partie, consacrée à l’état de l’art. Le chapitre 1 présente les objectifs de ce travail. Le chapitre 2 rappelle les éléments de base sur le tissu osseux et présente les caractéristiques du réseau lacuno-canaliculaire. Le chapitre 3 présente les différentes méthodes d’imagerie utilisées jusqu’à présent pour étudier le réseau lacuno-canaliculaire. Le chapitre 4 présente l’état de l’art sur les paramètres qui sont classiquement utilisés pour caractériser le réseau lacuno-canaliculaire. La seconde partie est consacrée aux contributions de ce travail. Le chapitre 5 présente les deux systèmes expérimentaux de l’ESRF sur lesquels des images d’échantillons osseux ont été acquises. Le chapitre 6 décrit la méthode développée pour la quantification des lacunes ostéocytaires à partir d’images à l’échelle micrométrique. Elle propose de calculer des paramètres issus des moments géométriques ainsi que des paramètres basés sur la notion de volumes intrinsèques. Les méthodes sont appliquées à une série de 13 échantillons acquis en collaboration avec le Laboratoire d’Imagerie Paramétrique, Paris. Les résultats obtenus sont comparés et discutés par rapport à ceux de la littérature. Le chapitre 7 décrit la quantification des canalicules reliant les ostéocytes à partir d’images à l’échelle sous-micrométrique. En particulier, nous nous sommes intéressées à estimer le nombre de canalicules issues d’une lacune ostéocytaire, paramètre encore jamais mesuré en 3D. L’évolution de ce paramètre en fonction de la distance au centre de la lacune a permis de mettre en évidence et de quantifier la ramification des canalicules. Le chapitre 8 propose l’application des méthodes développées à une série d’échantillons acquis en collaboration le groupe de Sharmila Majumdar à l’université de San Francisco. Dans ce chapitre, nous avons travaillé sur une nouvelle méthode de segmentation du réseau lacuno-canaliculaire basée sur une méthode de chemins géodésiques. Les premiers résultats acquis sur 8 échantillons humains d’âges différents sont présentés. Finalement, le chapitre 9 conclut ce travail et présente des perspectives. / The osteocyte system has raised increasing interest in the recent years, since it is hypothesized to play an important role in orchestrating bone adaptation through mechanosensation and bone mechanotransduction mechanism. The osteocytes are deeply buried within the bone matrix, where their bodies are encysted in cavities called lacunae and their stellular processes are enclosed in tunnels called canaliculi. Together, they formed the lacuno-canalicular network (LCN). The geometry of the LCN is of importance since it is supposed to potentially affect and reflect the viability of the osteocyte and is supposed to be related to biomechanical constraints at the cell level. However, studying the LCN is quite challenging, due to limitations in an ideal imaging modality and the lack of quantitative analysis tools. In this thesis, we propose computational efficient and automated methods to quantify the 3D morphological properties of the LCN from synchrotron radiation (SR) micro / nano-CT images. For image acquisition, we used the SR micro/nano-CT setups installed on beamlines ID19 and ID22 at ESRF. A series of human cortical samples were imaged with spatial resolutions ranging between 3.5 µm to 60 nm. For the 3D assessment of lacunae, we used an image moment-based approach to calculate the volume, length, width, height and anisotropy of each osteocyte lacuna. We employed a fast algorithm to further calculate the surface area, the Euler number and the SMI of each lacuna. Validation of segmentation and experimental results on 13 bone samples are presented. For the 3D assessment of canaliculi, we propose a method to quantify the canalicular ramification around each lacuna. After segmentation, our method first labels each lacuna from the LCN. Then, a signature of the numbers of canaliculi at different distances from the lacunar surface is estimated through the calculation of topological parameters. Validation of this method and statistical results a large 3D SR micro-CT image of a human femoral bone sample are reported. We also improved the segmentation of the canaliculi and illustrated the feasibility of the application on a series of bone samples. We investigated a segmentation approach based on minimum cost paths and geodesic voting. A parallel computation scheme was implemented to reduce the computation times. The LCN was characterized by using the previous methods. Besides, we introduced the parameters from the Voronoi tessellation. Statistical results are reported on 8 large 3D micro-CT images, including around a hundred lacunae and the canaliculi. Future works will concern the improvement of canaliculi segmentation of from images at 300 nm as well as its evaluation and further characterization of LCN from SR CT images at both 300 nm and 50 nm. This work opens many perspectives for a better knowledge of the physiopathology of bone at the cellular scale.

<p dir="ltr">Bone health relies on its cells' ability to sense and respond to mechanical forces, a process primarily managed by osteocytes embedded within the bone matrix. The cells reside in the lacuno-canalicular network (LCN), a complex structure, comprised of lacunae (small cavities) and canaliculi (microscopic channels), through which they communicate and receive nutrients. The mechanotransduction (MT) process, by which osteocytes convert mechanical signals from mechanical loading into biochemical responses, is essential for bone remodeling but remains poorly understood. Both in-vitro and in-vivo studies present challenges in directly measuring the cellular stresses and strains involved, making computational modeling a valuable tool for studying osteocyte mechanics.</p><p> </p><p dir="ltr">In this dissertation, we present a coarse-grained, integrative model designed to simulate stress and strain distributions within an osteocyte and its microenvironment. Our model features the osteocyte membrane represented as a network of viscoelastic springs, with six slender, arm-like osteocytic processes extending from the membrane. The osteocyte is immersed in interstitial fluid and encompassed by the rigid extracellular matrix (ECM). The cytosol and interstitial fluid are both modeled as water-like, viscous incompressible fluids, allowing us to capture the fluid-structure interactions crucial to understanding the MT.</p><p> </p><p dir="ltr">To simulate these interactions, we employ the Lattice Boltzmann - Immersed Boundary (LB-IB) method. This approach couples the Lattice Boltzmann method, which numerically solves fluid equations, with the immersed boundary method, which handles the interactions between the osteocyte structures and the surrounding fluids. This framework consists of a system of integro-partial differential equations describing both fluid and solid dynamics, enabling a detailed examination of force, strain, and stress distribution within the osteocyte. Major results include 1) increased incoming flow routes results in increased stress and strain, 2) regions of higher stress and strain are concentrated near the junctions where the osteocytic processes meet the main body.</p>