Resumo não disponível

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O carcinoma adrenocortical (ACC) é um tumor maligno raro. O objetivo foi testar a ação de drogas antitumorais na linhagem H295R, em cultura 2D e 3D, analisadas por MTS, ensaios multiparamétricos, e microscopia confocal. Em monocamada (2D), as drogas tiveram maior efeito quando utilizadas com o mitotano 10 mM, sendo: everolimus 10 mM (50±0,02% p &#8804 0.001), imatinib (10 mM 52±0.01% p &#8804 0.001), sunitinib 5 mM (47±0.02% p &#8804 0.001), e nilotinib 5 mM (59±0,03% p &#8804 0.001), com evidência de apoptose. Nos esferoides (3D) foi necessário mitotano 30 M com everolimus 10 mM para se obter diminuição de 32±0.02% p &#8804 0.001 na viabilidade das células, e com nilotinib 10 mM para redução de 57±0.03% p &#8804 0.001, com evidência de necrose e apoptose. Em resumo, os dados sugerem que os esferoides são mais resistentes aos tratamentos, como ocorre com tumores in vivo, e podem representar uma importante abordagem para estudos de ACC. O nilotinib foi o que induziu as melhores respostas, tanto no modelo em 2D quanto 3D, resultados que se apresentam promissores para o tratamento dos carcinomas adrenocorticais. / Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare malignant tumor. The objective was to test the antitumor drugs action in the H295R cell line, in 2D and 3D culture system, by using MTS, multiparameter assay (High Content Screening) and confocal microscopy. In monolayer, all drugs were more effective in combination with mitotane 10 mM: everolimus 10 mM (50±0.02%), 10 mM imatinib (52±0.01%), 5 mM sunitinib (47±0.02%), and 5 mM nilotinib (59±0.03%). The spheroids required mitotano 30 mM with everolimus 10 mM to decrease cell viability (32±0.02% p &#8804 0.001); and with 10 mM nilotinib to inhibit cell viability in 57±0.03% (p &#8804 0.001), with induction of apoptosis and necrosis. In summary, the spheroids were more resistant to treatment and may represent an important approach for studies of ACC. Nilotinib was the tyrosine kinase inhibitor that, either alone or in combination with mitotane, induced higher cytotoxicity, in both 2D and 3D cell cultures, showing promising results for the treatment of adrenocortical carcinoma, as well as for the studies of its mechanism of action.

A carcinogênese do córtex da supra-renal é um processo complexo que envolve alterações genéticas múltiplas e seqüenciais. Embora algumas dessas alterações já tenham sido caracterizadas, de modo geral estes mecanismos permanecem pouco compreendidos. Um conhecimento mais aprofundado dos mesmos não só levaria à descoberta de novos marcadores de prognóstico como também a alvos terapêuticos em potencial. A fim de melhor caracterizarmos os mecanismos envolvidos na progressão maligna do tumor e selecionarmos genes candidatos a serem marcadores de malignidade e alvos terapêuticos, nós estudamos os RNAs de uma linhagem celular derivada de um tumor adrenocortical maligno (NCI-H295A) e um espécime de tumor do córtex da supra-renal por \"Differential Display\" (DDRT-PCR). Foi selecionado um total de 317 transcritos únicos diferencialmente expressos, com base na análise densitométrica digital dos géis de DDRTPCR. A anotação funcional dos genes hiper-expressos mostrou relação com motilidade celular e proliferação. Entre os hipo-expressos foram identificados genes envolvidos na regulação de transcrição, síntese e processamento de RNA e remodelamento da cromatina. A expressão de dois genes entre os transcritos selecionados foi verificada por RT-PCR semi-quantitativa em 19 tumores adrenocorticais adultos e pediátricos, metastáticos e não metastáticos. Os genes da fucosiltransferase-11 e do supressor tumoral BCSC-1 (hiper- e hipo-regulado, respectivamente) encontraram-se diferencialmente expressos nos subgrupos específicos das 19 amostras tumorais. Em suma, o DDRT-PCR revelou-se uma ferramenta valiosa para uma análise global dos transcritomas do córtex da supra-renal e para selecionar genes com possível envolvimento na tumorigênese adrenocortical. Novos aspectos da biologia, progressão e possíveis alvos terapêuticos moleculares puderam ser vislumbrados. / There are important gaps in the present knowledge about adrenocortical tumorigenesis. For this reason we compared by Differential Display RNAs from a carcinoma-derived cell line (NCI-H295A) and a metastatic adrenocortical tumor and characterized 317 differentially expressed transcripts. The up-regulated genes are mainly related to cell motility and proliferation. Among the down-regulated genes, those involved in regulation of transcription, RNA synthesis and processing and chromatin remodeling were identified. Differential expression of FUTT11 and BCSC-1 tumor suppressor gene were confirmed in specific subsets of 19 adult and pediatric adrenocortical tumors and might serve as marker for malignancy. Our data revealed previously unknown aspects of adrenal tumorigenesis.

A carcinogênese do córtex da supra-renal é um processo complexo que envolve alterações genéticas múltiplas e seqüenciais. Embora algumas dessas alterações já tenham sido caracterizadas, de modo geral estes mecanismos permanecem pouco compreendidos. Um conhecimento mais aprofundado dos mesmos não só levaria à descoberta de novos marcadores de prognóstico como também a alvos terapêuticos em potencial. A fim de melhor caracterizarmos os mecanismos envolvidos na progressão maligna do tumor e selecionarmos genes candidatos a serem marcadores de malignidade e alvos terapêuticos, nós estudamos os RNAs de uma linhagem celular derivada de um tumor adrenocortical maligno (NCI-H295A) e um espécime de tumor do córtex da supra-renal por \"Differential Display\" (DDRT-PCR). Foi selecionado um total de 317 transcritos únicos diferencialmente expressos, com base na análise densitométrica digital dos géis de DDRTPCR. A anotação funcional dos genes hiper-expressos mostrou relação com motilidade celular e proliferação. Entre os hipo-expressos foram identificados genes envolvidos na regulação de transcrição, síntese e processamento de RNA e remodelamento da cromatina. A expressão de dois genes entre os transcritos selecionados foi verificada por RT-PCR semi-quantitativa em 19 tumores adrenocorticais adultos e pediátricos, metastáticos e não metastáticos. Os genes da fucosiltransferase-11 e do supressor tumoral BCSC-1 (hiper- e hipo-regulado, respectivamente) encontraram-se diferencialmente expressos nos subgrupos específicos das 19 amostras tumorais. Em suma, o DDRT-PCR revelou-se uma ferramenta valiosa para uma análise global dos transcritomas do córtex da supra-renal e para selecionar genes com possível envolvimento na tumorigênese adrenocortical. Novos aspectos da biologia, progressão e possíveis alvos terapêuticos moleculares puderam ser vislumbrados. / There are important gaps in the present knowledge about adrenocortical tumorigenesis. For this reason we compared by Differential Display RNAs from a carcinoma-derived cell line (NCI-H295A) and a metastatic adrenocortical tumor and characterized 317 differentially expressed transcripts. The up-regulated genes are mainly related to cell motility and proliferation. Among the down-regulated genes, those involved in regulation of transcription, RNA synthesis and processing and chromatin remodeling were identified. Differential expression of FUTT11 and BCSC-1 tumor suppressor gene were confirmed in specific subsets of 19 adult and pediatric adrenocortical tumors and might serve as marker for malignancy. Our data revealed previously unknown aspects of adrenal tumorigenesis.

Introdução: A 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A redutase (HMGCR) é a enzima limitante da via do mevalonato. Esta via, que tem como produto final o colesterol, gera inúmeros subprodutos, como os isoprenóides, essenciais para modificação pós-traducional de várias proteínas envolvidas em proliferação e crescimento celular. Em tecidos esteroidogênicos (por exemplo, córtex adrenal), a HMGCR pode desempenhar um papel tanto no controle do crescimento e proliferação celular quanto na esteroidogênese. HMGCR está hiperexpressa em várias formas de neoplasias humanas inclusive em tumores adrenocorticais (ACTs), mas a sua importância na biologia dos ACTS é desconhecida. Objetivos: Avaliar o padrão de expressão da HMGCR e outros genes que participam na economia de colesterol e esteroidogênese em ACTs adultos e pediátricos; avaliar o efeito do inibidor da HMGCR lovastatina na via proliferativa MAPK; e analisar os efeitos de vários inibidores da via mevalonato na viabilidade de células NCI-H295A. Casuística e métodos: Analisamos a expressão do RNAm por PCR em tempo real dos genes HMCGR, FDFT1, SCARB1, LDLR StAR, TSPO, CYP11A1, CYP11B1, CYP17A1, CYP21A1 e HSD3B1, em ACTs, incluindo 27 tumores de adultos: [17 adenomas (ACA) e 10 carcinomas (ACC)]; 21 tumores de crianças [13 adenomas (PAD) e 8 carcinomas (PAC)]. Um pool comercial de RNA poli A obtido de córtex adrenal normal humano foi utilizado como amostra referência. A fosforilação da proteína ERK 1/2 (efetor final da via MAPK) no extrato intracelular de células NCI-H295A após tratamento com lovastatina foi avaliada através de SDS-PAGE seguido por immunoblot com anticorpos específicos. A ação sob a viabilidade celular em células NCI-H295A dos inibidores da via mevalonato foi realizada por análise colorimétrica. Resultados: A maioria dos ACTs de adultos apresentou expressão diminuída de StAR, TSPO, CYP11A1, CYP11B1, CYP17A1, CYP21A1 e HSD3B1 e hiperexpressão da HMGCR. Neste grupo, a expressão relativa dos genes StAR, TSPO, CYP11B1, CYP21A1 e HSD3B1 foi significativamente menor nos ACCs (p <0,02). O gene LDLR não foi diferencialmente expresso na maioria dos ACTs do grupo adulto, enquanto que o gene SCARB1 e FDFT1 estavam hipoexpressos nestes tumores, independentemente do comportamento biológico. A análise de grupamento mostrou que ACCs formam um grupo distinto dos ACAs, com exceção de uma amostra. Com relação aos tumores do grupo pediátrico, não houve diferença na expressão dos genes estudados entre PAD e PAC. A expressão de HMGCR e TSPO se correlacionou inversamente, enquanto uma significativa correlação positiva entre StAR, CYP11A1, CYP11B1, CYP17A1, CYP21A1 e HSD3B1 foi observada nos ACTs do grupo adulto. O tratamento de células NCI-H295A com lovastatina provocou uma diminuição na fosforilação ERK 1/2. A inibição da HMGCR e isoprenilação de proteínas diminuiu drasticamente a viabilidade das células NCI-H295A, ao contrário do bloqueio específico da síntese de colesterol, que não apresentou efeito sobre a viabilidade celular. Conclusão: A hipoexpressão de genes relacionados à esteroidogênese e, em menor grau, a hiperexpressão da HMGCR caracterizam os ACCs. A hiperexpressão da HMGCR leva a um aumento na isoprenilação de proteínas e não da produção de colesterol, pois os principais genes envolvidos na esteroidogênese estão hipoexpressos e o bloqueio específico da síntese de colesterol não interferiu na viabilidade das células NCI-H295A. A isoprenilação de proteínas (por exemplo, Ras) é um evento crucial para viabilidade das células NCI-H295A e está envolvida na ativação de cascatas de sinalização de proliferação celular. A via mevalonato é um alvo potencial para o tratamento dos tumores adrenocorticais / Introduction: 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzime A reductase (HMGCR) is the rate-limiting enzyme of the mevalonate pathway, which generates isoprenoids for both post-translational modification of several proteins involved in cell growth and proliferation and biosynthesis of cholesterol. Therefore, in steroidogenic tissues (e. g. adrenal cortex), HMGCR may play a role in both growth control and steroidogenesis. HMGCR is overexpressed in several forms of human neoplasms incluiding adrenocortical tumors (ACTs), but its importance in the biology of ACTs is unknown. Objective: To assess the expression pattern of HMGCR, and other genes involved in cholesterol economy and steroidogenesis in pediatric and adult ACTs. To evaluate the impact of a HMGCR inhibitor lovastatin on proliferative pathway- MAPK - of NCI-H295A cells; to evaluate the effects of various mevalonate pathway inhibitors in NCI-H295A cells viability. Methods: We analyzed HMGCR, FDFT1, LDLR, SCARB1, StAR, TSPO, CYP11A1, CYP11B1, CYP17A1, CYP21A1 and HSD3B1 mRNA expression by real-time RT-PCR in ACTs [Adult tumors: 14 adenomas (ACA) and 11 carcinomas (ACC); Pediatric tumors: 13 adenomas (PAD) and 8 carcinomas (PAC)]. A commercial pool of normal human adrenal cortex poly A RNA was used as reference sample. We assess ERK phosphorylation after treatment with lovastatin through SDS-PAGE of intracellular extract followed by immunoblotting with specific antibodies. Action of mevalonate pathway inhibitors on cellular viability was assessed by colorimetric assay. Results: Most adult ACTs showed decreased expression of StAR, TSPO, CYP11A1, CYP11B1, CYP17A1, CYP21A1 and HSD3B1 and overexpression of HMGCR. In this group, the relative expressions of TSPO, StAR, CYP11B1, CYP21A1 and HSD3B1 were significantly lower in the ACCs (P<0.02). LDLR was not differentially expressed in most of adults ACTs, while FDFT1 and SCARB1 were hypoexpressed in this group, independently of biological behavior. Cluster analysis showed that adult ACCs form a group distinct from adrenocortical adenomas, with exception of one carcinoma sample. Regarding tumors of the pediatric group, no differences in the expression of evaluated genes were found between PAD and PAC. The expression of HMGCR and TSPO correlated negatively while a significantly positive pairwise correlation among StAR, CYP11A1, CYP11B1, CYP17A1, CYP21A1 e HSD3B1 was observed in adults ACTs. Lovastatin treatment leads a decreased ERK phosphorylation in NCI-H295A cells. Inhibition of HMGCR, farnesyl syntase and protein isoprenylation decreased drastically NCI-H295A viability unlike the specific block of cholesterol biosyntheses that did not have any effect on cell viability. Conclusion: The hypoexpression of genes related to steroidogenesis and (to a lesser degree) the overexpression of HMGCR characterizes ACCs. HMGCR overexpression cause an increased isoprenylation of proteins rather than cholesterol production for steroidogenesis or membrane cellular integrity since the key regulators involved in this process were downregulated and specific inhibition of cholesterol did not affect NCI-H295A viability. Isoprenylation of proteins is a crucial event for NCI-H295A viability and is involved in signaling cascades (e.g. Ras). Mevalonate pathway is a potential target for treatment of adrenocortical tumors

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LUCIANA MOREIRA BORGES.pdf: 1848721 bytes, checksum: 3b9777e8d534e26ba687aa1328ac6555 (MD5) Previous issue date: 2014-04-07 / Introduction: the R337H mutation of the TP53 gene was originated in the Brazilian population through a founder effect and is considered a molecular defect of low penetrance. In combination with some polymorphisms, the R337H mutation can increase the susceptibility to tumor. The frequency of the R337H mutation in Brazilian families is considered high when compared to the observed frequencies in other countries. The unambiguous association between the mutation, the emergence of different tumor types and the high number of individual that carry the mutation makes the R337H a relevant factor in public health, particularly in the prediction of cancer. Objective: This study aimed to investigate the predictive value of the R337H mutation of the TP53 gene as a clinical marker in cancer patients. Method: a systematic literature review (SLR) was carefully performed, by searching electronic scientific literature in LILACS, IBECS, MEDLINE, Pubmed and SciELO. Twelve articles, published in English between the years 2006 to 2013, were selected by performed the relevance tests I and II. Extraction of detailed data was independently performed by two investigators, following on extraction data protocol. Results: the R337H mutation was found in 287 of 1,548 patients with cancer, two of 750 women considered healthy, 200 of 887 family members of patients with adrenocortical tumor (ACT) carrying the R337H mutation, 12 of 647 health controls and in 442 of 171 630 newborns. Eight of the twelve selected references associated the R337H mutation with family history of 411 patients with the mutation. Four studies associated the R337H mutation prognosis. Conclusion: the frequency of the R337H mutation of the TP53 gene is considerably higher in the south and southeast regions of Brazil compared to other countries. The mutation was associated with family history of cancer, the increase of the positive predictive value and the decreased of negative predictive value at diagnosis, and poor prognosis in ACT and CPC patients with with the mutation. / Introdução: a mutação R337H do gene TP53 foi originada na população brasileira por efeito fundador e é considerada um defeito molecular de baixa penetrância. Em combinação com alguns polimorfismos, a mutação R337H, pode aumentar a susceptibilidade ao desenvolvimento do tumor. A frequência da mutação R337H em famílias brasileiras é considerada elevada, quando comparada com as frequências observadas em outros países. A inequívoca associação entre a mutação, o surgimento de diferentes tipos tumorais e o alto número de indivíduos portadores da mutação fazem da R337H um relevante fator de saúde pública, em especial na predição do câncer. Objetivos: este estudo objetiva de investiga o valor preditivo da mutação R337H do gene TP53 como um marcador clínico em pacientes com câncer. Método: revisão bibliográfica sistemática (RBS) criteriosa foi realizada, através de busca eletrônica de artigos científicos nas bases de dados LILACS, IBECS, MEDLINE, Scielo e Pubmed. Doze artigos selecionados foram publicados em língua inglesa entre os anos de 2006 à 2013, foram selecionados para aplicação dos testes de relevância I e II. Extração de dados detalhada foi realizada de forma independente por dois investigadores seguindo o protocolo para extração de dados. Resultados: a mutação R337H foi encontrada em 287 dos 1.548 portadores de câncer, duas das 750 mulheres consideradas saudáveis, 200 dos 887 familiares de pacientes portadores de tumor do córtex adrenal (TCA) com a mutação R337H, doze dos 647 controles e 442 dos 171.630 recém-nascidos. Oito das doze referências selecionadas associaram a mutação R337H com histórico familiar de 411 pacientes com a mutação. Quatro estudos associaram a mutação R337H com o prognóstico. Conclusão: a frequência da mutação R337H do gene TP53 é consideravelmente mais elevada no sul e sudeste do Brasil quando comparada com os demais países do mundo. A mutação foi associada com: histórico familiar de câncer, aumento do valor preditivo positivo e diminuição do valor preditivo negativo no diagnóstico e mal prognóstico em pacientes com ACT e CPC com a mutação.

NTRODUÇÃO: O carcinoma cortical da suprarrenal é uma neoplasia rara com uma incidência estimada em 0,5-2,0 por milhão por ano em adultos. No momento, poucas opções terapêuticas para os pacientes com doença metastática são disponíveis, e novas descobertas sobre a sua patogênese são necessárias. O perfil de expressão gênica dos microRNAs (miRNAs) em tumores humanos tem sido caracterizado por uma redução global da expressão dos miRNAs. A enzima DICER1 e seu cofator TRBP (codificado pelo gene TARBP2) estão envolvidos em uma etapa essencial do processamento dos miRNAs. De forma interessante, a desregulação do processamento dos miRNAs em células cancerosas devido ao silenciamento da DICER1 propiciou a emergência de células com fenótipo mais agressivo, acelerando a progressão tumoral. Recentemente, mutações somáticas missense recorrentes no domínio de clivagem RNase IIIb da enzima DICER1 foram identificadas em 29% tumores de ovários não-epiteliais esteroidogênicos (e em até 60% de tumores ovarianos de células de Leydig). Adicionalmente, mutações inativadoras no éxon 5 do gene TARBP2, com consequente prejuízo da função da DICER1, foram identificadas em linhagens celulares de tumores com instabilidade cromossômica. OBJETIVOS: Determinar a expressão gênica e proteica da DICER1 e TRBP em tumores do córtex da suprarrenal de adultos e crianças; Investigar variantes genéticas no domínio de clivagem RNAse IIIb do gene DICER1; Investigar variantes genéticas no éxon 5 do gene TARBP2; Estudar a expressão dos miR-103 e miR-107, envolvidos na regulação da DICER1, e do miR-497, envolvido na regulação da TRBP. MÉTODOS: A expressão proteica da DICER1 e da TRBP foi avaliada por imunohistoquímica em uma micromatriz tecidual contendo 198 tumores do córtex da suprarrenal [154 em adultos (75 adenomas e 79 carcinomas) e 44 em crianças (38 clinicamente benignos e 6 clinicamente malignos)]. A expressão gênica da DICER1 e TARBP2 foi avaliada em um subgrupo de 84 tumores (61 adultos e 23 pediátricos) e a expressão do miR-103, miR-107 e miR-497 em 82 tumores (59 adultos e 23 pediátricos). O sequenciamento dos genes DICER1 e TARBP2 foi realizado em um subgrupo quase idêntico de 83 tumores. RESULTADOS: Em adultos, uma expressão forte para a DICER1 foi encontrada em 24 de 75 adenomas (32%) e em 39 de 79 carcinomas (51%; X2= 4,8, p= 0,028). Similarmente, a hiperexpressão do gene DICER1 foi encontrada em 15 de 25 carcinomas (60%) e em 7 de 30 adenomas (23%; X2= 7,64, p= 0,006). Dentre os carcinomas de adultos, a imunorreatividade fraca para DICER1 foi significativamente mais frequente em carcinomas metastáticos do que em não metastáticos (66% vs. 31%; X2= 9,3, p= 0,002). Além de mais agressivos, os carcinomas com uma expressão fraca da DICER1 foram diagnosticados em pacientes com uma mediana de idade menor (35 vs. 45 anos, p= 0,02), maior tamanho (12,3 vs. 9 cm, p= 0,001), estadio mais avançado (ENSAT 3 ou 4 em 55% vs. 30%, p= 0,04) e maior escore de Weiss (6 vs. 4, p= 0,02). Adicionalmente, a expressão fraca para a DICER1 se correlacionou com uma significativa redução da sobrevida global (p= 0,004) e livre de doença (p= 0,005). Na análise multivariada, Ki67 >- 10% (p= 0,0001) e expressão proteica fraca para DICER1 (p= 0,048) permaneceram como marcadores significativos de recorrência. No grupo pediátrico, a expressão gênica e proteica da DICER1 não foi diferente entre tumores clinicamente malignos e benignos Não identificamos nenhuma variante genética nos quatro sítios de metais do domínio RNAse IIIb do gene DICER1 tanto em adultos como em crianças. Além disso, a expressão proteica e gênica da DICER1 não se correlacionou com a expressão do miR-103 e miR-107. O miR-107 foi hiperexpresso em carcinomas em relação a adenomas de adultos, mas não apresentou impacto na análise de sobrevida. Em relação ao gene TARBP2, a sua expressão gênica e proteica não teve correlação com parâmetros histopatológicos e clínicos em adultos e crianças. Variantes genéticas no sequenciamento do éxon 5 do gene TARBP2 não foram encontradas nesses tumores. Além disso, o miR-497 não foi expresso em nenhum dos tumores da nossa coorte. CONCLUSÕES: A baixa expressão proteica da DICER1 foi um marcador de prognóstico em pacientes adultos com carcinoma cortical da suprarrenal. A perda da expressão da DICER1 em carcinomas metastáticos não foi causada por mutações inativadoras no domínio RNase IIIb do gene DICER1 e nem por alteração na expressão do miR-103 e miR-107, reguladores da sua expressão em outros tecidos. Apesar do miR-107 ter sido hiperexpresso em carcinomas, a sua expressão não teve importância prognóstica. Por fim, a expressão do gene TARBP2 e da proteína TRBP não apresentou importância prognóstica nos tumores do córtex da suprarrenal / INTRODUCTION: Adrenocortical cancer is a rare neoplasia with an estimated incidence of 0.5-2.0/million/year in adults. There are currently few therapeutic options for patients with adrenocortical cancer, and new insights into the pathogenesis of this lethal disease are needed. The microRNA (miRNA) expression profile of human tumors has been characterized by an overall miRNA downregulation. DICER1 enzyme and its cofactor TRBP are a key component of the miRNA processing machinery. It was recently demonstrated that escaping miRNA control in cancer cells due to Dicer downregulation may allow the phenotypic emergence of more aggressive genetic variants, accelerating cancer progression. Recently, DICER1 mutations in the RNase IIIb domain were found in 29% of nonepithelial ovarian tumors, predominantly in Sertoli-Leydig cell tumors (60%). In addition, TARBP2 truncating mutations, causing DICER1 destabilization, were identified in tumor cell lines with microsatellite instability. AIM: To study the mRNA and protein expression of DICER1 and TRBP in adult and pediatric adrenocortical tumors; To investigate DICER1 mutations in metal biding sites located at the RNase IIIb domain; To investigate inactivating mutations in the exon 5 of TARBP2 gene; To determine the expression of miR-103 and miR-107, DICER1 regulators, and miR-497, a TRBP regulator. METHODS: Protein expression of DICER1 and TRBP was evaluated by immunohistochemistry in a tissue microarray with 198 adrenocortical tumors [154 in adults (75 adenomas and 79 carcinomas) and 44 in children (38 clinically benign and 6 malignant)]. Expression of DICER1 and TARBP2 genes was assessed in a subgroup of 84 tumors (61 adults and 23 children) and miRNA expression in 82 tumors (59 adults and 23 children). The DICER1 and TARBP2 gene sequencing was performed in a subgroup of 83 tumors. RESULTS: In adults, a strong DICER1 expression was demonstrated in 39 out of 79 carcinomas (51%) and in 24 out of 75 adenomas (32% X2= 4.8, p= 0.028). Similarly, DICER1 gene overexpression was demonstrated in 15 out of 25 carcinomas (60%) and in 7 out of 30 adenomas (23%; X2= 7.64, p= 0.006). Among adult adrenocortical carcinomas, a weak DICER1 expression was significantly more frequent in metastatic than in non-metastatic adrenocortical carcinomas (66% vs. 31%; X2= 9.3, p= 0.002). Besides being more aggressive, adult adrenocortical carcinomas with a weak DICER expression were diagnosed in younger patients (median 35 vs. 45 yrs, p= 0.02) and had larger size (12.3 vs. 9 cm, p= 0.001), more advanced staging (ENSAT 3 or 4 in 55% vs. 30%, p= 0.04) and higher Weiss score (6 vs. 4, p= 0.02). Additionally, a weak DICER1 expression was significantly correlated with a reduced overall (p= 0.004) and disease-free (p= 0.005) survival. In the multivariate analysis, Ki67 >- 10% (p= 0.0001) and a weak DICER1 expression (p= 0.048) remained as independent predictors of recurrence. In the pediatric group, DICER protein and gene expression was not different between clinically benign and malignant tumors. No variant was identified in the metal binding sites of the RNase IIIb domain of DICER1 gene in both adult and pediatric tumors. Furthermore, DICER1 protein and gene expression did not correlate with miR-103 e miR-107 expression. miR-107 was overexpressed in adult carcinomas compared to adenomas, but it was not a predictor of poor outcome. Regarding TARBP2 gene, its gene and protein expression did not correlate with histopathological and clinical parameters in both children and adults. No variant was identified in exon 5 TARBP2 gene. Additionally, miR-497 was not expressed neither in the normal adrenal cortex and in adrenocortical tumors. CONCLUSION: A weak DICER1 protein expression was significantly associated with poor outcome in adult adrenocortical carcinomas. However, DICER1 deregulation in adult ACCs was not caused by mutations within the RNase IIIb domain and not associated with expression of its regulatory miRNAs. Although miR-107 was overexpressed in adult adrenocortical carcinomas, its expression was not correlated with a reduced survival. Finally, TARBP2 gene and protein expression was not associated with poor outcome in adrenocortical tumors

NTRODUÇÃO: O carcinoma cortical da suprarrenal é uma neoplasia rara com uma incidência estimada em 0,5-2,0 por milhão por ano em adultos. No momento, poucas opções terapêuticas para os pacientes com doença metastática são disponíveis, e novas descobertas sobre a sua patogênese são necessárias. O perfil de expressão gênica dos microRNAs (miRNAs) em tumores humanos tem sido caracterizado por uma redução global da expressão dos miRNAs. A enzima DICER1 e seu cofator TRBP (codificado pelo gene TARBP2) estão envolvidos em uma etapa essencial do processamento dos miRNAs. De forma interessante, a desregulação do processamento dos miRNAs em células cancerosas devido ao silenciamento da DICER1 propiciou a emergência de células com fenótipo mais agressivo, acelerando a progressão tumoral. Recentemente, mutações somáticas missense recorrentes no domínio de clivagem RNase IIIb da enzima DICER1 foram identificadas em 29% tumores de ovários não-epiteliais esteroidogênicos (e em até 60% de tumores ovarianos de células de Leydig). Adicionalmente, mutações inativadoras no éxon 5 do gene TARBP2, com consequente prejuízo da função da DICER1, foram identificadas em linhagens celulares de tumores com instabilidade cromossômica. OBJETIVOS: Determinar a expressão gênica e proteica da DICER1 e TRBP em tumores do córtex da suprarrenal de adultos e crianças; Investigar variantes genéticas no domínio de clivagem RNAse IIIb do gene DICER1; Investigar variantes genéticas no éxon 5 do gene TARBP2; Estudar a expressão dos miR-103 e miR-107, envolvidos na regulação da DICER1, e do miR-497, envolvido na regulação da TRBP. MÉTODOS: A expressão proteica da DICER1 e da TRBP foi avaliada por imunohistoquímica em uma micromatriz tecidual contendo 198 tumores do córtex da suprarrenal [154 em adultos (75 adenomas e 79 carcinomas) e 44 em crianças (38 clinicamente benignos e 6 clinicamente malignos)]. A expressão gênica da DICER1 e TARBP2 foi avaliada em um subgrupo de 84 tumores (61 adultos e 23 pediátricos) e a expressão do miR-103, miR-107 e miR-497 em 82 tumores (59 adultos e 23 pediátricos). O sequenciamento dos genes DICER1 e TARBP2 foi realizado em um subgrupo quase idêntico de 83 tumores. RESULTADOS: Em adultos, uma expressão forte para a DICER1 foi encontrada em 24 de 75 adenomas (32%) e em 39 de 79 carcinomas (51%; X2= 4,8, p= 0,028). Similarmente, a hiperexpressão do gene DICER1 foi encontrada em 15 de 25 carcinomas (60%) e em 7 de 30 adenomas (23%; X2= 7,64, p= 0,006). Dentre os carcinomas de adultos, a imunorreatividade fraca para DICER1 foi significativamente mais frequente em carcinomas metastáticos do que em não metastáticos (66% vs. 31%; X2= 9,3, p= 0,002). Além de mais agressivos, os carcinomas com uma expressão fraca da DICER1 foram diagnosticados em pacientes com uma mediana de idade menor (35 vs. 45 anos, p= 0,02), maior tamanho (12,3 vs. 9 cm, p= 0,001), estadio mais avançado (ENSAT 3 ou 4 em 55% vs. 30%, p= 0,04) e maior escore de Weiss (6 vs. 4, p= 0,02). Adicionalmente, a expressão fraca para a DICER1 se correlacionou com uma significativa redução da sobrevida global (p= 0,004) e livre de doença (p= 0,005). Na análise multivariada, Ki67 >- 10% (p= 0,0001) e expressão proteica fraca para DICER1 (p= 0,048) permaneceram como marcadores significativos de recorrência. No grupo pediátrico, a expressão gênica e proteica da DICER1 não foi diferente entre tumores clinicamente malignos e benignos Não identificamos nenhuma variante genética nos quatro sítios de metais do domínio RNAse IIIb do gene DICER1 tanto em adultos como em crianças. Além disso, a expressão proteica e gênica da DICER1 não se correlacionou com a expressão do miR-103 e miR-107. O miR-107 foi hiperexpresso em carcinomas em relação a adenomas de adultos, mas não apresentou impacto na análise de sobrevida. Em relação ao gene TARBP2, a sua expressão gênica e proteica não teve correlação com parâmetros histopatológicos e clínicos em adultos e crianças. Variantes genéticas no sequenciamento do éxon 5 do gene TARBP2 não foram encontradas nesses tumores. Além disso, o miR-497 não foi expresso em nenhum dos tumores da nossa coorte. CONCLUSÕES: A baixa expressão proteica da DICER1 foi um marcador de prognóstico em pacientes adultos com carcinoma cortical da suprarrenal. A perda da expressão da DICER1 em carcinomas metastáticos não foi causada por mutações inativadoras no domínio RNase IIIb do gene DICER1 e nem por alteração na expressão do miR-103 e miR-107, reguladores da sua expressão em outros tecidos. Apesar do miR-107 ter sido hiperexpresso em carcinomas, a sua expressão não teve importância prognóstica. Por fim, a expressão do gene TARBP2 e da proteína TRBP não apresentou importância prognóstica nos tumores do córtex da suprarrenal / INTRODUCTION: Adrenocortical cancer is a rare neoplasia with an estimated incidence of 0.5-2.0/million/year in adults. There are currently few therapeutic options for patients with adrenocortical cancer, and new insights into the pathogenesis of this lethal disease are needed. The microRNA (miRNA) expression profile of human tumors has been characterized by an overall miRNA downregulation. DICER1 enzyme and its cofactor TRBP are a key component of the miRNA processing machinery. It was recently demonstrated that escaping miRNA control in cancer cells due to Dicer downregulation may allow the phenotypic emergence of more aggressive genetic variants, accelerating cancer progression. Recently, DICER1 mutations in the RNase IIIb domain were found in 29% of nonepithelial ovarian tumors, predominantly in Sertoli-Leydig cell tumors (60%). In addition, TARBP2 truncating mutations, causing DICER1 destabilization, were identified in tumor cell lines with microsatellite instability. AIM: To study the mRNA and protein expression of DICER1 and TRBP in adult and pediatric adrenocortical tumors; To investigate DICER1 mutations in metal biding sites located at the RNase IIIb domain; To investigate inactivating mutations in the exon 5 of TARBP2 gene; To determine the expression of miR-103 and miR-107, DICER1 regulators, and miR-497, a TRBP regulator. METHODS: Protein expression of DICER1 and TRBP was evaluated by immunohistochemistry in a tissue microarray with 198 adrenocortical tumors [154 in adults (75 adenomas and 79 carcinomas) and 44 in children (38 clinically benign and 6 malignant)]. Expression of DICER1 and TARBP2 genes was assessed in a subgroup of 84 tumors (61 adults and 23 children) and miRNA expression in 82 tumors (59 adults and 23 children). The DICER1 and TARBP2 gene sequencing was performed in a subgroup of 83 tumors. RESULTS: In adults, a strong DICER1 expression was demonstrated in 39 out of 79 carcinomas (51%) and in 24 out of 75 adenomas (32% X2= 4.8, p= 0.028). Similarly, DICER1 gene overexpression was demonstrated in 15 out of 25 carcinomas (60%) and in 7 out of 30 adenomas (23%; X2= 7.64, p= 0.006). Among adult adrenocortical carcinomas, a weak DICER1 expression was significantly more frequent in metastatic than in non-metastatic adrenocortical carcinomas (66% vs. 31%; X2= 9.3, p= 0.002). Besides being more aggressive, adult adrenocortical carcinomas with a weak DICER expression were diagnosed in younger patients (median 35 vs. 45 yrs, p= 0.02) and had larger size (12.3 vs. 9 cm, p= 0.001), more advanced staging (ENSAT 3 or 4 in 55% vs. 30%, p= 0.04) and higher Weiss score (6 vs. 4, p= 0.02). Additionally, a weak DICER1 expression was significantly correlated with a reduced overall (p= 0.004) and disease-free (p= 0.005) survival. In the multivariate analysis, Ki67 >- 10% (p= 0.0001) and a weak DICER1 expression (p= 0.048) remained as independent predictors of recurrence. In the pediatric group, DICER protein and gene expression was not different between clinically benign and malignant tumors. No variant was identified in the metal binding sites of the RNase IIIb domain of DICER1 gene in both adult and pediatric tumors. Furthermore, DICER1 protein and gene expression did not correlate with miR-103 e miR-107 expression. miR-107 was overexpressed in adult carcinomas compared to adenomas, but it was not a predictor of poor outcome. Regarding TARBP2 gene, its gene and protein expression did not correlate with histopathological and clinical parameters in both children and adults. No variant was identified in exon 5 TARBP2 gene. Additionally, miR-497 was not expressed neither in the normal adrenal cortex and in adrenocortical tumors. CONCLUSION: A weak DICER1 protein expression was significantly associated with poor outcome in adult adrenocortical carcinomas. However, DICER1 deregulation in adult ACCs was not caused by mutations within the RNase IIIb domain and not associated with expression of its regulatory miRNAs. Although miR-107 was overexpressed in adult adrenocortical carcinomas, its expression was not correlated with a reduced survival. Finally, TARBP2 gene and protein expression was not associated with poor outcome in adrenocortical tumors