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Développement et validation de modèles adaptés à la mesure de l’anxiété et du stress chez le rat Wistar : application à la caractérisation des effets protecteurs d’un hydrolysat trypsique de caséines bovines enrichies en caséine as1 / Development and validation of models suited to the anxiety and stress measurement in Wistar rats : application to the characterisation of the protective effects of a tryptic hydrolysate from bovine milk caseins enriched with as1-caseinViolle, Nicolas 15 October 2008 (has links)
Actuellement, la prise en charge pharmacologique des troubles anxieux et de ceux liés au stress est d’une efficacité limitée, ce qui motive la recherche de nouveaux traitements. Dans ce contexte, les propriétés que possède un hydrolysat trypsique des caséines bovines (HTC) semblent prometteuses mais restent à préciser, à condition de développer des modèles animaux d’anxiété et de stress pertinents. Ce travail a d’abord consisté à valider les conditions d’utilisation d’un modèle d’anxiété, le labyrinthe en croix surélevé (LCS), et à développer des modèles de stress aigu et chronique induisant des troubles de type anxieux ou dépressifs. Puis, ces modèles ont été appliqués à la caractérisation des propriétés anxiolytiques et antistress d’un HTC administré per os. Les résultats montrent 1) que la détection d’une activité anxiolytique dépend des conditions d’application du LCS (lumière, structure du labyrinthe, espace de travail) et 2) que l’HTC présente dans ce test et celui de l’enfouissement défensif conditionné une activité anxiolytique différente de celle du diazépam utilisé comme référence. Par ailleurs, il a été montré 1) que les réponses physiologiques et comportementales à un stress aigu varient selon la modalité de stress utilisée (contention ou nage forcée), et 2) que l’HTC réduit ces deux types de réponses. Enfin, deux modèles d’exposition chronique au stress ont été développés, un seul ayant été appliqué à l’étude de l’HTC (stress chronique varié). Dans ce cas, l’HTC a réduit les effets comportementaux du stress en lien avec l’activité sans pour autant prévenir les troubles physiologiques liés au stress. En conclusion, ces résultats confirment les propriétés anxiolytiques et antistress de l’HTC, suggérant un mode d’action différent de celui des benzodiazépines. / Currently, the pharmacological care of anxiety- and stress-related disorders presents a limited efficacy, and then justifies the need for developing new treatments. In this context, the properties of a tryptic hydrolysate from bovine caseins (CTH) are of interest and remain to be clarified. For that, this work aimed in a first part to define the most sensitive conditions for detecting the effects of potent anxiolytic compounds in the well-known behavioural model of anxiety, the elevated plus-maze (EPM), and to develop both acute and chronic stress models able to modify anxiety- and depression-like behaviour in rat. In a second part, these models have been applied to the evaluation of the anxiolytic and antistress putative properties of CTH when orally administrated. The results indicated that 1) the anxiety level of rats tested in the plus-maze is related to methodological parameters (luminosity, closed wall type, extramaze space), and 2) the CTH shows in behavioural tests as the EPM and the conditioned defensive burying an anxiolytic activity that is different from diazepam used as a reference. The results also indicated that 1) the physiological and behavioural responses to an acute stress exposure depend on the model of stress (restraint or forced swim), and 2) the CTH reduces both stress induce responses. Finally, two models of chronic stress have been developed. The CTH has been tested only in one model that consists in submitting rats to chronic variable stresses.In these conditions, the CTH reduced the behavioural hyperactivity induced by the chronic stress exposure, but not the stress-related physiological alterations. In conclusion, this study confirms the anxiolytic and antistress properties of the CTH when orally administrated and suggests a mechanism of action that may be different from that of benzodiazepines.
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Stabilisation des émulsions laitières aux cours des traitements technologiques : action combinée des agrégats de protéines de lactosérum et des caséines. / Combined effect of whey protein aggregates and caseins on dairy emulsions stability during technological treatments.Chevallier, Marie 10 March 2017 (has links)
Les émulsions laitières sont des systèmes thermodynamiquement instables qui doivent résister aux contraintes technologiques (chauffage, congélation) appliquées lors de leur fabrication ou usage. Les émulsions riches en protéines de lactosérum sont particulièrement sensibles et l’emploi d’additifs alimentaires est un moyen de ralentir leur déstabilisation. Dans l’objectif d’offrir des produits 100 % lait aux consommateurs, concevoir des émulsions, riches en protéines de lactosérum, sans additifs alimentaires et stables aux traitements technologiques, constitue un réel challenge. La stratégie employée dans ce projet de thèse a été de combiner les propriétés des agrégats de protéines de lactosérum et des caséines pour stabiliser des émulsions aux cours des traitements technologiques sur une large gamme de concentration.Des émulsions ont été préparées avec des agrégats de protéines de lactosérum de structure différente et avec différents ratios agrégats/caséines. Quelle que soit leur structure, la présence d’agrégats à la surface des globules gras déstabilise l’émulsion (gélification /séparation de phase) alors que dans la phase dispersante ceux-ci sont stables aux traitements technologiques. A l’inverse, les émulsions dont la surface des globules gras est recouverte de caséines sont très stables aux traitements technologiques. Ainsi, il est possible de moduler la stabilité des émulsions riches en protéines de lactosérum aux cours des traitements technologiques en exploitant les propriétés des agrégats et des caséines et en contrôlant leur répartition entre la surface des glo / Dairy emulsions are thermodynamically unstable systems, which have to be resistant to the technological treatments (heating, freezing/thawing) applied during their manufacture or use. Whey protein-rich emulsions are particularly sensitive to technological treatments and instabilities are currently tackled by the use of non-dairy additives. With aim to offer products that are more natural to consumers (additive-free), the preparation of whey protein-rich emulsions without additive and stable during technological treatments constitutes a major challenge for dairy companies. The strategy adopted during this thesis was to combine the properties of the whey proteins aggregates and caseins in order to stabilize emulsion during technological treatments in a large range of protein concentrationsEmulsions were prepared with various whey protein aggregates and various whey protein aggregates/caseins ratio. Whatever the whey protein aggregates, their presence at the fat droplet surface destabilize the emulsions (gelation/phase separation) whereas they are stable in the continuous phase of the emulsions during technological treatments. In contrast, emulsions are extremely stable during technological treatments when caseins fully cover the fat droplet surface. The results obtained highlighted the possibility of modulating the stability during technological treatments of whey protein-rich emulsions by combining the properties of the whey protein aggregates and the caseins and by controlling their repartition between the fat droplet surface and the continuous phase of the emulsion.
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DEVELOPPEMENT D'UN MODELE CELLULAIRE DE DECLENCHEMENT DE LA REACTION ALLERGIQUE. APPLICATIONS A L'ETUDE DES ALLERGENES DU LAIT ET DE L'ARACHIDE, ET EVALUATION DE L'EFFET DE TRAITEMENTS THERMIQUES SUR L'ALLERGENICITE DE Ara h 1.Blanc, Fany 27 November 2008 (has links) (PDF)
Les allergies alimentaires à l'arachide et au lait posent un problème majeur de santé publique, en particulier chez les enfants. Nous avons développé un modèle cellulaire de dégranulation, afin d'analyser si la liaison d'un allergène à ses IgE spécifiques, mesurée in vitro, a bien la capacité de déclencher la phase effectrice de la réaction allergique. Ce modèle repose sur l'utilisation de la lignée cellulaire RBL SX-38 développée par JP Kinet, mastocytes de rat immortalisés et modifiés pour exprimer le récepteur de haute affinité aux IgE humaines. Le développement de ce modèle pour son utilisation en microplaques de 96 puits a consisté notamment en l'optimisation de différents paramètres critiques pour la réalisation des 2 phases du test : la phase de sensibilisation des cellules par les IgE de patients allergiques et la phase de déclenchement par les allergènes auxquels le patient est sensibilisé. Ce modèle a permis de montrer l'importance des caséines et des albumines 2S (Ara h 2 et Ara h 6) dans cette étape clé de la réaction allergique au lait et à l'arachide, confirmant les observations sérologiques et cliniques disponibles. L'effet de traitements thermiques sur l'allergénicité d'un allergène majeur de l'arachide (Ara h 1), a été évalué dans le cadre du programme européen EuroPrevall. Les résultats obtenus montrent la diminution de la réactivité d'Ara h 1 après chauffage de la protéine isolée en solution. Par contre, la même protéine préparée et purifiée à partir d'arachide grillée présente une forte réactivité. Ces résultats suggèrent qu'un traitement à température élevée de la graine entraine une augmentation de l'allergénicité de Ara h 1 du fait de ses interactions avec les autres constituants de la graine. Le modèle cellulaire de dégranulation développé apparaît être un outil pertinent pour l'étude de la fonctionnalité biologique de l'interaction allergène-IgE, permettant une meilleure compréhension de la relation entre la structure d'une protéine alimentaire et son allergénicité, voire une évaluation du risque allergique des aliments ne nécessitant pas d'essais cliniques systématiques.
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Structuration des suspensions denses de caséines par les phosphates en présence de calcium : étude de leurs organisations et de leurs propriétés rhéologiques / Structuration of dense casein suspensions by phosphates in the presence of calcium : a study of their organization and rheological propertiesThomar, Peggy 21 January 2016 (has links)
Les caséines, les protéines les plus abondantes du lait, sont associées sous forme de micelle ayant un rayon moyen de 100nm, pontées par du phosphate de calcium colloïdal (CCP). Lorsque le CCP est retiré par précipitation acide, les micelles se désintègrent formant les caséinates de sodium (NaCas), des particules de 10nm. Les caséines sont très sensibles aux ions calcium et phosphate présents dans certains produits alimentaires qui constituent un levier important dans l’industrie laitière pour contrôler la texture. La viscosité des suspensions de NaCas augmente fortement lorsque la concentration en protéines augmente à cause du remplissage compact par les particules, mais décroît lorsque la température augmente car la fraction volumique efficace des particules diminue. Au-delà d’un ratio critique Ca2+/caséine, les interactions attractives mènent à la formation de microdomaines denses qui diminuent la solubilité et augmententla turbidité. Le phénomène est amplifié lorsque la température augmente et modifie les propriétés viscoélastiques des suspensions de NaCas. En large excès, les ions Na+ entraînent la dissociation des micro-domaines denses par compétition avec les ions Ca2+. Au-dessus de 0.2M de Na+, la viscosité augmente à cause de la déshydratation des protéines (salting-out). L’orthophosphate (Pi) se lie aux protéines en présence de calcium, ce qui conduit à la formation de complexes. En large excès, le Pi se lie directement au calcium et précipite forme de phosphate de calcium ou sous forme de complexes avec les protéines. Lorsque les micelles des caséines sont acidifiées au-dessus de pH 5,2, le phosphateet le calcium solubilisés interagissent avec les protéines lorsque la température augmente, ce qui conduit à une gélification. Cette étude a démontré combien la nature du phosphate et du calcium est fondamentale dans l’organisation des caséines en suspension dense. / In milk, caseins, the main proteins, are associated into a casein micelle (100nm) held together with colloidal calciumphosphate (CCP). When CCP is removed by acid precipitation into sodium caseinate (NaCas), the caseins reassemble into smaller particles, the so-called submicelles (10nm). Caseins are highly sensitive to calcium and phosphate ions,used in most applications. Challenge for dairy industry is to control the texture, mainly determined by protein interactions.The viscosity of dense NaCas suspensions strongly increased with increasing concentration due to jamming of the particles. Increasing the temperature led to a decrease of the viscosity as the effective volume fraction of the particles decreased. When a ratio of Ca2+ is bound by the casein, attractive interactions are introduced and led to the formation of dense micron sized particles that decreased solubility and increased the turbidity. The effect was stronger with increasingtemperature. The visco-elastic properties of NaCas suspensions were also modified. The same behaviour was observed for calcium caseinate suspensions if the ratio of Ca2+ per casein was equal. Large excess of Na+ led to dissociationof the dense protein domains formed by Ca2+ by competiton for specific binding sites of caseins. For increasing the Na+concentration above 0.2M the viscosity increased by decreased hydration of the protein. Orthophosphate (Pi) was bound to the caseins with Ca2+ leading to the formation of complexes. Large excess of Pi competed with Ca2+. The precipitation of the caseins and large calcium phosphate particles were formed. When casein micelles are acidified above pH 5.2, calcium and phosphate are solubilized and interact with casein leading to the formation of a gel. This study showed how calcium and phosphate of different origins are fundamental in the organization of caseins in dense suspensions.
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Étude protéomique de la microhétérogénéité des caséines [alpha]s1 et [bêta] équines : identification des variants transcriptionnels et de phosphorylation ; identification des sites phosphorylés de la caséine [bêta] / Proteomic study of the microheterogeneity of equine [alpha]s1 and [bêta] caseins : identification of post-transcriptional and phosphorylation variants ; identification of phosphorylated sites of [beta] caseinMateos, Aurélie 21 November 2008 (has links)
La caséine [bêta] (CN-[bêta]) et la caséine [alpha]s1 (CN-[alpha]s1) du lait de jument possèdent un taux variable de phosphorylation et sont de bons modèles d’étude de l’influence du degré de phosphorylation et de la séquence peptidique sur la chélation de caséinophosphopeptides (CPP) avec des minéraux d’intérêt nutritionnel. Avant d’envisager une telle étude, la structure des caséines doit être déterminée précisément. Notre travail a été consacré à la caractérisation de variants post-transcriptionnels et post-traductionnels de CN-[alpha]s1 et de CN-[bêta]. Après fractionnement chromatographique et analyse par spectrométrie de masse, la CN-[alpha]s1 entière, trois variants d’épissage alternatif des exons 7 et 14 de la CN-[alpha]s1 et quatre variants délétés du résidu Gln91, résultat de l’utilisation d’un site d’épissage cryptique, ont été identifiés dans le lait équin. Nous avons montré que le degré de phosphorylation de ces isoformes varie de 2 à 8 groupes phosphates. Au total, 36 isoformes différentes de CN-[alpha]s1 ont été caractérisées. La cartographie bidimensionnelle de la CN-[bêta] a été établie avec précision après avoir isolé par chromatographie chacun des variants de phosphorylation (possédant de 3 à 7 groupes phosphates) et après avoir caractérisé les formes de CN-[bêta] modifiées par désamidation non enzymatique du résidu Asn135. Des CPP trypsiques de chaque variant de phosphorylation ont été préparés avec une technique récente de chromatographie d’affinité au dioxyde de titane, ce qui a permis de localiser par spectrométrie de masse en tandem les sites phosphorylés de la CN-[bêta] (Ser9, Ser10, Thr12, Ser18, Ser23, Ser24, Ser25) et de montrer que la phosphorylation de la CN-[bêta] n’est pas aléatoire mais séquentielle / Equine [bêta]-casein ([bêta]-CN) and [alpha]s1-casein ([alpha]s1-CN) have a variable phosphorylation degree and are good models for the study of the influence of phosphorylation degree and peptide sequence on chelation of caseinophosphopeptides (CPP) with minerals of nutritional interest. Before considering such study, structure of caseins must be precisely determined. Our work has been devoted to the characterization of post-transcriptional and post-translational variants of [alpha]s1-CN and [bêta]-CN. Concerning [alpha]s1-CN, the full-length protein, three alternative splicing variants involving exons 7 and 14 and four variants involving cryptic splice site resulting in deletion of residue Gln91 have been identified in mare’s milk after chromatographic fractionation and mass spectrometric analysis. The phosphorylation degree of these variants varies between 2 and 8 phosphate groups. Finally, 36 isoforms of [alpha]s1-CN have been identified. Isolation of each phosphorylation variant (having 3 to 7 phosphate groups) of [bêta]-CN by chromatography, and characterization of modified forms of [bêta]-CN by non enzymatic deamidation of residue Asn135 permits the establishment of bidimensional cartography of [bêta]-CN with precision. After hydrolysis by trypsin, CPP of each phosphorylation variant have been prepared by affinity chromatography to titanium dioxide, a recent technology, which allowed to locate by mass tandem spectrometry the phosphorylated sites of [bêta]-CN (Ser9, Ser10, Thr12, Ser18, Ser23, Ser24, Ser25). It was shown that the phosphorylation of [bêta]-CN is not a random process but follows a sequential way
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Developpement d'un modèle cellulaire de déclenchement de la réaction allergique. Applicatins à l'étude des allergènes du lait et de l'arachide, et évaluation de l'effet de traitements thermiques sur l'allergenicite de Ara h 1.Blanc, Fanny 27 November 2008 (has links) (PDF)
Les allergies alimentaires à l'arachide et au lait posent un problème majeur de santé publique, en particulier chez les enfants. Nous avons développé un modèle cellulaire de dégranulation, afin d'analyser si la liaison d'un allergène à ses IgE spécifiques, mesurée in vitro, a bien la capacité de déclencher la phase effectrice de la réaction allergique. Ce modèle repose sur l'utilisation de la lignée cellulaire RBL SX-38 développée par JP Kinet, mastocytes de rat immortalisés et modifiés pour exprimer le récepteur de haute affinité aux IgE humaines. Le développement de ce modèle pour son utilisation en microplaques de 96 puits a consisté notamment en l'optimisation de différents paramètres critiques pour la réalisation des 2 phases du test : la phase de sensibilisation des cellules par les IgE de patients allergiques et la phase de déclenchement par les allergènes auxquels le patient est sensibilisé. Ce modèle a permis de montrer l'importance des caséines et des albumines 2S (Ara h 2 et Ara h 6) dans cette étape clé de la réaction allergique au lait et à l'arachide, confirmant les observations sérologiques et cliniques disponibles. L'effet de traitements thermiques sur l'allergénicité d'un allergène majeur de l'arachide (Ara h 1), a été évalué dans le cadre du programme européen EuroPrevall. Les résultats obtenus montrent la diminution de la réactivité d'Ara h 1 après chauffage de la protéine isolée en solution. Par contre, la même protéine préparée et purifiée à partir d'arachide grillée présente une forte réactivité. Ces résultats suggèrent qu'un traitement à température élevée de la graine entraine une augmentation de l'allergénicité de Ara h 1 du fait de ses interactions avec les autres constituants de la graine. Le modèle cellulaire de dégranulation développé apparaît être un outil pertinent pour l'étude de la fonctionnalité biologique de l'interaction allergène-IgE, permettant une meilleure compréhension de la relation entre la structure d'une protéine alimentaire et son allergénicité, voire une évaluation du risque allergique des aliments ne nécessitant pas d'essais cliniques systématiques.
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Influence de la présence et de la composition du microbiote intestinal sur le développement et la prévention des allergies alimentaires / Role of gut microbiota and its composition on the development of food allergiesMorin, Stéphanie 29 October 2012 (has links)
Le développement de l’allergie peut être influencé par le microbiote intestinal qui est impliqué dans la maturation du système immunitaire de l’hôte lors de la colonisation du tractus digestif dès la naissance. L’objectif de mon travail a été d’étudier l’impact du microbiote intestinal sur le développement d’une sensibilisation allergique à des protéines de lait de vache à l’aide d’un modèle de souris BALB/c gnotoxéniques. Dans une première étude, nous avons montré que les souris axéniques (Ax, sans germe) sont plus réactives que les souris conventionnelles (CV) au potentiel immunogénique et allergénique de la β-lactoglobuline (BLG) et de la caséine (CAS), lorsque ces deux protéines sont injectées intrapéritonéalement sans adjuvant. A l’aide d’un autre modèle de sensibilisation par voie orale au lait, nous avons confirmé que les souris Ax développent des réponses IgE contre la BLG plus fortes que celles des souris CV. Les mécanismes de sensibilisation contre la BLG et la CAS sont alors différemment affectés par la présence ou non d’un microbiote intestinal. Par ailleurs, une colonisation tardive du tractus digestif de souris Ax à l’âge de 6 semaines par le microbiote de souris CV induit chez les souris conventionnalisées (CVd) le développement, après sensibilisation, de réponses humorales toujours plus fortes que celles observées chez les souris CV. A l’inverse, une conventionnalisation des souris Ax au moment du sevrage à l’âge de 3 semaines, induit un niveau de sensibilisation plus faible que celui des souris CV. Dans ce cas, des différences de composition du microbiote intestinal entre souris CV et CVd pourraient jouer un rôle dans le faible niveau de sensibilisation des souris CVd. Nous avons enfin évalué l’impact de l’implantation dès la naissance d’une souche de Lactobacillus casei en monoxénie (souris Mx). La réponse humorale contre la CAS, mais pas contre la BLG, est alors significativement plus élevée chez les souris Mx que chez les souris Ax. Ces différentes études suggèrent que l’influence du microbiote sur le développement d’une sensibilisation aux protéines du lait de vache diffère selon les allergènes et selon le mode d’exposition aux allergènes. Ces résultats soulignent également qu’un retard de colonisation du tractus digestif peut perturber durablement la réactivité du système immunitaire à une sensibilisation contre des antigènes alimentaires. / The development of allergic responses can be influenced by the gut microbiota, which critically stimulates the maturation of the host immune system during colonization of the digestive tract at birth. We thus aimed to study the impact of the gut microbiota on the development of an allergic sensitization to cow's milk proteins by using a gnotobiotic BALB/c mouse model. First, we showed that germ-free (GF) mice are more responsive than conventional mice (CV) to the immunogenic and allergenic potential of β-lactoglobulin (BLG) and casein (CAS) when these proteins are injected intraperitoneally without adjuvant. With another model of oral sensitization to cow’s milk, the development of higher BLG-specific IgE responses in GF mice compared to CV mice was confirmed. We also observed that the mechanisms leading to oral sensitization to BLG and CAS are differentially affected by the absence of gut microbiota. Furthermore, a delayed colonization of the digestive tract of 6-week-old GF mice by a conventional microbiota was studied. The conventionalized mice (CVd) still developed, after sensitization, higher antibody responses than those measured in CV mice. In contrast, GF mice conventionnalized just after weaning, at 3 week of age, displayed a level of sensitization lower than that of CV mice. Differences in the gut microbiota composition evidenced between CVd and CV mice could also play a role in the lower level of sensitization of CVd mice. Finally, we evaluated the impact of the neonatal mono-colonization of mice by a strain of Lactobacillus casei. The antibody responses against CAS, but not against BLG, were then significantly higher in mono-associated mice than in GF mice. These studies suggest that the influence of microbiota on the development of sensitization to cow's milk proteins depends on the nature of the allergens and the mode of exposure. These results also underline that delayed bacterial colonization altered persistently the host immune response to oral sensitization against food antigens.
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Exploring the fine composition of Camelus milk from Kazakhstan with emphasis on protein components / Analyse de la composition fine du lait des Camelidés du Kazakhstan en ciblant plus spécifiquement la fraction protéiqueRyskaliyeva, Alma 12 July 2018 (has links)
La présente étude visait à identifier, en explorant la fraction protéique des laits de camélidés provenant de plusieurs régions du Kazakhstan, des molécules originales (peptides, protéines) potentiellement responsables des propriétés attribuées au lait de chamelle. Près de 180 échantillons de lait de 2 espèces de camélidés (Camelus bactrianus, C. dromedarius et leurs hybrides) ont été collectés à différents stades de lactation, âge et nombre de vêlages, et soumis à différentes techniques analytiques et approches protéomiques (SDS-PAGE, LC-MS/MS et LC-ESI-MS). Cinquante molécules protéiques correspondant à des variants génétiques, des isoformes issues de modifications post-traductionnelles et d'épissages différentiels, appartenant à 9 familles de protéines (κ-, αs1-, αs2-, β- et γ-CN, WAP, α-LAC, PGRP, CSA / LPO) ont été caractérisées. L’existence de deux isoformes inconnues (i1 et i2) de la caséine αs2 a été observée dans les deux esèces. Ces isoformes sont des variants d'épissage consécutif pour l’un à l’intégration d'une séquence de 27 nucléotides « in frame », codant pour le nonapeptide ENSKKTVDM, dont la présence a été confirmée au niveau génomique, flanquée de motifs canoniques définissant une structure exonique. La seconde isoforme, présente à différents niveaux de phosphorylation compris entre 8P et 12P, comporte un décapeptide supplémentaire (VKAYQIIPNL), révélé par LC-MS/MS, codé par une extension 3 'de l'exon 16. En outre, nous rapportons, pour la première fois à notre connaissance, l’existence d'une isoforme de phosphorylation de la caséine αs2 présentant au moins un résidu S/T phosphorylé n’appartenant pas à la séquence canonique habituelle (S/T-X-A) reconnue par la kinase mammaire, suggérant ainsi l'existence de deux systèmes impliqués dans la phosphorylation des caséines, dans la glande mammaire.S’agissant de la WAP, nous avons identifié chez C. bactrianus un nouveau variant génétique (B), issue d'une transition G => A conduisant à un changement de codon (GTG/ATG) dans la séquence nucléotidique de l’ARNm, qui entraine un changement d’acide aminé en position 12 de la protéine mature (V12M). Un variant résultant de l’usage du site d'épissage canonique, reconnu comme tel chez les autres mammifères exprimant la WAP dans leur lait, a été identifié. La forme majoritaire de la WAP cameline, décrite pour la première fois par Beg et al. (1986) qui présente une insertion de 4 résidus d'acides aminés (56VSSP59) dans le segment peptidique reliant les deux domaines 4-DSC, résulte de l'utilisation d'un site d'épissage cryptique intronique improbable, prolongeant l'exon 3 du gène de 12 nucléotides sur son extrémité 5 '. De plus, nous confirmons que chez les camélidés, l'intron 3 du gène spécifiant la WAP, est un intron rare de type GC-AG, avec un site donneur faible qui s’accompagne d’un effet compensatoire au site consensus de l'exon accepteur.Finalement, en utilisant un protocole optimisé, nous avons isolé les vésicules extracellulaires (VE) dérivés du lait de camélidés présentant les caractéristiques morphologiques, de taille et de contenu en protéines des exosomes. Nous avons identifié un millier de protéines différentes représentant le premier protéome des VE dérivés du lait de chamelle qui semble plus étendu que le protéome du lait de chamelle, incluant notamment les marqueurs associés aux VEs, tels CD63, CD81, HSP70, HSP90, TSG101 et ADAM10. Nous avons également identifié des protéines présentes dans d'autres compartiments du lait. C'est notamment le cas pour les protéines apparentées à Ras, MFG-E8, ou CD9 qui sont également présentes dans les globules gras du lait. Nos résultats suggèrent par ailleurs fortement que les VEs dérivés du lait de chamelle ont des origines cellulaires différentes. / The present study aimed to identify, in exploring the protein fraction of camelid milks from several regions of Kazakhstan, original molecules (peptide, proteins) potentially responsible for the properties attributed to camel milk. Nearly 180 milk samples from two camel species (Camelus bactrianus and C. dromedarius, and their hybrids) we collected at different lactation stage, age and calving number, and submitted to different proven analytical techniques and proteomic approaches (SDS-PAGE, LC-MS/MS and LC-ESI-MS). A detailed characterization of 50 protein molecules, relating to genetic variants, isoforms arising from post-translational modifications and alternative splicing events, belonging to 9 protein families (κ-, αs1-, αs2-, β-; and γ-CN, WAP, α-LAC, PGRP, CSA/LPO) was achieved. We reported the occurrence of two unknown isoforms (i1 and i2) of camel αs2-CN arising from alternative splicing events. Using cDNA-sequencing, i1 was characterized as a splicing-in variant of an in-frame 27-nucleotide sequence, of which the presence at the genome level, flanked by canonic motifs defining an exon 13 encoding the nonapeptide ENSKKTVDM, was confirmed. Isoform i2, which appeared to be present at different phosphorylation levels ranging between 8P and 12P, was shown to include an additional decapeptide (VKAYQIIPNL), revealed by LC-MS/MS, encoded by a 3’-extension of exon 16. In addition, we reported, for the first time to our knowledge, the occurrence of a αs2-CN phosphorylation isoform with at least one phosphorylated S/T residue that does not match with the usual canonic sequence (S/T-X-A) recognized by the mammary kinase, suggesting thereby the existence of two kinase systems involved in the phosphorylation of caseins in the mammary gland.As far as camel WAP is concerned, we identified in C. bactrianus a new genetic variant (B), originating from a transition G => A, leading to a codon change (GTG/ATG) in the nucleotide sequence of cDNA, which modifies a single amino acid residue at position 12 of the mature protein (V12M). In addition, we describe the existence of a splicing variant of camel WAP, arising from an alternative usage of the canonical splice site recognized as such in the other mammalian species expressing WAP in their milk. We also report that the WAP isoform predominantly present in camelids milk, first described by Beg et al. (1986) as displaying an additional sequence of 4 amino acid residues (56VSSP59) in the peptide segment connecting the two 4-DSC domains, results from the usage of an unlikely intron cryptic splice site, extending camel exon 3 on its 5’ side by 12-nucleotides. In addition, we confirm that in the camel gene encoding WAP, intron 3 is a GC-AG intron, with a GC donor site showing a compensatory effect in terms of a dramatic increase in consensus at the acceptor exon position.Finally, using an optimized protocol, we isolated camel milk-derived EVs satisfiying the typical requirements for exosomal morphology, size and protein content. We identified a thousand of different proteins representing the first comprehensive proteome of camel milk-derived EVs that appears wider than camel milk proteome, including markers associated with small extracellular vesicles, such as CD63, CD81, HSP70, HSP90, TSG101 and ADAM10. We also identified proteins present in other milk components. This is particularly the case for lactadherin/MFG-E8, Ras-related proteins or CD9 that have been reported to occur in MFG. Our results strongly suggest that milk-derived exosomes have different cellular origin.
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Développement d'une nouvelle stratégie d'encapsulation de molécules bioactives hydrophobes basée sur la dynamique des micelles de caséines / Novel encapsulation strategy for hydrophobic bioactives based on casein micelle dynamicsBahri-Hammami, Asma 19 June 2017 (has links)
De nombreux composés bioactifs hydrophobes sont actuellement mis en avant en raison de leurs propriétés nutritionnelles et fonctionnelles. Une attention particulière est, en conséquence, portée à leur incorporation en tant qu'ingrédients dans des aliments fonctionnels. Cependant, la majorité de ces composés bioactifs sont caractérisés par une faible solubilité en milieu aqueux, une dégradation au cours des procédés de transformation ainsi qu'une absorption limitée au niveau du tractus gastro-intestinal. La micelle de caséines, grâce à ses propriétés fonctionnelles uniques, peut être considérée comme un support d’encapsulation naturel pour ces molécules bioactives hydrophobes. En effet, une des originalités de cette suprastructure est sa dynamique dans le lait se caractérisant par des échanges réversibles de protéines et de minéraux entre le sérum et la structure micellaire interne en fonction des conditions physicochimiques, et notamment avec la température. En particulier, un stockage du lait à 4°C permet la dissociation sélective de la caséine β de la phase micellaire vers la phase soluble et un retour à température ambiante permet sa réintégration. L’objectif de cette thèse est de développer une nouvelle stratégie d’encapsulation de molécules bioactives hydrophobes dans les micelles de caséines via cette dynamique de la caséine β. Dans un premier temps, l’optimisation de la dissociation de la caséine β de la micelle de caséines a été réalisée en modifiant la température et le pH, tout en portant une attention particulière au maintien de l’intégrité des micelles déplétées en caséines β. Un procédé de séparation physique de la caséine β solubilisée a été optimisé par microfiltration à l’échelle pilote. Une étude de la concentration micellaire critique de la caséine β a permis de vérifier son état monomérique à l’issue de cette séparation. Une étude de la cinétique d’interaction entre la caséine β monomérique et deux composés bioactifs hydrophobes, la curcumine et la vitamine D3, a ensuite été réalisée par résonance plasmonique de surface et par spectroscopie de fluorescence. La curcumine a été choisie pour la suite de l’étude au vu de sa bonne affinité pour la caséine β. Le complexe caséine β monomérique-curcumine a ensuite été encapsulé dans des micelles de caséines préalablement déplétées en caséines β. Les résultats de ces travaux montrent l’efficacité de cette stratégie d’encapsulation qui peut présenter un intérêt particulier pour la vectorisation de molécules bioactives hydrophobes afin d’assurer leur protection dans des produits laitiers pauvres en matière grasse.De plus, au cours de ce projet, une méthode de caractérisation des propriétés morphologiques et nano-mécaniques des micelles de caséines par microscopie à force atomique en milieu liquide a été développée. Cette méthode représente un outil intéressant de compréhension de la structure micellaire dans son environnement natif et offre la possibilité d’évaluer l’impact de certaines modifications sur les propriétés de la micelle de caséines, comme sa déplétion en caséine β ou sa réticulation. / In the last years, the number of studies highlighting the nutritional and functional properties of several hydrophobic bioactives has markedly increased. Special attention is consequently paid to their addition as ingredients to food. However, most of these hydrophobic compounds display a low aqueous solubility, poor stability during processing and low absorption in the gastrointestinal tract. Casein micelles exhibiting unique set of properties can be considered as a natural nanocarrier for these molecules. Actually, changes in environmental factors namely pH and temperature induce the dissociation of caseins and minerals from the colloidal phase to the soluble phase. Particularly, a selective dissociation of β-casein occurs at low temperatures. This effect is reversed with an increase in temperature, with a transfer of β-casein from the serum to the micelles when equilibrated at room temperature. The aim of this study is to develop a novel encapsulation strategy to incorporate hydrophobic bioactive compounds into casein micelles using the β-casein reversible dissociation. First, the β-casein dissociation from casein micelles was optimized by temperature and pH modifications while preserving the integrity of the β-casein depleted casein micelles. The separation of dissociated β-caseins from casein micelles was carried out by microfiltration at a pilot scale. The β-casein critical micelle concentration was concurrently evaluated to ensure the monomeric state of -casein after separation. Secondly, the binding kinetic between monomeric β-casein and two hydrophobic compounds, curcumin and vitamin D3, was investigated by surface plasmon resonance and fluorescence spectroscopy. Curcumin was then selected thanks to its high affinity to -casein β. The complex monomeric β-casein – curcumin was encapsulated in β-casein depleted casein micelles. The results of this study show the efficiency of this encapsulation strategy of hydrophobic bioactive compounds, which could be used to protect such molecules in low fat dairy products.Besides, during this project, a novel strategy was developed in order to evaluate the casein micelle topography and nanomechanical properties by atomic force microscopy in liquid environment. This method opens a new line of investigation to better understand the casein micelle structure in its native environment but also investigate the impact induced by the modification of physico-chemical conditions on its topography and elastic properties.
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Influence de la présence et de la composition du microbiote intestinal sur le développement et la prévention des allergies alimentairesMorin, Stéphanie 29 October 2012 (has links) (PDF)
Le développement de l'allergie peut être influencé par le microbiote intestinal qui est impliqué dans la maturation du système immunitaire de l'hôte lors de la colonisation du tractus digestif dès la naissance. L'objectif de mon travail a été d'étudier l'impact du microbiote intestinal sur le développement d'une sensibilisation allergique à des protéines de lait de vache à l'aide d'un modèle de souris BALB/c gnotoxéniques. Dans une première étude, nous avons montré que les souris axéniques (Ax, sans germe) sont plus réactives que les souris conventionnelles (CV) au potentiel immunogénique et allergénique de la β-lactoglobuline (BLG) et de la caséine (CAS), lorsque ces deux protéines sont injectées intrapéritonéalement sans adjuvant. A l'aide d'un autre modèle de sensibilisation par voie orale au lait, nous avons confirmé que les souris Ax développent des réponses IgE contre la BLG plus fortes que celles des souris CV. Les mécanismes de sensibilisation contre la BLG et la CAS sont alors différemment affectés par la présence ou non d'un microbiote intestinal. Par ailleurs, une colonisation tardive du tractus digestif de souris Ax à l'âge de 6 semaines par le microbiote de souris CV induit chez les souris conventionnalisées (CVd) le développement, après sensibilisation, de réponses humorales toujours plus fortes que celles observées chez les souris CV. A l'inverse, une conventionnalisation des souris Ax au moment du sevrage à l'âge de 3 semaines, induit un niveau de sensibilisation plus faible que celui des souris CV. Dans ce cas, des différences de composition du microbiote intestinal entre souris CV et CVd pourraient jouer un rôle dans le faible niveau de sensibilisation des souris CVd. Nous avons enfin évalué l'impact de l'implantation dès la naissance d'une souche de Lactobacillus casei en monoxénie (souris Mx). La réponse humorale contre la CAS, mais pas contre la BLG, est alors significativement plus élevée chez les souris Mx que chez les souris Ax. Ces différentes études suggèrent que l'influence du microbiote sur le développement d'une sensibilisation aux protéines du lait de vache diffère selon les allergènes et selon le mode d'exposition aux allergènes. Ces résultats soulignent également qu'un retard de colonisation du tractus digestif peut perturber durablement la réactivité du système immunitaire à une sensibilisation contre des antigènes alimentaires.
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