A catepsina L é uma cisteína proteinase da família da papaína (clã CA, família C1), sendo esta família a mais conhecida entre as cisteína proteinase. A catepsina L, como outras proteinases da família C1, é sintetizada como uma pró-enzima inativa que é ativada através da remoção do pró-peptídeo. Os pró-peptídeos das catepsinas da subfamília catepsina L apresentam um motivo consenso, denominado motivo ERFNIN. A catepsina L corresponde a principal proteinase digestiva em Tenebrio molitor. No nosso laboratório 3 pró-catepsinas L (pCALs) foram clonadas e seqüenciadas a partir de uma biblioteca de cDNA de intestino médio de larvas de T. molitor: pCAL1 (CAL lisossomal), pCAL2 e pCAL3 (enzimas digestivas). Estas proteinases apresentam o motivo ERFNIN e os resíduos envolvidos na catálise: Cys25, His169, e Asn175 com Gln19 (numeração da papaína). Neste trabalho descrevemos a clonagem em vetores de expressão e a expressão em bactérias das sequências codificadoras de pCAL1, pCAL2 e pCAL3. As pró-catepsinas L recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade e a incubação em pH ácido resultou na formação das enzimas maduras CAL1, CAL2 e CAL3 com atividade sobre o substrato Z-FR-MCA. O anticorpo policlonal anti-pCAL2 foi produzido em coelho e reconheceu pCAL2 e CAL2 em immunoblots. Experimentos de immunoblots com diferentes tecidos de T. molitor mostraram que o anticorpo policlonal anti-pCAL3 reconheceu pCAL3 e CAL3 nos dois terços anteriores do intestino médio de larvas de T. molitor. Estudos de imunocitolocalização indicam que a catepsina L 3 ocorre em vesículas no intestino médio anterior e em microvilosidades no intestino médio posterior. Para os experimentos de cristalização, nós expressamos pCAL1, pCAL2 e pCAL3 como mutantes Cys25→Ser inativos. pCAL3Cys26Ser foi cristalizada por difusão de vapor (gota sentada) contra 0,1-1,6M de dihidrogênio fosfato de amônio. Os cristais são monoclínicos com grupo espacial C2 e parâmetros de célula: a=57,634 Å, b=89,322 Å, c=70,076 Å, α=γ=90°, β=92,502° e uma molécula na unidade assimétrica. A e strutura foi determinada por substituição molecular usando a estrutura de Fasciola hepatica (42% de identidade) como modelo. O modelo foi refinado a 2,1 Å com fator R final de 16,19% (Rfree=20,5%). pCAL2Cys25Ser foi cristalizada por difusão de vapor (gota sentada) contra acetato de sódio 0,2M, cacodilato de sódio 0,1M pH6,6-6,7 e 20% de PEG 8000. Os cristais são triclínicos com grupo espacial P1 e parâmetros de célula: a=51,669 Å, b=52,37 Å, c=59,716 Å, α= 91,278°, γ=109,586°, β=91,547° e duas moléculas na unidade assimétrica. A estrutura foi determinada por substituição molecular usando a estrutura da pCAL3 (44% de identidade) como modelo. O modelo foi refinado a 2,0 Å com fator R final de 17,61% (Rfree=22,48%). A estrutura terciária da pró-catepsinas L digestivas é muito similar as estruturas de cisteína proteinases da família da papaína / Cathepsin L is a cysteine proteinase of the papain family (clan CA, family C1), which is the most known among the cysteine proteinases. Cathepsin L, like other proteinases of family C1, is synthesized as an inactive proenzyme that is activated by propeptide removal. The propeptide of cathepsin L-like subfamily contain a highly conserved motif, the so called ERFNIN motif. Cathepsin L corresponds to the major digestive proteinase in Tenebrio molitor. In our laboratory, 3 procathepsins L (pCALs) were cloned and sequenced from a cDNA library prepared from T. molitor larval midguts: pCAL1 (lysosomal CAL), pCAL2 and pCAL3 (digestive enzymes). These proteinases have ERFNIN motif and 3 residues directly involved in catalysis: Cys25, His169, Asn175 with Gln19 (papain numbering). In this work we report the cloning into the expression vector and bacterial expression of the sequences coding pCAL1, pCAL2 and pCAL3. The recombinant procathepsins L were purified by affinity chromatography and activation of these enzymes occurs under acidic conditions. The cathepsins L (CAL1, CAL2 and CAL3) were able to hydrolyse Z-FR-MCA. The polyclonal antibody anti-pCAL2 was produced in rabbit and recognized pCAL2 and CAL2 on immunoblots. Immunoblot analyses of different T. molitor larval tissues demonstrated that the polyclonal antibody anti-pCAL3 recognised pCAL3 and CAL3 in the anterior two-thirds of midgut tissue of T. molitor larvae. Immunolocalization studies indicate that cathepsin L 3 occurs in vesicles in the anterior midgut and microvilli in posterior midgut. To crystallographic studies we expressed pCAL1, pCAL2 and pCAL3 as inactive Cys25→Ser mutants. pCAL3Cys26Ser was crystallized by vapor diffusion in sitting drops against 0.1-1.6 M mono-ammonium dihydrogen phosphate. The crystals are monoclinic, belonging to space group C2, with cell parameters: a = 57.634 Å, b = 89.322 Å, c = 70.076 Å, α = γ =90°, β = 92.502° and contain one molecule in the asymmetric unit. The structure was determined by molecular replacement using the structure of Fasciola hepatica procathepsin L (42.5% identity) as a model. The model was refined at 2.1 Å resolution with an R factor of 16.19% (Rfree = 20.5%). pCAL2Cys25Ser was crystallized by vapor diffusion in sitting drops against 0.2M sodium acetate, 0.1M sodium cacodylate pH 6.6-6.7 and 20% polyethylene glycol 8,000. The crystals are triclinic, belonging to space group P1, with cell parameters: a = 51.669 Å, b = 52.37 Å, c = 59.716 Å, α = 91.278° γ = 109.586°, β = 91.547° and contain two molecules in the asymmetric unit. The structure was determined by molecular replacement using the structure of procathepsin L 3 (44 % identity) as a model. The model was refined at 2.0 Å resolution with an R factor of 17.61% (Rfree = 22.48%). The tertiary structure ofdigestive procathepsins L is very similar to papain-like cysteine proteinases structures

A catepsina L é uma cisteína proteinase da família da papaína (clã CA, família C1), sendo esta família a mais conhecida entre as cisteína proteinase. A catepsina L, como outras proteinases da família C1, é sintetizada como uma pró-enzima inativa que é ativada através da remoção do pró-peptídeo. Os pró-peptídeos das catepsinas da subfamília catepsina L apresentam um motivo consenso, denominado motivo ERFNIN. A catepsina L corresponde a principal proteinase digestiva em Tenebrio molitor. No nosso laboratório 3 pró-catepsinas L (pCALs) foram clonadas e seqüenciadas a partir de uma biblioteca de cDNA de intestino médio de larvas de T. molitor: pCAL1 (CAL lisossomal), pCAL2 e pCAL3 (enzimas digestivas). Estas proteinases apresentam o motivo ERFNIN e os resíduos envolvidos na catálise: Cys25, His169, e Asn175 com Gln19 (numeração da papaína). Neste trabalho descrevemos a clonagem em vetores de expressão e a expressão em bactérias das sequências codificadoras de pCAL1, pCAL2 e pCAL3. As pró-catepsinas L recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade e a incubação em pH ácido resultou na formação das enzimas maduras CAL1, CAL2 e CAL3 com atividade sobre o substrato Z-FR-MCA. O anticorpo policlonal anti-pCAL2 foi produzido em coelho e reconheceu pCAL2 e CAL2 em immunoblots. Experimentos de immunoblots com diferentes tecidos de T. molitor mostraram que o anticorpo policlonal anti-pCAL3 reconheceu pCAL3 e CAL3 nos dois terços anteriores do intestino médio de larvas de T. molitor. Estudos de imunocitolocalização indicam que a catepsina L 3 ocorre em vesículas no intestino médio anterior e em microvilosidades no intestino médio posterior. Para os experimentos de cristalização, nós expressamos pCAL1, pCAL2 e pCAL3 como mutantes Cys25→Ser inativos. pCAL3Cys26Ser foi cristalizada por difusão de vapor (gota sentada) contra 0,1-1,6M de dihidrogênio fosfato de amônio. Os cristais são monoclínicos com grupo espacial C2 e parâmetros de célula: a=57,634 Å, b=89,322 Å, c=70,076 Å, α=γ=90°, β=92,502° e uma molécula na unidade assimétrica. A e strutura foi determinada por substituição molecular usando a estrutura de Fasciola hepatica (42% de identidade) como modelo. O modelo foi refinado a 2,1 Å com fator R final de 16,19% (Rfree=20,5%). pCAL2Cys25Ser foi cristalizada por difusão de vapor (gota sentada) contra acetato de sódio 0,2M, cacodilato de sódio 0,1M pH6,6-6,7 e 20% de PEG 8000. Os cristais são triclínicos com grupo espacial P1 e parâmetros de célula: a=51,669 Å, b=52,37 Å, c=59,716 Å, α= 91,278°, γ=109,586°, β=91,547° e duas moléculas na unidade assimétrica. A estrutura foi determinada por substituição molecular usando a estrutura da pCAL3 (44% de identidade) como modelo. O modelo foi refinado a 2,0 Å com fator R final de 17,61% (Rfree=22,48%). A estrutura terciária da pró-catepsinas L digestivas é muito similar as estruturas de cisteína proteinases da família da papaína / Cathepsin L is a cysteine proteinase of the papain family (clan CA, family C1), which is the most known among the cysteine proteinases. Cathepsin L, like other proteinases of family C1, is synthesized as an inactive proenzyme that is activated by propeptide removal. The propeptide of cathepsin L-like subfamily contain a highly conserved motif, the so called ERFNIN motif. Cathepsin L corresponds to the major digestive proteinase in Tenebrio molitor. In our laboratory, 3 procathepsins L (pCALs) were cloned and sequenced from a cDNA library prepared from T. molitor larval midguts: pCAL1 (lysosomal CAL), pCAL2 and pCAL3 (digestive enzymes). These proteinases have ERFNIN motif and 3 residues directly involved in catalysis: Cys25, His169, Asn175 with Gln19 (papain numbering). In this work we report the cloning into the expression vector and bacterial expression of the sequences coding pCAL1, pCAL2 and pCAL3. The recombinant procathepsins L were purified by affinity chromatography and activation of these enzymes occurs under acidic conditions. The cathepsins L (CAL1, CAL2 and CAL3) were able to hydrolyse Z-FR-MCA. The polyclonal antibody anti-pCAL2 was produced in rabbit and recognized pCAL2 and CAL2 on immunoblots. Immunoblot analyses of different T. molitor larval tissues demonstrated that the polyclonal antibody anti-pCAL3 recognised pCAL3 and CAL3 in the anterior two-thirds of midgut tissue of T. molitor larvae. Immunolocalization studies indicate that cathepsin L 3 occurs in vesicles in the anterior midgut and microvilli in posterior midgut. To crystallographic studies we expressed pCAL1, pCAL2 and pCAL3 as inactive Cys25→Ser mutants. pCAL3Cys26Ser was crystallized by vapor diffusion in sitting drops against 0.1-1.6 M mono-ammonium dihydrogen phosphate. The crystals are monoclinic, belonging to space group C2, with cell parameters: a = 57.634 Å, b = 89.322 Å, c = 70.076 Å, α = γ =90°, β = 92.502° and contain one molecule in the asymmetric unit. The structure was determined by molecular replacement using the structure of Fasciola hepatica procathepsin L (42.5% identity) as a model. The model was refined at 2.1 Å resolution with an R factor of 16.19% (Rfree = 20.5%). pCAL2Cys25Ser was crystallized by vapor diffusion in sitting drops against 0.2M sodium acetate, 0.1M sodium cacodylate pH 6.6-6.7 and 20% polyethylene glycol 8,000. The crystals are triclinic, belonging to space group P1, with cell parameters: a = 51.669 Å, b = 52.37 Å, c = 59.716 Å, α = 91.278° γ = 109.586°, β = 91.547° and contain two molecules in the asymmetric unit. The structure was determined by molecular replacement using the structure of procathepsin L 3 (44 % identity) as a model. The model was refined at 2.0 Å resolution with an R factor of 17.61% (Rfree = 22.48%). The tertiary structure ofdigestive procathepsins L is very similar to papain-like cysteine proteinases structures

A partir da identificação de catepsinas L em ensaios in vitro e em zimogramas partimos para purificação desta enzima no inseto. A região V2 foi selecionada como fonte de obtenção da cisteína proteinase já que dentre os três ventrículos o segundo apresentou maior atividade específica. Após diversas tentativas de isolar esta proteinase, foi estabelecida uma marcha de purificação que envolvia em todas as etapas a participação de metil metanosulfonato (MMTS), o que inativa a proteinase evitando assim autólise ao longo do processo de purificação. A marcha consistiu de três passos cromatográficos (troca-iônica, filtração em gel e afinidade, nesta ordem) onde foi observada a presença de duas cisteína proteinases, cada uma apresentando respectivamente as seguintes massas moleculares 32 e 45 kDa (SDSPAGE). As duas cisteína proteinases possuem o mesmo pH ótimo igual a 6,3. Além disso, estas enzimas foram termicamente inativadas a 40 ºC segundo uma cinética de primeira ordem aparente, sugerindo a existência de apenas uma espécie molecular de cada enzima na preparação com meia vida de 5 minutos para cis 1 e 4,8 minutos para cis 2. Foi determinada a constante de dissociação entre enzimainibidor, onde foi observado os valores de 17,3 nM para cis 1 e 7,11 nM para cis 2 através da titulação por E-64. A eficiência de catálise cis 1 e cis 2 é maior para o substrato sintético Z-FR-MCA do que para Z-RR-MCA, indicando que tratava-se de catepsinas L. Com o intuito de descrever os mecanismos moleculares por trás dos fenômenos fisiológicos no intestino médio do Hemiptera Dysdercus peruvianus foi construída uma biblioteca de cDNA a partir de mRNA deste tecido. Utilizamos ESTs provenientes desta biblioteca com o objetivo de identificar genes transcritos relacionados com proteínas de transporte de glicose além de enzimas digestivas. Após o processamento das leituras, surgiram 1053 ESTs úteis. Montando estes ESTs por alinhamento de bases, foram produzidos 62 contíguos e 841 singletos, o que totaliza 903 seqüências únicas. Entre as seqüências homólogas encontradas as mais relevantes para o nosso estudo foram: β-glicosidase (marcadora de membranas microvilares), α-glicosidase (marcadora de membranas 8 perimicrovilares), aminopeptidase (espaço perimicrovilar), catepsina L (conteúdo de vesículas secretoras) e proteína transportadora de açúcar do tipo GLUT. Estas seqüências encontradas tiveram a sua transcrição específica (ou preferencial) averiguada por RT-PCR semiquantitativo nos diferentes tecidos do inseto estudado (intestino médio, túbulo de Malpighi, corpo gorduroso, glândula salivar, ventrículo 1, ventrículo 2 e ventrículo 3 do intestino médio). O transporte de glicose e água in vivo foi estudado. Para isso, os insetos foram alimentados com uma solução contendo glicose e corante não absorvível seguido de dissecação e análise do conteúdo luminal. O transporte de água e glicose foi inibido por floretina 0,2 mM (inibidor do uniportador GLUT) e por florizina 0,1 mM (inibidor do simportador SGLT) e ativado por K2SO4 50 mM. Isto sugere a presença do transportador do tipo uniportador (GLUT), e do simportador K+-glicose (SGLT), ambos co-transportando água. O transcriptoma revelou proteína homóloga a transportador GLUT cuja seqüência está parcialmente completa e foi analisada com ferramentas de bioinformática / After identification of cathepsins L in vitro assays and in zimograms we began to purify this enzyme in insect midgut. The region V2 was selected as a source of material for purifying a cysteine proteinase because it contains most of the activity of that proteinase. After several attempts to purify this proteinase, an effective process was developed that avoid autolysis with methyl methanethiosulfonate (MMTS), a sulfhydryl-reactive and reversible sulfonating reagent for thiol-containing molecules. The purify process was made by three chromatographic steps (anion-exchange column, gel filtration column and affinity column in this order), where two cysteine proteinase were purified, cys 1 and cys 2 with 32 and 45 kDa (SDS-PAGE). The two cysteine proteinases have the same pH optimum of 6.3. Besides that, these enzymes were thermicaly inactivated following apparent first-order kinetics with a half-life of 5 min (cys1) and 4.8 min (cys2) at 40 ºC. Both Cys are inhibited by E-64 with a KD of 17.3 nM (Cys 1) and 7.11 nM (Cys2). Both Cys are more active on Z-FR-MCA than on Z-RR-MCA, suggesting they are cathepsins-L. With purpose of describe the molecular mechanisms underlying physiological phenomena in midgut of the Hemiptera Dysdercus peruvianus a cDNA library was prepared from midgut mRNA. We used ESTs from this library to identify transcripts genes related with glucose transport proteins besides digestive enzymes. Analysis of 1053 high-quality expressed sequence tags (ESTs) yielded 903 unique sequences comprised of 62 contigs and 841 singlets. Among the homologous sequences found the following are more relevant to our aim: β-glucosidase (microvillar membrane marker), α-glucosidase (perimicrovillar membrane marker), aminopeptidase (perimicrovillar space marker), cathepsin L (vesicles content) and sugar transporter protein, GLUT. These sequences had its specific transcription (or preferential) verified by semi-quantitative RT-PCR on different insect tissues (malpighian tubules, salivary gland, fat body, midgut, midgut first ventriculus, second ventriculus and third ventriculus). The glucose and water absorption across the first ventriculus of the midgut of the Hemiptera Dysdercus peruvianus were determined. The insects were fed with a 10 glucose-non-absorbable dye solution, followed by periodical dissection of insects and analysis of ventriculus contents. The transport of water and glucose can be inhibited by 0.2 mM phloretin (GLUT inhibitor) and by 0.1 mM phlorizin (SGLT inhibitor) and is activated by 50 mM K2SO4 The results suggest that D. peruvianus has a transporter uniporter like (GLUT) and K+-glucose symporter like SGLT, both co-transporting water. The transcriptome showed a GLUT homologous protein which sequence is almost complete and was analyzed by bioinformatics tools

A partir da identificação de catepsinas L em ensaios in vitro e em zimogramas partimos para purificação desta enzima no inseto. A região V2 foi selecionada como fonte de obtenção da cisteína proteinase já que dentre os três ventrículos o segundo apresentou maior atividade específica. Após diversas tentativas de isolar esta proteinase, foi estabelecida uma marcha de purificação que envolvia em todas as etapas a participação de metil metanosulfonato (MMTS), o que inativa a proteinase evitando assim autólise ao longo do processo de purificação. A marcha consistiu de três passos cromatográficos (troca-iônica, filtração em gel e afinidade, nesta ordem) onde foi observada a presença de duas cisteína proteinases, cada uma apresentando respectivamente as seguintes massas moleculares 32 e 45 kDa (SDSPAGE). As duas cisteína proteinases possuem o mesmo pH ótimo igual a 6,3. Além disso, estas enzimas foram termicamente inativadas a 40 ºC segundo uma cinética de primeira ordem aparente, sugerindo a existência de apenas uma espécie molecular de cada enzima na preparação com meia vida de 5 minutos para cis 1 e 4,8 minutos para cis 2. Foi determinada a constante de dissociação entre enzimainibidor, onde foi observado os valores de 17,3 nM para cis 1 e 7,11 nM para cis 2 através da titulação por E-64. A eficiência de catálise cis 1 e cis 2 é maior para o substrato sintético Z-FR-MCA do que para Z-RR-MCA, indicando que tratava-se de catepsinas L. Com o intuito de descrever os mecanismos moleculares por trás dos fenômenos fisiológicos no intestino médio do Hemiptera Dysdercus peruvianus foi construída uma biblioteca de cDNA a partir de mRNA deste tecido. Utilizamos ESTs provenientes desta biblioteca com o objetivo de identificar genes transcritos relacionados com proteínas de transporte de glicose além de enzimas digestivas. Após o processamento das leituras, surgiram 1053 ESTs úteis. Montando estes ESTs por alinhamento de bases, foram produzidos 62 contíguos e 841 singletos, o que totaliza 903 seqüências únicas. Entre as seqüências homólogas encontradas as mais relevantes para o nosso estudo foram: β-glicosidase (marcadora de membranas microvilares), α-glicosidase (marcadora de membranas 8 perimicrovilares), aminopeptidase (espaço perimicrovilar), catepsina L (conteúdo de vesículas secretoras) e proteína transportadora de açúcar do tipo GLUT. Estas seqüências encontradas tiveram a sua transcrição específica (ou preferencial) averiguada por RT-PCR semiquantitativo nos diferentes tecidos do inseto estudado (intestino médio, túbulo de Malpighi, corpo gorduroso, glândula salivar, ventrículo 1, ventrículo 2 e ventrículo 3 do intestino médio). O transporte de glicose e água in vivo foi estudado. Para isso, os insetos foram alimentados com uma solução contendo glicose e corante não absorvível seguido de dissecação e análise do conteúdo luminal. O transporte de água e glicose foi inibido por floretina 0,2 mM (inibidor do uniportador GLUT) e por florizina 0,1 mM (inibidor do simportador SGLT) e ativado por K2SO4 50 mM. Isto sugere a presença do transportador do tipo uniportador (GLUT), e do simportador K+-glicose (SGLT), ambos co-transportando água. O transcriptoma revelou proteína homóloga a transportador GLUT cuja seqüência está parcialmente completa e foi analisada com ferramentas de bioinformática / After identification of cathepsins L in vitro assays and in zimograms we began to purify this enzyme in insect midgut. The region V2 was selected as a source of material for purifying a cysteine proteinase because it contains most of the activity of that proteinase. After several attempts to purify this proteinase, an effective process was developed that avoid autolysis with methyl methanethiosulfonate (MMTS), a sulfhydryl-reactive and reversible sulfonating reagent for thiol-containing molecules. The purify process was made by three chromatographic steps (anion-exchange column, gel filtration column and affinity column in this order), where two cysteine proteinase were purified, cys 1 and cys 2 with 32 and 45 kDa (SDS-PAGE). The two cysteine proteinases have the same pH optimum of 6.3. Besides that, these enzymes were thermicaly inactivated following apparent first-order kinetics with a half-life of 5 min (cys1) and 4.8 min (cys2) at 40 ºC. Both Cys are inhibited by E-64 with a KD of 17.3 nM (Cys 1) and 7.11 nM (Cys2). Both Cys are more active on Z-FR-MCA than on Z-RR-MCA, suggesting they are cathepsins-L. With purpose of describe the molecular mechanisms underlying physiological phenomena in midgut of the Hemiptera Dysdercus peruvianus a cDNA library was prepared from midgut mRNA. We used ESTs from this library to identify transcripts genes related with glucose transport proteins besides digestive enzymes. Analysis of 1053 high-quality expressed sequence tags (ESTs) yielded 903 unique sequences comprised of 62 contigs and 841 singlets. Among the homologous sequences found the following are more relevant to our aim: β-glucosidase (microvillar membrane marker), α-glucosidase (perimicrovillar membrane marker), aminopeptidase (perimicrovillar space marker), cathepsin L (vesicles content) and sugar transporter protein, GLUT. These sequences had its specific transcription (or preferential) verified by semi-quantitative RT-PCR on different insect tissues (malpighian tubules, salivary gland, fat body, midgut, midgut first ventriculus, second ventriculus and third ventriculus). The glucose and water absorption across the first ventriculus of the midgut of the Hemiptera Dysdercus peruvianus were determined. The insects were fed with a 10 glucose-non-absorbable dye solution, followed by periodical dissection of insects and analysis of ventriculus contents. The transport of water and glucose can be inhibited by 0.2 mM phloretin (GLUT inhibitor) and by 0.1 mM phlorizin (SGLT inhibitor) and is activated by 50 mM K2SO4 The results suggest that D. peruvianus has a transporter uniporter like (GLUT) and K+-glucose symporter like SGLT, both co-transporting water. The transcriptome showed a GLUT homologous protein which sequence is almost complete and was analyzed by bioinformatics tools

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5217.pdf: 18042962 bytes, checksum: 6c55d259639b3b244326b14d21f608f1 (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / Universidade Federal de Minas Gerais / The sugarcane weevil, Sphenophorus levis, is an insect that feeds on the rhizome of sugarcane in its larval stage, boring channels that cause damage and death to the plant. Conventional methods of insect control have not been efficient. The aim of the present study was to generate knowledge on the biology of this insect on the molecular level using a transcriptomic approach to determine potential targets genes for the engineering of insect-resistant plants. After sequence processing and assembly using the dCAS program, 3804 sequences were grouped into 201 contigs and 1363 singlets, which were manually annotated. Several plant cell wall degrading enzymes were identified, including pectinases and cellulases. An invertasecontaining contig was identified for the first time in a coleopteran. Total probable digestive enzymes accounted for 19.3% and unknown genes accounted for 28.8% of the total number of expressed sequence tags. Considering the predominance of cathepsin L enzymes among the digestive enzymes found in the transcriptome (54.3%) and their importance to the breakdown of proteins in the insect digestive process, a cDNA clone encoding a cathepsin L enzyme, denominated Sl-CathL, was chosen for recombinant expression in Pichia pastoris cells, characterization and in vitro inhibition by the sugarcane cystatin CaneCPI-4 (Ki = 0.196 nM). Immunolocalization assays demonstrated the production of Sl-CathL in the midgut epithelium and secretion into the gut lumen from vesicles containing the enzyme. S. levis demonstrated sensitivity in triggering RNA interference machinery induced by dsRNA injections in the body cavity and gene-specific knockdown was confirmed by qRT-PCR. Larvae injected with V-ATPase E dsRNA died within three weeks after injection and serpin 1-silenced larvae either exhibited delayed development, arresting in the pupal stage, or died as pharate adults. In conclusion, transcriptome analyses, together with the inhibition of the main digestive enzyme by Cane-CPI-4 and gene silencing using RNAi, are promising procedures for the development of transgenic sugarcane plants to enhance resistance to Sphenophorus levis. / O bicudo da cana-de-açúcar, Sphenophorus levis, é um inseto que na fase larval se alimenta do rizoma da cana-de-açúcar cavando galerias que causam danos e levam à morte das plantas. Os métodos convencionais de controle disponíveis não tem sido eficientes contra esse inseto. O objetivo desse estudo foi gerar conhecimento sobre a biologia desse inseto em nível molecular utilizando uma abordagem transcriptômica para a identificação de possíveis genes alvo, visando futuros estudos para desenvolvimento de plantas transgênicas resistentes ao ataque deste inseto. Após o processamento e montagem das sequências utilizando o programa dCAS, 3804 sequências foram agrupadas em 201 contigs e 1363 singlets, os quais foram manualmente anotados. Foram identificados diversos genes de degradação de parede celular, incluindo pectinases e celulases. Pela primeira vez um contig contendo uma sequência que codifica uma invertase foi identificado em um coleóptero. As prováveis enzimas digestivas totalizam 19,3% e os genes desconhecidos representam 28,8% do total de sequências expressas. Considerando a predominância de catepsinas L dentre as enzimas digestivas identificadas no transcriptoma (54,3%) e a sua importância para a hidrólise de proteínas nos processos digestivos, um clone de cDNA codificando uma catepsina L, denominado Sl-CathL, foi escolhido para a expressão recombinante em células de Pichia pastoris, caracterização e inibição in vitro utilizando a cistatina da cana-de-açúcar CaneCPI-4 (Ki = 0,196 nM). Os ensaios de imunolocalização evidenciaram a produção da Sl-CathL no epitélio do intestino médio e a secreção de vesículas, contendo a enzima, no lúmen do intestino. Larvas do inseto S. levis também apresentaram sensibilidade para disparar a maquinaria de RNA de interferência induzida por injeções de dsRNA na cavidade corpórea e o silenciamento gênico específico foi confirmado por qRT-PCR. As larvas que receberam injeções com dsRNA da V-ATPase E morreram dentro de três semanas, enquanto as larvas que tiveram a serpina 1 silenciada exibiram atraso no desenvolvimento, aprisionamento na fase pupal, ou morreram como adultos farados. Desse modo, concluímos neste trabalho iniciado a partir da análise do transcriptoma, que a inibição da principal enzima digestiva pela Cane-CPI-4 e o silenciamento gênico via RNAi são alternativas promissoras para o estabelecimento de plantas resistentes ao inseto e podem ser aplicadas no desenvolvimento de plantas de cana-de-açúcar transgênicas com o objetivo de aumentar sua resistência ao Sphenophorus levis.

A diversidade de tripanossomas é atribuída a um arsenal gene vasto. HSP compreendem várias famílias que atuam como uma chaperona moleculares em condições de estresse e fisiológicas. A HSP70 em tripanossomas consiste em 9 genes: Canonical, HSP70.4, HSP70.c, GRP78, Lc2.2, HSP70.b, Grp170, HSP110 e HSP70.a. Análises filogenéticas indicam que a evolução de HSP70 segue um padrão de ramificação que coincide com a compartimentação celular. As inferências filogenéticas de Trypanosoma obtidas a partir de genes que codificam HSP70s foram compatíveis com os obtidos por gGAPDH indicando que as HSP70s são uteis como marcadores moleculares. Os genes que codificam proteínas possuindo domínio P3/alfa-cristalino (ACD) na sua estrutura atuam como chaperonas envolvidas na proliferação e migração celular, citoesqueleto, na resposta a agentes patogénicos e desenvolvimento. Nove chaperonas putativas com o ACD foram recuperadas em Trypanosoma: TryDYX1C1, TrySGT1, Tryp23A, Tryp23B, TryNudC1, TryNudC2, HSP20, TryACDP, TryACD-TPR. / The diversity of trypanosomes is attributed to a vast gene arsenal. HSP comprehends several families which acts as a molecular chaperone in stress and physiological conditions. The HSP70 in trypanosomes consists of nine genes: Canonical, HSP70.4, HSP70.c, Grp78, Lc2.2, HSP70.b, Grp170, HSP110 and HSP70.a. Phylogenetic analysis shows that the evolution of HSP70 from Trypanosoma follows branching pattern that coincides with the cellular compartmentation. Phylogenetic Inferences of Trypanosoma obtained from genes encoding HSP70s were compatible with those obtained by gGAPDH indicating that HSP70 gene is a useful molecular maker. Genes encoding proteins having p3/alpha-crystalline domain (ACD) in its structure act as chaperones and co-chaperones involved in cell proliferation and migration, cytoskeleton and in response to pathogens and development. Nine putative chaperones containing the ACD were recovered in Trypanosoma: TryDYX1C1, TrySGT1, Tryp23A, Tryp23B, TryNudC1, TryNudC2, HSP20, TryACDP, TryACD-TPR.

A catepsina L, uma cisteína proteinase da família da papaína, é a principal proteinase digestiva do besouro Tenebrio molitor. Estudos anteriores do nosso grupo mostraram que existem três catepsinas L no intestino médio do T. molitor, uma delas é lisossômica (CAL 1) e as outras duas são digestivas (CAL 2 e CAL 3). As estruturas 3D das enzimas digestivas foram recentemente elucidadas. Com o objetivo de estudar em detalhes as propriedades das enzimas digestivas, CAL 3 foi expressa como um zimógeno em E. coli, purificada por cromatografia de afinidade e autoativada em meio ácido. Foram realizados ensaios de atividade com 63 peptídeos FRET derivados da sequência Abz-KLRSSKQ-EDDnp em um espectrofluorímetro termostatizado a 30 ºC, monitorando-se continuamente a variação de fluorescência em 320 nm (λex) e 420 nm (λem). Os parâmetros kcat e KM obtidos foram utilizados na determinação da hidrofobicidade dos subsítios (H) e da função de cada subsítio através da razão das energias livres de ativação do complexo enzima-substrato (ΔG‡T) e de ligação da enzima com o substrato (ΔGs). Os resultados mostram que o subsítio S2 está envolvido prioritariamente em catálise e é bastante seletivo para substratos com resíduos hidrofóbicos em P2. Esse subsítio é o mais hidrofóbico dentre os analisados, encontrando-se num bolsão localizado no interior da enzima. O subsítio S\'2, por outro lado, é o que apresentou a menor especificidade dentre os analisados. Este subsítio está envolvido prioritariamente na ligação com o substrato e se localiza na superfície da enzima, o que pode facilitar a acomodação de diferentes cadeias laterais em P\'2 do substrato, não oferecendo muitas restrições espaciais. O subsítio S1, hidrofílico, não é muito seletivo, o que pode ser consequência de sua localização na superfície da enzima. Esse subsítio está prioritariamente envolvido na ligação com o substrato. O subsítio S\'1, assim como S1, está localizado na superfície da enzima, é hidrofílico e não muito seletivo. No entanto, esse subsítio tem papel na catálise além de atuar na ligação do substrato. Numa análise inicial da estrutura 3D deste subsítio, sua função catalítica foi atribuída à presença de parte da cavidade oxiânica. Uma enzima com mutação no resíduo W187, pertencente à cavidade oxiânica e a S\'1, foi produzida e purificada, no entanto essa enzima não apresentou atividade. Uma análise mais aprofundada mostrou que a falta de atividade pode ser atribuída ao fato do resíduo de aminoácido mutado fazer parte de um cluster aromático essencial à estabilização da tríade catalítica. Os dados obtidos na caracterização de S\'1 e S\'2 permitem inferir que a acilação é o passo limitante da reação da CAL 3. Além disso, os resultados deste trabalho mostram que o conceito de hidrofobicidade de subsítios proposto anteriormente pelo grupo parece ser aplicável a subsítios que apresentem especificidades mais restritas. / Cathepsin L, a cysteine proteinase of the papain family, is the major digestive proteinase in the beetle Tenebrio molitor. Previous studies of our group showed that there are three cathepsins L in T. molitor midgut, one is lysosomal (CAL1) and two are digestive (CAL2 and CAL3). The 3D structures of the digestive enzymes were recently elucidated. With the aim to study in details the digestive enzymes specificities, CAL3 was expressed in E. coli as a zymogen, purified by affinity chromatography and autoactivated in acid conditions. Activity assays were performed in a thermostated spectrofluorometer at 30 ºC with 63 FRET peptides derived from the lead sequence Abz-KLRSSKQ-EDDnp, continuously monitoring the fluorescence changes at 320 nm (λex) and 420 nm (λem). The parameters kcat and KM were used in the determination of subsite hydrophobicity (H) and subsite role based on the ratio of complex enzyme-substrate activation energy (ΔG‡T) and free energy of substrate binding (ΔGs). The data obtained suggest that the S2 is mainly involved in catalysis and is very selective to substrates with hydrophobic residues in P2. This subsite is the most hydrophobic among the analyzed and is located in a pocket in the enzyme interior. S\'2, on the other hand, is the less selective subsite and is mainly involved in substrate binding and is located on the enzyme surface, what can ease the accommodation of different side chains located in P\'2 by not imposing many spatial restrictions. S1, is hydrophilic and not very selective, what may be a consequence of its location on the enzyme surface. This subsite is mainly involved in substrate binding. S\'1, just like S1, is located on the enzyme surface, is hydrophilic and not very selective. However this subsite has a role in catalysis besides the role in substrate binding. In an initial 3D structure analysis its catalytic function was attributed to the presence of a part of the oxyanion hole. An enzyme with mutation in the residue W187, which apparently belonged both to the oxyanion hole and S\'1, was produced and purified, but this enzyme was inactive. A better analysis showed that the lack of activity can be attributed to the fact that the mutated residue belongs to an aromatic cluster that is essential to the catalytic triad stabilization. The data obtained in S\'1 and S\'2 characterization suggest that acylation is the limiting step in CAL 3 reaction. The results presented in this work support the concept of subsite hydrophobicity previously proposed by our group, which seems to be true to subsites with more restrict specificities

Nós isolamos e seqüenciamos genes que codificam Catepsina L-like em diversos isolados de T.rangeli de humano, mamíferos silvestres e Rhodnius spp., do centro e sul da América. Análises filogenéticas de seqüências que codificam a proteína madura de T. rangeli, outras espécies de Trypanosoma e Leishmania e duas espécies de bodonídeos, posicionaram T.rangeli próximo a T.cruzi de acordo com a ordem de divergência determinada em filogenias baseadas em SSUrDNA. Uma análise de 17 seqüências do domínio catalítico de CatL-like de isolados representativos da diversidade filogenética e distribuição geográfica de T. rangeli, apoiaram as mesmas linhagens filogenéticas previamente definidas. Seqüências do gene CatL-like também foram usados para padronizar ensaios de PCR para diagnóstico de T. cruzi e T. rangeli. Além disso, um método de genotipagem por PCR multiplex segregou os isolados de T. rangeli nas principais linhagens previamente estabelecidas. Este é o primeiro estudo usando um gene codificador de proteína para comparar isolados de T. rangeli de linhagens distintas. / We have isolated and sequenced genes encoding cathepsin L-like (CatL-like) cysteine proteases from isolates of T. rangeli from human, wild mammals and Rhodnius spp., from Central and South America. Phylogenetic analysis of sequences encoding the mature CatL-like enzymes from T. rangeli (Rangelipain), other Trypanosoma and Leishmania species, and two species of bodonids, positioned T. rangeli closest to T. cruzi corroborating the same order of divergence showed in phylogenies based on SSU rDNA. Analysis of 17 sequences of the catalytic domains of CatL-like genes isolates representative of the phylogenetic diversity and geographical range of T.rangeli supported previously defined phylogenetic lineages. Sequences of CatL-like genes were used to standardize PCR assays for the diagnosis of T. rangeli and T. cruzi, and a genotyping method of multiplex-PCR distributed of isolates of T. rangeli in the major phylogenetic lineages previously established. This is the first study using protein-encoding genes to compare isolates from T. rangeli of distinct lineages.

Submitted by Deborah Santos (deborah.araujo89@gmail.com) on 2018-05-30T20:42:54Z No. of bitstreams: 1 Tese - Deborah Santos.pdf: 12203832 bytes, checksum: e193cc5eef9d1f8e0dd6df5a35d4cc55 (MD5) / Rejected by Ronildo Prado (ri.bco@ufscar.br), reason: Oi , Faltou enviar a Carta comprovante assinada pelo orientador. Solicite o modelo em sua Secretaria de Pós-graduação, preencha e colete a assinatura com o orientador e acesse novamente o sistema para fazer o Upload. Fico no aguardo para finalizarmos o processo. Abraços Ronildo on 2018-06-04T18:07:58Z (GMT) / Submitted by Deborah Santos (deborah.araujo89@gmail.com) on 2018-06-04T19:48:12Z No. of bitstreams: 2 Tese - Deborah Santos.pdf: 12203832 bytes, checksum: e193cc5eef9d1f8e0dd6df5a35d4cc55 (MD5) doc PPGQ.pdf: 706491 bytes, checksum: 90df4e7187c05b6824acb979f9f1cafd (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ri.bco@ufscar.br) on 2018-06-06T17:46:22Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Deborah Santos.pdf: 12203832 bytes, checksum: e193cc5eef9d1f8e0dd6df5a35d4cc55 (MD5) doc PPGQ.pdf: 706491 bytes, checksum: 90df4e7187c05b6824acb979f9f1cafd (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ri.bco@ufscar.br) on 2018-06-06T17:53:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Deborah Santos.pdf: 12203832 bytes, checksum: e193cc5eef9d1f8e0dd6df5a35d4cc55 (MD5) doc PPGQ.pdf: 706491 bytes, checksum: 90df4e7187c05b6824acb979f9f1cafd (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-06T17:53:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Deborah Santos.pdf: 12203832 bytes, checksum: e193cc5eef9d1f8e0dd6df5a35d4cc55 (MD5) doc PPGQ.pdf: 706491 bytes, checksum: 90df4e7187c05b6824acb979f9f1cafd (MD5) Previous issue date: 2017-12-01 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Cathepsin L is a lysosomal cysteine protease, that is related to many physiological processes, however overexpression and up- or downregulation may cause several pathologies. Therefore, cathepsin L became an interesting drug target. Peptidyl epoxides and aziridines are reported as potent cathepsin inhibitors.Previously, our research group has synthesized six new epoxi-α-acyloxycarboxamides through one-pot process starting with an organocatalyzed asymmetric epoxidation using catalyst I followed by Passerini reaction. Then, inhibitory assays against cathepsins K, L and V were performed, and the new compounds presented inhibition, mainly against cathepsin L. In order to further evaluate the structure-activity relationship of epoxi-α-acyloxycarboxamides 11 new compounds were synthesized. Among all, LPSN423 exhibited the best inhibitory activity. The mechanistic study showed that LSPN423 is a reversible tight binding uncompetitive inhibitor, which characterized by a high affinity enzyme-inhibitor complex. To further explore the application of 2,3-epoxi-aldehydes in multicomponent reactions, in addition to create a library of compounds to be evaluated against cathepsin L, Ugi reaction were performed sequentially to epoxidation. The 2-step procedure furnished the desired product with yields ranged from 22% to 68%. The new epoxi-α-acylaminocarboxamides were tested against cathepsin L and no significant activity was observed. The organocatalytic aziridination reaction is reported, however some drawbacks are associated with this reaction, such as the use of chlorinated solvents and large excess of base to promote the reaction. Thus, catalyst I allowed the use of the greener solvent mixture ethanol/water and a lower amount of base. Another drawback of this reaction is the unstable product, so to overcome this issue, the one-pot Passerini reaction was performed, right after the completion of the aziridination; the desired products were obtained from moderate to good yields. Preliminary evaluation of the new aziridine peptidomimetics indicates a potential activity of this class of compounds, although further studies are required. / A catepsina L é uma cisteíno protease lisossomal, que está envolvida em vários processos fisiológicos. Entretanto, falhas na sua expressão e regulação desencadeiam processos patológicos, por esse motivo, a catepsina L se tornou um alvo terapêutico interessante. Peptídeos contendo anéis epóxido e aziridina são reportados como inibidores potentes de catepsinas. Em um estudo prévio desenvolvido pelo nosso grupo de pesquisa, 6 epoxi-α-aciloxicarboxamidas foram sintetizadas de maneira one-pot via reação de epoxidação assimétrica organocatalisada utilizando o catalisador I seguida da reação de Passerini. Testes relacionados à atividade dos compostos como inibidores de catepsinas K, V e L mostraram o potencial da nova classe, sobretudo frente à catepsina L. Neste trabalho, a coleção de epoxi-α-aciloxicarboxamidas foi ampliada com a síntese de mais 11 exemplos, a fim de melhor avaliar a relação estrutura-atividade desta classe de compostos frente à catepsina L. De toda a série, o LPSN423 apresentou a melhor inibição. Estudos sobre o mecanismo de inibição demonstraram que o LSPN423 é um inibidor reversível do tipo tight binding incompetitivo. Neste modo de inibição, o complexo enzima-inibidor apresenta elevada afinidade. Com o intuito de explorar a aplicação dos 2,3-epoxi-aldeídos assimétricos preparados pela metodologia desenvolvida no grupo de pesquisa, bem como criar uma biblioteca de compostos candidatos a inibidores de catepsina L, novas epoxi-α- acilaminocarboxamidas foram sintetizadas, desta vez empregando de forma sequencial a reação multicomponente de Ugi. Os rendimentos em duas etapas variaram de 22-68% para os cinco exemplos sintetizados. Os compostos desta série foram avaliados frente à catepsina L, porém, nenhum deles apresentou atividade inibitória significativa. A síntese de aziridinas assimétricas via organocatálise é reportada tendo como desvantagem a utilização de solventes clorados e excessos de base. O emprego do organocatalisador I proporcionou o uso de etanol:água como solvente e diminuição da quantidade de base. Uma limitação na síntese de β-formilaziridinas está na dificuldade de isolar os produtos, por esse motivo, aplicou-se a funcionalização da aziridina na reação de Passerini one-pot, na qual obteve-se o produto desejado com rendimentos moderados. A avaliação preliminar das aziridinas obtidas frente à inibição da catepsina L indica uma potencial atividade dessa classe de compostos, no entanto estudos mais aprofundados serão necessários. / CNPq: 144095/2014-9

A catepsina L, uma cisteína proteinase da família da papaína, é a principal proteinase digestiva do besouro Tenebrio molitor. Estudos anteriores do nosso grupo mostraram que existem três catepsinas L no intestino médio do T. molitor, uma delas é lisossômica (CAL 1) e as outras duas são digestivas (CAL 2 e CAL 3). As estruturas 3D das enzimas digestivas foram recentemente elucidadas. Com o objetivo de estudar em detalhes as propriedades das enzimas digestivas, CAL 3 foi expressa como um zimógeno em E. coli, purificada por cromatografia de afinidade e autoativada em meio ácido. Foram realizados ensaios de atividade com 63 peptídeos FRET derivados da sequência Abz-KLRSSKQ-EDDnp em um espectrofluorímetro termostatizado a 30 ºC, monitorando-se continuamente a variação de fluorescência em 320 nm (λex) e 420 nm (λem). Os parâmetros kcat e KM obtidos foram utilizados na determinação da hidrofobicidade dos subsítios (H) e da função de cada subsítio através da razão das energias livres de ativação do complexo enzima-substrato (ΔG‡T) e de ligação da enzima com o substrato (ΔGs). Os resultados mostram que o subsítio S2 está envolvido prioritariamente em catálise e é bastante seletivo para substratos com resíduos hidrofóbicos em P2. Esse subsítio é o mais hidrofóbico dentre os analisados, encontrando-se num bolsão localizado no interior da enzima. O subsítio S\'2, por outro lado, é o que apresentou a menor especificidade dentre os analisados. Este subsítio está envolvido prioritariamente na ligação com o substrato e se localiza na superfície da enzima, o que pode facilitar a acomodação de diferentes cadeias laterais em P\'2 do substrato, não oferecendo muitas restrições espaciais. O subsítio S1, hidrofílico, não é muito seletivo, o que pode ser consequência de sua localização na superfície da enzima. Esse subsítio está prioritariamente envolvido na ligação com o substrato. O subsítio S\'1, assim como S1, está localizado na superfície da enzima, é hidrofílico e não muito seletivo. No entanto, esse subsítio tem papel na catálise além de atuar na ligação do substrato. Numa análise inicial da estrutura 3D deste subsítio, sua função catalítica foi atribuída à presença de parte da cavidade oxiânica. Uma enzima com mutação no resíduo W187, pertencente à cavidade oxiânica e a S\'1, foi produzida e purificada, no entanto essa enzima não apresentou atividade. Uma análise mais aprofundada mostrou que a falta de atividade pode ser atribuída ao fato do resíduo de aminoácido mutado fazer parte de um cluster aromático essencial à estabilização da tríade catalítica. Os dados obtidos na caracterização de S\'1 e S\'2 permitem inferir que a acilação é o passo limitante da reação da CAL 3. Além disso, os resultados deste trabalho mostram que o conceito de hidrofobicidade de subsítios proposto anteriormente pelo grupo parece ser aplicável a subsítios que apresentem especificidades mais restritas. / Cathepsin L, a cysteine proteinase of the papain family, is the major digestive proteinase in the beetle Tenebrio molitor. Previous studies of our group showed that there are three cathepsins L in T. molitor midgut, one is lysosomal (CAL1) and two are digestive (CAL2 and CAL3). The 3D structures of the digestive enzymes were recently elucidated. With the aim to study in details the digestive enzymes specificities, CAL3 was expressed in E. coli as a zymogen, purified by affinity chromatography and autoactivated in acid conditions. Activity assays were performed in a thermostated spectrofluorometer at 30 ºC with 63 FRET peptides derived from the lead sequence Abz-KLRSSKQ-EDDnp, continuously monitoring the fluorescence changes at 320 nm (λex) and 420 nm (λem). The parameters kcat and KM were used in the determination of subsite hydrophobicity (H) and subsite role based on the ratio of complex enzyme-substrate activation energy (ΔG‡T) and free energy of substrate binding (ΔGs). The data obtained suggest that the S2 is mainly involved in catalysis and is very selective to substrates with hydrophobic residues in P2. This subsite is the most hydrophobic among the analyzed and is located in a pocket in the enzyme interior. S\'2, on the other hand, is the less selective subsite and is mainly involved in substrate binding and is located on the enzyme surface, what can ease the accommodation of different side chains located in P\'2 by not imposing many spatial restrictions. S1, is hydrophilic and not very selective, what may be a consequence of its location on the enzyme surface. This subsite is mainly involved in substrate binding. S\'1, just like S1, is located on the enzyme surface, is hydrophilic and not very selective. However this subsite has a role in catalysis besides the role in substrate binding. In an initial 3D structure analysis its catalytic function was attributed to the presence of a part of the oxyanion hole. An enzyme with mutation in the residue W187, which apparently belonged both to the oxyanion hole and S\'1, was produced and purified, but this enzyme was inactive. A better analysis showed that the lack of activity can be attributed to the fact that the mutated residue belongs to an aromatic cluster that is essential to the catalytic triad stabilization. The data obtained in S\'1 and S\'2 characterization suggest that acylation is the limiting step in CAL 3 reaction. The results presented in this work support the concept of subsite hydrophobicity previously proposed by our group, which seems to be true to subsites with more restrict specificities