Submitted by Katiane Souza (katyane.souza@gmail.com) on 2016-06-05T16:57:52Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2970217 bytes, checksum: d54e4990a98e77a7f5d22ad2384ffdd3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-05T16:57:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2970217 bytes, checksum: d54e4990a98e77a7f5d22ad2384ffdd3 (MD5) Previous issue date: 2015-12-10 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The subtribe Laeliinae comprises about 2000 species in 38 genera, exclusively neotropical and is considered the third largest family of subtribe. Cytological features most species with basic chromosome number x = 20 and karyotype evolution mainly associated with polyploidy. This study aimed performed a comparative cytogenetic analysis in 42 species of Laeliinae subtribe based on banding fluorochromes with CMA/DAPI, and estimate the nuclear DNA content of many of these species through citmetria of flow. All species presented 2n = 40 except Cattleya nobilior with 2n = 42 and the polyploid C. elongata, C. crispata, Encyclia alboxanthina, E. jenischiana, E. seidelii, Laelia gouldiana and Prosthechea faresiana (2n = 80). We observed two blocks CMA+/DAPI terminals in all species. The DNA content of species ranged from 2C = 3.45 pg in Brassavola nodosa to 2C = 7.96 pg in C. guttata. The leaf tissues of the analyzed representatives presented endoreduplication cycles in most species. Our data suggest that although it occurs an apparent macrostructural stable karyotype (2n = 40) in the species of the subtribe Laeliinae as well as the genus Cattleya studied, they present a pattern of diversification of heterochromatin consistent with the phylogenetic clusters and identify possible sinapomorphies that allow better understanding of taxonomically complex species. / A subtribo Laeliinae compreende cerca de 2000 espécies distribuídas em 38 gêneros, exclusivamente neotropical, sendo considerada a terceira maior subtribo da família. Citologicamente apresenta a maioria das espécies com número cromossômico básico x = 20 e evolução cariotípica principalmente associada a poliploidia. O presente trabalho objetivou realizada uma análise citogenética comparativa em 42 espécies da subtribo Laeliinae com base em bandeamento com fluorocromos, CMA/DAPI, além de estimar o conteúdo de DNA nuclear de várias dessas espécies através de citometria de fluxo. Todas as espécies apresentaram 2n = 40, exceto Cattleya nobilior com 2n = 42 e os poliploides C. elongata, C. crispata, Encyclia alboxanthina, E. jenischiana, E. seidelii, Laelia gouldiana e Prosthechea faresiana (2n = 80). Foram observados pelo menos dois blocos CMA+/DAPI terminais em todas as espécies, além de bandas DAPI+/CMA– proximais ou terminais em várias outras espécies. O conteúdo de DNA das espécies variou de 2C = 3,45 pg em Brassavola nodosa até 2C = 7,96 pg em C. guttata, com ciclos de endoreduplicação na maioria das espécies. Nossos dados sugerem que embora ocorra uma aparente estabilidade cariotípica macroestrutural (2n = 40) nas espécies da subtribo Laeliinae e no gênero Cattleya como um todo, em geral, o padrão de diversificação da heterocromatina foi compatível com os agrupamentos filogenéticos, identificando possíveis sinapomorfias que permitem um melhor entendimento de espécies taxonomicamente complexas.

Made available in DSpace on 2016-07-18T17:51:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mariane Marangoni Hengling.pdf: 461101 bytes, checksum: 470b3527f7728c3d348a0a74885a6f7e (MD5) Previous issue date: 2015-10-30 / Orchidacae is cited as the largest plant family (about 20-25 thousand species). Some species have great economic importance, so with the intense degradation of their habitats, has resulted in extinction in native populations. One capsule of this family can contain hundreds to thousands of seeds, seed conservation can be a very important strategy. For the analysis of physiological quality and monitoring of conservation of seed in storage, the most used method is the germination test associated with the tetrazolium test. The reduction of temperature and air humidity tends to increase the shelf-life of seeds. The liquid nitrogen temperature (-196° C) can provide greater preservation, though this response is not always observed. The objective was to evaluate the germination and viability of four species of the Orchid genus Cattleya (Cattleya purpurata, C. tigrina, C. amethystoglossa, C. brevicaulis) conditioned in three levels of water content in the seed (1.5, 12%), 6.4 and in three different conditions of storage environment temperature (5° C, -18° C and -196° C), for nine months of storage. Stored seed were evaluated for germination tests, index of seed velocity, tetrazolium test and evaluation of oxidative damage caused by storage period, such as malondialdehyde (MDA), peroxidase (PRX), superoxide dismutase (SOD) and soluble proteins. The experimental design was completely random and factorial arrangement of treatments (combined storage temperature and seed moisture) x storage periods. The variance analyses were applied and the treatments were compared by Tukey test. Among all the proposed storage conditions and water content of the seeds the best results highlighted that the seeds remain viable for more time with water levels of 6.4% and kept in liquid nitrogen. With the exception of C. purpurata, the other species also presented results for 5° C and -18°C storage with water levels at 6.4%. The biochemical results have shown that over time of storage, there is loss of viability and alterations of compounds, even with seeds conserved in liquid nitrogen. / Orchidacae é citada como a maior família vegetal (cerca de 20-25 mil espécies). Algumas espécies têm grande importância econômica, portanto com a intensa degradação de seus habitats, tem resultado na extinção localizada de populações nativas. Uma cápsula dessa família pode conter de centenas a milhares de sementes, com isso, a conservação de sementes pode ser uma estratégia muito importante. Para a análise de qualidade fisiológica e monitoramento da conservação das sementes em armazenamento, o método mais utilizado é o teste de germinação associado ao teste de tetrazólio. A redução da temperatura e da umidade do ar tende a aumentar o período de conservação das sementes. A temperatura de nitrogênio líquido (-196°C) pode proporcionar uma maior preservação, porém essa resposta não é sempre observada. O objetivo foi avaliar a germinação e a viabilidade de quatro espécies de orquídeas do gênero Cattleya (Cattleya purpurata, C. tigrina, C. amethystoglossa, C. brevicaulis) condicionadas em três níveis de teor de água na semente (1,5, 6,4 e 12%), em três diferentes condições de temperatura do ambiente de armazenamento (5°C, -18°C e -196°C), durante nove meses de armazenamento. Sementes armazenadas foram avaliadas por testes de germinação, índice de velocidade de germinação, teste de tetrazólio e testes para avaliação de danos oxidativos causados pelo período de armazenamento, como, malondialdeído (MDA), peroxidase (PRX), superóxido dismutase (SOD) e proteínas solúveis. O delineamento experimental foi inteiramente ao acaso com três repetições e arranjo fatorial de tratamentos (combinações dos ambientes de armazenamento e teores de água nas sementes) x períodos de armazenamento. Aplicou-se a análise da variância os tratamentos foram comparados pelo teste de Tukey. Entre todas as condições de armazenamento propostas e teores de água das sementes os melhores resultados indicam que as sementes se mantêm mais viáveis por mais tempo com teores de água de 6,4% e mantidas em nitrogênio líquido. Com exceção de Cattleya purpurata, as demais espécies também apresentaram conservação em 5°C e -18°C de armazenamento com teores de água em 6,4%. Os resultados das avaliações bioquímicas indicam que, ao longo do tempo de armazenamento, há perda de viabilidade e alterações nos compostos, mesmo nas sementes conservadas em nitrogênio líquido.

Delimitar espécies e reconstruir a história evolutiva em complexos de espécies pode demandar grandes esforços uma vez que grupos taxonomicamente problemáticos são muitas vezes consequência de eventos de especiação recente ou de rápida especiação. O complexo \'Cattleya coccinea\', da família Orchidaceae, é composto por orquídeas com alto valor ornamental, epifíticas e rupícolas de porte pequeno. Apesar de estarem descritas com caracteres morfológicos diagnósticos claros que permitem sua identificação, a delimitação das espécies atualmente reconhecidas é problemática. Portanto, os objetivos dessa pesquisa foram revisar a delimitação de espécies do complexo e a relação entre as espécies, além de avaliar a diversidade e estrutura genética, aliadas às análises filogeográficas para testar a ocorrência de eventos demográficos históricos. Para responder tais questões foram utilizadas regiões de sequência de cpDNA e nrDNA, 11 locos microssatélites, além de inferência bayesiana e modelo coalescente somadas às estatísticas tradicionais como metodologia. Os resultados suportam o monofiletismo para o clado para as regiões de cpDNA concatenadas. Indicam também quatro grandes eventos de reticulação das espécies do clado C. coccinea com outras espécies do gênero Cattleya. Adicionalmente, suportam o reconhecimento de sete diferentes espécies para o clado C. coccinea, composto por duas principais linhagens evolutivas mais ao norte da região Sudeste: C. brevipedunculata predominante da Serra do Espinhaço e C. wittigiana do norte da Serra do Mar. E cinco espécies distribuídas ao longo da Serra do Mar e Serra da Mantiqueira (C. coccinea, C. mantiqueirae, e mais três espécies correspondentes às populações de DMES; SJPSP e CSRS/JOSC/PMPR. As análises de diversidade mostraram de moderados a altos níveis de diversidade genética e apontam que as espécies C. coccinea e C. brevipedunculata apresentam os maiores níveis de diversidade comparadas a outras espécies do clado. A estruturação genética entre populações dentro de espécies mostrou variação entre níveis baixos a altos. A análise de atribuição de indivíduos a partir de inferência bayesiana mostrou a formação de oito grupos geneticamente distintos. A análise de taxa de dispersão de fluxo gênico pólen x semente mostrou que a dispersão via pólen é aproximadamente oito vezes mais eficiente que a dispersão via sementes somente para C. coccinea. Além disso, a rede de haplótipos indicou que as espécies raramente compartilham haplótipos e que C. coccinea e C. brevipedunculata apresentam maior diversidade com eventos de expansão. A análise de estimativa de tempo de divergência demonstrou que C. brevipedunculata e C. wittigiana provavelmente se originaram entre o Plioceno e o Pleistoceno. As outras espécies do clado se diversificaram no Pleistoceno. Eventos de expansão populacional foram observados para todas as espécies em eras glaciais do Pleistoceno. Por se tratarem de espécies ameaçadas, esse estudo recomenda a conservação \"in situ\" como também a conservação \"ex situ\" de todas as espécies do clado, com atenção especial às duas espécies do Espírito Santo: C. wittigiana e a espécie da localidade DMES, além da espécie da localidade SJPSP em São Paulo. / Species delimitation and reconstruction of the evolutionary history of species complexes may require great efforts since taxonomically problematic groups are often a result of recent speciation events or rapid speciation. The \'Cattleya coccinea\' complex, of the orchid family, consists of epiphytic and small rupicolous orchids with high ornamental value. Despite being described with clear diagnostic morphological characters that allow their identification, delimitation of the currently recognized species is problematic. Therefore, the objectives of this study were to review the species delimitation of the complex and the relationship between species, and to evaluate the genetic diversity and structure, combined with phylogeographic analyzes to test the occurrence of historical demographic events. To answer such questions, cpDNA and nrDNA sequence regions, 11 microsatellite loci, and Bayesian inference and coalescent model were used, combined with traditional statistics and methodology. The results support the monophyly for the clade for concatenated cpDNA regions. They also indicate four major reticulation events of C. coccinea species clade with other species of the genus Cattleya. Additionally, results support the recognition of seven different species for C. coccinea clade, composed of two main evolutionary lineages further north in the Southeast: C. brevipedunculata predominant in the Serra do Espinhaço and C. wittigiana from northern Serra do Mar. And five species distributed along the Serra do Mar and Serra da Mantiqueira (C. coccinea, C. mantiqueirae, and three other species of the populations DMES; SJPSP and CSRS/JOSC/PMPR. The diversity analyzes showed moderate to high levels of genetic diversity and point out that the species C. coccinea and C. brevipedunculata have the highest levels of diversity compared to other species of the clade. The genetic structure of populations within species showed variation from low to high. Assigning individuals analysis from Bayesian inference showed the formation of eight genetically distinct groups. The dispersal rate analysis of pollen x seed gene flow showed that dispersal through pollen is approximately eight times more efficient than the dispersal through seeds only for C. coccinea. Furthermore, the haplotype network indicated that the species rarely share haplotypes and that C.coccinea and C. brevipedunculata present greater diversity with expansion events. The divergence time estimation analysis showed that C. brevipedunculata and C. wittigiana probably originated between the Pliocene and the Pleistocene. The other clade species have diversified in the Pleistocene. Population expansion events were observed for all species in the Pleistocene ice ages. Because they are endangered species, this study recommends the \"in situ\" conservation as well as \"ex situ\" conservation for all species of clade, with special attention for two species of Espírito Santo: C. wittigiana and the species of DMES locality, in addition to the species of SJPSP location in São Paulo.

Delimitar espécies e reconstruir a história evolutiva em complexos de espécies pode demandar grandes esforços uma vez que grupos taxonomicamente problemáticos são muitas vezes consequência de eventos de especiação recente ou de rápida especiação. O complexo \'Cattleya coccinea\', da família Orchidaceae, é composto por orquídeas com alto valor ornamental, epifíticas e rupícolas de porte pequeno. Apesar de estarem descritas com caracteres morfológicos diagnósticos claros que permitem sua identificação, a delimitação das espécies atualmente reconhecidas é problemática. Portanto, os objetivos dessa pesquisa foram revisar a delimitação de espécies do complexo e a relação entre as espécies, além de avaliar a diversidade e estrutura genética, aliadas às análises filogeográficas para testar a ocorrência de eventos demográficos históricos. Para responder tais questões foram utilizadas regiões de sequência de cpDNA e nrDNA, 11 locos microssatélites, além de inferência bayesiana e modelo coalescente somadas às estatísticas tradicionais como metodologia. Os resultados suportam o monofiletismo para o clado para as regiões de cpDNA concatenadas. Indicam também quatro grandes eventos de reticulação das espécies do clado C. coccinea com outras espécies do gênero Cattleya. Adicionalmente, suportam o reconhecimento de sete diferentes espécies para o clado C. coccinea, composto por duas principais linhagens evolutivas mais ao norte da região Sudeste: C. brevipedunculata predominante da Serra do Espinhaço e C. wittigiana do norte da Serra do Mar. E cinco espécies distribuídas ao longo da Serra do Mar e Serra da Mantiqueira (C. coccinea, C. mantiqueirae, e mais três espécies correspondentes às populações de DMES; SJPSP e CSRS/JOSC/PMPR. As análises de diversidade mostraram de moderados a altos níveis de diversidade genética e apontam que as espécies C. coccinea e C. brevipedunculata apresentam os maiores níveis de diversidade comparadas a outras espécies do clado. A estruturação genética entre populações dentro de espécies mostrou variação entre níveis baixos a altos. A análise de atribuição de indivíduos a partir de inferência bayesiana mostrou a formação de oito grupos geneticamente distintos. A análise de taxa de dispersão de fluxo gênico pólen x semente mostrou que a dispersão via pólen é aproximadamente oito vezes mais eficiente que a dispersão via sementes somente para C. coccinea. Além disso, a rede de haplótipos indicou que as espécies raramente compartilham haplótipos e que C. coccinea e C. brevipedunculata apresentam maior diversidade com eventos de expansão. A análise de estimativa de tempo de divergência demonstrou que C. brevipedunculata e C. wittigiana provavelmente se originaram entre o Plioceno e o Pleistoceno. As outras espécies do clado se diversificaram no Pleistoceno. Eventos de expansão populacional foram observados para todas as espécies em eras glaciais do Pleistoceno. Por se tratarem de espécies ameaçadas, esse estudo recomenda a conservação \"in situ\" como também a conservação \"ex situ\" de todas as espécies do clado, com atenção especial às duas espécies do Espírito Santo: C. wittigiana e a espécie da localidade DMES, além da espécie da localidade SJPSP em São Paulo. / Species delimitation and reconstruction of the evolutionary history of species complexes may require great efforts since taxonomically problematic groups are often a result of recent speciation events or rapid speciation. The \'Cattleya coccinea\' complex, of the orchid family, consists of epiphytic and small rupicolous orchids with high ornamental value. Despite being described with clear diagnostic morphological characters that allow their identification, delimitation of the currently recognized species is problematic. Therefore, the objectives of this study were to review the species delimitation of the complex and the relationship between species, and to evaluate the genetic diversity and structure, combined with phylogeographic analyzes to test the occurrence of historical demographic events. To answer such questions, cpDNA and nrDNA sequence regions, 11 microsatellite loci, and Bayesian inference and coalescent model were used, combined with traditional statistics and methodology. The results support the monophyly for the clade for concatenated cpDNA regions. They also indicate four major reticulation events of C. coccinea species clade with other species of the genus Cattleya. Additionally, results support the recognition of seven different species for C. coccinea clade, composed of two main evolutionary lineages further north in the Southeast: C. brevipedunculata predominant in the Serra do Espinhaço and C. wittigiana from northern Serra do Mar. And five species distributed along the Serra do Mar and Serra da Mantiqueira (C. coccinea, C. mantiqueirae, and three other species of the populations DMES; SJPSP and CSRS/JOSC/PMPR. The diversity analyzes showed moderate to high levels of genetic diversity and point out that the species C. coccinea and C. brevipedunculata have the highest levels of diversity compared to other species of the clade. The genetic structure of populations within species showed variation from low to high. Assigning individuals analysis from Bayesian inference showed the formation of eight genetically distinct groups. The dispersal rate analysis of pollen x seed gene flow showed that dispersal through pollen is approximately eight times more efficient than the dispersal through seeds only for C. coccinea. Furthermore, the haplotype network indicated that the species rarely share haplotypes and that C.coccinea and C. brevipedunculata present greater diversity with expansion events. The divergence time estimation analysis showed that C. brevipedunculata and C. wittigiana probably originated between the Pliocene and the Pleistocene. The other clade species have diversified in the Pleistocene. Population expansion events were observed for all species in the Pleistocene ice ages. Because they are endangered species, this study recommends the \"in situ\" conservation as well as \"ex situ\" conservation for all species of clade, with special attention for two species of Espírito Santo: C. wittigiana and the species of DMES locality, in addition to the species of SJPSP location in São Paulo.

This thesis is focussed on the biosynthesis of three toxins: fluoroacetate, 4-fluoro-L-theronine and β-ethynyl-L-serine which are biosynthesised by the soil bacteria Streptomyces cattleya. The two fluorinated metabolites originate from a common biosynthetic pathway and the thesis describes studies carried out on an aldose-ketose isomerase enzyme of the pathway. The biosynthetic origin of β-ethynyl-L-serine is not known. A total synthesis of this acetylenic amino acid is descibed along with the development of a new analytical method for identifying the metabolite and for future isotope-labelling based biosynthetic studies. Chapter 1 presents the background of this research. It is focussed on the biosynthesis of fluoroacetate and 4-fluoro-L-threonine by S. cattleya and it also introduces alkyne-containing natural products and their biosynthesis. Chapter 2 describes the work carried out on crystallisation of the aldose-ketose isomerase of the fluorometabolite pathway in S. cattleya. Crystals of the isomerase were obtained and they were diffracted by X-ray, however a structure could not be solved. Chapter 3 contains site-directed mutagenesis studies of the isomerase from S. cattleya. Chapter 4 describes an enantioselective total synthesis of β-ethynyl-L-serine. A robust analytical technique based on derivatisation using 'Click' chemistry and LC-MS was developed for the detection of this amino acid directly from the fermentation broth. Chapter 5 details the experimental procedures for compounds synthesised in this thesis and the biological procedures for gene cloning and protein purification.