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Avec plus de 39 millions de personnes infectées à travers le monde, le virus de l’immunodéficience humaine de type-1 (VIH-1) est un problème majeur de santé publique. Bien que la thérapie antirétrovirale contrôle la réplication virale, améliore la santé et prolongent la vie des personnes vivant avec le VIH-1, elle ne permet pas d’éradiquer complètement le virus. En effet, celui-ci établit des phases de latence en intégrant son génome dans l’ADN cellulaire des cellules cibles, entrainant la formation de ce que l’on appelle le réservoir latent du virus. Ce réservoir se situe principalement dans les lymphocytes T CD4+, bien qu’on le retrouve également dans les cellules myéloïdes, et il constitue le principal obstacle à l’éradication du virus. Il est donc impératif de mieux comprendre les facteurs de l’hôte qui régissent non seulement la susceptibilité de ces cellules à l’infection et qui contribuent également à la persistance du VIH-1. Nous postulons que les micro-ARN (miARN), des petits ARN produits par la cellule et qui régulent l’expression génique, jouent un rôle au cours de l’infection par le VIH-1. Dans un premier temps, nous nous sommes concentrés sur le rôle des miARN dans l’entrée virale. À l’aide d’un séquençage de nouvelle génération des miARN dans les macrophages, nous avons déterminé que le miARN-103, ainsi que son paralogue le miARN-107, ciblent l’ARNm du corécepteur CCR5 utilisé par le VIH-1. Nous montrons que l’induction de l’expression des miARN-103/107 est régulée par le facteur de transcription p53 et rend les macrophages réfractaires à l’entrée du VIH-1. Nous observons que le niveau d’expression des miARN-103/107 est enrichi dans les macrophages résidant dans les tissus intestinaux de donneurs sains et les macrophages alvéolaires des personnes sous thérapie antirétrovirale, ce qui contribue vraisemblablement à leur résistance à l’infection par le VIH-1. Étant donné que les lymphocytes T CD4+ constituent le principal réservoir du VIH-1, nous avons ensuite étendu l’étude du miARN-103 dans ces cellules. Récemment, il a été montré que la latence virale serait la conséquence de l’infection de lymphocytes T CD4+ dans une fenêtre très étroite suite à leur activation. Ces cellules qui 3 transitionnent vers un phénotype mémoire posséderaient des propriétés uniques, comme une augmentation temporaire de l’expression du corécepteur viral CCR5, ainsi qu’une capacité réduite de transcrire l’ADN proviral intégré. Nos résultats montrent que le miARN-103, qui cible également le CCR5 dans les lymphocytes T CD4+, participe à la modulation du CCR5 selon l’état d’activation de la cellule et contribue indirectement à l’établissement de la latence virale dans ces cellules. De plus, nos résultats montrent que les lymphocytes T CD4+ issus d’individus qui contrôlent l’infection par le VIH-1 expriment des niveaux réduits d’ARNm de CCR5 (lorsque comparés à ceux d’individus non-contrôleurs). Cet état étant associé à une tendance à la hausse du miARN-103, suggère que le miARN-103 pourrait participer au contrôle de l’expression de CCR5 in vivo. Dans un deuxième temps, nous avons réalisé un séquençage de nouvelle génération de l’ARN des lymphocytes T CD4+ infectés. À la suite de cette analyse, nous avons déterminé que le miARN-26a participe à la régulation de CD59, une protéine cellulaire incorporée dans les virions jouant un rôle clé dans l’activation du complément en inhibant la formation du complexe d’attaque membranaire. Au cours de l’infection, ce miARN est diminué dans les cellules productivement infectées. Cette diminution est associée à une augmentation de CD59 dans les cellules infectées et à la surface des virions produits par ces cellules, favorisant leur échappement à la lyse médiée par le complément. Nous montrons que l’introduction d’un analogue du miARN-26a dans les cellules rend les virions produits par ces dites cellules plus sensibles à la lyse médiée par le complément. En conclusion, les observations et analyses réalisées dans le cadre de cette thèse nous aident à mieux comprendre le rôle des miARN dans l’infection et la persistance du VIH-1. Ces résultats aident à notre compréhension des facteurs de l’hôte qui régissent la susceptibilité de ces cellules à l’infection ainsi que la persistance virale, et pourraient aider au développement de stratégies thérapeutiques. / With more than 39 million people infected in the world, human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is a major public health problem. Although antiretroviral therapy controls viral replication, improves the health, and prolongs the lives of people living with HIV-1, it does not completely eradicate the virus. Indeed, the virus has established latency phases by integrating its genome into the cellular DNA of target cells, leading to the formation of what is called the latent reservoir of the virus. This reservoir is located mainly in CD4+ T cells, although it is also found in myeloid cells, and it has become the main obstacle to eradication of the virus. It is therefore imperative to better understand the host factors that not only govern the susceptibility of these cells to infection but also contribute to HIV-1 persistence. We postulate that microRNAs (miRNAs), which are small RNAs produced by the cell involved in regulation of gene expression, have a role during HIV-1 infection. First, we focused on the role of miRNAs in viral entry. Using next generation miRNA sequencing in macrophages, we determined that miRNA-103, as well as its paralogue miRNA-107, target the mRNA of CCR5, the HIV-1 coreceptor. We show that the induction of miRNA-103/107 expression is regulated by the transcription factor p53 and makes macrophages more resistant to HIV-1 entry. We observe that the expression level of miRNAs-103/107 is enriched in resident macrophages in intestinal tissues of healthy donors and alveolar macrophages of people on antiretroviral therapy, which likely contributes to their resistance to infection by HIV-1. Given that CD4+ T cells constitute the main reservoir of HIV-1, we then extended the study of miRNA-103 in these cells. Recently, it has been shown that viral latency is the consequence of the infection of CD4+ T cells within a very narrow window following their activation. These transitioning to memory T cells are thought to possess unique properties, such as a temporary increase in the expression of the viral coreceptor CCR5, as well as a reduced capacity to transcribe integrated proviral DNA. Our results show that miRNA-103, which also targets CCR5 in CD4+ T cells, participates in the modulation of CCR5 depending on the activation state of the cell 5 and indirectly contributes to the establishment of viral latency in these cells. Furthermore, our results show that CD4+ T cells from individuals who control HIV-1 infection express reduced levels of CCR5 mRNA (when compared to those from non- controller individuals), this being associated to a upward trend in miRNA-103 expression, suggesting that miRNA-103 may participate in the control of CCR5 expression in vivo. Secondly, we carried out next generation RNA sequencing of HIV-1 infected CD4+ T cells. Their resulting analyses determined that miRNA-26a participates in the regulation of CD59, a cellular protein that is incorporated into virions and has a key role in complement activation by inhibiting the formation of the membrane attack complex. During infection, this miRNA is decreased in productively infected cells. This decrease is associated with an increase in CD59 in infected cells, as well as on the surface of virions produced by these cells, favoring their escape from complement- mediated lysis. We show that introduction of miRNA-26a mimics in cells makes the virions produced by these cells more sensitive to complement-mediated lysis. In conclusion, the observations and analyses developed in this thesis will help us better understand the role of miRNAs in HIV-1 infection and persistence. These results help in the understanding of host factors that govern the susceptibility of these cells to infection as well as viral persistence and could help in the development of therapeutic strategies.

Els inhibidors d'entrada del VIH han sorgit recentment com una nova generació de fàrmacs antiretrovirals, els quals bloquegen la unió del virus als co-receptors de membrana CXCR4 i CCR5. S'han desenvolupat diverses molècules petites antagonistes d'aquests co-receptors, algunes de les quals estan actualment en fase d'assaig clínic. No obstant això, donat que no existeixen estructures cristal·logràfiques per aquests co-receptors proteics, és necessari analitzar els modes d'unió d'inhibidors coneguts a la cavitat d'unió extracel·lular dels co-receptors mitjançant experiments de mutagènesi dirigida i estudis computacionals. En general, l'objectiu d'aquestes aproximacions computacionals és cribar un gran nombre de compostos candidats a fàrmacs ràpidament. El cribatge virtual s'ha convertit recentment en un complement útil dels mètodes de cribatge experimentals high-throughput screening per a grans llibreries de compostos. Per tant, en aquesta tesi s'ha portat a terme un protocol de cribatge virtual, mitjançant aproximacions basades en el receptor i en lligands actius coneguts, amb la finalitat de trobar antagonistes de CXCR4 i CCR5 que puguin servir com a potencials inhibidors d'entrada del VIH.Per al cribatge virtual basat en el receptor, s'han millorat els models dels co-receptors CXCR4 i CCR5 construïts a la secció de disseny molecular de l'IQS, i s'han portat a terme assajos preliminars de mode d'unió utilitzant aquests models i lligands coneguts d'elevada afinitat. Així mateix, s'ha analitzat el comportament en el cribatge virtual i en el post-processat de resultats de docking de diferents fingerprints d'interacció en comparació amb els resultats obtinguts per un nou fingerprint d'interacció (APIF) desenvolupat a la secció de disseny molecular de l'IQS.Per al cribatge virtual basat en lligands, s'han comparat models farmacofòrics i diverses aproximacions basades en la forma i propietats moleculars utilitzant lligands d'elevada afinitat com a molècules de referència. A més, s'ha desenvolupat una nova aproximació basada en la forma molecular, la qual s'ha utilitzat per a estudiar en profunditat la hipòtesi de la multi-regió d'unió de la cavitat d'unió extracel·lular del co-receptor CCR5.Tots els mètodes, ja siguin basats en el receptor o en lligands coneguts, s'han aplicat en primer lloc de manera retrospectiva utilitzant una extensa base de dades d'inhibidors de CXCR4/CCR5 i suposats inactius, similars en propietats als actius, recopilada en aquesta tesi. Per a cada receptor, la quimioteca ha estat cribada utilitzat inhibidors coneguts, S'han analitzat els factors d'enriquiment i la diversitat a les llistes finals de hits. A més, s'han portat a terme anàlisis ROC per a ambdós inhibidors de CXCR4 i CCR5 amb la finalitat de comparar l'habilitat del nou algoritme basat en la igualtat de formes de lligands amb la resta d'aproximacions de cribatge utilitzades.Una vegada validades les diferents aproximacions de cribatge i seleccionats els millors paràmetres per a cadascuna d'elles, s'han aplicat les eines de cribatge virtual de manera prospectiva sobre una quimioteca combinatòria dissenyada a la secció de disseny molecular de l'IQS, així com tècniques de disseny de novo de lligands per tal d'identificar nous bloquejadors de l'entrada del VIH a les cèl·lules. / Los inhibidores de entrada del VIH han surgido recientemente como una nueva generación de fármacos antiretrovirales, los cuales bloquean la unión del virus con los co-receptores de membrana CXCR4 y CCR5. Se han desarrollado diversas moléculas pequeñas antagonistas de estos co-receptores, algunas de las cuales están actualmente en fase de ensayo clínico. Sin embargo, dado que no existen estructuras cristalográficas para estos co-receptores proteicos, es necesario analizar los modos de unión de inhibidores conocidos a la cavidad de unión extracelular de los co-receptores mediante experimentos de mutagénesis dirigida y estudios computacionales. En general, el objetivo de estas aproximaciones computacionales es cribar un gran número de compuestos candidatos a fármacos rápidamente. El cribado virtual se ha convertido recientemente en un complemento útil de los métodos de cribado experimentales high-throughput screening para grandes librerías de compuestos. Por lo tanto, en esta tesis se ha llevado a cabo un protocolo de cribado virtual, mediante aproximaciones basadas en el receptor y en ligandos activos conocidos, con el fin de encontrar antagonistas de CXCR4 y CCR5 que puedan servir como potenciales inhibidores de entrada del VIH.Para el cribado virtual basado en el receptor, se han mejorado los modelos de los co-receptores CXCR4 y CCR5 construidos en la sección de diseño molecular del IQS, y se han llevado a cabo ensayos preliminares de modo de unión utilizando estos modelos y ligandos conocidos de elevada afinidad. Asimismo, se ha analizado el comportamiento en el cribado virtual y en el post-procesado de resultados de docking de diferentes fingerprints de interacción en comparación con los resultados obtenidos por un nuevo fingerprint de interacción (APIF) desarrollado en la sección de diseño molecular del IQS.Para el cribado virtual basado en ligandos, se han comparado modelos farmacofóricos y diversas aproximaciones basadas en la forma y propiedades moleculares utilizando ligandos de elevada afinidad como moléculas de referencia. Además, se ha desarrollado una nueva aproximación basada en la forma molecular, la cual se ha utilizado para estudiar en profundidad la hipótesis de la multi-región de unión de la cavidad de unión extracelular del co-receptor CCR5.Todos los métodos, ya sean basados en el receptor o en ligandos conocidos, se han aplicado en primer lugar de manera retrospectiva utilizando una extensa base de datos de inhibidores de CXCR4/CCR5 y supuestos inactivos, similares en propiedades a los activos, recopilada en esta tesis. Para cada receptor, la quimioteca ha sido cribada utilizando inhibidores conocidos, Se han analizado los factores de enriquecimiento y la diversidad en las listas finales de hits. Además, se han llevado a cabo análisis ROC para ambos inhibidores de CXCR4 y CCR5 con el fin de comparar la habilidad del nuevo algoritmo basado en la igualdad de formas de ligandos con el resto de aproximaciones de cribado utilizadas.Una vez validadas las diferentes aproximaciones de cribado y seleccionados los mejores parámetros para cada una de ellas, se han aplicado las herramientas de cribado virtual de manera prospectiva sobre una quimioteca combinatoria diseñada en la sección de diseño molecular del IQS, así como técnicas de diseño de novo de ligandos para identificar nuevos bloqueadores de la entrada del VIH a las células. / HIV entry inhibitors have emerged as a new generation of antiretroviral drugs that block viral fusion with the CXCR4 and CCR5 membrane co-receptors. Several small molecule antagonists for these co-receptors have been developed, some of which are currently in clinical trials. However, because no crystal structures for the co-receptor proteins are available, the binding modes of the known inhibitors within the co-receptor extracellular pockets need to be analyzed by means of site-directed mutagenesis and computational experiments. Generally, the objective of these computational approaches is to screen large numbers of candidate drug compounds rapidly. Virtual screening has recently become a useful complement to laboratory-based high-throughput screening methods for large libraries of compounds. Hence, in this thesis, a virtual screening protocol, using several receptor-based and ligand-based approaches, has been performed to find CXCR4 and CCR5 antagonists that could potentially serve as HIV entry inhibitors.For receptor-based virtual screening, homology models of CXCR4 and CCR5 co-receptors built in our research group have been improved, and preliminary binding mode analyses using these models and high affinity known ligands have been carried out. Also, the performance in virtual screening and docking post-processing of different interaction fingerprints, compared to the results obtained with a new interaction fingerprint (APIF) developed in our research group, has been analysed.For ligand-based virtual screening, pharmacophore modelling and several shape-based and property-based molecular comparison approaches have been compared, using high-affinity ligands as query molecules. Also, a novel consensus shape-based virtual screening approach has been developed and used to investigate and add further evidence for multiple binding sites within the CCR5 extracellular pocket hypothesis.All the receptor-based and ligand-based methods have been firstly applied in a retrospective virtual screening, using a large database of known CXCR4/CCR5 inhibitors and similar presumed inactive molecules assembled in this thesis. For each receptor, the library has been queried using known binders, and the enrichment factors and diversity of the resulting virtual hit lists have been analyzed. Moreover, receiver-operator-characteristic analyses for both CXCR4 and CCR5 inhibitors have been carried out in order to compare the performance of the new consensus shape matching algorithm with the other screening approaches used. Once the different virtual screening approaches have been validated and the best parameters for each one have been selected, prospective virtual screening of a combinatorial library designed by our research group and de novo design methods have been applied to identify new HIV entry blockers.

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Mécanismes d’activation et conséquences fonctionnelles de la dimérisation des récepteurs aux chimiokines<p><p>Les chimiokines sont de petites protéines qui régulent la migration des cellules immunitaires. Elles exercent leur action en se liant à des récepteurs appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) dont la fonction est intimement liée à la régulation des cellules immunitaires. Notre laboratoire étudie depuis plusieurs années les relations reliant la structure et la fonction des récepteurs aux chimiokines. Ces dernières années, un nouveau concept est venu révolutionner le mode de fonctionnement des RCPGs. En effet, des travaux ont montré que la plupart des RCPGs sont capables de former des dimères. Le but de cette thèse de doctorat est d’étudier de manière systématique la dimérisation des récepteurs aux chimiokines et d’analyser les conséquences fonctionnelles de la dimérisation. <p><p>Dimérisation des récepteurs humains aux chimiokines et conséquences fonctionnelles<p><p>En utilisant une technique biophysique basée sur un transfert d’énergie de luminescence (BRET) nous avons montré au cours de ce travail de thèse que les récepteurs CCR1, CCR2, CCR5, CCR7 et CXCR4 sont capables de former des homodimères et des hétérodimères. De plus, une dimérisation entre ChemR23, dont le ligand naturel, la chémérine, est structurellement différent des chimiokines, et les récepteurs CCR7 et CXCR4, a également été identifiée. <p><p>D’un point de vue fonctionnel, des expériences réalisées au laboratoire dans le cadre d’un autre travail de thèse ont identifié une forme de compétition croisée entre CCR2, CCR5 et CXCR4 où la liaison de ligands (agonistes ou antagonistes) spécifiques de l'un des deux récepteurs inhibe la liaison des ligands spécifiques de l’autre. Ces effets ont été démontrés sur des cellules recombinantes mais aussi sur des cellules immunes et dans un modèle in vivo. (El-Asmar, 2005; Springael, 2006; Sohy, 2007; Sohy, 2009). Au cours de ce travail, nous nous sommes dans un premier temps focalisés sur les <p>hétéromères de ChemR23 avec CXCR4 et CCR7 et nous avons ensuite étudié plus en profondeur les hétéromères de CCR7. Concernant la dimérisation de ChemR23 avec les récepteurs aux chimiokines CCR7 et CXCR4, nous avons pu mettre en évidence une coopérativité négative de liaison entre les agonistes des récepteurs comme cela avait pu être démontré pour CCR2/CCR5/CXCR4. Par contre, nous n’avons observé aucun effet de compétition hétérologue ou d’inhibition fonctionnelle croisée de l’AMD3100 sur ChemR23 quand il est coexprimé avec CXCR4. De manière additionnelle, nous avons pu observer cette compétition croisée sur des cellules dendritiques murines immatures, démontrant l’existence des effets de l’hétérodimérisation lorsque les récepteurs sont exprimés à un niveau physiologique. Lors de l’étude approfondie des hétéromères de CCR7, nous avons montré que les conséquences fonctionnelles de l’hétérodimérisation de CCR7 sont différentes suivant le récepteur avec lequel il interagit. Pour l’hétérodimère CCR7/CCR2, nous avons identifié une forme de compétition croisée, où la liaison de ligands spécifiques de l'un des deux récepteurs inhibe la liaison des ligands spécifiques de l’autre, rejoignant les effets mis en évidence pour les hétéromères CCR2/CCR5/CXCR4. Ensuite, nous avons montré pour l’hétérodimère CCR7/CCR5 que les ligands de CCR7 sont capables d’inhiber la liaison des ligands spécifiques sur CCR5 mais que l’inverse n’est pas vrai. Enfin, pour l’hétérodimère CCR7/CXCR4, nous n’avons pas pu mettre en évidence d’inhibition croisée, que ce soit dans un sens ou dans l’autre. D’autre part, un effet inhibiteur de CCR7 a également été identifié pour les hétéromères CCR7/CCR5 et CCR7/CXCR4. Nous avons pu montrer que l’expression de CCR7 exerce un effet négatif sur la réponse fonctionnelle de certains récepteurs hétérologues comme CCR5 et CXCR4 mais pas CCR2 ou ChemR23.<p><p>L’ensemble de ces données permet de mieux comprendre les interactions entre récepteurs et pourrait mener à l’identification de nouvelles cibles pour les programmes de recherche de molécules thérapeutiques, qui, jusqu’à présent, ciblaient presque exclusivement un seul et unique récepteur.<p><p>Etude du mécanisme d’activation du récepteur CCR5 et étude de la relation entre activité constitutive et dimérisation.<p><p>De nombreux travaux ont été menés ces dernières années afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires à la base de l’activation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Il apparaît que les RCPGs peuvent se trouver dans plusieurs états conformationnels, dont certains sont favorisés par la présence d’agonistes ou d’antagonistes, ou encore d’anticorps reconnaissant des épitopes conformationnels. Certaines mutations peuvent également induire la stabilisation de certaines conformations, actives ou inactives. Pour les RCPGs appartenant à la famille de la rhodopsine, il en a résulté un modèle selon lequel les récepteurs sont maintenus dans une conformation inactive par un ensemble d’interactions ioniques impliquant l’arginine (R3.50) d’un motif DRY conservé, présent à l’extrémité cytosolique du troisième segment transmembranaire. Les interactions responsables de ce qu’on appelle le « DRY-lock » feraient intervenir notamment l’aspartate (D3.49) adjacent de l’arginine et un aspartate ou glutamate (D/E6.30) localisé au sein de l’hélice 6. Selon ce modèle, la liaison d’un agoniste, ainsi que certaines mutations, favoriseraient la rupture de ces interactions ioniques, et une conformation permettant aux récepteurs de se coupler plus efficacement aux protéines G. Des résultats du laboratoire indiquent cependant que ce modèle ne serait pas transposable complètement au récepteur CCR5. <p><p>CCR5 possède intrinsèquement une activité constitutive en absence d'agoniste. Cette activité peut être mise en évidence par l'action d'un des antagonistes de CCR5, le TAK-779, qui s'est révélé posséder une activité de type agoniste inverse. D'autre part, CCR5 possède au sein de l'hélice 6 une arginine en position 6.30 et non pas un glutamate ou un aspartate. Une arginine à cette position ne peut donc contribuer au maintien d’une conformation inactive par interaction avec R3.50 .Dans le but de tester le modèle de « DRY-lock » sur CCR5 et de mieux comprendre les interactions moléculaires impliquées dans l’activation du récepteur, plusieurs récepteurs mutants ont été construits au laboratoire. Tout d’abord, l’arginine 3.50 du motif DRY a été mutée en Asn (R3.50N) afin de rompre les interactions ioniques de ce résidu. L’aspartate 3.49 a été muté en Asn (D3.49N) ou en Val (D3.49V), afin de neutraliser une des interactions du « DRY-lock » (Lagane, 2005). L’arginine 6.30 a été mutée d’une part en Asp (R6.30D) ou en Glu (R6.30E), afin de rétablir une possibilité d’interaction avec R3.50, d’autre part en Ala (R6.30A) et en Gln (R6.30Q) afin de mieux cerner le rôle de la charge de l’arginine. Afin de tester l’hypothèse d’interaction entre le résidu 6.30 et le résidu 2.40, l’aspartate 2 .40 a été mutée en Ala (D2.40A) ou en Arg (D2.40R) et des récepteurs présentant les deux mutations ont également construits (D2.40A/R6.30A et D2.40R/R6.30D). L’ensemble des résultats obtenus par l’analyse de ces mutants a permis de montrer que la nature des interactions entre l’extrémité cytosolique des hélices 3 et 6 influence l’activité du récepteur CCR5 (Springael, 2007). Une interaction forte conduit à une forme de récepteur inactif alors qu’une interaction faible s’accompagne d’une augmentation d’activité constitutive. Cette propriété de CCR5 serait donc partagée avec d’autres récepteurs appartenant à la famille de la rhodopsine. Cependant les interactions inter-hélice stabilisant ces conformations seraient différentes pour CCR5. D’autre part, l’étude de la position 2.40 laisse supposer l'importance du résidu aspartate 2.40 dans le maintien d'une conformation permettant l'activité constitutive du récepteur. Nous avons également testé s’il existait une corrélation entre activité constitutive et capacité du récepteur CCR5 à former des dimères, mais les résultats ne nous ont pas permis de mettre en évidence une quelconque relation entre activité et dimérisation.<p><p> <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La dimérisation des récepteurs couplés aux protéines G est un nouveau concept apparu dans la littérature au cours des quelques années qui ont précédé le début de notre travail. Bien qu’il soit clairement établi que les récepteurs sont capables de former des homo et des hétérodimères, les conséquences fonctionnelles de telles interactions demeurent souvent peu claires. Dans une étude précédente, le laboratoire d’accueil a montré que les récepteurs aux chimiokines CCR2 et CCR5 forment des homo et des hétérodimères de manière constitutive et identifié une coopérativité négative de liaison de nature allostérique entre les deux sites de liaison de CCR2 et CCR5 dans des cellules co-exprimant les deux récepteurs. Dans ce travail, nous avons étendu cette étude au récepteur CXCR4, structurellement plus éloigné que CCR2 et CCR5 entre eux. Nous montrons par une méthode biophysique se basant sur le transfert d’énergie de bioluminescence (le BRET) que CCR2, CCR5 et CXCR4 forment des homodimères et des hétérodimères de manière constitutive. De plus nous démontrons une coopérativité négative de liaison de nature allostérique des deux sites de liaisons pour les hétérodimères CCR2/CXCR4 et CCR5/CXCR4. lorsque CXCR4 est co-exprimé avec CCR2 ou CCR5, la chimiokine spécifique de CXCR4 (SDF-1α) inhibe la liaison du traceur spécifique de CCR2 (MCP-1) ou du traceur spécifique de CCR5 (MIP-1β), et vice-versa. La nature allostérique de ces interactions est démontrée par des expériences mesurant la dissociation de traceurs en présence ou non de compétiteurs. La coopérativité négative de liaison de nature allostérique des deux sites de liaisons est montrée également dans des cellules primaires, excluant tout effet indésirable dû à la surexpression de récepteurs. Nous montrons également que l’antagoniste spécifique de CXCR4 (AMD3100) inhibe la liaison du traceur spécifique de CCR2 (MCP-1) ou du traceur spécifique de CCR5 (MIP-1β), et vice-versa (TAK-779 vs SDF-1α), uniquement quand CXCR4 est co-exprimé respectivement avec CCR2 ou CCR5. Il s’agit là de la première preuve montrant que les interactions allostériques au sein d’hétérodimères de récepteurs aux chimiokines impliquent aussi des antagonistes, et qu’un antagoniste de récepteur aux chimiokines influence la réponse fonctionnelle d’un autre récepteur aux chimiokines auquel il ne se lie pas. De tels effets fonctionnels ont été montré dans des expériences de mobilisation de Ca++, de chimiotactisme sur lymphoblastes et dans des expériences d’air pouch in vivo. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Malgré de nombreux progrès thérapeutiques, la seule réelle option thérapeutique des malades atteints d’une cirrhose terminale ou d’hépatite aiguë fulminante est la transplantation hépatique, cependant limitée par la pénurie d’organes. De même, la prise en charge des pathologies pancréatiques aigues et chroniques consiste essentiellement en traitements supportifs et des complications.<p>La réaction inflammatoire au cours des maladies hépatiques et pancréatiques joue un rôle majeur dans l’évolution de ces maladies car elle influence la sévérité de l’affection aiguë et se complique fréquemment de fibrose et de cirrhose. <p>Les chimiokines constituent une famille de peptides possédant des propriétés chimiotactiques et activatrices sur les leucocytes, et de ce fait jouent un rôle primordial dans la réaction inflammatoire en recrutant des cellules inflammatoires vers un site lésé. Les chimiokines exercent leurs activités en se liant à une famille de récepteurs à 7 hélices transmembranaires situés sur les leucocytes. <p>Le CCR5 est un récepteur pour les chimiokines CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP-1β), CCL5 (RANTES) et CCL8 (MCP-2). Le CCR5 joue un rôle important de corécepteur dans l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine. Chez l’humain, il existe une mutation relativement fréquente du CCR5, appelée CCR5Δ32, qui confère chez les patients homozygotes pour la mutation une protection presque complète contre l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine. Plus récemment, la mutation CCR5Δ32 a été rapportée comme étant associée à certaines maladies hépatiques et des traitements expérimentaux chez l’homme par inhibiteurs du CCR5 ont entraînés des cas d’hépatotoxicité sévère. De même, il a été rapporté que l’expression pancréatique de CCR5 était augmentée chez les patients atteints de pancréatite chronique. Cependant, le rôle du récepteur CCR5 et de ses ligands dans la pathogénie des maladies hépatiques et pancréatiques n’est pas connu.<p>Dans un premier temps, nous avons démontré dans un modèle expérimental d’hépatite médiée par les lymphocytes T qu’il existe une production hépatique de CCL3, CCL4 et CCL5 au cours de la maladie et que le foie des souris malades est caractérisé par une infiltration accrue de cellules CCR5+. En utilisant des souris CCR5-déficientes, nous avons ensuite montré que l’absence de CCR5 est associée à une maladie plus sévère, à une production accrue de cytokines pro-inflammatoires et des chimiokines liant le CCR5 (CCL3, CCL4 et CCL5), ainsi que par un recrutement plus important de cellules inflammatoires, particulièrement des cellules CCR1+. Nous avons ensuite montré que la production accrue des ligands du CCR5 joue un rôle important dans l’exacerbation de la maladie observée chez les souris CCR5-déficientes, puisque leur neutralisation réduit fortement la sévérité de la maladie ainsi que le recrutement hépatique de cellules inflammatoires.<p>Dans un second temps, nous avons étudié l’expression et le rôle du CCR5 et de ses ligands dans un modèle murin de pancréatite aiguë sécrétagogue, induite par des injections répétées d’un analogue de la cholécystokinine. Précocément après l’induction de la maladie, nous avons observé une augmentation de l’expression de CCL2 (MCP-1), CCL3 et CCL4 alors que l’augmentation d’expression de CCL5 est observée plus tardivement au cours de la maladie. Nous avons ensuite montré que les souris CCR5-déficientes développent une pancréatite plus sévère, ainsi qu’une production accrue de CCL2, CCL3 et CCL4, et un infiltrat inflammatoire plus marqué que les souris ‘’wild-type’’. Nous avons également montré que la production accrue de ces chimiokines joue un rôle dans l’exacerbation de la pancréatite aiguë chez les souris CCR5-déficientes. En effet, la neutralisation simultanée de ces chimiokines par des anticorps monoclonaux réduit significativement la sévérité de la maladie pancréatique chez ces souris. De même, la neutralisation simultanée des ligands du CCR5 chez des souris wild-type réduit également la sévérité de la pancréatite aiguë, suggérant un rôle de ces molécules dans la pathogénie de la pancréatite aiguë.<p>En conclusion, nous avons montré que l’absence du récepteur CCR5 augmente la susceptibilité aux maladies inflammatoires hépatiques et pancréatiques expérimentales. Le développement d’inhibiteurs du CCR5 dans l’arsenal thérapeutique contre le virus de l’immunodéficience humaine devra tenir compte de ces données, d’autant plus que des cas d’hépatotoxicité sévère ont été récemment rapportés avec certains inhibiteurs en développement et que l’association du virus de l’immunodéficience humaine avec la présence de maladies hépatiques est fréquente. Enfin, ces travaux ouvrent de nouveaux champs d’investigation au niveau de l’étude d’association du CCR5Δ32 avec les maladies inflammatoires pancréatiques et hépatiques, et des perspectives thérapeutiques ciblant CCL3, CCL4 et CCL5. <p><p><p> / Doctorat en sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

A més del seu paper en la regulació del metabolisme mineral, la vitamina D a través del seu receptor intracel·lular (VDR), juga un paper significatiu en la modulació de la resposta immune. Variants del gen VDR han estat associades amb la vulnerabilitat a malalties infeccioses com la tuberculosis y la lepra i recentment amb la progressió clínica de malalts infectats per VIH-1, la qual cosa posa de manifest el paper que la variabilitat del gen VDR pot jugar en la resposta a agents patògens.El gen CCR5 codifica per a un receptor de citoquines actuant, juntament amb el CD4, com principal correceptor del virus de la immunodeficiència humana tipus I (VIH-1- 1). Variants del gen CCR5 que alteren el patró d'expressió del receptor han estat associades amb la susceptibilitat a la infecció per VIH-1 i progressió a sida.En la present tesi doctoral s'ha caracteritzat l'estructura d´haplotips del gen VDR. Apartir del patró de blocs observat s'han seleccionat cinc variants polimòrfiques localitzades en diferents regions del gen amb la finalitat d'avaluar la seva associació amb la vulnerabilitat a la infecció pel VIH-1 i el ritme de progressió a sida. Els resultat obtinguts indican que l´haplotip GATGL, associat amb una menor funcionalitat de la ruta metabòlica de la vitamina D, confereix protecció a la infecció per VIH-1 seguint un model genètic dominant. Trobem també que el l´haplotip G++GL, relacionat també amb una menor funcionalitat de la ruta metabòlica de la vitamina D, confereix progressió lenta a sida seguint un model dominant. Finalment, trobem que l´haplotip G++AS confereix un major risc de progressió a sida, seguint un model recessiu.A més, hem caracteritzat variants polimòrfiques i l'estructura d'haplotips del gen CCR5. A partir de la caracterització d'aquestes variants es va avaluar la seva associació amb el ritme de progressió a sida en pacients VIH+. Hem trobat que el diplotipo AB, relacionat amb una menor síntesi del receptor CCR5, confereix protecció enfront de la progressió a sida.L'anàlisi conjunta dels gens VDR i CCR5 ens ha permès determinar que els pacients que presenten el genotip combinat G++AS/G++AS (gen VDR) i noAB (gen CCR5) presenten el ritme més ràpid de progressió a sida. Els pacients portadors d'aquest genotip progressen a sida 7 anys abans que els portadors del genotip de protecció G++GL/- (gen VDR) i AB (gen CCR5).Una vegada descrits els haplotipos del gen VDR que presentaven associació. Es va avaluar l'efecte fenotípic del haplotips del gen VDR associats amb infecció i progressió a sida amb els nivells d'expressió del receptor CCR5 i el seu lligat natural RANTES, així com en el balanç Th1/Th2 de pacients VIH+ addictes a droga per via intravenosa (ADVP) i controls sans. No es van detectar diferencies en la síntesi del receptor CCR5 ni en el seu lligant natural RANTES en funció del genotip per a VDR en els pacients VIH+. Tampoc es van detectar diferencies en el balanç Th1/Th2 en funció del genotip per a VDR en pacients VIH+ ADVP. No obstant això, varem trobar que els nivels de CCR5 en membrana varien en funció del genotip per a VDR en els controls sans. Els portadors del diplotip de protecció GL/- presentaven uns nivells inferiors de CCR5 en membrana que aquells que eran portadors del diplotip de risc AS/AS. Podem concloure doncs que en el context de la infecció per VIH-1 i progressió a sida l'acció de la vitamina D exerciria un paper negatiu en quant al control de la infecció viral.La caracterització dels haplotips de VDR i CCR5 podria ser d'utilitat com factor de predicció de la progressió del malalt VIH+. La disponibilitat de vitamina D depèn de factors ambientals com la dieta i de la radiació solar disponible per a la síntesi de vitamina D. Per a entendre l'impacta de la vitamina D en la infecció per VIH-1 i progressió a sida caldria considerar una complexa equació que inclogui factors ambientals, genètics i socials. / Además de su papel en la regulación del metabolismo mineral, la vitamina D a través de su receptor intracelular (VDR), juega un papel significativo en la modulación de la respuesta inmune. Variantes del gen VDR han sido asociadas con la vulnerabilidad a enfermedades infecciosas como tuberculosis o lepra y recientemente con la progresión clínica de enfermos infectados por VIH-1, lo que pone de manifiesto el papel que la variabilidad del gen VDR puede jugar en la respuesta a agentes patógenos.El gen CCR5 codifica para un receptor de citoquinas actuando, junto a CD4, como principal correceptor del virus de la inmunodeficiencia humana tipo I (VIH-1-1). El estudio de variantes en el gen CCR5 que alteren el patrón de expresión del receptor han sido asociadas con variaciones en la respuesta frente a la infección por VIH-1 y progresión a sida.En la presente tesis doctoral se ha caracterizado la estructura de haplotipos del gen VDR. A partir del patrón de bloques observado se han seleccionado cinco variantes polimórficas localizadas en distintas regiones del gen VDR con el fin de evaluar su asociación con la vulnerabilidad a la infección por el VIH-1 y el ritmo de progresión a sida.Encontramos que el haplotipo GATGL del gen VDR, relacionado con una menor funcionalidad de la ruta metabólica de la vitamina D, confiere protección frente a la infección por VIH-1 siguiendo un modelo dominante. Encontramos también que el diplotipo G++GL/- del gen VDR, relacionado con una menor funcionalidad de la ruta metabólica de la vitamina D, confiere protección frente a la progresión a sida siguiendo un modelo dominante. Por último, encontramos que el diplotipo G++AS/G++AS confiere riesgo de progresión a sida siguiendo un modelo recesivo.Además, hemos caracterizado variantes polimórficas y estructura de haplotipos del gen CCR5. A partir de la caracterización de dichas variantes se evaluó su asociación con el ritmo de progresión a sida en pacientes VIH+. Encontramos que el diplotipo AB del gen CCR5, relacionado con una menor síntesis del receptor CCR5 confiere protección frente a la progresión a sida.El análisis de las variantes de los genes VDR y CCR5 nos permitió determinar que los pacientes que presentan el genotipo combinado G++AS/G++AS (gen VDR) y noAB (gen CCR5) presentan el ritmo más rápido de progresión a sida. Los pacientes portadores de dicho genotipo progresan a sida 7 años antes que los portadores del genotipo de protección G++GL/- (gen VDR) y AB (gen CCR5).Una vez descritos los haplotipos del gen VDR que presentaban asociación se determinó su efecto fenotípico en la expresión del receptor CCR5 y su ligado natural RANTES y en el balance Th1/Th2 en pacientes VIH+ adictos a droga por vía intravenosa (ADVP) y controles sanos. No se detectaron variaciones en la síntesis del receptor CCR5 ni en su ligando natural RANTES en función del genotipo para VDR en los pacientes VIH+.Tampoco se detectaron variaciones en el balance Th1/Th2 en función del genotipo para VDR en pacientes VIH+ ADVP. Sin embargo, encontramos que la síntesis del receptor CCR5 varía en función del genotipo para VDR en los controles sanos, siendo menor en los portadores del diplotipo de protección GL/- del gen VDR.Podemos concluir por tanto que en el contexto de la infección por VIH-1 y progresión a sida la acción de la vitamina D ejercería un papel negativo en el control de la infección viral.La caracterización del haplotipo del VDR y CCR5 de las variantes polimórficas analizadas podría servir como factor de predicción de la progresión del enfermo VIH+. Ladisponibilidad de vitamina D depende de factores ambientales como la dieta y la radiación solar disponible para la síntesis de la vitamina D . Para entender el impacto de la vitamina D en la infección por VIH-1 y progresión a sida hay que considerar una compleja ecuación que incluya factores ambientales, genéticos y sociales. / In addition to a important function in the regulation of the mineral metabolism, vitamin D plays a significant role in the modulation of the immune response through its intracellular receptor, VDR. Variants of the VDR gene have been associated with vulnerability to infectious diseases like tuberculosis or leprosy and recently with the clinical progression of patients infected by HIV-1. These facts clearly indicate the importance of VDR variability in the response against pathogenic agents.CCR5 gene codifies for a cytokine receptor protein and is, together with the CD4, the main coreceptor of the virus of the human immunodeficiency type I (HIV-1-1). The study of variants in the CCR5 gene that alter the expression pattern of the receptor has shown that this variation is associated with differences in the response against HIV-1 infection and progression to AIDS.In the present thesis, the structure of haplotypes of the VDR gene has been characterized. From the block pattern observed, five polymorphic variants located in different regions from the VDR gene have been characterized with the purpose of evaluating its association with the vulnerability to infection by the HIV-1 and the rate of progression to AIDS. We have found that haplotype GATGL of the VDR gene, associated with a lower functionality of the metabolic pathway of vitamin D, confers protection from HIV-1 infection following a dominant model. We also found that diplotype G++GL/- of the VDR gene, which also implicates a lower functionality of the metabolic pathway of vitamin D, confers protection from progression to AIDS following a dominant model. Finally, we found that diplotype G++AS/G++AS increase the risk of progression to AIDS, following a recessive model.In addition, we have characterized several polymorphic variants and the structure of haplotypes for the CCR5 gene. Based in the characterization of these variants, we evaluated its association with the rate of progression to AIDS in patients HIV-1. We found that diplotype AB of CCR5 gene, linked to a lower synthesis of receptor CCR5, confers protection from progression to AIDS.The analysis of the variants of VDR and CCR5 genes together allowed us to determine that the patients who present combined genotype G++AS/G++AS (VDR gene) and noAB (CCR5 gene) presents the fastest rate from progression to AIDS. Patients carrying this genotype progress to AIDS 7 years earlier than carriers of protection genotype G++GL/- (VDR gene) and AB (CCR5 gene).Once defined the haplotypes of VDR gene that present association, we determined his phenotypic effect in the expression of receptor CCR5 and his natural ligand RANTES, as well as in the Th1/Th2 balance in intravenous-drugs-users (IVDU) HIV-1 patients and healthy controls. Variations in the synthesis of receptor CCR5 or in his natural ligand RANTES based on the genotype for VDR in patients HIV+ were not detected. Neither were detected variations in the Th1/Th2 based on the genotype for VDR in patients HIV-1 IVDU. Nevertheless, we found that the synthesis of receptor CCR5 varies depending on the genotype for VDR in the healthy controls, being lower in the carriers of the diplotype of protection GL/- of the VDR gene.Therefore, we can conclude that in the context of the infection by HIV-1 and progression to AIDS, vitamin D would play a negative paper in the control of the viral infection.The characterization of the VDR and CCR5 haplotypes for the analyzed polymorphic variants could be a useful factor for predicting progression in HIV+ patient. In addition to the genetic background, different environmental factors as well as behavioral factors could also be considered since the vitamin D availability is dependent of diet and solar radiation D. A complex equation including environmental, genetic and behavioral factors should be proposed to comprehend the impact of vitamin-D3 on HIV-1-1 infection. Our results offer a new scenario to understand the relationship between HIV-1-1 infection and vitamin-D3 metabolism, including dietary supply and synthesis through sunlight exposure.

It is widely known that early estimates about the binding properties of drug candidates are important in the drug discovery process. Surface plasmon resonance (SPR) biosensors have become a standard tool for characterizing interactions between a great variety of biomolecules and it offers a unique opportunity to study binding activity. The aim of this project was to develop a SPR based assay for pre-screening of low molecular weight (LMW) drug compounds, to enable filtering away disturbing compounds when interacting with drugs. The interaction between 47 LMW compounds and biological ligands were investigated using the instrument BiacoreTM, which is based on SPR-technology.