Os estágios avançados da DPOC são longos e dolorosos processos onde há o aumento dos sintomas, fazendo com que o paciente entre em um ciclo vicioso de deterioração da capacidade física, dispneia, ansiedade e isolamento social. Deste modo, o exercício vem se mostrando um componente importante na DPOC, auxiliando no tratamento medicamentoso para a redução dos sintomas e melhora da qualidade de vida. Neste contexto, não há muitos relatos na literatura sobre o papel da atividade física no padrão de secreção de citocinas e na resposta proliferativa de pacientes com DPOC. Além disso, não há muita concordância sobre o comprimento do telômero e fenótipo celular quando a comparados tabagistas que não desenvolvem a doença e pacientes com DPOC. O objetivo deste trabalho foi comparar alguns parâmetros imunológicos entre pacientes com DPOC e indivíduos tabagistas sem DPOC, e em pacientes com DPOC antes e após o programa de reabilitação oferecido no Hospital das Clínicas da FMUSP. As coletas de sangue foram realizadas em dois momentos para o grupo DPOC (pré e pós-programa de reabilitação pulmonar), e em um único momento para o grupo tabagista. Estas amostras foram processadas para obtenção de células mononucleares do sangue periférico, onde foram analisados os seguintes parâmetros: proliferação celular e apoptose, fenotipagem de linfócitos, comprimento relativo do telômero e dosagem de citocinas. Verificamos que indivíduos tabagistas possuem menores quantidades de proteína C reativa que pacientes com DPOC, e uma tendência a maior número de linfócitos. Além disso, o comprimento relativo do telômero em tabagistas é maior do que em pacientes com DPOC, especialmente em linfócitos TCD8+, e em menor grau em linfócitos TCD4+. Linfócitos TCD8+ de portadores de DPOC apresentaram maiores porcentagens de células terminalmente diferenciadas, sugerindo exaustão celular destes linfócitos, e menores porcentagens de células de memória central e memória efetora. Pacientes com DPOC apresentam maiores quantidades de citocinas comparados aos tabagistas sem DPOC. Já na comparação pré e pós-reabilitação verificamos menores quantidades de leucócitos, menores pontuações nos questionários de sintomas, e maiores distâncias percorridas no teste de caminhada de 6 minutos. Na avaliação da linfoproliferação, para as células estimuladas com mitógeno (fitohemaglutinina) e antígenos (citomegalovirus e Haemophilus influenza) foi possível verificar melhora na resposta linfoproliferativa dos pacientes no período pós-reabilitação, assim como maiores níveis da citocina imunoreguladora IL-10. Deste modo concluímos que pacientes com DPOC possuem um perfil mais pró-inflamatório e de diferenciação terminal que tabagistas sem a doença e que exercício físico é capaz de modular o ambiente inflamatório melhorando alguns parâmetros da resposta imune celular / The advanced stages of COPD are long and painful with increase of symptoms making the patients enter a vicious cycle of deterioration of physical capacity, dyspnea, anxiety and social isolation. Therefore, the exercise shows an important component of COPD pathogenesis, assisting in pharmacological treatment, reducing symptoms and enhancing life quality. In this context, there are no concise reports in literature about the role of physical activity in the pattern of cytokine secretion and proliferative response in COPD patients. Besides this, there is no consensus in the data comparing smokers with COPD and smokers without COPD. Because of this, we compared some immune parameters of smokers with COPD and smokers without COPD, and evaluated the cellular immune response before and after a rehabilitation program offered at the Hospital das Clínicas FMUSP. Blood collection was performed in two moments in the COPD group (before and after the rehabilitation program), and once in smokers without COPD. After that the samples were processed to peripheral blood mononuclear cells isolation, in which were analyzed the cellular proliferation and apoptosis, the lymphocyte phenotypic characteristics, the telomere length and the cytokines levels in serum and culture supernatants. Smokers without COPD have lower levels of C reactive protein, and a trend to greater percentages of lymphocytes than in smoker with COPD. The telomere length of COPD patients was shorter than that of smokers without COPD, especially in TCD8+ lymphocytes, with a non-significant trend in the TCD4+ lymphocytes. The TCD8+ subpopulation of COPD patients comprised greater percentages of terminally differentiated cells, and lower percentages of central memory and effector memory cells, suggesting a bias to more terminally differentiated (and eventually exhausted) cells. Moreover, the levels of pro inflammatory cytokines were greater in COPD patients. Evaluation of the exercise effect, we found greater quantities of leucocytes, lower scores in the symptoms questionnaires and longer distances in the six minute walk test after the rehabilitation program. Besides this, the proliferative response to the mitogen phytohemaglutinin, and the antigens from cytomegalovirus and nontypeable Haemophilus influenza were all improved after the exercise program with greater levels of secretion of the anti-inflammatory cytokine IL-10. In conclusion, COPD patients have a pro inflammatory profile and a bias for more terminally differentiated (and eventually exhausted) cells when compared with smokers without COPD, and that the exercise program is capable of modulating the inflammatory microenvironment enhancing some parameters of the cellular immune response

O epitélio gástrico de ratos passa por modificações morfofisiológicas importantes durante o primeiro mês de vida pós-natal e a dieta é um dos principais fatores que influenciam esse desenvolvimento. Ratos receberam dieta com 20% (C) ou 8% (RP) de proteína, durante o período pré e pós-natal. Avaliamos em ratos de 14, 30 e 50 dias os efeitos da restrição protéica sobre proliferação celular no epitélio gástrico, massa do estômago e corpórea, comprimento do intestino e, expressão de ghrelina no estômago e no plasma. O grupo RP apresentou proliferação celular, massa do estômago e corpórea e comprimento do intestino reduzidos em relação ao grupo C. E maior imunomarcação para ghrelina em animais RP com 30 e 50d em comparação ao grupo C. Não houve diferença na imunomarcação entre animais de 14d. Os níveis plasmáticos de ghrelina apresentaram a mesma tendência observada na imunomarcação. O consumo de quantidade adequada de proteína é importante durante o desenvolvimento gástrico de ratos e a ghrelina apresenta resposta hormonal diferente de acordo com a idade do animal. / The gastric epithelium of rats undergoes morphophysiological changes throughout the first month of life and diet is one of the main factors influencing the development. Rats were fed a 20% (NP) or 8% (RP) protein diet throughout the pre- and post-natal life. We analyzed the cell proliferation and observed the body and stomach weight and small intestine length at 14, 30 and 50 days rats. Additionally, we evaluated ghrelin in gastric epithelium and its plasma levels. Cell proliferation in the gastric epithelium, body and stomach weight and small intestine length were reduced in RP animals when compared to NP animals. We observed an increase in the number of labeled cells for ghrelin in 30- and 50-d-old RP rats when compared to the NP group and no difference was found in 14-d-old animals. Plasma ghrelin levels showed the same results observed in immunohistochemical reactions. These results emphasize the importance of diet protein on the development of gastric mucosa and protein restriction seems to differently modulate ghrelin response at different ages.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:43:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DiegoMS_DISSERT.pdf: 1792102 bytes, checksum: 305ff686e7a1606e27026b528fd1d091 (MD5) Previous issue date: 2013-01-25 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Low level laser irradiation (LLLI) has been used in Dentistry to promote wound healing and tissue regeneration. The literature shows a positive effect of LLLI on cell proliferation, but little is known about their effectiveness in promoting stem cells proliferation. The aim of this study was to evaluate the effect of LLLI on the proliferative rate of human periodontal ligament stem cells. Extracts of periodontal ligament were isolated from two third molars removed by surgical and/or orthodontic indication. After enzymatic digestion, the cells were grown in α-MEM culture medium supplemented with antibiotics and 15% fetal bovine serum. On the third subculture, the cells were irradiated with a InGaAlP-diode laser, using two different energy densities (0,5J/cm 2 - 16 seconds and 1,0J/cm? - 33 seconds), with wavelength of 660nm and output power of 30mW. A new irradiation, using the same parameters, was performed 48h after the first. A control group (non irradiated) was kept under the same experimental culture conditions. The Trypan blue exclusion test and the mitochondrial activity of the cells measured by MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide] essay were performed to assess the cell proliferation in the intervals of 0, 24, 48 e 72 h after irradiation. The data of cell counts were submitted to nonparametrical statistical tests (Kruskal-Wallis and Mann-Whitney), considering a confidence interval of 95%. DAPI (4 -6-Diamidino-2-phenylindole) staining of the cells was performed at 72h interval to evaluate possible nuclear morphological changes induced by LLLI. The results of this study show that the energy density of 1,0 J/cm? promoted greater cell proliferation compared to the other groups (control and 0,5 J/cm?) at intervals of 48 and 72h. The mitochondrial activity measured by MTT essay showed similar results to the Trypan blue cell counting test. The group irradiated with 1,0J/cm? exhibited a significantly higher MTT activity in the intervals of 48 and 72h, when compared to the group irradiated with 0,5J/cm?. No nuclear morphological change was observed in the cells from the three groups studied. It is concluded that LLLI has stimulatory effects on the proliferation of human periodontal ligament stem cells. Therefore, the use of laser irradiation in this cell type may be important to promote future advances in periodontal regeneration / O laser de baixa intensidade (LBI) tem sido utilizado na Odontologia com a finalidade de promover cicatriza??o e regenera??o dos tecidos. A literatura mostra um efeito positivo do LBI na prolifera??o celular, por?m pouco se sabe sobre a sua efic?cia na prolifera??o de c?lulas-tronco. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da irradia??o do LBI na taxa proliferativa de c?lulas -tronco do ligamento periodontal humano. Extratos de ligamento periodontal foram isolados de dois terceiros molares h?gidos removidos por indica? ?o cir?rgica e/ou ortod?ntica. Ap?s a digest?o enzim?tica, as c?lulas foram cultivadas em meio de cultura α-MEM suplementado com antibi?ticos e 15% de soro fetal bovino. No terceiro subcultivo, as c?lulas foram irradiadas com um laser diodo InGaAlP, utilizando-se duas diferentes densidades de energia (0,5J/cm 2 - 16 segundos e 1,0J/cm? - 33 segundos), comprimento de onda de 660nm e pot?ncia de 30mW. Uma nova irradia??o, utilizando os mesmos par?metros, foi realizada 48 h ap?s a primeira. Um grupo controle (n?o irradiado) foi mantido nas mesmas condi??es experimentais de cultivo. O m?todo de exclus?o por azul de Tripan e a atividade mitocondrial das c?lulas medida atrav?s do ensaio de MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetraz?lio], nos intervalos de 0, 24, 48 e 72 h p?s-irradia??o, foram utilizados a fim de avaliar a prolifera??o celular. Os dados das contagens celulares foram submetidos a testes estat?sticos n?o param?tricos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, considerando um intervalo de confian?a de 95%. Com o objetivo de verificar poss?veis altera??es morfol?gicas nucleares induzidas pelo laser, as c?lulas foram submetidas ? marca??o com DAPI (4 -6-Diamidino-2-phenylindole) no intervalo de 72 h. Os resultados do presente estudo mostraram que a densidade de energia de 1,0 J/cm? promoveu maior prolifera??o das c?lulas em compara??o com os outros grupos (controle e laser 0,5 J/cm?) nos intervalos de 48 e 72 h. A atividade mitocondrial, medida pelo ensaio de MTT, apresentou resultados semelhantes ?s contagem celulares com azul de Tripan, com o grupo irradiado com 1,0 J/cm? exibindo uma atividade significativamente maior do MTT nos intervalos de 48 e 72 h, quando comparado com o grupo irradiado com 0,5 J/cm?. Nenhuma altera??o morfol?gica nuclear foi observada, tanto das c?lulas do grupo controle quanto nas c?lulas irradiadas. Conclui-se que o LBI apresenta efeitos estimulantes sobre a prolifera??o de c?lulas-tronco do ligamento periodontal humano. Portanto, a aplica??o da laserterapia neste tipo celular pode ser importante para futuros avan?os na regenera??o periodontal

FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2), o fundador da família FGF, tem funções regulatórias na mitogênese, diferenciação, morfogênese e reparo tecidual. Diversas espécies moleculares de FGF2 compartilham uma seqüência C-terminal comum de 155 aminoácidos, pois se originam de diferentes sítios de iniciação de leitura de um único mRNA. O menor, o FGF2-18kDa, é liberado extracelularmente para se ligar a receptores específicos (FGFRs) para disparar as funções parácrinas e autócrinas pelas quais este fator é conhecido. Por outro lado, as espécies maiores (FGF2-21, 22, 22,5 e 34kDa) são intracelulares se ligam a parceiros moleculares desconhecidos para exercer funções intrácrinas ainda indefinidas. O objetivo desta tese foi produzir espécies recombinantes do FGF2-18 e FGF2-22,5, na forma de proteínas de fusão, para analisar funções biológicas e mecanismos de sinalização. Nas células malignas Y1 de camundongo, os recombinantes de FGF2-18kDa (FGF2-18, His-FGF2-18 e His-FGF2-18-ProA) dispararam uma resposta antagônica estimulando as vias de sinalização mitogênica, mas bloqueando o ciclo celular. Nos fibroblastos não tumorigênicos Balb3T3, estes mesmos recombinantes de FGF2-18kDa dispararam apenas a resposta mitogênica clássica. Todos os efeitos biológicos destes recombinantes de FGF2-18kDa foram bloqueados pelo inibidor específico da proteína quinase de tirosina dos FGFRs, PD173074, demonstrando que são respostas intermediadas pelos FGFRs. Portanto, os domínios estruturais adicionados aos recombinantes de FGF2-18kDa não impediram que estas proteínas se ligassem e ativassem os FGFRs. Por outro lado, o recombinante His-FGF2-22,5 dispara apenas as vias de sinalização mitogênica em ambas as células Y1 e 3T3, mas este efeito biológico não é inibido por PD173074. Estes resultados sugerem que a seqüência N-terminal de 55 resíduos, rica em aminoácidos básicos, impede que o FGF2-22,5kDa se ligue e/ou ative os FGFRs. Entretanto, o recombinante His-FGF2-22,5ProA dispara a resposta antagônica característica do FGF2-18kDa. As implicações destes últimos resultados é que o domínio de ProA adicionado ao C-terminal torna o FGF2-22,5kDa um bom ligante dos FGFRs. A interação física entre ligante e receptor das formas recombinantes His-FGF2-18kDa (ou His-FGF2-18ProA) e FGF2-22,5kDa com os putativos FGFRs foi analisada através da técnica de SPR e os resultados mostram KDs aproximados (Kd18=21, 488.10-9 e Kd22,5=20,70393.10-9), enquanto que o número de sítios ligantes em vesículas microssomais das células é significantemente inferior para o FGF2-22,5kDa. Estes resultados são compatíveis com a existência de receptores diferentes para FGF2-18kDa e FGF2-22,5kDa, uma hipótese ainda a ser definitivamente corroborada. Em conclusão, o FGF2-18kDa, mesmo em formas recombinantes como proteína de fusão, dispara todos os efeitos biológicos descritos para FGF2, através dos FGFRs. Diferentemente, o FGF2-22,5kDa, como fator parácrino, só desencadeou a resposta mitogênica clássica de FGF2, provavelmente através de receptores diferentes dos FGFRs. Os resultados e conclusões desta tese têm um potencial indiscutivelmente relevante para a biologia molecular do câncer, com implicações possíveis em terapia oncológica / FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2), the founder of the FGF family, has regulatory functions in mitogenesis, differentiation, morphogenesis and tissue repair. Multiple FGF2 molecular species, sharing a C-terminal sequence of 155 amino acids, are translated from different iniciation sites of the same mRNA. The smaller, the FGF2-18kD, is extracellularly released to bind to specific membrane receptors (FGFRs), performing paracrine and autocrine functions. On the other hand, the larger FGF2s (21, 22, 22.5 and 34kDa) are intracellular species that bind to unknown partners to play still undefined intracrine roles. The aim of this thesis was to produce recombinant species of FGF2-18kDa and FGF2-22,5kDa, in the form of fusion proteins, to analyze functions and signaling mechanisms. In mouse Y1 malignant cells, FGF2-18kD recombinants (FGF2-18kDa and His-FGF2-18kDaProA) triggered an antagonistic response activating mitogenic signaling pathways, but blocking the cell cycle. However, in non tumorigenic Balb3T3 fibroblasts, these same FGF2-18kD recombinants only elicited the classical mitogenic response. All biological effects of these FGF2-18kD recombinants were blocked by the specific inhibitor of FGFR-protein-tyrosine-kinases, PD173074, demonstrating that these responses are mediated by FGFRs. Therefore, the new peptide domains added to FGF2-18kD did not prevent these recombinant fusion proteins to bind and activate FGFRs. Conversely, the recombinant His-FGF2-22,5kDa triggered only mitogenic signaling pathways in both Y1 and Balb3T3 cells, a biological effect not inhibited by PD173074. These results suggested that the additional basic-rich N-terminal sequence of 55 amino acid residues, found in FGF2-22,5kDa, prevents this FGF2 species from binding and / or activate FGFRs. However, surprisingly, the recombinant His-FGF2-22kDaProA triggered the antagonistic response characteristic of FGF2-18kDa. These results imply that the ProA-domain added to the C-terminal end rendered the FGF2-22,5kDaProA a good ligand of FGFRs. The physical interaction between recombinants of both His-FGF2-18kD and His-FGF2-22kDa with putative FGFRs, analyzed by SPR, yielded close KD values (KD18=21, 5.10-9 e K D22,5=20,7.10-9), while the number of binding sites in cell microsomal vesicles were significantly lower for the His-FGF2-22,5kDa. These results are consistent with the existence of different receptors for FGF2 and FGF2-18kD-22,5kDa, a hypothesis that has yet to be definitively confirmed. In conclusion, FGF2-18kD, even as recombinant fusion proteins, triggered all biological effects of FGF2, through FGFRs. Conversely, the FGF2-22, 5kDa only triggered the classical mitogenic response, probably via receptors other than FGFRs. The results and conclusions of this thesis are potentially of great interest in cancer molecular biology, with implications in oncologic therapy.

Os estágios avançados da DPOC são longos e dolorosos processos onde há o aumento dos sintomas, fazendo com que o paciente entre em um ciclo vicioso de deterioração da capacidade física, dispneia, ansiedade e isolamento social. Deste modo, o exercício vem se mostrando um componente importante na DPOC, auxiliando no tratamento medicamentoso para a redução dos sintomas e melhora da qualidade de vida. Neste contexto, não há muitos relatos na literatura sobre o papel da atividade física no padrão de secreção de citocinas e na resposta proliferativa de pacientes com DPOC. Além disso, não há muita concordância sobre o comprimento do telômero e fenótipo celular quando a comparados tabagistas que não desenvolvem a doença e pacientes com DPOC. O objetivo deste trabalho foi comparar alguns parâmetros imunológicos entre pacientes com DPOC e indivíduos tabagistas sem DPOC, e em pacientes com DPOC antes e após o programa de reabilitação oferecido no Hospital das Clínicas da FMUSP. As coletas de sangue foram realizadas em dois momentos para o grupo DPOC (pré e pós-programa de reabilitação pulmonar), e em um único momento para o grupo tabagista. Estas amostras foram processadas para obtenção de células mononucleares do sangue periférico, onde foram analisados os seguintes parâmetros: proliferação celular e apoptose, fenotipagem de linfócitos, comprimento relativo do telômero e dosagem de citocinas. Verificamos que indivíduos tabagistas possuem menores quantidades de proteína C reativa que pacientes com DPOC, e uma tendência a maior número de linfócitos. Além disso, o comprimento relativo do telômero em tabagistas é maior do que em pacientes com DPOC, especialmente em linfócitos TCD8+, e em menor grau em linfócitos TCD4+. Linfócitos TCD8+ de portadores de DPOC apresentaram maiores porcentagens de células terminalmente diferenciadas, sugerindo exaustão celular destes linfócitos, e menores porcentagens de células de memória central e memória efetora. Pacientes com DPOC apresentam maiores quantidades de citocinas comparados aos tabagistas sem DPOC. Já na comparação pré e pós-reabilitação verificamos menores quantidades de leucócitos, menores pontuações nos questionários de sintomas, e maiores distâncias percorridas no teste de caminhada de 6 minutos. Na avaliação da linfoproliferação, para as células estimuladas com mitógeno (fitohemaglutinina) e antígenos (citomegalovirus e Haemophilus influenza) foi possível verificar melhora na resposta linfoproliferativa dos pacientes no período pós-reabilitação, assim como maiores níveis da citocina imunoreguladora IL-10. Deste modo concluímos que pacientes com DPOC possuem um perfil mais pró-inflamatório e de diferenciação terminal que tabagistas sem a doença e que exercício físico é capaz de modular o ambiente inflamatório melhorando alguns parâmetros da resposta imune celular / The advanced stages of COPD are long and painful with increase of symptoms making the patients enter a vicious cycle of deterioration of physical capacity, dyspnea, anxiety and social isolation. Therefore, the exercise shows an important component of COPD pathogenesis, assisting in pharmacological treatment, reducing symptoms and enhancing life quality. In this context, there are no concise reports in literature about the role of physical activity in the pattern of cytokine secretion and proliferative response in COPD patients. Besides this, there is no consensus in the data comparing smokers with COPD and smokers without COPD. Because of this, we compared some immune parameters of smokers with COPD and smokers without COPD, and evaluated the cellular immune response before and after a rehabilitation program offered at the Hospital das Clínicas FMUSP. Blood collection was performed in two moments in the COPD group (before and after the rehabilitation program), and once in smokers without COPD. After that the samples were processed to peripheral blood mononuclear cells isolation, in which were analyzed the cellular proliferation and apoptosis, the lymphocyte phenotypic characteristics, the telomere length and the cytokines levels in serum and culture supernatants. Smokers without COPD have lower levels of C reactive protein, and a trend to greater percentages of lymphocytes than in smoker with COPD. The telomere length of COPD patients was shorter than that of smokers without COPD, especially in TCD8+ lymphocytes, with a non-significant trend in the TCD4+ lymphocytes. The TCD8+ subpopulation of COPD patients comprised greater percentages of terminally differentiated cells, and lower percentages of central memory and effector memory cells, suggesting a bias to more terminally differentiated (and eventually exhausted) cells. Moreover, the levels of pro inflammatory cytokines were greater in COPD patients. Evaluation of the exercise effect, we found greater quantities of leucocytes, lower scores in the symptoms questionnaires and longer distances in the six minute walk test after the rehabilitation program. Besides this, the proliferative response to the mitogen phytohemaglutinin, and the antigens from cytomegalovirus and nontypeable Haemophilus influenza were all improved after the exercise program with greater levels of secretion of the anti-inflammatory cytokine IL-10. In conclusion, COPD patients have a pro inflammatory profile and a bias for more terminally differentiated (and eventually exhausted) cells when compared with smokers without COPD, and that the exercise program is capable of modulating the inflammatory microenvironment enhancing some parameters of the cellular immune response

Centrado no carcinoma colorretal, o presente trabalho visou: 1) Estudar a distribuição das principais variáveis anatomopatológicas, pesquisando sua associação com metástase linfonodal ou hepática. 2) Com base nas eventuais associações encontradas, selecionar um conjunto de variáveis que, estudadas no tumor primário, possam predizer a presença de metástase nodal ou hepática. 3) Analisar os perfis de imunoexpressão de alguns marcadores potencialmente relacionados à citoarquitetura (queratina 7 e 20) e ao crescimento tumoral (proliferação através do Ag Ki-67 e apoptose através da queratina 18 clivada) em amostras de mucosa normal, adenocarcinoma primário, metástase linfonodal e metástase hepática, explorando suas eventuais relações com as variáveis histopatológicas e o estadio da lesão. 4) Pesquisar possíveis associações entre a expressão dos transportadores de monocarboxilato 1, 2 e 4, moléculas reguladoras do pH intracelular, e os marcadores acima relacionados e as variáveis anatomopatológicas. A casuística foi constituída por 139 adenocarcinomas colorretais, sendo 96 sem metástase hepática e 39 com metástase hepática. Os casos foram revistos e 13 variáveis anatomopatológicas foram selecionadas para fazer parte do estudo. Foram confecionados manualmente blocos de microarranjos teciduais (TMA) de mucosa normal, tumor primário, metástase linfonodal e metástase hepática, cujos cortes foram submetidos a estudo imuno-histoquímico utilizando anticorpos anti queratina 7 (K7), queratina 20 (K20), Ki-67 e queratina 18 clivada. Em 126 blocos de parafina de tumores, e 86 amostras de mucosa normal correspondentes foram submetidos a estudo imuno-histoquímico utilizando anticopos anti transportadores de monocarboxilato 1, 2 e 4 (MCT1, MCT2 e MCT 4). A presença de metástase linfonodal asociou-se estatisticamente com a presença de infiltração tumoral além da camada muscular própria (T3 ou T4) (p<0,001), presença de desmoplasia tumoral moderada / intensa (p=0,043), presença de infiltração de vasos linfáticos (p<0,001), presença de infiltração venosa (p<0,001) e presença de infiltração tumoral perineural (p<0,001). A presença de metástase hepática teve associação estatisticamente significativa com a presença de infiltração tumoral além da camada muscular própria (p = 0,004) e com a presença de bordas tumorais infiltrativas ( p=0,05). As amostras de mucosa colorretal normal apresentaram baixa freqüência de positividade para a queratina 7, o mesmo ocorrendo com os adenocarcinomas primários e as metástases linfonodais. Detectamos, entretanto, diferença estatística significante entre a maior imunoexpressão da K7 nas metástases hepáticas quando comparadas aos adenocarcinomas primários (p<0,001) e às metástases linfonodais (p=0,015). Conforme esperado a queratina 20 mostrou-se presente na quase totalidade das amostras de mucosa colorretal normal e em mais de 90% das amostras dos vários tipos de lesão aqui estudadas. A taxa de proliferação nos adenocarcinomas primários foi significantemente superior à da observada na mucosa normal (p<0,001). Não houve diferenças estatísticas entre as taxas proliferativas das amostras neoplásicas. O índice de células em apoptose foi estatisticamente significante mais elevado nos adenocarcinomas primários que na mucosa normal (p<0,001), assim como foi mais elevado nas metástases hepáticas em relação aos adenocarcinomas primários (p=0,022). Tumores maiores que 5 cm apresentaram índices apoptóticos mais elevados que aqueles menores que 5 cm (p=0,005). As expressões citoplasmática e membranosa dos MCT1 e 4 foram mais frequentes nos adenocarcinomas que nas mucosas normais (p<0,001). A expressão membranosa do MCT1 associou-se à presença de infiltração linfática (p=0,004) , infiltração sangüínea (p=0,018) e à presença de índices apoptóticos mais elevados. Em conclusão, dentre as variáveis histológicas, infiltração linfática tumoral e infiltração de vasos sangüíneos foram fatores de risco independentes para metástase linfonodal e infiltração tumoral além da muscular própria e a presença de bordas tumorais infiltrativas foram fatores de risco independentes para metástase hepática nas análises multivariadas. A queratina 7 foi mais frequentemente expressa nas metástases hepáticas que nas metástases linfonodais e adenocarcinomas primários, indicando que a aquisição da expressão da queratina 7 pode ser uma alteração tardia do citoesqueleto associada a maior agressividade do tumor. A proliferação celular marcada pelo Ag Ki-67 assim como a apoptose, marcada pela queratina 18 clivada mostraram significativo incremento do normal para o adenocarcinoma primário e suas respectivas metástases. Os MCTs foram mais expressos nos adenocarcinomas que nas mucosas normais, sugerindo possível interferência de seu papel no controle do pH intracelular nestas neoplasias / The aims of this study in colorectal carcinoma were: 1) Verify the distribution of the most important anatomopathological variables, and identifying their relationship with lymph node or liver metastasis. 2) Considering the associations obtained in the first aim, a group of variables was selected to verify the prediction of lymph node or liver metastasis. 3) Analyze the immunoprofile of both markers associated with cytoarchitecture (keratins 7 and 20) and with tumor growth (proliferation and apoptosis using Ki-67 and cleaved keratin 18, respectively) in samples of nontumoral mucosa, primary adenocarcinoma, lymph node metastasis and liver metastasis, exploring the eventual relation with anatomopathological variables and tumor stage. 4) Look for possible associations between molecules related to intracellular pH control, as monocarboxylates transporters 1, 2 and 4, and the markers above mentioned and anatomopathological variables. One hundred and thirty nine colorectal carcinomas is the universe of the casuistic, 96 of them without liver metastasis and 39 metastatic to the liver was studied. Thirteen anatomopathological variables were selected and semi-quantified. We mannualy builted tissue microarrays (TMAs) of non tumoral mucosa, primary adenocarcinoma, lymph node metastasis and liver metastasis. The histological sections from the TMAs were submmitted to immunohistochemical study using antibodies against keratin 7 (K7), keratin 20 (K20), Ag Ki-67 and cleaved keratin 18. In 126 tumor paraffin blocks, 86 of which also had non tumoral mucosa were submitted to immunohistochemical stain using antibodies against monocarboxylate transportes 1, 2 and 4 (MCT1, MCT2 e MCT 4). Lymph node metastasis was associated with tumor infiltration across muscularis propria(p<0,001), moderate / intense desmoplasia(p=0,043), lymph vessel infiltration(p<0,001), venous infiltration (p<0,001) and perineural infiltration (p<0,001). Liver metastasis was statistically associated with tumor infiltration across muscularis propria and infiltrative tumor borders ( p=0,05). Few colorectal mucosa samples, as well as primary tumor and lymph node metastasis showed immunoexpression of K7, although we found statistically significant higher immunoexpression of K7 in liver metastasis as compared with primary carcinomas (p<0,001) and with lymph node metastasis (p=0,015). As expected, K20 was expressed in more than 90% of the samples examined. Higher Ki-67 rates were found in adenocarcinoma compared with normal mucosa (p<0,001). We did not find statistical differences of proliferation rates between neoplastic samples. Apoptotic index were higher in primary adenocarcinomas than in normal mucosa ( p<0,001), and was also higher in liver metastasis than in primary adenocarcinoma (p=0,022). We also found higher apoptotic index in tumors that measured more than 5 cm (p=0,005). Membranous and cytoplasmic expression of MCTs 1 and 4 were found more frequently expressed in adenocarcinoma than in non neoplastic mucosa (p<0,001). Membranous MCT1 expression was associated with lymph vessel infiltration (p=0,004), venous infiltration (p=0,018) and with higher apoptotic index. Lymphatic vessel infiltration and venous vessel infiltration were found as independent risk factors for lymph node metastasis. Tumor infiltration across muscularis propria and infiltrative tumor borders were also independent risk factor for liver metastasis by multivariate analysis. Keratin 7 were more frequently expressed in liver metastasis samples than in lymph node metastasis and primary adenocarcinomas, indicating that the acquisition of K7 expression could be a late cytoskeleton alteration associated with higher tumor aggressiveness. Proliferation rates as well as higher frequency of apoptosis, showed increased expression from normal mucosa to primary adenocarcinoma and its respective metastasis. Finally, monocarboxylate transporters were higher expressed in adenocarcinoma samples than in normal mucosa samples indicating a probable role in the intracellular pH in colorectal neoplasia

Os genes homeobox são responsáveis por codificar proteínas nucleares que agem como fatores de transcrição durante o desenvolvimento embrionário, regulando proliferação e diferenciação celular. A expressão alterada do gene homeobox PROX1 já foi identificado em diferentes neoplasias, incluindo mama, esôfago, fígado, sistema biliar, linfomas e cavidade bucal. Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da superexpressão do gene PROX1 em linhagem celular derivada de carcinoma epidermóide bucal nos mecanismos de proliferação e diferenciação celular, apoptose e perfil global de expressão gênica. Após a superexpressão deste gene na linhagem celular SCC-9, foi realizada a análise de proliferação por meio dos ensaios de curva de proliferação celular, citometria de fluxo, índice de incorporação de BrdU ao DNA e expressão de Ki67. A diferenciação celular foi verificada por meio de reações imunocitoquímicas para as citoqueratinas 1, 10, 13, 14, 16, 18 e 19 e a apoptose foi avaliada por meio de células positivas para anexina-V e iodeto de propídeo. O ensaio de microarray foi realizado para avaliação do perfil global de expressão gênica na linhagem celular SCC9 com superexpressão do gene PROX1. Observou-se que a superexpressão do gene PROX1 promove redução da proliferação celular, bem como reduz a expressão das citoqueratinas 1, 13, 18 e 19. Não houve alteração na taxa de apoptose entre as células com superexpressão do gene PROX1 e controles. Os resultados do microarray revelaram a expressão diferencial significante de genes envolvidos com os processos de desenvolvimento, adesão e invasão celular. Desta maneira, estes resultados são fortemente sugestivos de que o gene PROX1 inibe a proliferação celular e contribui para a diferenciação do carcinoma epidermóide bucal. / Homeobox genes encode transcription factors with an important role during normal development by controlling cellular proliferation and differentiation. Altered expression of PROX1 homeobox gene is related to many cancers, including those of the breast, esophagus, liver, billiary system and lymphomas. The aim of this study was evaluate the effects of PROX1 overexpression, in an oral squamous cell carcinoma cell line, on cellular proliferation and differentiation, apoptosis as well as gene expression prolfile. After overexpression of PROX1 gene in SCC9 cell line, proliferation was assessed by proliferation curve, flow citometry, BrdU incorporation to DNA and Ki67 expression. Cell differentiation was verified by immunocytochemistry to cytokeratins 1, 10, 13, 14, 16, 18 and 19 and apoptosis was measured by annexin V positive cells. Gene expression profile was analyzed by microarray in PROX1-overexpressing cells and control. PROX1-overexpressing cells showed a statistically significant decrease in proliferation as well cytokeratin 1, 13, 18 and 19 expression. No significant differences from controls and PROX1- overexpressing cells were observed in apoptosis. Microarray analyses showed differential expression of genes related to development, cellular adhesion an invasion. Our results strongly suggest that overexpression of PROX1 inhibit cell proliferation and contributes to differentiation of oral squamous cell carcinoma.

O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP) representa 6ª malignidade mais comum no mundo. Para melhor entender os mecanismos envolvidos na iniciação tumoral, progressão e metástase, é necessária a elucidação dos eventos moleculares que guiam esses processos. É também importante a investigação da interação e modulação das células tumorais e seu microambiente. A participação de agentes inflamatórios no desenvolvimento e manutenção do CECP pode ser resumida na superexpressão da cicloxigenase 2 (COX-2) e na secreção de prostaglandina E2 (PGE2) pelas células tumorais. A PGE2 ativa seus receptores EP1-4 que são ligados a proteínas G. As proteínas G ativam outras vias de sinalização responsáveis por processos celulares como proliferação e angiogênese. Embora a participação do EP2 no câncer de cólon seja bem estabelecida, o papel dos receptores de PGE2 no CECP ainda permanece incerto. Este trabalho teve como objetivo avaliar o papel da PGE2 e de seus receptores na proliferação celular em linhagens celulares de CECP, bem como a expressão dos receptores em tissue microarrays de CECP. Inicialmente as linhagens de CECP foram utilizadas para analisar o padrão de expressão da COX-2 e dos receptores EP1-4 por meio da técnica de western blotting. A inibição da secreção da PGE2 pelos inibidores de COX-2 foi mensurada por meio da técnica de ELISA. A expressão dos receptores EP1-3 e da COX-2 foi também avaliada por meio da imuno-histoquímica em dois diferentes tissue microarray. A fim de esclarecer a indução da proliferação celular pela PGE2 e de apontar um de seus receptores como responsável pelo processo, duas PGE2 sintéticas, um antagonista do EP2 e um antagonista do EP3 foram utilizados para estimular a proliferação celular. Foi realizado o bloqueio do receptor EP2 por meio da interferência de RNA. Seus efeitos sobre a proliferação foram avaliados por meio do ensaio de incorporação de timidina. Os resultados mostraram que o CECP expressa constitutivamente a COX-2, o EP1, o EP2 e o EP3; e que é capaz de secretar PGE2. Os inibidores de COX-2 inibiram a secreção de PGE2 em baixas concentrações, mas não foram capazes de inibir a proliferação. A COX-2 e os receptores EP1-3 foram amplamente expressos nos tissue microarrays. Foi observada correlação entre EP1 e EP2; EP1 e EP3; e EP2 e EP3 (p<0,05). Somente o EP1 mostrou correlação com a COX-2 (p<0,05). A PGE2 induziu a proliferação por meio da indução da síntese de DNA nas linhagens celulares de CECP. O agonista de EP3 também induziu a síntese de DNA, sugerindo sua participação na proliferação dos CECPs. Os efeitos do siRNA para EP2 sobre a síntese de DNA não foram conclusivos. As proteínas ativadas por segundos mensageiros do EP2 também não foram afetadas pelo bloqueio do mesmo. Este estudo indica três importantes achados: 1. a PGE2 é secretada por linhagens de CECP; 2. a COX-2 é superexpressa nos CECPs; 3. os receptores de PGE2 são constitutivamente expressos nos CECPs. No entanto, esse trabalho mostra que esta via inflamatória parece ser independente aos mecanismos indutores da proliferação nos CECPs. / Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the 6th most common malignant lesion worldwide. To better understand the mechanisms of tumor initiation, progression, and metastasis a better understanding of the molecular networks that guides these process is needed. Towards this goal, it is important to investigate the interaction and modulation of cancer cells over its surrounding microenvironment. The involvement of inflammatory agents in HNSCC development and maintenance can be resumed in the overexpression of cycloxygenase 2 (COX-2) and secretion of prostaglandin E2 (PGE2) by tumor cells. Prostaglandin E2 activates its receptors EP1-4 which are coupled to G proteins. G protein activates other pathways responsible for cellular processes such as proliferation and angiogenesis. The participation of EP2 in colon cancer is well established however the role of PGE2 receptors in HNSCC is still poorly understood. This work aims to investigate the role of PGE2 and its receptors in cellular proliferation in HNSCC cell lines and the clinical relevant expression pattern in HNSCC tissue microarrays. HNSCC cell lines were initially used to access the expression pattern of COX-2 and EP1-4 by using western blotting technique. The ability of selective COX-2 inhibition to block PGE2 secretion was measured by ELISA antibody specific assay. Also, EP1, EP2, EP3 and COX-2 expression were evaluated by immuno-histochemistry in two different sets of HNSCC tissue microarrays. To address the question about PGE2 inducted cell proliferation and which PGE2 receptor are involved in the process, two synthetic PGE2, an EP2 agonist and an EP3 agonist were used to stimulate cell proliferation. Finally, the knockdown of EP2 receptor was performed by siRNA transfection assay and its effect was evaluated in cell proliferation by radioactive thymidine incorporation assay. The results presented here shows that HNSCC constitutively express COX-2, EP1, EP2 and EP3 and that they are able to secret PGE2. COX-2 selective inhibitors are able to suppress PGE2 secretion in lower concentrations but not to inhibit cell proliferation. Also, COX-2, EP1, E2 and EP3 are widely expressed in HNSCC tissue microarrays. A correlation between EP1 and EP2; EP1 and EP3; and EP2 and EP3 (p<0.05) was observed. Only EP1 showed correlation with COX-2 in tissue microarrays (p<0,05). PGE2 was able to induce cell proliferation as it induces DNA synthesis in HNSCC cell lines. EP3 agonist also induced DNA synthesis addressing its role in cell proliferation induction in HNSCC. The siRNA for EP2 effects in DNA synthesis was not conclusive and the downstream proteins activated by EP2 second messenger were not affected following its expression knockdown. This study indicates three important findings. First, PGE2 is secreted by HNSCC. Second, COX-2 is found to be overexpressed in HNSCC; and third, PGE2 receptors are found to be constitutively expressed in HNSCC. Most interesting, we show here that this inflammatory pathway seems to be independent of the mechanisms that induce HNSCC proliferation.

A expressão do gene Dermicidina (DCD) no câncer de mama promove aumento na proliferação e sobrevivência celular, porém os mecanismos envolvidos são desconhecidos. Através de um ensaio de microarranjos de DNA demonstramos que o DCD desempenha atividade de fator de crescimento pela modulação da via de sinalização EGF/ErbB. Estes dados foram confirmados através de silenciamento gênico, superexpressão e tratamento com a proteína recombinante. O silenciamento diminuiu a expressão de EGFR e seus ligantes, e reduziu a ativação da via de sinalização EGF/ErbB. O tratamento da linhagem celular MDA-MB-361 com DCD recombinante resultou em uma curva de proliferação em forma de sino com concomitante aumentou a expressão de EGFR e seus ligantes. A superexpressão de DCD na linhagem MCF-7 também resultou no aumento da expressão dos receptores EGFR e HER-2 e de seus ligantes, além da ativação de suas vias de sinalização. Este trabalho sugere que o DCD é capaz de modular a expressão e ativação da família EGF/ErbB resultando no aumento do crescimento e sobrevivência celular. / The expression of the gene Dermicidin (DCD) in breast cancer promotes increased in cell growth and survival, however the mechanisms involved are unknown. Using a DNA microarray assay we demonstrated that the DCD activity plays by modulating growth factor signaling phathway of EGF/ErbB. These data were confirmed by gene silencing, overexpression and treatment with the recombinant protein. The silencing decreased the expression of EGFR and its ligands, and reduced the activation of the EGF/ErbB signaling pathways. The treatment of MDA-MB-361 cell line with recombinant DCD resulted in a proliferation curve bell-shaped with a concomitant increased in the expression of the EGFR and its ligands. The overexpression of the DCD in the MCF-7 cell line also resulted in increased expression of the receptors HER-2 and EGFR and its ligands, and activation of theirs signaling pathways. This work suggests that DCD is able to modulate the expression and activation of the EGF/ErbB family resulting in increased of cellular growth and survival.

Made available in DSpace on 2016-08-19T18:16:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 HELIANA TRINDADE MARINHO.pdf: 1186217 bytes, checksum: 54acac9509ef409a9fe2f8f198769e4f (MD5) Previous issue date: 2010-06-30 / FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA E AO DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLÓGICO DO MARANHÃO / This research aimed to study cell proliferation by Ki-67 marker and CD71 in acute leukemias, as well as establish the relationship between them and their relationship to therapeutic response. Patients were selected prospectively commencing in December 2008 and ending in November 2009 (12 months). Samples were collected from bone marrow or peripheral blood of 54 patients diagnosed with acute leukemia, from the referral hospital for cancer treatment in the state of Maranhão (northeastern Brazil) and determined the expression of Ki-67 markers and CD71 by flow cytometry. Most patients were from the northeast, followed by the central, northwest, southwest and southeast of Maranhão. No patients were in southern state. The values of Ki-67 in bone marrow and peripheral blood in the patients were higher in B-ALL than other acute leukemias. The bone marrow CD71 showed increased expression in T-ALL and peripheral blood, increased expression in AML. Was no statistical difference in Ki-67 in peripheral blood and bone marrow only in AML. A significant positive correlation between Ki-67 and CD71 in peripheral blood in B-ALL. In bone marrow, the markers showed a linear correlation in AML. No relationship was found between markers of cell proliferation and response to treatment. A continuing study of cell proliferation with a greater number of patients, coupled with other techniques of cell proliferation it is necessary to evaluate other / Esta pesquisa objetivou estudar a proliferação celular através do marcador Ki-67 e CD71 nas leucemias agudas, bem como estabelecer a relação entre eles e sua relação com a resposta terapêutica. Os pacientes foram selecionados de forma prospectiva tendo início em dezembro de 2008 e término em novembro de 2009 (12 meses). Foram coletadas amostras de medula óssea ou sangue periférico de 54 pacientes diagnosticados com leucemias agudas, provenientes do hospital de referência para tratamento oncológico no estado do Maranhão (no nordeste brasileiro), sendo determinada a expressão dos marcadores Ki-67 e CD71 por citometria de fluxo. A maior parte dos pacientes era da região nordeste, seguidos da região central, noroeste, sudoeste e sudeste do Maranhão. Não houve pacientes da região sul do estado. Os valores da expressão de Ki-67 em medula óssea e sangue periférico no total de pacientes apresentaram-se maiores na LLAB que as demais leucemias agudas. O CD71 apresentou na medula óssea uma maior expressão na LLAT e no sangue periférico, uma maior expressão na LMA. Foi observada diferença estatística na expressão de Ki-67 em sangue periférico e medula óssea apenas na LMA. Foi observada correlação positiva entre o Ki-67 e CD71 em sangue periférico na LLAB. Na medula óssea, os marcadores apresentaram correlação linear na LMA. Não foi encontrada relação entre os marcadores de proliferação celular e a resposta ao tratamento. Uma continuidade do estudo de proliferação celular com um número de pacientes maior, atrelados a outras técnicas de proliferação celular se faz necessária para avaliação de outros parâmetros como a evolução clínica, prognóstico e sobrevida dos pacientes leucêmicos em nosso estado.